Adn Electroforeza

Metode de analiza ale secventelor
ADN si ARN
Electroforeza pe gel de
agaroza
Structura acizilor nucleici

poate fi studiata in prezent
utilizand diverse metode
Scopul analizarii secventelor
acizilor nucleici este
complex: in vederea
studierii, sintetizarii si
multiplicarii genelor, dar si
pentru detectarea mutatiilor
Ingineria genetica reprezinta

un ansamblu de tehnici de
laborator folosite pentru
modificarea ADN-ului
organismelor vii
ADN-ul poate fi extras din
sange total, dar si din
diferite celule sau tesuturi
Pentru extragerea ADN-ului
se folosesc diverse metode
chimice
Izolarea ADN-ului constituie

si ea o etapa importanta in
cadrul inginerie genetice
Clonarea ADN-ului
semnifica amplificarea unei
molecule sau a unei catene;
o clona reprezentand un
numar mare de molecule
sau celule identice,
provenind dintr-o celula sau
molecula initiala
Clonarea unui fragment de

ADN se realizeaza fie prin
insertia acestuia intr-un
vector care se va multiplica
intr-o celula gazda, fie prin
metoda PCR
Vectorii frecvent utilizati
sunt: plasmidele, cosmidele
si bacteriofagii
Metoda PCR are ca

finalitate obtinerea intr-un
timp scurt a unui numar
foarte mare de copii ale unei
gene sau a unui anumit
fragment de ADN
Aceasta se realizeaza printro amplificare enzimatica, ce
are loc in mod exponential
PCR cuprinde 30-40 de
cicluri realizate cu un aparat
automat
In vederea detectarii
mutatiilor se utilizeaza
metode diferite
Pentru a detecta mutatiile
cunoscute se folosesc
urmatoarele metode: PCR si
separarea pe baza marimii
fragmentului de ADN; PCR
si digestia cu enzime de
restrictie sau metoda
amplificarii cu alele
specifice.
Pentru detectarea mutatiilor

necunoscute se folosesc
metode precum: metoda
FISH, electroforeza in camp
pulsatil sau, in cazul
mutatiilor punctiforme,
metoda clivarii cu
ribonucleaze, metoda
proteinelor functionale ori
analiza polimorfismelor
conformationale
monocatenare.
Secventializarea ADNului uman permite:

finalizarea secventei
complete a genomului
uman(PGU), clonarea
genelelor localizate,
precum si punerea la
dispozitia publicului a
intregii secvente de
ADN in mod gratuit
Secventializarea ADN
Secventializarea ADN
reprezinta identificarea
tipului, felului si succesiunii
nucleotidelor dintr-un
fragment ADN de analizat
In momentul de fata s-au
dezvoltat tehnici de
secventiere automate: fie
chimic prin metoda MaxamGilbert, fie enzimatic prin
metoda Sanger
Metoda chimica presupune

marcarea ADN-ului supus
secventializarii la unul din
capetele sale, denaturarea,
urmata de de separarea prin
electroforeza in gel a celor
doua catene
Are loc apoi taierea ADNului monocatenar cu
obtinerea unor fragmente de
ADN cu lungime varibila ce
pot fi separate electroforetic
pe geluri de poliacrilamida
Metoda enzimatica Sanger

consta din replicarea ADNului monocatenar incepand
de la un punct precis de
initiere, replicarea fiind apoi
intrerupta in functie de baza
existenta in secventa de
analizatde catre
dideoxinucleotide
Metode de separare ale acizilor

nucleici
In functie de scopul urmarit,

pentru separarea acizilor
nucleici se pot utiliza:
centrifugarea, cromatografia
sau electroforeza
Metoda centrifugarii ofera
posibilitatea obtinerii de
ARN in cantitati
considerabile si de inalta
puritate
Din cadrul metodelor

cromatografice, pentru
separarea acizilor nucleici
se utilizeaza cromatografia
de gel filtrare, cromatografia
de schimb ionic si metoda
dHPLC
Cromatografia de gel filtrare
se foloseste pentru
purificarea produsilor PCR
Cromatografia de
schimb ionic se
utilizeaza pentru
extractia rapida de ADN
si ARN din diverse
probe biologice, in
cantitati suficiente
dHPLC este o metoda

