Apuntes Análisis de Medicamentos
Apuntes Análisis de Medicamentos
Apuntes Análisis de Medicamentos
INTRODUCCIN
Definicin
Anlisis
Medicamento
Procedimientos
Mtodos
Tcnicas
Control
de
Calidad
Anlisis Qumico
Excipiente
Principio
Activo
Forma Farmacutica
Slidas
Semislidas
Lquidas
ANALISIS
DE
MEDICAMENTOS
Farmacopeas
A.O.A.C.
ASTM
Etiquetas
{Acondicionamiento}
Materias Primas
GMPs
Auditorias
Aseguramiento
{PNOs}
Frmula Maestra
GLPs
Bitcora
Mtodos validados
Instrumentos
calificados
Personal capacitado
Analizar: llevar a cabo una serie de procedimientos, tcnicas o mtodos para caracterizar algo.
Mtodo: serie de procedimientos lgico que nos puede llevar a un resultado.
Procedimiento: serie de pasos secuenciales lgicos (comprobados) que nos deben de llevar
a un resultado.
Tcnica: es la utilizacin de un procedimiento en el cual est inmiscuido un instrumento.
Medicamento: de acuerdo a la OMS es una forma farmacutica cuyas caractersticas
deben ser prevenir, diagnosticar y aliviar una enfermedad tanto en seres
humanos como en animales. Ejemplos: vacunas.
Forma Farmacutica: presentacin comercial de un medicamento formado por un
excipiente y un principio activo.
Excipiente: materia prima inerte, no tiene actividad farmacolgica y no da una respuesta
analtica.
Principio Activo: tienen efecto farmacolgico.
Formas Farmacuticas
Slidos
Comprimidos
Tabletas
Cpsulas
Parches
Tabletas masticables
Efervescentes
Polvos efervescentes
Grageas
Implantes
Semislidos
Supositorios
vulos vaginales
Ungentos
Cremas
Pomadas
Lquidas
Jarabes
Suspensiones
Emulsiones
Inyectables
Oftlmicos
Oticos
Nasales
Elixir
Los medicamentos pueden clasificarse en:
Estriles y
No estriles
Espesor
Tamao
Altura
Dimetro
Delimitacin (no grietas)
Forma
Olor
Color
Tamao
Cpsulas
Tamao
Prueba de dilucin: establece el medicamento adecuado o no. Tiene que ver con la bioequivalencia y biodisponibilidad.
Semislidos.
Aspecto
Textura (cremas, ungentos, pomadas)
Dureza (vulos y supositorios)
Color
Olor
Apariencia
Gravedad especfica
Prueba de reblandecimiento
Densidad
Contenido de Principio Activo
Viscosidad y velocidad de sedimentacin
Tamao de partcula para emulsiones
Aspecto
Color
Gravedad especfica (lquido de referencia, el valor es adimensional)
Densidad (masa/volumen)
Viscosidad
Cantidad de azcar presente en jarabes
Elixir (cantidad de alcohol)
Prueba de esterilidad (en inyectables)
Prueba de pirogenicidad
Prueba de isotonicidad
pH
Contenido de Principio Activo
Prueba de Identidad previamente
Incluir informacin (nombre, cantidad, contenedores recibidos, nmero de lote). Cada bolsa debe de llevar su
propia etiqueta, la fecha de caducidad y las recomendaciones de almacenaje.
Medicamentos Magistrales deben de llevar el nombre del paciente, nombre del mdico y lo que contiene.
Las etiquetas generalmente son de color blanco con margen de color rojo.
Todas las pruebas se deben de realizar en medicamentos :
Al inicio.
A granel.
Y como producto terminal.
ANLISIS QUMICO
Uso de metodologa analtica.
Prueba de Identidad
Aluminio + EDTA . Formacin de un complejo utilizando como indicador a negro de eriocromo.
Na+ a la flama es de color anaranjado.
K+ color rosado violeta.
Fe+2 color verde.
Procedimiento.
Tcnica.
Mtodo
Se selecciona el mtodo, la tcnica a seguir y que procedimiento. En el compendio de Farmacopea se regulan los lmites de
dosificacin.
La calidad de los reactivos est a cargo de la American Chemical Society.
Validacin de Mtodos: se refiere a cualquier cambio de metodologa que impacte sobre los resultados. En la Farmacopea se
encuentran los mtodos validados o requerimientos especficos.
Anlisis adecuado
Aleatorizar: que cada elemento de la muestra tenga la misma probabilidad de ser seleccionado para llevar a cabo el anlisis.
METODO
Preciso
Exacto
Reproducible
Repetible
Rpido y sencillo
Sensible
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
La exactitud
La precisin o fidelidad
La sensibilidad
El lmite de deteccin
La especificidad y selectividad
La linealidad
El rendimiento de extraccin
La apreciacin de las cualidades del mtodo se define en relacin a una molcula, un mtodo y un equipo dado.
Exactitud: representa la cualidad de concordancia entre un valor determinado y el valor real o convencionalmente verdadero.
Estadsticamente, la exactitud se aprecia por la diferencia entre una media observada (Xi) y un valor terico (X): (Xi X).
Precisin: la precisin o fidelidad de un mtodo, representa la cualidad de concordancia en una zona definida de valores para
determinar entre medidas repetidas, efectuadas en una misma muestra en condiciones constantes y determinadas.
Sensibilidad: se define por la variacin mnima que se debe imponer a la magnitud medida (por ejemplo, una concentracin), para
obtener una variacin significativa del resultado de la medicin (rea en cromatografa).
Lmite de deteccin: se trata de la menor cantidad que puede detectarse por un mtodo, con una probabilidad determinada de un
blanco realizado en las mismas condiciones.
Especificidad: caracteriza a un mtodo que responde a un compuesto nico y que no representa interferencia alguna.
Selectividad: refleja la posibilidad de que mediante un mtodo se determine simultneamente o por separado las cantidades de dos
entidades qumicas distintas.
Funcin analtica: relacin entre el resultado analtico y la seal propia de la medida C = f(x).
Funcin de calibracin: relacin inversa de la anterior entre la seal propia de la medida y el valor del patrn X = g(c).
Repetibilidad: expresin cuantitativa de la precisin, cuando el mismo tcnico aplica el mtodo a la misma muestra, en el mismo
laboratorio, con los mismos aparatos y los mismos reactivos, en el transcurso de la misma serie de anlisis.
Reproductibilidad: expresin de la precisin cuando el mtodo se aplica a muestras distintas en condiciones diversas que deben de
definirse.
VALIDACIN
Preciso
Exacto
Reproducible
Repetible
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
Robustez
Tolerancia
Muestra
Mtodo
Analista
TIPOS DE ERROR
Sistemtico (determinados)
Aleatorio (indeterminados)
Craso
SISTEMATICO: se da independiente del aleatorio, ofrece valores abajo del valor real o verdadero, se da por el instrumento o material de
laboratorio. El analista los puede eliminar al ser cuidadoso. Se pueden minimizar no eliminar.
ALEATORIO: el equipo mismo los da, el analista no puede controlarlos. Se dan al azar inherente a los mtodos. Pueden provocar
valores que estn por arriba o por debajo de los valores promedio.
CRASO: errores graves que no tiene sentido llevar la metodologa. Ejemplo:
A + B
Reactivos
-
C + D
productos
Directa : valorar C o D.
Indirecta: producir C o D y determinar cuanto queda de A o B (reactivos en exceso).
Para el reactivo en exceso se emplea el indicador fenolftaleina con pH de
8 a 10 (incoloro a rosa).
