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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO
RESIDÊNCIA MULTIPROFISSIONAL EM SAÚDE E ÁREA PROFISSIONAL DE
SAÚDE

ÉRIKA DAYANE LEAL RODRIGUES

Caracterização molecular do Vírus da Parvovirose Canina em amostra de fezes de

cão em Belém-Pará – Relato de caso.

BELÉM

2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO
RESIDÊNCIA MULTIPROFISSIONAL EM SAÚDE E ÁREA PROFISSIONAL DE
SAÚDE

ÉRIKA DAYANE LEAL RODRIGUES

Caracterização molecular do Vírus da Parvovirose Canina em amostra de fezes de

cão em Belém-Pará – Relato de caso.

Monografia apresentada à
coordenação do programa de
Residência Multiprofissional em
Área da Saúde em Medicina
Veterinária, da Universidade
Federal Rural da Amazônia, como
requisito para a obtenção de título
de especialista em Medicina
Veterinária Preventiva.

Área de Concentração: Med.

Veterinária Preventiva

Orientador: Profº Dr. Alexandre do

Rosário Casseb

BELÉM

2016
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ÉRIKA DAYANE LEAL RODRIGUES

Caracterização molecular do Vírus da Parvovirose Canina em amostra de fezes de

cão em Belém-Pará – Relato de caso.

Monografia apresentada à coordenação do programa de Residência Multiprofissional

em Área da Saúde em Medicina Veterinária, da Universidade Federal Rural da
Amazônia, como requisito para a obtenção de título de especialista em Medicina
Veterinária Preventiva.
____________________________________
Data

______________________________________
Prof. Dr. Alexandre do Rosário Casseb
Presidente

______________________________________
Profª. Dra. Andréa Maria Góes Negrão
UFRA

______________________________________
Dr. Sandro Patroca da Silva
IEC
Belém

2016
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RESUMO

A parvovirose canina é uma enfermidade infectocontagiosa aguda, que acomete

principalmente cães jovens e caracteriza-se por manifestações gastroentéricas graves.
Um cão filhote que foi atendido no Hospital Veterinário (HOVET) apresentando
gastroenterite hemorrágica foi positivo para parvovírus canino (CPV-2) por meio da
técnica de PCR do fragmento de 216 pb do gene de VP2 e realizou-se a caracterização
molecular do parvovírus detectado nesta amostra fecal. A análise filogenética mostrou
que a cepa Belém CPV-2b estaria relacionada com cepas de CPV-2a do Brasil,
agrupamento com amostras posteriores aos anos 1990. A sequência nucleotídica da cepa
de CPV-2b identificada em nosso estudo está disponivel no NCBI com o número de
acesso KX774249. Foi isolada pela primeira vez a cepa CPV-2b em um cão com
gastroenterite hemorrágica na cidade de Belém. A parvovirose canina ainda é uma
enfermidade de alta morbidade e mortalidade na população canina, mesmo com a
disponibilidade da vacina. Não houve mudança nucleotídica em regiões codificadoras
observadas em alguns estudos sobre CPV. Portanto, o monitoramento constante dos
subtipos de CPV-2 circulantes na população canina é de suma importância para
subsidiar estudos epidemiológicos, de patogenicidade e de evolução do CPV-2 no
Brasil.

Palavras-chave: parvovirus canino, CPV-2, cão, PCR

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ABSTRACT

Canine parvovirus is an acute infectious disease, which affects mainly young

dogs and is characterized by severe gastroenteric manifestations. A puppy dog that was
seen at the Veterinary Hospital (HOVET) presenting hemorrhagic gastroenteritis was
positive for canine parvovirus (CPV-2) using the PCR technique of the 216 bp fragment
of the VP2 gene and the molecular characterization of the detected parvovirus was
performed in this fecal sample. Phylogenetic analysis showed that the Belém CPV-2b
strain would be related to CPV-2a strains from Brazil, grouping with samples after the
1990s. The nucleotide sequence of the CPV-2b strain identified in our study is available
from the NCBI under the number access code KX774249. The strain CPV-2b was
isolated for the first time in a dog with hemorrhagic gastroenteritis in the city of Belém.
Canine parvovirus is still a disease with high morbidity and mortality in the canine
population, even with the availability of the vaccine. There was no nucleotide change in
coding regions observed in some studies on CPV. Therefore, constant monitoring of the
CPV-2 subtypes circulating in the canine population is extremely important to support
epidemiological, pathogenicity and evolution studies of CPV-2 in Brazil.

Keywords: canine parvovirus, CPV-2, dog, PCR

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.............................................................................. 6
1.1. TAXONOMIA................................................................................. 6
1.2. HISTÓRICO.................................................................................... 6
1.3. EPIDEMIOLOGIA.......................................................................... 8
1.4. PATOGENIA.................................................................................. 8
1.5. SINAIS CLÍNICOS......................................................................... 9
1.6. DIAGNÓSTICO.............................................................................. 11
1.6.1. Diagnóstico Diferencial................................................................. 13
1.7. PROFILAXIA.................................................................................. 13
2. OBJETIVOS.................................................................................. 15
3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................... 16
3.1. RELATO DO CASO....................................................................... 16
3.2. AMOSTRA, EXTRAÇÃO ssDNA, e PCR..................................... 16
3.3. SEQUENCIAMENTO.................................................................... 17
3.4. ALINHAMENTO E ANÁLISE FILOGENÉTICA........................ 17
3.5. AVALIAÇÃO DA RECOMBINAÇÃO GÊNICA......................... 18
4. RESULTADOS.............................................................................. 19
5. DISCUSSÃO.................................................................................. 22
6. CONCLUSÃO............................................................................... 25
REFERÊNCIAS............................................................................ 26
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1. INTRODUÇÃO

