Universidad Nacional Autónoma de Honduras
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FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGA
PRCTICA # 1
GRUPO # 7
INTEGRANTES: Abner Obed Cortez 20081006955
Lessi Sarah Morales - 20101005925
OBJETIVOS
1. DESCRIBIR EL FUNDAMENTO DE LA TCNICA DE EXTRACCIN DE
CIDOS NUCLICOS.
2. IDENTIFICAR UN MTODO DE EXTRACCIN DE CIDOS NUCLICOS
DE EUCARIOTAS.
3. CONOCER LA FUNCIN DE LA CADA UNO DE LOS REACTIVOS
UTILIZADOS.
INTRODUCCIN
EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ADN
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la
mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de
recombinacin de ADN.
A continuacin se recogen los principios de algunos de los mtodos de extraccin y
purificacin de cidos nucleicos que ms se emplean en la actualidad.
Mtodos de extraccin: El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un
equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material
inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar
el cido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los
siguientes:
Rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.);
Tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.);
Digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).
Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al
mismo tiempo.
Mtodos de purificacin: Los mtodos empleados para purificar los cidos
nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o ms tcnicas de
las siguientes:
Extraccin/precipitacin: A menudo se efecta una extraccin con disolventes para
eliminar los contaminantes de los cidos nucleicos.
Cromatografa: Pueden emplearse diversas tcnicas cromatogrficas de separacin;
permeacin sobre gel, intercambio inico, adsorcin selectiva o unin por afinidad.
Centrifugacin: La centrifugacin selectiva constituye un mtodo de purificacin
eficaz.
Separacin por afinidad: En los ltimos aos, cada vez son ms los mtodos de
purificacin que combinan la inmovilizacin por afinidad de cidos nucleicos y la
separacin magntica.
Mtodo de extraccin y purificacin con CTAB
El protocolo del mtodo del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado
por Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado
posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El
mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos
derivados de vegetales y est especialmente indicado para eliminar los polisacridos
y los compuestos polifenlicos, que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y,
por tanto, su calidad.
Principios del mtodo del CTAB: lisis, extraccin y precipitacin
Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico que forma un complejo
insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los
polisacridos, los compuestos fenlicos y los dems contaminantes permanecen en
el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado.
MATERIALES Y EQUIPOS
1. MICROTUBOS 1.5 mL
2. MICROPISTILOS
3. MICROPIPETAS
4. PUNTAS PARA MICROPIPETAS
5. MICROCENTRIFUGA
6. PLATO CALIENTE
7. MATERIAL VEGETAL
DISCUSIN
Una vez entregado el material vegetal se procede a la manipulacin y corte del mismo,
en este paso se eliminan totalmente sus nervaduras y se disminuye su tamao, estos
pasos con 2 propsitos: cortar la fuente de alimentacin de la hoja, para as evitar
interferencia de los metabolitos presentes en ella; aumentar la superficie de contacto con
el disolvente y mejorar la maceracin del proceso, una vez hecho esto se procede a
introducir los fragmentos de la hoja y luego agregar el CTAB 2%(1 mL), esto por varias
razones: el CTAB es un detergente inico, esto da como resultado la formacin de un
complejo de impurezas del material que se observar en el sobrenadante, tiene como
principio bsico el de todos los detergentes, que sus micelas actan atrayendo las
impurezas de la solucin ests por tener igual estructura qumica que ellas cabezas
hidrfilas y colas hidrfobas, que ser descartable ms adelante en el lavado. Luego de
macerar durante 15 minutos, se coloca en incubacin por 40 minutos en 64 C este paso
usndose como catalizador de la reaccin, luego de ello se procede agregar una solucin
en proporcin de 24:1 Cloroformo:Octanol (500 MicroL) para la separacin de las
fases, ya que este compuesto tiene la facilidad de volver insolubles las protenas o
inclusive desnaturalizar las mismas dentro de la reaccin, volvindolas impurezas
dentro de la solucin. Luego se transportan los microtubos a la microcentrifugadora,
centrifugamos por 15 minutos a 10, 000 RPM ya equiparada, pasado este tiempo y al
sacar los microtubos se concluye extrayendo la fase acuosa quedando el residuo del
material vegetal por debajo del tubo, transferidos estos microlitros (400-600 MicroL) de
la fase acuosa a un tubo nuevo, procederamos agregar isopropanol fro (600-800
MicroL) para precipitar el ADN y adems de ello elimina compuestos anteriores que
podran interferir dentro de nuestro extracto, luego de ello se transporta de nuevo a
centrifugar pero esta vez por 10 minutos y a 14,000 RPM, al pasar de estos minutos
descartamos el sobrenadante y teniendo mucho cuidado de no descartar el Pellet
formado, concluido ello agregamos Etanol al 70% fro (450 MicroL) para lavar el pellet
y as evitar cualquier tipo de impurezas de los anteriores lavados y posibles residuos del
sobrenadante anterior, luego se elimina y sus restos se evaporaran a TA o 60 C,
agregamos agua destilada (60-120 MicroL) y almacenamos para su posterior uso, el
cual puede ser:
1. Clonaje
2. Amplificacin: cadena de polimerasa PCR
3. Secuenciacin. (2)
CUESTIONARIO
1. Investigue los siguientes trminos:
EDTA
CTAB
CLOROFORMO
Es un lquido incoloro con un olor dulce y agradable. Se utiliza como disolvente y para
fabricar refrigerantes, resinas y plsticos. Ya no se usa como anestsico.