PRECISION: se vincula con los errores aleatorios. Coeficiente de variacin o desviacin estndar, hace referencia a que tan cercano se
encuentran los valores por arriba o por abajo dentro de un valor medio. Ejemplo: valorar aspirina de 500 mg.
501.04 mg
498.60 mg
502.30 mg
497.30 mg
503.60 mg
2502.80 mg / 5 = 500.56 mg =
X
=
(Xi - n X)2
n - 1
i
/ X
X 100
EXACTITUD: que tan cercano se encuentran los valores al valor verdadero o valor real (no conocido). Vinculada con errores
sistemticos.
REPRODUCIBILIDAD DEL METODO: reproduccin entre rachas, se manipula en diferentes perodos y en diferentes condiciones de
laboratorio.
REPETIBILIDAD DEL METODO: se determina la precisin dentro de rachas, dos personas trabajan en el mismo laboratorio, con el
mismo material y con los mismos reactivos.
LIMITE DE DETECCIN: cantidad de analito ms pequea que puede detectarse con un grado de confianza concreto. Est en funcin
del instrumento utilizado
LIMITE DE CUANTIFICACION: cantidad que se puede cuantificar con precisin y exactitud.
ROBUSTEZ: mtodo capaz de aceptar cambios en los laboratorios, reactivos, analistas.
TOLERANCIA
Distribucin de Gauss n > 50
valor medio de poblacin completa.
X estimacin del valor.
3 = 99 %
2 = 95 %
1 = 66 %
La ms elegible es la del 95 %.
En caso de diseos experimentales
Variables independientes
Controlar las variables
95 %
n
Grado de libertad: nmero de desviaciones independientes que se utilizan al calcular la desviacin estndar. A medida de que el
tamao de la muestra se hace ms pequeo s agranda la incertidumbre.
Ejemplo. Se determin el contenido de ion sodio en una muestra de orina utilizando electrodo selectivo de iones y se obtuvieron los
siguientes valores:
102, 97, 99, 98, 101, 106 m
Cules son los lmites de confianza al 95 % y 99% para la concentracin del ion sodio?
X = 100.5
Grado de libertad = 5
t= 2.57 a 95 %
t= 4.03 a 99 %
= 3.27
100.5 +/- 2.57 (3.27/ 6 ) = 97.1 ------ 103.9
0.003
t = 2.26
Encuentre intervalo de confianza al 95 % y decida si existe un error sistemtico.
0.461 +/- 2.26 (0.003/ 10) = 0.459 ------- 0.463 hay error sistemtico
t = 3.25 a 99%
0.461 +/- 3.25 (0.003/ 10) = 0.458 ------- 0.464 hay error sistemtico
Empleo de lmites de confianza
-
CURVAS DE CALIBRACION
Requiere de un estndar primario o estndar de referencia con las siguientes caractersticas:
Estable.
Poco higroscpico.
Barato.
Se pesa la mnima cantidad con precisin en balanza digital. La exactitud y precisin est dada por la estabilidad de la sustancia.
Cada concentracin se realiza por triplicado (15).
Cada valoracin requiere de cinco concentraciones.
Primera solucin STOCK o solucin madre, la cual es la de mxima concentracin (una nica
pesada, una nica concentracin, volumen exacto y concentracin conocida).
De la solucin stock se realizan CINCO SOLUCIONES ESTANDAR, cada una por triplicado.
Se procede a aleatorizar (prepararlas para leerlas indistintamente y con el mismo procedimiento).
PRUEBAS DE SIGNIFICANCIA
Si se acepta la hiptesis nula no significa que se haya probado que sea verdadera, slo que no se
ha demostrado que sea falsa.
Para decidir si la diferencia entre y el valor promedio entonces
y x
x +/- (t n
)
t = ( x - n
/
El valor crtico (t) si el valor de t es mayor que el crtico entonces se rechaza la hiptesis nula.
Ejemplo: en un mtodo para determinar mercurio por absorcin atmica de vapor fro se obtienen los siguientes resultados para material
de referencia: 38.9, 37.4, 37.1 %. Un valor de referencia conocido dio 38.9 % . Hay alguna evidencia de error sistemtico?
Grados de libertad = 2
t = 0.05 ----- 4.3
x = 37.8
0.9644
t = (37.8 38.9)
3/ 0.9644 = 1.9756
n = 6 ------ Q = 0.621
Q = [ 9.8 10.0 ] / (10.5 9.8) = 0.285
Q = [ 10.4 10.5 ] / (10.5 9.8) = 0.1428
Q = [10.5 10.4 ] / (10.5 9.8) = 0.1428
Q = [ 10.5 10.0 ] / (10.5 9.8) = 0.07
GRASAS
Densidad menor a la del agua por tener peso molecular elevado. Es una propiedad INTENSIVA
del sistema porque no depende la cantidad.
g/ ml = 1g / cm 4 C referencia con agua.
Gravedad Especfica
G.E. = muestra
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H
O
H-C-O-C-R1
MONOGLICERIDO
3 RCOOH --------------------- H-C-O-C-R2
DIGLICERIDO
H-C-O-C-R3 TRIGLICERIDO
H
O
ESTER
PRUEBAS
Pesar muestra en balanza analtica (peso exacto) y colocarlo en un matraz erlenmeyer de 250 ml.
Adicionar mezcla alcohol-ter (1:1) previamente neutralizado a la fenoftaleina.
Valorar con NaOH 1N solucin valorada usando fenoftalena como indicador, despus de 30
minutos neutralizada en color rosa. Incoloro si y solo si hay cidos grasos libres.
Los cidos grasos insaturados presentan ismeros CIS y TRANS predominando el cis.
Dependiendo de la posicin de la doble ligadura se van a encontrar los ISOMEROS DE
OPOSICION.
Los polimorfos (diferentes formas cristalinas) son de importancia por la diferencia de sus
propiedades como solubilidad, punto de fusin, difraccin de rayos X, etc.
Porcin hidroflica.
Porcin hidrofbica.
Reaccin de hidrogenacin (cuantas dobles ligaduras se encuentran).
Cromatografa en placa fina teniendo un estndar.
Absorcin cercano al infrarrojo.
SATURADOS
No de Carbonos
Nombre
P de fusin
Frmula
12
16
24
cido larico
Acido palmtico
Acido lignosrico
44.2 C
63.1 C
86.0 C
CH3(CH2)10COOH
CH3(CH2)14COOH
CH3(CH2)22COOH
A temperatura ambiente son slidos y conforme aumenta el nmero de carbonos aumenta el punto de fusin.
INSATURADOS
No de Carbonos
Nombre
Punto de fusin
16
Acido palmitoleico
-0.5 C
18
-13.4 C
20
Acido araquidnico
-49.5 C
ESTERES
Grasas o aceites.
Las grasas se presentan en forma slida y los aceites en forma lquida.
Evaluacin:
-
Indice de acidez es la descomposicin del ster en alcohol y cido. Medida de la hidrlisis de una
sustancia.
Empleo de un desecante o cidos fuertes y bases fuertes en solucin (hidrlisis cida o alcalina).
Evitar humedad del medio ambiente.
10
FC = N EXP / N teorico X ml
Ejemplo:
gastados
11
x = 0.2331
ADULTERANTES
Como los terpenos (colesterol y
Materias primas no saponificables, no llevan a cabo hidrlisis .
lanosterol).
Ejemplo: mezcla que contenga 33.4% Isap = 80 y 66.6 % Isap = 118
0.334 (80) + (0.666) (118) = 105.308
Qu cantidad se coloca de cada una de ellas?