A parvovirose canina é uma enfermidade infectocontagiosa aguda, que acomete

principalmente cães jovens e caracteriza-se por manifestações gastroentéricas graves
(PAES, 2016). O agente etiológico da doença é o Parvovírus canino tipo 2 (CPV-2),
pertencente à família Parvoviridae, gênero Protoparvovírus (MORAES & COSTA,
2007). É um vírus DNA fita simples, não envelopado, com cerca de 5200 nucleotídeos,
sem envelope, hemaglutinante (HUEFFER et al., 2003), que tem como principal
característica biológica a dependência de células na fase S ou G2 do ciclo celular para
sua replicação (MORAES & COSTA, 2007), apresenta capsídeo icosaédrico, onde
possui três proteínas do capsídeo, VP1, VP2 e VP3. A principal proteína do capídeo é a
VP2 que desempenha um papel importante na determinação de hospedeiros virais e
tropismos por tecidos (TRUYEN, 1999). Substituições de aminoácidos no gene VP2
foram responsáveis por propriedades genéticas e antigênicas (PARRISH &
CARMICHAEL, 1983).
Uma vez que a doença cursa com sinais clínicos semelhantes a outras
enfermidades causadas por bactérias, parasitas intestinais ou outros vírus, são
necessários testes específicos para o diagnóstico definitivo da enfermidade (MORAES;
COSTA, 2007).

1.1 - TAXONOMIA
A família Parvoviridae é composta pelas subfamílias Densovirinae e
Parvovirinae, capaz de infectar hospedeiros artrópodes e vertebrados, respectivamente.
Recentemente, foi proposta uma reclassificação da subfamília Parvovirinae, sendo
composta por sete gêneros distintos (ICTV, 2017). O gênero anteriormente conhecido
como Parvovirus, foi renomeado para Protoparvovirus, o qual pertence o CPV-2, tendo
o Carnivore protoparvovirus 1 (protoparvovírus dos carnívoros 1) junto com Feline
parvovirus – FPV (parvovírus felino); Mink Enteritis Virus - MEV (vírus da enterite da
marta) e Racoon parvovirus – RaPV (parvovírus do guaxinim) , de acordo com o
Comitê International de Taxonomia de Vírus (COTMORE et al., 2014; ICTV, 2017).

1.2 - HISTÓRICO
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A origem exata do vírus não está completamente esclarecida, porém a hipótese

mais aceita é de que o vírus tenha se originado da mutação do vírus da panleucopenia
felina (FPV) (HOELZER e PARRISH, 2010).
O vírus surgiu como patógeno de cão no final da década de 1970 como um
hospedeiro a partir de uma variante do vírus da panleucopenia felina (FPV) (TRUYEN,
2006; PARRISH et al., 1985). Poucos anos depois de seu surgimento, o tipo original do
CPV-2 foi substituído por duas novas variantes antigênicas, CPV-2a e CPV-2b )
(PARRISH et al., 1988; DECARO et al., 2007). Recentemente, um novo mutante, CPV-
2c, está sendo amplamente distribído e co-existindo com outros tipos de CPV na Europa
(DECARO et al., 2011; KAPIL et al., 2007), e em países da América do Norte e
América do Sul (HONG et al., 2007; CALDERON et al., 2009; PEREZ et al., 2007;
ANGELO et al., 1980).
Desde os primeiros relatos da ocorrência da doença no Brasil (ANGELO et al.,
1980; HAGIWARA et al., 1980), o CPV vem se mantendo na população canina do país
e diversos estudos têm demonstrado a sua presença em várias regiões (BARCELOS et
al., 1988; FRANDALOSO et al., 2004; MIRANDA et al., 2004).
No Brasil, os primeiros surtos de parvovirose ocorreram por volta de 1980,
atingindo cães de todas as idades. A partir daquele ano, a parvovirose canina tornou-se
uma doença endêmica no país, acometendo principalmente animais jovens e
organicamente debilitados (LARA, 2000).
Adicionalmente, por volta dos anos 2000, uma nova variante, inicialmente
denominada mutante Glu-426, foi detectada em cães na Itália (PARRISH et al., 1985).
Estudos posteriores mostraram a circulação da nova cepa, renomeada CPV- 2c, em
outros países, porém, os conhecimentos sobre a mesma ainda permanecem limitados
(HAGIWARA et al., 1980; BARCELOS et al., 1988; FRANDALOSO et al., 2004).
No Brasil, existem relatos da circulação dos três subtipos e, embora os sinais
clínicos relacionados à infecção pelos três sejam praticamente os mesmos, estudos
relatam que a infecção causada pelo CPV-2c apresenta forma clínica mais severa da
doença e maiores taxas de mortalidade, podendo, inclusive, se instalar em cães adultos,
mesmo com protocolo vacinal atualizado (HAGIWARA et al., 1980; MIRANDA et al.,
2004; LARA, 2000; ETTINGER & FELDMAN, 1997).
O CPV-2 encontra-se entre os vírus mais resistentes conhecidos. Ele sobrevive
durante meses a anos no ambiente e em fômites, e não é afetado pela maioria dos
detergentes e desinfetantes comercialmente disponíveis. O hipoclorito de sódio (a água
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sanitária comum) é um dos poucos desinfetantes efetivos contra o vírus (ETTINGER &
FELDMAN, 1997; MCCANDLISH, 2001).