El umbral del olor es de 2.4 85 ppm, varia mucho, ya que no depende solo del olor
solamente, sino que determina tambin su exposicin potencialmente peligrosa. Es
potencialmente carcingeno y al incendiarse es produce gases txicos.(12)
OCTANOL
ETANOL
Conocido como alcohol etlico, es un alcohol que se presenta como un Lquido incoloro
e inflamable con un punto de ebullicin de 78 C. Al mezclarse con agua en cualquier
proporcin, da una mezcla azeotrpica. Su frmula qumica es CH3-CH2-OH, principal
producto de las bebidas alcohlicas como el vino (15% aproximadamente), la cerveza
(5%) licores (hasta 50%). Se usa como disolvente altamente polar, de sabor dulce por su
caracterstica cida.
Es producido por la fermentacin de plantas de azcar, maz y otros productos de grano
en Latinoamrica maz y otros productos de grano, en Latinoamrica principalmente de
caa de azcar. Para su uso comercial e industrial, siempre es desnaturalizado (es decir,
se le adicionan pequeas cantidades de substancias nocivas para evitar su mal uso como
bebida alcohlica.(9)
ISOPROPANOL
AGUA DESTILADA
Es aquella que como todo tipo de agua esta compuesta por dos tomos de hidrgeno y
uno de oxgeno, cuya molcula se representa qumicamente por la frmula H2O y que
mediante el proceso de destilacin se le han eliminado las impurezas e iones. Incolora,
inodora y sin sabor, solvente universal.
La destilacin se usa para purificar el agua desde hace mucho tiempo, en este proceso
los contaminantes disueltos tales como las sales disueltas se quedan en el tanque donde
el agua hierve, mientras que el vapor de agua libre de impurezas se eleva hacia fuera.
Puede no funcionar si los contaminantes son voltiles, como el alcohol disuelto, en estos
casos los contaminantes tambin hierven y se recondensan. (12)
CLON
La palabra clon (el trmino se debe a J. B. S. Haldane, 1963) procede del griego, y
significa brote, retoo o esqueje, y tambin multitud. Por clonacin se
entienden los procedimientos tcnicos (artificiales) dirigidos a conseguir de una unidad
vital (clula, organismo vivo), por multiplicacin asexual, individuos genticamente
idnticos a ella y entre s. En realidad significa hacer un ser vivo o sus partes
exactamente iguales a otro u otras (es una fotocopia, una rplica). Es una definicin en
la que se incluye la clonacin molecular, y a veces la gemelacin (los gemelos
monocigticos, univitelinos o verdaderos son clones naturales), lo que obviamente es
incorrecto pues en ella no hay transferencia de ncleo, y la paraclonacin.
A la vez que se realiza la clonacin tcnica en animales se pueden incorporar diversos
genes a las clulas germinales (transgenia), para mejora, y particularmente para que se
expresen y produzcan (en la leche, por ejemplo) las protenas correspondientes
(productos farmacuticos, etc.) o clulas y tejidos utilizables con diversos fines
(investigacin o transplantes), todos ellos de utilidad principalmente en la medicina.