Isap = 93
x (80) + y (118) = 93 ............... Ec. 1
x + y = 1 ............................... Ec. 2
x = 1- y
1- y (80) + 118 y = 93
80 80 y + 118 y = 93
38 y = 93 80
y = 93 80 / 38 = 0.3421
0.3421 (118) + 0.6579 (80) = 92.9998 %
X % = 65.79 ------ ISAP = 80
Y % = 34.21 ------ ISAP = 118
IESTER = mg KOH / g
IESTER = ISAP - IACIDEZ mg necesarios de KOH para esterificar 1 g de muestra.
IESTER = ISAP cuando IACIDEZ = 0
IYODO = g Yodo / 100 g de muestra
Procedimiento:
ICl ------------- I+ + Cl
R-CH = CH2 + I + --------- R-CH-CH2 + ClCl H
I+ ----------------- R-C-C-H
I
ICl + KI --------- KCl + I2
I2 + 2 Na2S2O3 --------- 2 NaI + Na2S4O6
Por cada doble ligadura se adicionar dos veces el peso del Yodo.
12
IYODO EXPERIMENTAL
IYODO = (VBCO VMTA) N 0.1 N
IYODO = (VBCO 0.1 N V MTA 0.1 N) 1.26 g / g de muestra
Blanco 44.6 0.1035 N
Na2S2O3
-------- Ejemplo: muestra de cido oleico con mtodo de Wijs se pesaron 0.59 g de muestra.
46.16
ml corregidos
Muestra 28.34 ml de
Na2S2O3 ----------29.33
FC = 0.1035 N / 0.1 N = 1.035
IYODO = (46.16 29.32) 1.269 / 0.259 = 82.45 g I / 100 g mtra.
El adulterante con doble ligadura aumenta el IYODO.
El IA en el ISAP no influye.
Otros ndices son el IPEROXIDO y el IACETILO.
INDICE DE HIDROXILO
IOH = mg / KOH
mg de KOH equivalentes al contenido de hidroxilos presentes en 1 g de muestra.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
CH3C-Cl
---------
] + Cl-
agente Nu:
acil piridinio
+
H+
O
CH3C-OR +
ster
cadena corta
ROH
+ HCl
de
13
O
1. CH3C-Cl
cloruro de
acetilo
CH3COOH
2. anhdro actico
O
CH3 C-O + H2O -----------CH3-C
O
+ H2O
2 CH3COOH
Los agentes acetilantes mejores son el anhdrido actico y el cloruro de acetilo debido a que tienen cadena corta y no hay impedimento
estrico por ataque del hidroxilo que el mismo cido actico.
0.5 N
P.M. 46 g/ mol
P.M 17 g/ mol
x = 0.3696 g OH
x = 0.0217
x = 0.5543 g
1 eq OH --------x
---------
x = 0.0326 eq OH
17.0
0.5543 g
14
El enranciamiento se debe a :
Perxidos.
Radicales libres.
Debido a grupos de aldehdos y cetonas por oxidacin. La luz puede ser un catalizador, por eso se debe de proteger.
ANALISIS DE AGUA
Determinacin de contenido de sustancias orgnicas e inorgnicas del agua, control microbiolgico es el ANALISIS DE AGUA.
El agua como impureza es la DETERMINACION CUANTITATIVA DE AGUA.
Diferentes formas de agua:
Agua no enlazada
Higroscpica
Ocluida
Agua enlazada
Hidratacin
Constitucin
HIGROSCOPICA: Se encuentra en la superficie del slido y puede ser eliminada por el calor.
OCLUIDA: Agua que se queda dentro de los cristales cuando se forma el slido, se considera
una impureza.
HIDRATACION: Forma parte de la molcula (hidratos) unida al compuesto mediante enlaces
covalentes.
CONSTITUCION: Agua que se encuentra presente en la muestra aunque se considera
deshidratada (bicarbonato de sodio).
2 NaHCO3 ----------- NaCO3 + H2O + CO2
Mtodos para la determinacin de agua:
DIRECTOS
Volumtricos (Reactivo de Karl Fischer) determina p.p.m., valora agua enlazada y no enlazada,
se emplea en la industris farmacutica y alimenticia; es preciso, exacto, sensible y es el mtodo
primario por excelencia.
INDIRECTOS
Secado trmico se lleva a cabo a presin normal y a presin reducida, valora agua higroscpica y
de hidratacin.
Desecacin se lleva a cabo a presin normal y a presin reducida.
Es un reactivo lquido con yodo, dixido de azufre, metanol y una base (piridina).
Presenta un color mbar (caoba) rojizo-amarillento.
El yodo le proporciona caractersticas oxidantes; ya que el par yodo/yoduro se oxidan y puede
realizarse una determinacin amperomtrica.
En el metanol son solubles los componentes.
Se emplea dimetilformamida y triclorotrifluroetano para los compuestos polares y no polares al
ayudar a la solubilidad de la muestra.
I2 y SO2 presentan reacciones secundarias que hacen que se degrade, se debe por lo tanto
controlar la luz y la temperatura.
DETERMINACION
CH3OH + I2 + SO2 + H2O -------- 2 HI + H2SO4 + BASE
15
Visual
Fotomtrica (500- 550 nm)
Electromtrica (amperomtrica y voltamtrica)
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
La bureta debe de esta seca protegida de la humedad, se controla la temperatura porque vara la
densidad del metanol.
Cuando hay agua se torna incoloro.
Cuando no hay agua est de color caoba.
El CH3OH anhidro es el medio de disolucin.
Se coloca una cantidad conocida de agua, se determina el volumen gastado del RKF y se calcula
el ttulo del reactivo.
Se decolora nuevamente agregando un exceso del reactivo para obtener el color original.
EL tartrato de sodio tiene 15.61 % de H 2O, puede contener agua ocluida; tambin se puede agregar carga pesada en lugar del agua
conocida y realizar lo mismo con el reactivo de Karl Fischer.
COULOMBIMETRIA
Mide la cantidad de corriente que se usa para oxidar in situ yoduros en yodo que reacciona con el agua presente. Un exceso de yodo en
el nodo indica el fin de la valoracin.
Desventajas:
Reacciones secundarias o colaterales con algunos grupos que pueden reaccionar con los componentes del reactivo como aldehdos
y cetonas con metanol formando acetales y cetales ms agua.
Los steres reaccionan con el agua formando metanol y cidos carboxlicos.
Acidos carboxlicos con metanol forman steres y agua.
Otros grupos son aminas, mercaptanos, silanoles, percidos, perxidos, nitritos, sales de estao, sales frricas, sulfitos y tiosulfatos.
Sales de cobre, selenito, telurito, sales de zinc, hidracina y derivados.
Solventes:
Metanol 100%, cloroformo 70% (muestras con aceites), decaol, hexanol, dodecanol al 50 % ayudan a la solubilidad para esencias,
pomadas y cremas. Formamida de 30 50 % en mermeladas, pastas, productos con almidn y azcar.
Ejemplo: se disolvieron 0.5404 g de agua en 50 ml de metanol, se tomaron 5 ml de esta solucin y se aadieron a un matraz erlenmeyer
que contena 20 ml ms de metanol. En la valoracin se consumieron 10 ml del reactivo de Karl Fischer, se corri un blanco de 20 ml del
mismo metanol los cuales requirieron 0.6 ml del reactivo antes mencionado. Calcular el ttulo del reactivo.
20 ml ---------- 0.6 ml
25 ml ---------- x
x = 0.75 ml de RKF
16
x = 17.81 mg H2O
x = 3.56 % de H2O
c) Granulado hay 5% y tomamos 1 g de mta. Cuntos ml del RKF utilizara para valorar el H2O?