1.3 - EPIDEMIOLOGIA
Desde sua descoberta, no final dos anos 1970, a parvovirose canina ainda gera
altas taxas de morbidade e mortalidade, onde inicialmente, sua gravidade está atribuída
à falta de imunidade dos cães contra o vírus. A vacinação e a resistência natural contra a
doença deveriam conferir maior proteção aos cães, porém, a alta incidência da infecção
se mantém em animais com idade entre 6 semanas e 6 meses. (MORAIS E COSTA,
2012).
O CPV-2 emergiu de forma pandêmica em 1978, associado com casos de
enterite hemorrágica grave e acentuada leucopenia, com alta mortalidade na população
canina suscetível. O CPV-2 foi assim denominado para diferenciar do parvovírus canino
tipo 1 (CPV-1), também chamado vírus minuto canino, encontrado normalmente nas
fezes de cães assintomáticos (GAGNON et al., 2016; GODDARD & LEISEWITZ,
2010; PARRISH et al., 1988). Estudos filogenéticos posteriores revelaram que o vírus
surgiu em meados de 1970 e em 1978 ele já havia sido distribuído mundialmente,
quando então foi detectado pela primeira vez (HOELZER & PARRISH, 2010;
PARRISH et al., 1988).

1.4 - PATOGENIA
A patogenicidade viral depende da idade, do estado imunológico do animal, da
virulência do vírus, da carga viral infectante, bem como de existência prévia de
parasitas, bactérias e outras infecções virais (LAMM & REZABEK, 2008).
O vírus é transmitido pela eliminação fecal e a porta de entrada é a via oronasal.
Após a penetração do vírus pela via oronasal, a replicação viral é observada no tecido
linfóide da orofaringe e nas amídalas. A viremia inicia-se aproximadamente no quarto
dia pós-infecção e mantêm-se por mais dois a três dias, sendo distribuído para todo a
organismo, tendo tropismo por células em divisão rápida, como a medula óssea, tecidos
linfopoiéticos, e dos epitélios das glândulas de Liberkhün nos intestinos.Após a
exposição ao vírus via oronasal, o mesmo se replica nos tecidos linfóides da orofaringe
e, subsequentemente, atinge a corrente sanguínea. Na viremia, mais intensa do primeiro
ao quinto dia após a infecção, o vírus se dissemina rapidamente para tecidos com
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células em rápida divisão celular como, medula óssea, órgãos linfopoiéticos e criptas do
jejuno e íleo (MORAES & COSTA, 2007).
Algumas raças são consideradas mais susceptíveis à infecção pelo CPV-2, como
Rottweilers, Dobermann, Pinschers, Labradores, American Staffordshire Terriers,
Pastores Alemães e Pitbulls (GREENE & DECARO, 2012; HALL & GERMAN, 2010;
MCCAW & HOSKINS, 2006). Embora as causas dessa susceptibilidade sejam
desconhecidas, sugere-se que animais destas raças sejam geneticamente não responsivos
ao CPV-2 (DAY et al., 2016).

FIGURA: Fluxograma da patogenia do CPV-2.

FONTE: Adaptado de GREENE e DECARO, 2012.

1.5 - SINAIS CLÍNICOS

Clinicamente, a parvovirose canina é caracterizada por vômito, diarréia,
anorexia, febre, panleucopenia e desidratação. Cães com a forma hemorrágica da
doença apresentam diarréia sanguinolenta e podem vir a óbito por choque endotóxico
em poucos dias. Pode ocorrer terminalmente em pacientes em choque, hipotermia,
icterícia ou diátese hemorrágica (coagulação intravascular disseminada)
(KRUININGEN, 1998; LOBETTI, 2003; SHERDING, 2003).
 10