de screening a
mutatiilor punctiforme
Electroforeza fragmentelor ADN si

ARN
Electroforeza fragmentelor de
ADN este o metoda analitica
folosita pentru separarea
acestor fragmente in functie de
marimea lor
In solutie libera, la pH neutru
sau alcalin, acizii nucleici nu pot
fi separati
Pentru separarea lor se se
folosesc matrici de gel de
agaroza sau poliacrilamida
Gelurile de agaroza sunt

folosite pentru separarea
acizilor nucleici cu mase mari,
in timp ce diferentierea
moleculelor de acizi nucleici cu
mase moleculare mici se face in
geluri de poliacrilamida
Un camp electric determina
migrarea lor prin gel
Datorita numarului mare de
resturi fosfat, acizii nucleici au o
puternica incarcatura negativa,
migrand in campul electric spre
anod
Fragmentele se separa
sub forma unor benzi
electroforetice
Mobilitatea unui
fragment de ADN este
invers proportionala cu
masa moleculara, fiind
de asemenea
influentata de o serie
de factori
In conditii ideale, viteza de

migrare a fragmentelor este
direct proportionala cu
tensiunea aplicata
Vascozitatea gelului se
poate reduce in momentul
cresterii temperaturii ceea
ce produce distorsiuni ale
procesului de migrare
Tampoanele de
electroforeza au rolul de a
mentine un pH si o putere
ionica constante, la valori
optime pentru separare
Agentii denaturanti(ureea,
formamida, formaldehida)
indeplinesc functia de
combatere a fenomenelor
de agregare si adsorbtie a
moleculelor de acizi nucleici
pe matricea de gel, dar si
functia de inlaturare a
diferentelor conformationale
Dupa ce separatia este

completa, fragmentele ADN
avand lungimi diferite sunt
adesea vizualizate prin
utilizarea unui colorant
fluorescent precum bromura
de etidiu
Marimea fragmentelor este
exprimata in:nucleotide,
perechi de baze sau kbpentru o mie de perechi de
baze
Determinarea marimii
fragmentelor se face
uzual prin compararea
cu DNA-ladders ce
contin fragmente liniare
de ADN, de lungimi
cunoscute
Electroforeza acizilor nucleici

este o etapa obligatorie in orice
protocol de analiza a acizilor
nucleici
Prin ea se realizeaza:
separarea fragmentelor ADN
rezultate in urma digestiei cu
enzime de restrictie; verficarea
amplificarii PCR; identificarea
si/sau determinarea
semicantitativa a fragmentelor
ADN rezultate in urma
amplificarii PCR; detectia si
determinarea semicantitativa a
ADN-ului genomic obtinut in
urma extractiei din tesuturi
Analizele ADN si ARN au

asadar roluri cruciale in
detectarea mutatiilor, in
diagnosticarea bolilor genetice,
a cancerelor, in diagnosticul
microbiologic
Dar si in cadrul testelor de
paternitate si de identificare a
persoanelor
In determinarea profilului
genetic al bolilor
In teste de filogenie
Toate aceste analize cuprind in
mod obligatoriu si etapa de
electroforeza
De aici sesizam cu
usurinta importanta
functie a utilizarii
tehnologiei ADN in
prognosticare,
diagnosticare,
monitorizare si terapie
Tehnologia ADN dispune de

un larg spectru de
aplicabilitate, in cele mai
diverse si complexe domenii
ale medicinii, atat in
cercetarea fundamentala ce
ne ofera permanent noi date
si informatii, cat si in
cercetarea aplicativa ce
ofera noi solutii terapeutice

Adn Electroforeza

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Adn Electroforeza

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Adn Electroforeza

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Metode de analiza ale secventelor

Structura acizilor nucleici

Ingineria genetica reprezinta

Izolarea ADN-ului constituie

Clonarea unui fragment de

Metoda PCR are ca

Pentru detectarea mutatiilor

Secventializarea ADNului uman permite:

Metoda chimica presupune

Metoda enzimatica Sanger

Metode de separare ale acizilor

In functie de scopul urmarit,

Din cadrul metodelor

dHPLC este o metoda

Electroforeza fragmentelor ADN si

Gelurile de agaroza sunt

In conditii ideale, viteza de

Dupa ce separatia este

Electroforeza acizilor nucleici

Analizele ADN si ARN au

Tehnologia ADN dispune de

S-ar putea să vă placă și