5g
x
---------------------
100 g
1g
x = 0.05 g
x = 8.56 ml
x = 4.5 % de agua
Sustancias a las que se les quiere determinar agua y que se descomponen a 100 o 105 C.
Considerar condiciones del desecante (si contiene agua y la muestra est seca, se combina la humedad y el crisol gana agua).
Las caractersticas del desecante son:
Muy estables.
Reversibles.
Inertes.
TERMOBALANZAS
17
Se tiene la balanza con rayos infrarrojos y se determina watts para calentar la muestra.
Se colocan 10g de muestra
Se pueden determinar cantidades de agua y otros componentes que son voltiles a la temperatura de infrarrojo.
AZEOTROPOS
Cromatografa de gases
Resonancia magntica nuclear
U.V
Infrarrojo
CH3COO - + H +
CH3OH -----------------
CH3O- + H +
Ion metxido
18
Distancia crtica: es la distancia mnima necesaria para que existan los pares inicos.
H2O = 79
Ki
Estabilidad.
Fuerza cido - base.
IONOFONOS (HCl ).
IONOGENOS (NaCl).
RNH3+ + CH3COO+
ACIDO Y BASE MAS FUERTES
Se permite la solubilidad de la amina en cido actico porque favorece las propiedades bsicas de la amina el cido actico.
19
Se valora el acetato CH3COO- por ser el cido actico el que se encuentre en exceso.
CH3COO- + H+ ClO4 -------------- CH3COOH + RNH3ClO4
ACIDO
PERCLORICO
NaOH + HCl -----------------------(H2O)
NaCl + H2O
RNH3COO4 + CH3COOH
Efecto nivelador: hace que las sustancias que se encuentren dentro de ella (cidos y bases fuertes) se disocien completamente.
Efecto diferenciador: establece una diferencia al valorar a distintas especies.
VALORES DE
SELECCIN DE INDICADORES
-
Se prefiere valoracin potenciomtrica en lugar de colorida cuando no existe indicador para la base de la valoracin. En Ka menores
a 10-4 por ser cidos dbiles.
Base dbil cido dbil, la sal formada es dbil. El pH lo impone los valores de pKa no la sal.
pH = pKa1 + pKa2
Diferencias con la valoracin cido base:
-
MOLECULAS BASICAS
Ejercicio: Metronidazol P.M. 171.2
El grupo Imidazol es bsico y se valora con un cido.
Acidos en medio no acuoso:
-
p-toluensulfnico.
HClO4 / cido actico anhidro o glacial 0.1 N y 0.5 N (soluciones valoradas, volumtricas o tituladas).
Indicadores ms comunes:
-
20
Estndares primarios:
-
Biftalato de potasio.
Piridina.
Acido actico.
Anhdrido actico.
Mezcla de ambos.
MOLECULAS ACIDAS
Valorantes cidos:
-
Metxido de sodio.
Metxido de litio.
En soluciones anhidras, se preparan en alcohol y benceno.
Estndar primario:
-
Acido benzoico.
Indicadores ms comunes.
-
Fenoftalena.
Timolftalena.
Solventes:
-
Dimetilformamida.
Piridina.
Ejercicio: se disolvieron 150 mg aproximadamente pesados en 30 ml de cido actico glacial, se calent suavemente la disolucin y se
adicionaron 3 gotas de verde de malaquita (SI). Se titul con HClO4 0.1 N, se gastaron 8.8 ml y se corri un blanco el cual gast 0.05 ml.
Cul es la pureza de la muestra?
21
CH3COO- + HCLO4
CH3COOH
CLO4-
Correccin de volumen (volumen gastado menos el blanco) = 8.8 ml 0.05 ml= 8.75 ml de HClO4
8.75 ml HClO4 x [0.1 meq de HClO4 / 1 ml HClO4 0.1 N] = 0.875 meq HClO4
Peso equivalente = 171 .2 g/mol
171.2 mg ------------- 1 meq
x
------------- 0.875 meq
x = 149.8 mg
a)
8.8 ml 0.02 ml = 8.78 ml
8.78 ml HClO4 x [0.0999 meq HClO4 / 1 ML HClO4 0.0999 N] = 0.8771 meq HClO4
284.7 mg ---------- 1 meq
x
---------- 0.8771 meq
x = 249.7166 mg
249.7166 mg /250 mg x 100 = 99.8867 %
b) Marbete 10 mg de diazepam /tableta. Se pesan 40 tabletas y e pso promedio es de 132.1 mg por
tableta. Tomar la cantidad equivalente de 150 mg de diazepam 0.1084 N, se gastaron 4.52 ml de
HClO4 y el blanco de 0.07 ml. Cunto diazepam hay por tableta?
Especificacin de la USP [98.5 100.5 %]
132.1 mg --------- 10 mg
x
--------- 150 mg
x = 1981.5 mg
1.9815 g
x = 137.33 mg
x = 9.155 mg diazepam
------------ 28.47 mg
22
8.77 ml ----------
x = 249.7166 mg
x1 = 1.05 mg H2O
x = 325.54 mg
El analista.
Normalidad del valorante.
Deteccin del mtodo (coloracin del indicador).
Trabajar con base hmeda cuando ya estaba en base seca.
23
Ejercicio: se determin el peso promedio de las tabletas que contenan sulfametoxazol y trimetroprim y fue de 565.6 mg. Se tom una
cantidad equivalente de muestra que contena 300 mg de trimetroprim. Se valoraron con HClO 4 / CH3COOH 0.1080 N y se gastaron
10.4 ml y un blanco gast 0.1 ml.
Qu cantidad se tom del polvo equivalente o de muestra?
Qu cantidad de trimetroprim hay en la tableta?
Si segn el marbete el contenido de trimetroprim por tableta es de 300 mg, decir cul es el % de variacin en el contenido?
565.6 mg ----------- 300 mg
x
----------- 300 mg
x = 565.6 mg
x = 322.9519 mg
x = 7.65 %
muestra
Ejercicio: 30 tabletas con peso promedio de 180 mg se reducieron a un polvo fino y se tom el peso de una tableta, se coloc en un
matraz erlenmeyer y se adicionaron 40 ml de cido actico. Se agreg indicador p-naftolbencena y se titul con HClO4 0.0994 N. La
muestra gast 3.7 ml y para el blanco 0.02 ml.
Cul es el porcentaje de fenitona en la tableta?
Volumen corregido = 3.7 ml 0.02 ml = 3.68 ml
Fc = 0.0984 N / 0.1 N = 0.984 (3.68 ml) = 3.6211 ml
1 ml 0.1 N ------------ 27.43 mg
3.6211 ml -----------x
24
Cul es el pH de la solucin?
H2SO4
+
98
784 mg
2 NaOH
2(40)
80 mg
---------------
Na2SO4
2 H2O
Se requiere de un estndar microbiolgico para la inhibicin; se expone el cultivo en diferentes condiciones para ver si hay un
microorganismo patgeno; se controla el proceso de esterilizacin para buscar la presencia de microorganismos (bacterias, virus,
levaduras).
En el caso de Microbiologa:
Controlar medio de cultivo. Se realiza prueba de promocin de crecimiento en los nutrientes (selectivos y no selectivos) y en el
pH.
En el microorganismo (se requiere de un estndar perfectamente reconocible cepario ATCC).
VALORACION DE ANTIBIOTICOS
Se controla el pH y la viscosidad del medio. Los mtodos por los que se puede realizar son.