A multiplicação viral nos órgãos linfóides resulta em linfopenia e neutropenia,

caracterizando um quadro de imunossupressão que pode culminar com a instalação de
infecções secundárias por outros agentes infecciosos (vírus, bactérias, fungos ou
parasitas). No intestino, a infecção nas células das criptas, cuja função é repor as células
do epitélio absortivo das vilosidades intestinais, resulta em achatamento das vilosidades,
associado à necrose epitelial e exposição da lâmina própria da mucosa, levando a
ruptura de vasos sanguíneos e sangramento intestinal (BIRD & TAPPIN, 2013;
MORAES & COSTA, 2007; PATRO et al., 2015).
Consequentemente, a diarreia resultante da má absorção intestinal apresenta-se
hemorrágica na maioria dos casos. Adicionalmente, as lesões no epitélio intestinal
podem favorecer a penetração e/ou absorção de bactérias ou toxinas, levando ao
desenvolvimento de um quadro septicêmico (BIRD & TAPPIN, 2013; MORAES &
COSTA, 2007).
O período de incubação da doença pode variar de dois a quatorze dias após a
infecção. A excreção do vírus para o ambiente se inicia no terceiro ou quarto dia após a
infecção e pode durar até vinte dias. Animais que conseguem responder à infecção
podem apresentar anticorpos neutralizantes contra o vírus por volta do quinto ou sexto
dia após a infecção, diminuindo assim a disseminação virêmica (MORAES & COSTA,
2007). Filhotes que são infectados no útero, ou antes de oito semanas de idade, podem
desenvolver miocardite devido a danos causadas pela replicação viral no tecido cardíaco
(BIRD & TAPPIN, 2013). Esses animais podem apresentar morte súbita ou sinais
inespecíficos seguidos de sinais de insuficiência cardíaca. A imunidade passiva é
responsável por proteger os filhotes da ocorrência dessa manifestação (MORAES &
COSTA, 2007).
Os sinais de prostração, anorexia e vômito precedem o quadro de diarreia,
geralmente em 12 a 24 horas. A diarréia pode ser profusa, hemorrágica e com odor
fétido. Adicionalmente, as alças intestinais podem estar doloridas, sendo possível
observar na palpação abdominal do animal. Cães com diarreia associada ou não ao
vômito podem apresentar desidratação, hipovolemia, e como consequência, choque
hipovolêmico. Os sinais clínicos iniciais de choque incluem pulso normal ou fraco,
taquicardia, tempo de preenchimento capilar aumentado, palidez das mucosas,
hipotensão, temperatura corporal baixa e grau de consciência reduzido. Adicionalmente,
podem estar presentes sinais de icterícia, coagulação intravascular disseminada, edema
pulmonar devido à síndrome de angústia respiratória no estágio terminal, sepse
 11

bacteriana, endotoxemia, choque endotóxico e infecção bacteriana associada à

leucopenia. Filhotes caninos com sepse frequentemente desenvolvem hipoglicemia
(MORAES & COSTA, 2007).
Os sinais clínicos podem piorar se associados a fatores como estresse, má
ventilação, superlotação, más condições sanitárias, infecções secundárias e doenças
concomitantes como cinomose canina, coronavirose e salmonelose. Quanto à
especificidade dos sintomas aos tipos temos que o CPV-1 causa problemas reprodutivos
e diarréia branda, enquanto o CPV-2 é responsável por miocardite e gastroenterite
hemorrágica em filhotes entre seis semanas e seis meses de idade (BIRCHARD &
SHERDING, 2008).

1.6 - DIAGNÓSTICO
O diagnóstico presuntivo na rotina clínica, geralmente é feito pelo histórico,
sinais clínicos e hemograma (MORAES & COSTA, 2007). Para Tams (2005), o início
agudo dos sinais clínicos em um cão não vacinado, previamente, é consistente com
infecção por parvovírus, porém o diagnóstico definitivo de parvovirose exige a
identificação do vírus por testes específicos (MORAES & COSTA, 2007).
A apresentação típica da doença com sinais clínicos como vômitos, diarreia,
hematoquezia, letargia, desidratação, febre e leucopenia em filhotes não vacinados, não
são específicos, mesmo sendo uma base forte para um diagnóstico presuntivo
(GODDARD & LEISEWITZ, 2010). Diversos outros agentes podem causar os mesmos
sinais clínicos como coronavírus, adenovírus, rotavírus, infecções bacterianas como
salmonelose ou clostridiose e parasitas (DECARO & BUONAVOGLIA, 2012).
Portanto, a utilização de métodos laboratoriais específicos são de extrema importância
para o diagnóstico definitivo. As técnicas disponíveis se baseiam principalmente na
detecção direta do CPV-2 nas fezes dos cães no período agudo da infecção (DECARO
& BUONAVOGLIA, 2012).
No hemograma pode-se observar neutropenia e linfopenia seguidos de
leucocitose de rebote com desvio a esquerda na fase de recuperação. Na análise do
perfil bioquímico, podem ser encontrados sinais de desidratação, acidose metabólica,
hipocalcemia, hipoglicemia e hipoalbuminemia, que podem se tornar mais graves com a
persistência do quadro de diarreia (BARR & BOWMAN, 2010). Adicionalmente,
azotemia pré-renal, aumento de bilirrubina e aumento nas atividades das enzimas
 12

hepáticas alanina amino transferase e fosfatasse alcalina, também podem estar presentes
(BICHARD & SHERDING, 2008).
Nos exames radiográficos é possível observar distensão do trato gastrointestinal
devido ao acúmulo de gases em decorrência de íleo paralítico. A distensão deve ser
diferenciada de casos de obstrução de intestino delgado por corpo estranho ou
intussuscepção. A palpação do abdômen auxilia a excluir obstrução mecânica, inclusive
intussuscepção secundária (BICHARD & SHERDING, 2008). Radiografia contrastada
com bário, frequentemente revela irregularidade de mucosa, com enrugamento ou forma
de concha, e maior tempo de trânsito intestinal (BICHARD & SHERDING, 2008). O
esfregaço de sangue direto, com intensa neutropenia, pode ser feito para distinguir a
doença de outras causas de enterite. Adicionalmente, exames parasitológicos como a
técnica de flutuação, realizada com as fezes de animais suspeitos, podem ser aplicados
para o diagnóstico diferencial. Nesses exames observa- se a presença de vermes adultos,
parasitas, ovos e oocistos de protozoários (RAKHA et al., 2015).
Para diagnóstico definitivo podem ser utilizados vários métodos laboratoriais,
tais como, isolamento viral, teste de imunofluorescência (IF), microscopia eletrônica
(ME), reação de hemaglutinação (HA), reação de inibição da hemaglutinação (HI),
testes imunoenzimáticos (ELISA), reação em cadeia da polimerase (PCR), ensaio
imunocromatográfico (EIE) e análise imunohistoquímica (IHQ) (MORAES & COSTA,
2007; REDDY et al., 2015).
A detecção de partículas virais nas fezes de pacientes suspeitos pode ser
realizada por intermédio de Microscopia Eletrônica, Hemaglutinação Direta (HA),
isolamento viral em cultivo celular ou ensaio imunoenzimático direto (ELISA). Estes
métodos são os mais sensíveis e específicos para o diagnóstico, porém são dependentes
do período de eliminação do antígeno fecal, que é breve e cíclico. A Reação em cadeia
mediada pela polimerase (PCR) tem sido utilizada principalmente pela alta
especificidade e sensibilidade deste teste. A detecção do material genético viral, pela
PCR, em amostras de fezes é sem dúvida o método atual de escolha, uma vez que
contribui para excluir muitos falsos positivos e falsos negativos (DE MARI et al.,
2003).
O diagnóstico precoce e definitivo da etiologia das gastroenterites caninas torna-
se essencial pra o tratamento e controle da disseminação do agente etiológico,
principalmente se o CPV estiver envolvido, e para alocação de cães com outras
infecções gastroentéricas. Técnicas baseadas na amplificação do genoma viral
 13

mostraram ser altamente sensíveis e a PCR além de permitir a detecção do genoma do

CPV em amostras de fezes, possibilita a distinção entre o tipo antigo (CPV-2) presente
em algumas vacinas e os novos tipos (CPV-2a, 2b e 2c) em circulação (SENDA et al.,
1995; PEREIRA et al., 2000; BUONAVOGLIA et al., 2001; COSTA et al., 2005;
DESARIO et al., 2005; PEREIRA; LEAL; DURIGON, 2007). Nesse aspecto, a PCR
vem sendo utilizada como método eficaz para o diagnóstico de inúmeras doenças de
etiologia viral. Estudos anteriores demonstram que a PCR é mais específica e sensível
para a detecção de CPV em fezes de cães, quando comparada com HA, ELISA e
isolamento viral (MOCHIZUKI; HARASAWA; NAKATAN, 1993).

1.6.1 - Diagnóstico Diferencial

O diagnóstico diferencial para parvovirose canina inclui de uma forma geral,
causas de diarréia que podem estar relacionadas a doenças metabólicas ou sistêmicas,
bem como distúrbios intestinais que acometem os cães. Dentre as causas de enterite
aguda, são diferenciais: apetite pervertido, presença de corpo estranho, intussuscepção,
uso de medicamentos antibióticos, toxinas como chumbo, causas parasitárias como
nematóides, criptosporidíase, coccidiose e tricuríase, doenças infecciosas como
salmonelose, campilobacteriose, supercrescimento bacteriano no trato gastro intestinal,
clostriodiose e coronavirose, disfunção do sistema renal, hepático ou pancreático,
distúrbio metabólico, hipoadrenocorticismo e neoplasias como linfoma ou
adenocarcinoma de trato gastrointestinal em cães mais velhos (BARR & BOWMAN,
2010).

1.7 - PROFILAXIA
A imunização ativa é a forma mais eficiente de conter o avanço da doença em
uma população. Anticorpos neutralizantes se mostraram capazes de prevenir a infecção
pelo CPV-2 e os anticorpos maternos protegem os filhotes da infecção e da doença
(TRUYEN, 2006). Cães com altos títulos de anticorpos não desenvolvem infecção ativa
e nem contribuem na disseminação da doença (PRITTIE, 2004).
No final dos anos 70 e início dos anos 80 a proteção de cães contra o CPV-2 era
obtida pelo uso de vacinas contra o parvovírus felino, que conferia uma imunidade
cruzada relativa. Entretanto, os níveis de proteção e duração do efeito protetor eram
muito baixos. Essas vacinas foram então substituídas por vacinas com vírus vivo
atenuado, que promoviam excelente proteção e maior duração da imunidade (SPIBEY
 14

et al., 2008). As vacinas atualmente disponíveis no mercado são constituídas por dois
subtipos do CPV-2: o CPV-2 e o CPV-2b (DAVIS-WURZLER, 2014; DAY et al.,
2016; PRATELLI et al., 2001).
As vacinas utilizadas atualmente contêm cepas atenuadas de altos títulos e baixa
passagem de CPV tipo 2, e 2b, consideradas muito efetivas e promovem a proteção de
cães contra a doença (DECARO & BUONAVOGLIA, 2012; WILSON et al., 2014). O
termo alto título se refere a quantidade de partículas virais na dose vacinal, enquanto a
baixa passagem se refere às inoculações em culturas de células para diminuir a
virulência dos vírus. Vacinas com altos títulos e baixa passagem são as mais eficientes
em conferir imunidade por reduzir a janela de susceptibilidade em filhotes com títulos
de anticorpos passivos (PRITTIE, 2004).
 15

2 - OBJETIVOS

Geral: realizar a caracterização molecular do parvovírus detectado em uma

amostra fecal de filhote de cão apresentando gastroenterite hemorrágica em Belém.