Por difusin: se utiliza cuando el antibitico es puro o difunde bien en un medio de cultivo slido.
Turbidimtrico: se realiza en medio de cultivo lquido.
DIFUSION
Es el mismo principio de los antibiogramas. Los factores que lo afectan son:
-
Gradiente de concentracin.
Temperatura.
Viscosidad.
Presin.
25
pH.
Tamao de la molcula.
Potencial.
Grosor del agar.
La potencia del antibitico es en UI o mcg/ mg muestra. El reservorio es un disco de fibra de vidrio estril que lleva cilindros huecos con
un volumen constante llamados PENICILINDROS.
Se realiza la incubacin y se mide el dimetro del halo de inhibicin que vaa depnder de la potencia del antibitico para inhibir el
crecimiento del microorganismo.
De acuerdo a la Regulacin del Cdigo Federal CFR marca que el ensayo sea Ensayo en placa pequea por interpolacin
mediante una curva estndar que contenga al menos 5 puntos por triplicado, el microorganismo estandarizado y el antibitico estndar.
Se realiza la regresin lineal para conocer la interpolacin de la concentracin y no se permiten las extrapolaciones.
MODELO
ln Co inicial = ln C mnima +
y2 / 4 Dto
ln Co
= 1 / 4
Dto
ln C mnima
Y2
Donde:
D = coeficiente de difusin del
to = tiempo crtico, tiempo mnimo
antibitico (mm/hr)
de inhibicin.
La concentracin de inhibicin
mnima en mcg/ml debe ser igual a la
concentracin de referencia del
estndar 3.
A partir de la concentracin mnima y potencia del estndar se prepara la concentracin.
A cada una de las placas se les coloca tres penicilindros con la concentracin de referencia CR y tres penicilindros con la concentracin
del estndar respectiva.
PREPARACION DEL MICROORGANISMO
-
Cepa pura es liofilizada y se reconstituye con caldo lactosado, el sembrado es en tubo inclinado mediante estra, se incuba 24 horas
antes de usarse.
Suspensin del microorganismo se realiza en agua, solucin buffer o solucin isotnica, se agita el tubo y se lee en la celda
espectrofotomtrica a 530 nm de transmitancia .
CAPA BASE es la primera capa que se coloca en la caja de Petri con 20 ml de agar aproximadamente, esta capa no contiene al
microorganismo.
CAPA SIEMBRA es la segunda capa y es la que contiene al microorganismo, se colocan aproximadamente 4 ml.
X Ref = X ref / n
26
Ejercicio:
C1
0.178
CR
0.534
C2
0.356
CR
0.534
C4
0.801
CR
0.534
C5
1.335
CR
0.534
CMTA
[mcg/ml]
CR
0.534
o (mm)
127.8
142.8
133.5
140.1
149.2
142.1
184.5
141
139.3
141.1
14.2
15.87
14.83
15.57
16.58
15.79
17.17
15.67
15.48
15.68
Fc
-0.154
0.146
-0.074
0.046
0.036
Xc
14.046
14.976
16.506
17.216
15.516
Xc (mm)
14.046
14.976
15.716 ------ Xref
16.506
17.216
r2 = 0.9951
b = -10.33
m = 0.6162
[mcg / ml]
0.178
0.356
0.534
0.801
1.335
ln Co
-1.7259
-1.0328
-0.6274
-0.2219
0.2889
y = mx + b
y = 0.6162 (15.516) + (-10.33) = -0.77
e-0.77= 0.462 mcg / ml
0.462 mcg / ml X [vol. mta ml / alcuota ml ] X [vol. ml / alicuota ml] X [vol. ml /peso mta] =
mcg de principio activo / ml de muestra
27
Estabilidad.
Crecimiento.
Blanco.
Para las mezclas de antibiticos se deja un antibitico activo y otros se inactivan con enzimas o mediante dilucin, filtracin o extraccin
como mtodos qumicos.
METODOS MICROBIOLOGICOS
-
Control microbiolgico.
Esterilidad.
Cuentas microbiolgicas.
CUENTAS MICROBIOLOGICAS
METODOS
NMP (nmero ms probable).
Cuenta en placa.
Los dos van a depender de la naturaleza qumica .
CUENTA EN PLACA
Se requiere de un medio de cultivo altamente nutritivo, el medio requiere anteriormente promocin de crecimiento. Se hace una dilucin
1/ 100 ml de agua, solucin salina fisiolgica o agua peptonada previamente estriles.
Se utilizan al menos tres cajas para cada muestra con 20 ml cada una, antes de que el medio solidifique se coloca 1 ml de la muestra, se
agita y la muestra queda inmersa MTODO DE INMERSION.
Se toma una caja como blanco, las dems se incuban a 34 C por 72 horas al menos. Se dejan 3 cajas como blanco a temperatura
ambiente de 20 25 C durante 5 das.
Si el blanco se contamina la prueba no sirve y se tiene que volver a repetir. Se cuentan las unidades formadoras de colonias (UFC)
en un cuenta colonias que tiene 10 cm3, se saca el promedio de 10 y se multiplica por 64 cuadritos. Otras pruebas se hacen en campana
con 1000 ml3 de aire.
Las bacterias no permisibles para la cuenta microbiolgica son: Enterobacterias, E.coli, Pseudomona aeruginosa, Salmonella, Candida
albicans y Staphylococcus aureus.
Los microorganismos se aislan y se siembran en agar soya tripticasena, se colocan en cajas con medios selectivos; por ejemplo: E. coli
en verde brillante o McConkey, Staphylococcus aureus en sales manitol, etc. Posteriormente se hacen las pruebas bioqumicas.
El anlisis se hace en materia prima, producto subterminado y producto terminado.
CUENTA EN TUBO
TABLAS DE NMP
28
1 / 10
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
1 / 100
3
3
3
3
2
2
2
2
1
1
1
1
0
0
0
0
1 / 1000
3
2
1
0
3
2
1
0
3
2
1
0
3
2
1
0
NMP
PRUEBA DE ESTERILIDAD
Se realiza en productos ticos, oftlmicos e inyectables que se aplican por va intramuscular e intravenosa.
Los dos mtodos son:
Prueba directa
Prueba indirecta
PRUEBA DIRECTA
Se consideran el medio fluido de tioglicolato para microorganismos anaerobios y el medio fluido
microorganismos aerobios. Los medios selectivos con indicador redox o pH.
La prueba tambin se aplica para gasas y material quirrgico previamente estril.
PRUEBA INDIRECTA
Se utilizan los mismos medios de cultivo, se considera para la muestra:
-
29
In vivo.
In vitro.
In vivo
Se emplean conejos; ya que la dosis umbral de pirgenos para producir reaccin febril es la misma para conejos que para humanos.
Una de las ventajas es que puede detectar cualquier tipo de pirgenos.
PIROGENOS: cualquier producto del metabolismo microbiano que al ser administrada por va
intramuscular e intravenosa produce reaccin febril tanto en conejos como en
el hombre.
La seal analtica es la fiebre en el conejo, el pirgeno en sangre hace que se libere histamina la cual desencadena la reaccin.
La respuesta es la reaccin febril con temperatura > 0.6 C.
La ruptura de la pared de los Gram (-) est formada por el lipopolisacrido que da lugar a la reaccin febril, el (LPS) es la endotoxina.
Los conejos detectan cualquier sustancia, incluyendo partculas como metales, vidrio, pelusas o la qumica.
La eleccin de los conejos se debe a:
-
Cuando se realiza la prueba por primera vez se seleccionan 5 conejos, se les toma la temperatura basal al menos 90 minutos antes de la
prueba en intervalos de 30 minutos con termopares que contienen sensor de temperatura para el recto con +/- 0.1 C.