Específicos:
 Detectar o CPV-2 em fezes de cão com gastroenterite hemorrágica pela
técnica da reação em cadeia pela polimerase (PCR) para amplificação do
gene VP2;
 Fazer a análise molecular para caracterização do subtipo de CPV-2 em
uma amostra de cão infectado.
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3 - MATERIAL E MÉTODOS

3.1. RELATO DE CASO

Em abril de 2014 durante o atendimento no Hospital Veterinário (HOVET) da
Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), foi realizado o atendimento de um
cão, macho, SRD, com 6 meses de idade, sem histórico de vacina, apresentando
gastroenterite hemorrágica, êmese, elevado grau de desidratação, mucosas hipocoradas,
apatia, dor abdominal. Após o exame físico, o animal passou por tratamento
ambulatorial com fluidoterapia a base de Ringer com Lactato, antibioticoterapia com
Metronidazol e Enrofloxacina, controle de dor com Dipirona e controle da êmese com
Metoclopramida e Cimetidina. Sendo realizados exames complementares como
hemograma, demonstrando intensa leucopenia e anemia. Tendo em vista o histórico,
clínica e o resultado de hemograma do animal, foi dado um diagnóstico sugestivo de
Parvovirose Canina, o cão veio a óbito antes do término de seu atendimento. As fezes
do animal foram coletadas a fim de posterior análise molecular para diagnóstico
definitivo.

3.2. AMOSTRA, EXTRAÇÃO ssDNA, e PCR.

A amostra de fezes coletada no HOVET/UFRA foi encaminhada ao CIT/IEC,
devidamente acondicionada em microtubo e mantidas a -70ºC até o momento das
análises. A amostra de fezes de cão foi analisada através da PCR.
O ssDNA foi extraído utilizando QIAamp®Viral RNA Mini Kit (Cat. No.
52906) e submetido ao teste de PCR. Os iniciadores utilizados para a detecção por PCR
de CPV - F 5' - GCCATTTACTCCAGCAGC - 3' e CPV - R 5' -
AGTAAGTGTACTGGCACAG - 3' que amplificou um fragmento com 216 pb (Figura
1) da proteína VP2 descrito por (KANG et al., 2006). Para a amplificação foram
aplicadas as seguintes condições: 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 s,
emparelhamento a 55 ° C durante 30 s e a polimerização a 72 ° C durante 40 s. Após a
PCR foi realizada a eletroforese em gel de agarose a 2 % com SYBR® safe DNA gel
stain, todos os passos incluíram um controle positivo realizado com uma vacina
comercial e água como um controle negativo.
 17

Figura 1: Região Amplificada pela PCR

3.3. SEQUENCIAMENTO
A segunda etapa da síntese ssDNA foi realizada utilizando o kit de cDNA
Synthesis System (Roche, cat. No. 11117831001 ) a 400 µM Roche Primer "random". A
reação foi purificada com Agencourt AMPure XP Reagente (Beckman Coulter, No. Cat.
A63880). Sequências codificantes completas (CDS) foram obtidas utilizando a
abordagem de pirosequenciamento (SHENDURE & JI, 2008). Uma biblioteca foi
preparada e usada para sequenciamento em um pirossequenciador GS FLX + (Roche,
454 Life Sciences), no Centro de Inovação Tecnológica no Instituto Evandro Chagas,
Ministério da Saúde, Brasil.

3.4 - ALINHAMENTO E ANÁLISE FILOGENÉTICA

O alinhamento da sequência obtida foi efetuado utilizando o programa de GS De
Novo Assembler (Newbler v. 3.0). Para análise adicional, o software Geneious v. 6.1.4
foi realizado. O conjunto de dados utilizado para reconstruir as árvores filogenéticas
consistia em sequências de aminoácidos obtidas para cada segmento de genoma.
O alinhamento foi realizado usando o programa mafft v. 7 (KATOH &
STANDLEY, 2013). A reconstrução das árvores filogenéticas foi feita usando o método
da máxima verossimilhança (ML) (MYUNG, 2003), implementado no RaxML v. 8.2.4
(STAMATAKIS, 2014).
Para a determinação da confiabilidade da topologia da árvore, análise de
bootstrap (FELSENSTEIN, 1985) foi realizada em 1000 repetições. Valores de
confiança utilizado como critério de inclusão ou exclusão do grupo foram calculados
 18

com base na média das identidades de sequências de aminoácidos no interior e entre os

membros seleccionados de CPV.

3.5 - AVALIAÇÃO DA RECOMBINAÇÃO GÊNICA

A fim de avaliar a possibilidade de recombinação genética natural entre os
sorotipos analisados, foram utilizadas sequências dos diferentes CPV. Alinhamentos de
váris sequência foram realizadas utilizando mafft v. 7 ( KATOH & STANDLEY, 2013)
e Simplot v. 3.5.1 (LOLE et al., 1999) para avaliação da recombinação do
sequenciamento do ssDNA. Os valores de árvores de permutação foram designados
como percentagens. Rearranjo genético foi considerado quando a percentagem de
árvores de permutação era mais de 90 % através de um dado genômico inteiro.
 19

4 - RESULTADO
A amostra clínica suspeita para CPV foi detectada via amplificação por PCR do
fragmento de 216 pb do gene de VP2 do CPV-2. A sequência nucleotídica da cepa de
CPV-2b identificada em nosso estudo está disponivel no NCBI com o número de acesso
KX774249. Variação de aminoácidos na proteína VP2 de CPV- 2 positivo em cães são
mostrados na Tabela 1.

Tabela 1: Variações de Aminoácidos na proteína VP2 de CPV-2 em cães.

Nº de Local Data Tipo
Substituição do aminoácido residual na
Acesso de de
proteína VP2 de CPV
Coleta CPV
87 101 297 300 305 324 375 426
GU569943 China 1983 CPV-2 Met Ile Ser Asp Asp Tyr Asn Asn
M38245 USA 1996 CPV-2 Met Ile Ser Ala Asp Tyr Asn Asn
FJ222824 Itália 2005 CPV-2 Met Ile Ser Ala Asp Tyr Asn Asn
DQ340404 Brasil 1980 CPV-
Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Asp Asn
2a
M24003 USA 1984 CPV-
Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Asp Asn
2a
DQ340410 Brasil 1986 CPV-
Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Asp Asn
2a
DQ340415 Brasil 1991 CPV-
Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asp Asn
2a
DQ340430 Brasil 1995 CPV-
Leu Thr Asn Gly Tyr Tyr Asp Asn
2a
DQ340434 Brasil 2000 CPV-
Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asp Asn
2a
KR559896 Portugal 2012 CPV-
Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asp Asn
2a
KF149976 Equador 2012 CPV-
Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asp Asn
2a
M74849 USA 1984 CPV-
Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Asp Asp
2b
DQ340409 Brasil 1985 CPV-
Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Asp Asp
2b
 20

KF149972 Equador 2012 CPV-

Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asp Asp
2b
KR559892 Portugal 2012 CPV-
Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asp Asp
2b
Belém Brasil 2014 CPV-
Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asp Asp
2b
KR559894 Portugal 2012 CPV-
Leu Thr Ala Gly Tyr Leu Asp Glu
2c
KF149965 Equador 2012 CPV-
Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asp Glu
2c
GU380303 China 2009 CPV-
Leu Thr Ala Gly Tyr Ile Asp Glu
2c

Na análise comparativa das amostras disponibilizadas no Genbank com a amostra

do presente estudo obteve-se uma variação de similaridade de 98,6% a 99,5%. Quando a
analise foi feita com amostras isoladas na China a similaridade variou de 98,6% a
99,1% enquanto que a amostra isolada no presente estudo variou de 99,2% a 99,5% com
amostras isoladas na Europa.
Nossa amostra apresentou similaridade de 99,5% com a amostra FJ222823 da
Itália e maior divergência com as amostras isoladas da Tailândia (GU 212792) e da
China (JQ996153) (98,6%) (figura 2).
 21

Figura 2: Árvore enraizada, demostrando as relações filogenéticas entre as amostras de

CPV disponíveis no GenBank e aquela descrita no presente estudo (em vermelho). A
árvore foi construída usando o modelo de máxima verossimilhança (ML) (MYUNG, 2003)
após o alinhamento de 216 nucleotídeos da região VP-2. O teste de sustentação estatística
(bootstrap) foi aplicado usando 1000 réplicas.
 22

5 - DISCUSSÃO
O CPV-2 é responsável por causar uma doença viral altamente contagiosa de
grande importância para proprietários de animais de companhia e médicos veterinários
(BARGUJAR et al., 2011). A ocorrência da infecção, bem como a gravidade dos sinais
clínicos dependem de fatores como imunidade materna, virulência da cepa viral, dose
infectante, raça e defesa imunológica do hospedeiro (LAPPIN, 2016; NELSON &
COUTO, 2006).
Apesar dos sinais clínicos da parvovirose canina serem sugestivos em animais
jovens, percebe-se que muitos animais, com gastroenterite de diversas origens, têm
sinais clínicos idênticos aos desta enfermidade, tornando-se, então, necessária a
confirmação laboratorial para o diagnóstico das infecções pelo CPV em cães. A
demonstração do CPV, ou antígenos do CPV nas fezes, deve ser rotineiro (CASSEB,
2009). Esta confirmação do diagnóstico clínico deve ser obtida através da realização de
testes laboratoriais, uma vez que os sinais clínicos são inespecíficos e podem ser
confundidos com várias outras enfermidades (REDDY et al., 2015).
Desde que emergiu em 1978 como um novo patógeno de cães, o CPV apresenta
um modelo contínuo de evolução, com o aparecimento e circulação de novos tipos e
variantes na população canina (TRUYEN, 1999; HOELZER & PARRISH, 2010).
O diagnóstico rápido de laboratório é benéfico para o começo imediato de
terapia do animal acometido pelo CPV-2 e, em alguns casos, possibilita a detecção do
subtipo envolvido com a infecção, ajudando no controle sanitário e estabelecimento de
medidas profiláticas específicas (CUBEL et al., 2002). Atualmente, uma série de testes
laboratoriais está disponível comercialmente para o diagnóstico da doença, o que pode
dificultar a escolha dos médicos veterinários. Alguns fatores como, tipo de amostra,
quantidade de amostra, estágio clínico da doença, entre outros, deve ser levado em
consideração na hora de definir o teste a ser realizado. Por exemplo, visto que a resposta
imune é iniciada de quatro a cinco dias após a infecção, a presença do vírus em testes
indiretos só poderá ser detectada de quatro a sete dias após o aparecimento dos sinais
clínicos, o que pode contribuir para resultados falso negativos (POLLOCK &
CARMICHAEL, 1990).
Vários métodos sorológicos, de microscopia eletrônica e cultura celular têm sido
utilizados para o diagnóstico de Parvovirose Canina, no entanto, a sensibilidade destes
métodos de diagnóstico tradicionais, tem provado ser inferior a ensaios moleculares.
Assim a PCR é uma técnica de alta especificidade e sensibilidade, sendo amplamente
 23