Se registran las temperaturas para saber si es constante, no debe haber un incremento de 0.6 C; el medicamento se administra por la
vena marginal de la oreja del conejo de acuerdo a la USP son 10 ml/ Kg de peso respecto al agua. El tiempo de administracin debe
ser menor a 10 minutos. La duracin de la prueba es de 5 horas y el material a utilizar es apirognico.
En caso de que los animales sean nuevos los pirgenos pueden casar tolerancia; de acuerdo a la USP se deben de mantener a las
mismas condiciones y se realiza una prueba en blanco que consiste en someterlos una noche anterior sin alimento, se registra la
temperatura durante 3 horas y lo que no se realiza es la inyeccin.
Para inyectables, estriles y apirognicos si no se aproxima 5 unidades de endotoxinas por peso no hay reaccin febril. Despus de
tener la temperatura se realiza la interpretacin de la prueba de la siguiente manera:
-
In vitro
De acuerdo a la USP es una prueba para endotoxinas, contaminacin de grmenes Gram (-). Es un mtodo relativamente nuevo pero su
desventaja es que solo detecta endotoxinas. En un principio se realiz para el agua pero ya se aplica tambin para materia prima,
medicamentos e instrumental.
La prueba se realiza mediante el LAL (lisado de amebocitos de Limulus poliphemus), se extrae el amebocito y el lisado contiene el
pptido y una enzima que se llama procoagulasa.
LAL (coagulgeno) + [ endotoxinas] + [ Ca+2] ----------- procoagulasa -------- GEL
Se controla la temperatura a 37 C y pH de 7 por 1 hora. El lisado se realiza en tubos apirgenos a los cuales se les adiciona la
muestra, se colocan en bao de agua, se sacan y la GEL debe de formarse intacta.
-
30
Se realiza una curva de calibracin para encontrar la mnima cantidad de formacin de GEL y es por triplicado. Se hace un control
negativo con agua apirognica y un control positivo con la concentracin mnima que forma la endotoxina.
PRUEBAS MISCELANEAS
Se emplean para:
Verificar la va de administracin.
Forma farmacutica.
TOXICIDAD AGUDA
Es exclusiva para antibiticos y se realiza en ratones que no sean utilizados anteriormente, recin nacidos con 17 g de peso; se utilizan
al menos 15 ratones. La observacin se hace despus de 24 y 48 horas. Si un ratn se muere antes de 48 horas se repite la prueba con
15 ratones nuevos pero ahora con un peso de 19 g de peso. La solucin se administra por la cola de los ratones.
IRRITABILIDAD
EN OJO
Se realiza para productos oftlmicos como pomada de terramicina, gotas y productos que por accidente caen en los ojos como tintes,
shampoo, acondicionadores, spray para el cabello, maquillaje, etc. Se utilizan 5 conejos y la cantidad demuestra que se coloca si es
slido son 100 mg, si es lquido 0.1 ml o 100 L ; se aplica en el saco conjuntival en un ojo, el otro ojo sirve de blanco.
Despus de la aplicacin se vigila a los conejos durante 10 das. Se observa dao leve como irritacin hasta un dao en la pupila o
crnea. Se clasifican desde 0 hasta 3 dependiendo del grado e irritabilidad.
EN PIEL
Para productos utilizados en piel daada por cortaduras o quemaduras. La prueba se realiza en ratas o conejos. Se lacera la piel y se
aplica el medicamento, se coloca un parche y se observa si hay una irritacin o lesin ms grave.
SENSIILIDAD EN PIEL
Se realiza para protectores solares, desodorantes, piel, talco, jabn y aceite de bebs. La prueba se determina en conejos y ratas sin
estrato crneo de la piel, se les coloca el parche y se observa durante tres veces al da. La respuesta es desde enrojecimiento a
hinchazn o prurito.
Se realiza para todos los intravenosos en perros a los cuales se les extrae muestra de la yugular. La muestra se les administra en la
pata. Como resultado se observa si la formulacin no causo lisis y que le sucedi a la vena con el producto como hinchazn, eritema,
inflamacin, enrojecimiento, etc.
SUPOSITORIOS Y OVULOS
Se realiza en conejos y ratas a los cuales se les aplica el producto en el recto y se sutura, despus se sacrifica al animal y se observa si
hay inflamacin, enrojecimiento, acumulacin de lquidos o necrosis.
GLANDULAS MAMARIAS
La prueba se realiza en ratas lactando a las que se les aplica el frmaco en las glndulas considerando unas como control. Se les retira
a las cras un da antes de la prueba; se aplica de la muestra 0.1 g 1 g con diferentes dosis requirindose para cada dosis 10 animales.
Se observa a las 24, 48 y 72 horas. Se sacrifican y se observa si la glndula presenta hinchazn, necrosis e irritacin.
CROMATOGRAFIA
Es una tcnica de separacin, identificacin y cuantificacin en la cual se requiere de una sustancia de referencia (patrn interno o
externo).
El sistema cromatogrfico est formado por 3 partes:
-
Fase estacionaria.
Fase mvil.
Muestra.
De acuerdo al fenmeno que se realiza cuando se lleva a cabo l separacin se clasifica en:
31
Solubilidad.
Polaridad.
Tamao.
Carga.
32
FASE MOVIL
Estabilidad qumica.
No interaccione con la fase estacionaria (lquido/ lquido).
El analito o la muestra debe de estar soluble en la fase mvil. Debe de cumplirse que la muestra permanezca mucho ms tiempo en
la fase mvil que en la fase estacionaria.
Polaridad y solubilidad depende de la muestra y tipo de cromatografa.
Alta pureza.
Solubilidad para la eleccin de la fase mvil y fase estacionaria.
Deteccin de la muestra (que propiedades se le pueden medir, cmo se puede revelar; propiedades espectrofotomtricas, de
fluorescencia).
ESTANDARES
Muy puro.
Poco higroscpico.
Estable (que no reaccione con otros componentes).
Se denomina COLEO al pico cromatogrfico no simtrico que se desva a la derecha e izquierda y se debe a la alta concentracin de la
muestra.
El tiempo de retencin es igual par la misma velocidad de flujo, muestra y fase mvil.
El ancho de la banda (w) depende de la teora cintica de la cromatografa con la ecuacin de Van Deemter.
Durante el proceso se llega a un equilibrio que depende del coeficiente de particin influenciado por la temperatura, pH, fuerza inica,
constante dielctrica del solvente y otras. Se lleva a cabo de forma contable surgiendo la teora del plato terico.
PLATO TEORICO (N): es el espacio en el cual se lleva a cabo el equilibrio, determina la
eficiencia del sistema (a mayor N mayor eficiencia).
ALTURA EQUIVALENTE DEL PLATO TEORICO (H = AEPT): se refiere al grosor o altura de la interfase (a menor altura mayor
eficiencia).
AMBOS DETERMINAN EFICIENCIA DE LA EXTRACCION.
En una extraccin hay la interaccin entre la fase acuosa y la fase orgnica (entre mayor interaccin hay mayor separacin). El proceso
es discontinuo y contable.
TEORIA CINETICA
33
Difusin en remolino. Se disminuye con tamao homogneo e partcula, geometra y fase estacionaria. Se mantiene constante por
una baja concentracin, lo que permite una interaccin mejor que conlleva a una separacin ms rpida y mejor.
Difusin longitudinal.
Transferencia de masa.
H = A + B / U + Cu
Donde:
A = constante
B = difusin longitudinal.