utilizada como método diagnóstico do CPV. Esta técnica é capaz de detectar títulos
mínimos do agente em diversos tipos de amostras biológicas, mesmo com o vírus não
mais infeccioso. Entretanto, essa técnica molecular exige infraestrutura laboratorial
especializada, além de ter maior custo quando comparada a outras metodologias de
diagnóstico (MORAES; COSTA, 2007). Deste modo, a PCR foi o método de
diagnóstico escolhido para a detecção de CPV-2 em amostras fecais, conferindo alta
sensibilidade e especificidade em nosso estudo (SCHUNCK: KRA: TRUYEN, 1995).
A técnica de sequenciamento é importante para conhecer a variante particular
do CPV presente na amostra de campo (NANDI: CHIDRI, KUMAR, 2009). As
mutações pontuais na proteína VP2 foram associadas com os tipos de CPV. A análise
da sequência pode dar uma ampla informação para a tipagem de CPV uma vez que o
fragmento amplificado por PCR convencional codifica, pelo menos, um aminoácido
informativo (resíduo 426) da proteína VP2 . A mudança do aminoácido na posição 426
pode diferenciar a CPV-2a (Asn), CPV-2b (Asp) e CPV-2c (Glu) (BUONAVOGLIA et
al., 2001).
CPV tem uma distribuição mundial. Em muitos países da Europa, como Reino
Unido, Alemanha e Itália, o tipo CPV-2a foi ultrapassado pela CPV-2b ou CPV-2c.
Tipo 2b e 2c isolado predominante na América do Norte (DECARO et al., 2006;
DECARO et al., 2007), enquanto CPV- 2c é mais difundido na América do Sul
(SHACKELTON et al., 2005; DECARO et al., 2007).
Neste trabalho foi identificado o tipo CPV-2b, corroborando com um estudo
feito por Costa et al. (2005) onde caracterizou os sub-tipos circulantes no Rio de Janeiro
usando métodos moleculares, onde mostrou que o sub-tipo prevalente entre 1995 a 2001
foi o CPV-2b. Assim como os resultados de Pereira (PEREIRA et al., 2000) que
detectaram o CPV-2b no estado de São Paulo.
Em outro estudo, Perez et al. (2007) relatou que a variante CPV-2a aumentou
em uma população de cães no Uruguai, onde era originalmente CPV-2c, indicando que
evoluiu a partir de variantes antigênicas do CPV.
A analise filogenética das variantes circulantes na população canina em
algumas regiões do Brasil tem mostrado que elas são muito similares àquelas
encontradas em outros países e não tem indicativo de uma origem geográfica comum
sendo chamados de cosmopolita (PINTO et al., 2012), corroborando com nosso achado,
cuja similaridade se mostrou em mais de 99,2%.
 24

O resultado do presente estudo, 2-b como principal tipo CPV circulante,

contrasta com o trabalho de Pinto et al., (2012) que demonstram que a 2-C foi o
principal tipo de CPV que circulou no Brasil entre os anos de 2008 e 2010, entretanto
um numero amostral maior seria necessario para ratificar essa teoria.
Pode-se inferir que a cepa isolada no estudo tem maior similaridade com
amostras isoladas na Europa e mais divergentes que com amostras isoladas na China.
A análise das variantes que circulam na população canina do Brasil
mostra que eles são muito semelhantes aos de outros países nas Americas demonstrando
a importância de realizar mais estudos de epidemiologia molecular do vírus a fim de
compreender e bloquear essa cadeia de transmissão entre a população canina. A análise
filogenética do fragmento parcial da VP2 do CPV-2 usado nesse estudo mostrou que há
uma importante variação genética dentro desse gene viral e que os clados formados com
amostras de outras partes do mundo mostra que as mutações tem ocorrido mesmo em
regiões geograficamente distantes o que pode significar a adaptação do vírus a novas
condições ou seleção de características positivas que ainda devem ser estudadas
(HAMAMURA, 2017).
Portanto, o contínuo monitoramento e caracterização molecular das amostras de
CPV e FPLV são necessários não somente para a identificação de possíveis mudanças
genéticas e antigênicas que possam interferir na eficácia das vacinas, mas também para
trazer uma melhor compreensão sobre os mecanismos que impulsionam a evolução dos
parvovírus no Brasil.
 25

6 – CONCLUSÃO

Foi isolada pela primeira vez a cepa CPV-2b em um cão com gastroenterite
hemorrágica na cidade de Belém.
A parvovirose canina ainda é uma enfermidade de alta morbidade e mortalidade
na população canina, mesmo com a disponibilidade da vacina.
Não houve mudança nucleotídica em regiões codificadoras observadas em
alguns estudos sobre CPV.
Portanto, o monitoramento constante dos subtipos de CPV-2 circulantes na
população canina é de suma importância para subsidiar estudos epidemiológicos, de
patogenicidade e de evolução do CPV-2 no Brasil.
 26

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