C = transferencia de masa
U = velocidad de flujo de fase mvil.
DIFUSION LONGITUDINAL (B)
B = 2 D
M
= factor de obstruccin de 0.5 a 0.9
DM = coeficiente de difusin del soluto
Cuando asciende la separacin difunden en primer plano las partculas que estn hasta el frente y son las que forman el pico de avance.
Depende del contacto de la fase mvil por el soluto y de la afinidad del soluto por la fase mvil y estacionaria, caractersticas del soluto y
la velocidad de la fase mvil.
Se debe de:
-
El es el impedimento que pone la fase estacionaria para que pase el soluto, le opone cierta resistencia que depende del empaque y
tamao de la partcula.
A mayor velocidad de flujo menor efecto de difusin longitudinal. Son inversamente proporcionales.
TRANSFERENCIA DE MASA (C)
Se habla de pseudoequilibrios porque es poco el tiempo que permanece la fase mvil con la muestra en la fase estacionaria.
A mayor velocidad de flujo mayor altura.
Velocidad de flujo ptimo:
-
Menor altura.
Mejor efecto de masa.
Menor efecto longitudinal.
altura
Donde:
tR = tiempo de retencin, tiempo de soluto en columna.
w = ancho de banda.
L = longitud de fase estacionaria.
Resolucin: dos picos perfectamente delimitados y separados. RS > 1.5
Cuando la resolucin es igual a 1 se dice que hay separacin pero no hay resolucin.
El fenmeno de adsorcin se da porque tanta muestra se coloca para la separacin; se forma una estela o bolero cuando hay mucha
muestra.
El fenmeno de particin se da cuando la fase mvil y estacionaria son lquidas; si depende de la concentracin se comporta de
diferente manera por lo que tiene que ser independiente.
La cromatografa es lineal cuando no depende la particin de la concentracin y cuando hay bajas concentraciones.
ISOTERMAS: arriba de la cromatografa lineal son cncavas y convexas y saturan el sistema.
34
Rs = 2 (tR B tR A) / wA + wB
Eficiencia del sistema cromatogrfico se debe a:
H (es la mejor)
N
RS
CROMATOGRAFIA PLANA
-
Ascendente.
Descendente.
La fase mvil migra por gravedad la fase estacionaria migra por capilaridad.
En el fenmeno de adsorcin lo importante es la polaridad de la fase normal; ya que lo menos polar es lo primero que sale, lo ms polar
tiene mayor afinidad por la fase mvil.
La activacin consiste en meter a la placa a cierta temperatura para la salida del solvente con agua. En la desactivacin es con etanol o
metanol.
La fase mvil se selecciona por la fuerza eluitrpica, la polaridad de la muestra y la fase mvil.
Factor de retardo
Rf = distancia que recorre la muestra / distancia que recorre fase mvil
El factor de retardo debe ser menor a 1. Cuando es igual a cero no hay migracin y cuando es igual a uno se dice que la muestra migr
con el frente de solvente.
CUANTIFICACION
-
La muestra es cuantitativa.
Se realiza por densitometra (se realiza un scanner de todas las muestras leyndose en nanolitros, se procede a la curva de
calibracin de estndares a diferentes concentraciones para determinar cuanto hay y que hay). Es un mtodo empleado en la
HPTLC (cromatografa en capa fina de alta resolucin).
REVELADO
Los tipos de reveladores que se utilizan son:
CROMATOGRAFIA DE PARTICION
Para la cromatografa en columna, la ms usada es la reversa.
K = CS / Cm
Donde:
K = constante de particin.
CS = concentracin de soluto en fase estacionaria.
Cm = concentracin de soluto en fase mvil.
-
FACTOR DE SELECTIVIDAD
35
= tR B / tR A
Donde:
factor de selectividad, debe ser menor a 1; ya que indica si es factible la separacin.
FACTOR DE CAPACIDAD (K)
Indica que tan factible es que se lleve a cabo la separacin. Hay diferentes maneras para calcularlo.
K (Vol. de fase estacionaria) / (Vol. de fase mvil)
tR t0 / t0
Q E / QM
En la fase estacionaria se colocan C18, C12, C8, C6, C4 que depende de la solubilidad de la muestra.
Se determina:
-
H
N
Rs
Area bajo la curva mediante el mtodo de los trapecios y formando un tringulo issceles.
CROMATOGRAFIA DE IONIZACION
Mediante la ionizacin se controla el pH de la muestra.
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
Se usan resinas de intercambio inico fuertemente cidas y no fuertemente cidas (grupos tipo cido carboxlico); resinas fuertemente
bsicas contienen derivados de sales cuaternarias de amonio y grupos amino de fuerza moderada.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR
Interviene el tamao o peso molecular de las molculas, la separacin se debe al radio de Stokes. Se usa una matriz que es un gel; por
ejemplo los biogeles que son poliacrilamidas, superdex agarosa con dextrano, geles de celulosa, etc; que consisten en partculas
huecas cuya superficie es una red o malla de tamao controlado.
Se da un entrecruzamiento de malla donde las partculas grandes salen por fuera y las pequeas por el hueco. Primero salen las de
mayor tamao y las ms pequeas son las ltimas. Ocurre un hinchado de la gel o de la malla porque las partculas esfricas huecas
van a la superficie.
Ejercicio: Se ha encontrado que la sustancia A y B tienen un tiempo de resolucin de retencin de 16.4 y 17.63 minutos en una columna
de longitud de 30 cm. Un compuesto no retenido de 1.3 minutos. Los anchos de pico fueron de 1.11 y 1.21 mm.
Calcular:
Nmero medio de platos tericos en columna.
Altura promedio del plato terico.
Resolucin de los 2 picos.
Cul sera la longitud de la columna necesaria para una resolucin de 1.5?
17.63 1.3 = 16.33
16.4 1.3 = 15.1
N = 16 (15.1 / 1.11)2 = 2960.93
N = 16 (16.33 / 1.21)2 = 2914.22
N = 2960.93 + 2914.22 = 5875.15 / 2 = 2937.57
H = 30 / 2937.57 = 0.0102 cm
Rs = 2 (17.63 16.4) / 1.11 + 1.21 = 1.060
N1 / N2 = (Rs1)2 / (Rs2)2 = (1.06)2 / (1.5)2
2937.57 / N2 = (1.06)2 / (1.5)2
N2 = 2937.57 (1.5)2 / (1.06)2 = 5882.46
36
H=L/N
L = HN
INYECTOR
FLUORESCENCIA
Los mtodos analticos quimioluminicentes son:
Fosforescencia.
Fluorescencia abarca espectro de absorcin y espectro de emisin.
La molcula en estado basal absorbe energa y pasa al estado de excitacin con diferentes niveles.
ABSORCION = de estado basal a singulete excitado (S*).
EMISION = de singulete excitado a estado basal.
La fluorescencia es de singulete excitado a estado normal.
La absorcin presenta longitudes de onda pequeas. Se emplea la ecuacin:
E=hC/
Donde:
E = energa
h = constante de Planck
FOSFORESCENCIA
El singulete normal de molculas se excitan pero no llega a singulete excitado sino a triplete excitado (T *). La fosforescencia es
de triplete excitado a singulete normal.
El T* es un nivel ms bajo que el S*.
De S* a T* es un paso no permitido; se permite nicamente si se lleva a cabo por un fenmeno diferente a la emisin de luz; por ejemplo:
calor.
La fluorescencia es de 10-4 y 10-8 segundos y no se ve a simple vista ya que se absorbe suficiente energa. La fosforescencia no depende
de la fuente de energa, se observa a simple vista y puede durar hasta varios das.
RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA
= cantidad de fotones emitidos / cantidad de fotones absorbidos
Tiende a 1 pero nunca va a ser igual. A > < energa; en emisin hay menor energa que en absorcin.
FENOMENO DE FLUORESCENCIA
F = IF = Io 2.3 E l C
------ K -----
37
Donde:
Io = intensidad de luz para que absorba.
E = coeficiente de absortividad.
IF = intensidad de fluorescencia.
l = longitud de paso de luz.
IF = K C
y = mx + b
Es lineal a bajas concentraciones (10-4 M). El fenmeno depende de Io para que suban a un estado de excitacin y emitan. A bajas
concentraciones hay pocas molculas, la luz impacta sobre todas por lo que se excitan y florecen. Se detectan cantidades pequeas
porque no todas fluorecen. Es selectivo y ms sensible que UV, al depender de la luz sensibilizan ms.
Impacta el medio de disolucin y pH mientras que la temperatura ayuda a la fluorescencia.
Es til para muestras con grupos heterocclicos, molculas planas y molculas con dobles ligaduras.
El espectrofluormetro al incidir la luz tiene un filtro donde detecta nicamente la luz emitida a un ngulo de 90 con lo cual lee la luz
transmitida en otra posicn.
Para la deteccin fluoromtrica se requiere estandarizar con sulfato de quinina 0.2 M en cido sulfrico o rodamina.
Se valora la calidad del espectrofotmetro con:
-
Dicromato de potasio.
Permanganato con alta pureza.
Osmio.
Benceno.
Ejercicios: Cromatografa de lquidos en fase inversa para el propanolol con un P.M. 259.35. Utilizando protiptilina como estndar interno
y un detector de fluorescencia.
Fase estacionaria C18.
Fase mvil: metanol / H2O / cido fosfrico
Velocidad de flujo 1 ml / min.
Detector de fluorescencia de excitacin o absorcin 293 nm.
de emisin 375 nm
Preparacin de la muestra: despus de una serie de extracciones con una mezcla de hexano y alcohol isoamlico a 1 ml de plasma
aadido de 20 L de estndar interno de una cncetracin de 1 mg / ml, el extracto obtenido se evapor a sequedad y se reconstituy
con 20 L de metanol, de stos 10 L se inyectaron en el cromatograma.
Preparacin del estndar: a 1 ml de plasma limpio (sin frmaco) se le agregaron 20 L del estndar de concentracin de 1 mg / ml ms
9.25 g / ml de un estndar de propanolol. Se trata de la misma forma que la muestra.
Calcular la concentracin de propanolol en la muestra de suero. Resolver por alturas.
Cromatograma de solucin muestra: propanolol 1.5 cm
A 11 cm.
Cromatograma de solucin estndar: popanolol 9.5 cm
B 11 cm.
9.25 g ----------- 1 ml ------ 10 L
x
---------- 20 L
x = 4.625 g propanolol
x = 0.7303 g propanolol
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A estndar interno.
B metabolito (desmetilgriseofulvina).
C griseofulvina.
a)
0.5 mg / ml x (1000 g / 1 mg) x (1 ml / 1000 L) = 0.5 g / L
0.5 g / L x 5 L = 2.5 g
g ------------ 13.8 cm
x ------------ 15 cm
x = 2.72 g
2.72 g / 3 ml = 0.906 g / ml
b)
0.906 g ------------ 1 ml
x
----------- 200 ml
c)
Aquel en el cual la fase mvil cambia de composicin y de proporcin; desde 100 % de A y 0 % de B hasta 0 % de A y 100 % de B. Se
necesitan 2 bombas necesariamente.
Ejercicio:
tR
1=3
2=5
3=8
4 = 10.5
5 =14
6 = 18
W
1 = 0.5
2 = 0.5
3 = 0.7
4 = 0.8
5 = 1.1
6 = 1.4
Calcular N para 3, 4 y 5.
N = 16 (8 / 0.7)2 = 2089.79
N = 16 (10.5 / 0.8)2 = 2756.25
N = 16 (14 / 1.1)2= 2591.73
Calcular la resolucin entre 3, 4 y 4, 5.
Rs = 2 (10.5 8 ) / 0.8 + 0.7 = 3.33
Rs = 2 (14 10.5) / 1.1 + 0.8 = 3.88
Ambas presentan una resolucin excelente por ser arriba de 1.5
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x = 1.340 g
x = 1.42 g
Ejercicio: se valor clorhidrato de tiamina (que fluoresce) P.M. 337.27 g / mol. Contenido en tabletas disolviendo el equivalente del peso
medio en 200 ml de HCl 0.2 N.
Se filtr la solucin y se tom 1 ml, se llev a un aforo de 50, se tom 1 ml y se afor a 25 ml. Se prepar el estndar de clorhidrato de
tiamina a 0.23 g / ml. En 2 tubos marcados como estndar y problema se colocaron 5 ml, 3 ml de agente oxidante (ferricianuro de
potasio) y despus se le adicionaron 20 ml de alcohol isobutlico. Se agita la muestra y se mide fluorescencia en capa orgnica en
celdilla de 1 cm.
Lecturas STD 0.980 UF
Problema 0.93 UF
x = 0.2111 g / ml
x = 5.278 g
5.278 g ----------- 1 ml
x
----------- 50 ml
x = 263.9 g
263.9 g ----------- 1 ml
x
----------- 200 ml
Ejercicio: se desea saber que cantidad de pesticida hay en una fruta. Cromatografa en placa y fluorescencia. Pesar 0.5 g de fruta, lavar
para disolver pesticida, el solvente del lavado se lleva a sequedad, el soluto que queda se redisuelve en 1 ml de solvente. Del ml se
toman 100 L se colocan en placa cromatogrfica, se corre la muestra y lo que hay en la mancha se redisuelve en 100 ml de etanol. Se
lleva al fluormetro con 47.5 UF y un blanco lee 3 UF. Un estndar de 5 g de pesticida bajo las mismas condiciones da una lectura de
87 UF.
Calcule cantidad de pesticida por p.p.m.
5 g / 1 ml x ( 1 ml / 1000 L) x (100 L) = 0.5 g
0.5 g ---------- 87
x
--------- 44.5
x = 0.255 g
0.255 g x 10 = 2.55 g
2.55 g --------- 0.5 g
x
-------- 1 g
Ejercicio: determinar selenio en una muestra e leche. Se toma leche en polvo 755.4 mg leche se diluyen 10 ml (Sol. A). Se le adiciona a
la solucin 2, 3-diaminonaftaleno para formar complejo fluorescente; da 27.8 UF.
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1 ml de solucin estndar de selenio cuya concentracin es de 0.5 g / ml se diluyeron en 10 ml (Sol. B). Se le adicion 2, 3diaminonaftaleno y se form el complejo fluorescente. Da una lectura de 66.4 UF.
Calcule contenido de selenio por cada 100 g de leche.
0.5 g --------- 66.4
x
--------- 27.8
x = 0.2093 g
UF
Y
0.5
r2 = 0.9703
b = 0.1667
m = 2.9462
0.2
0.4
0.8
0.1
0.2
0.4
1.6
2.4
0.8
x = 0.062 g
REFRACTOMETRIA
Es una medicin en forma de luz. Su base es en el fenmeno de refraccin donde se mide el ngulo que se forma debido a la refraccin
de la luz al hacer incidir un rayo de luz y pasar de un medio a otro medio.
El ndice de refraccin sirve para:
-
Pureza.
Identidad.
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