Clonacin-fertilizacin
La clonacin (mejor sera denominarla transferencia de ncleos) se diferencia
claramente de la fertilizacin (fecundacin), proceso que consiste en la fusin de un
espermatozoide (con 23 cromosomas) con el vulo (con 23 cromosomas) en que ha
penetrado de manera sexuada o asexuada, fusin que ocasionar una nueva clula o
cigoto con los 46 cromosomas de los progenitores, y que se dividir por activacin
espontnea, producindose el intercambio de los cromosomas y sus genes en la fase de
divisin posterior de 2-4-6 y hasta 8 clulas o blastmeros. En cambio, la clula creada
por clonacin no es un cigoto, y consecuentemente ha de tener un nombre, as que la he
llamado nuclvulo. Debidamente estimulado en el laboratorio (elctrica, qumica
-microinyeccin de Oscilina-, fsica ionforo de calcio-, etc.), el nuclvulo tambin
puede dividirse por mitosis y dar lugar a un preembrin de dos clulas o blastmeros,
despus de varias clulas, a un conglomerado de clulas en forma de mora (la mrula) y
hacia el 5-6 da, al blastocisto. Ambos, nuclvulo y cigoto pueden desarrollarse como
embriones Preimplantatorios (preembriones), embriones propiamente dichos
(postimplntato- rios), fetos, y, finalmente, dar lugar a descendencia.(3)
ENZIMA
Una enzima es una protena con propiedades catalticas, elaborada por la clula,
susceptible de ser regulada y que adems presenta, como veremos ms adelante, un alto
grado de especificidad.
Como todo catalizador, aceleran notablemente la velocidad de una reaccin qumica y
cumple con las siguientes condiciones:
a) Son efectivas en cantidades pequeas
b) No sufren modificaciones ni cualitativas ni cuantitativas al final de la reaccin. Es
decir deben quedar qumicamente inalteradas.
c) No afectan la posicin de la reaccin que catalizan. Es decir se llega mucho ms
rpidamente al equilibrio, pero el mismo es igual al que se llegara en ausencia del
catalizador.
Pero adems de cumplir estas condiciones propias de todos los catalizadores, las
enzimas presentan una serie de caractersticas, derivadas de su naturaleza proteica que
las diferencia netamente de los catalizadores inorgnicos:
a) Son termolbiles
b) Presentan una mayor eficiencia. Entendiendo por eficiencia en este caso al numero de
moles de sustrato transformado por mol de catalizador en la unidad de tiempo.
c) Presentan alta especificidad en relacin a la naturaleza de la reaccin que catalizan y
al sustrato que utilizan.
d) Estn sujetas a una gran variedad de controles celulares. (5)
GEN
VECTOR
MATERIAL Y REACTIVOS
Muestra vegetal
Agua (destilada o mineral)
Sal de mesa
Bicarbonato sdico
Detergente lquido o champ
Alcohol isoamlico a 0C
Batidora
Nevera
Colador o centrfuga
Vaso
Tubo de ensayo
Varilla fina
La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones
salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y
posterior extraccin de la clula.
Se empieza por lisar (romper) las clulas mediante un detergente, vacindose su
contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN. En ese
momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN,
carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin.
Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo
cual se utiliza alcohol isoamlico, probablemente el nico reactivo de esta prctica que
no suele haber en una cocina.
REALIZACIN
1. Preparar el tampn con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un
bao de hielo triturado o 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar
agua del grifo. 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura, 5 g de bicarbonato sdico, 5
ml de detergente lquido o champ.
2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber
en la cocina (cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos.
3. Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a
impulsos de 10 segundos. As se rompern muchas clulas y otras quedarn expuestas a
la accin del detergente.
4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampn fro y
agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar despus los restos vegetales
ms grandes del caldo molecular hacindolo pasar por un colador lo ms fino posible.
Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y despus pipetear el sobrenadante.
5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y aadir con pipeta 10 ml de
alcohol isoamlico enfriado a 0C. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la
cara interna del recipiente, teniendo ste inclinado. El alcohol quedar flotando sobre el
tampn.
6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separacin entre
el alcohol y el tampn. Remover la varilla hacia delante y hacia atrs y poco a poco se
irn enrollando los fragmentos de mayor tamao de ADN. Pasado un minuto retirar la
varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedar adherido a su
extremo con el aspecto de un copo de algodn mojado.
RESULTADOS
El producto filamentoso obtenido de la extraccin no es ADN puro ya que,
entremezclado con l, hay fragmentos de ARN. Una extraccin "profesional" se realiza
aadiendo enzimas que fragmentan las molculas de ARN e impiden que se unan al
ADN. (10)
3. DE QU DEPENDE LA EXTRACCIN DE ADN?
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
1. M. Somma, extraccin y purificacin de ADN, sesin 4, Anlisis de la
Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de
Alimentos, JCR European Comission.
http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi
%C3%B3n4.pdf
2. J.M. Garrido, N. ADURIZ y R.A. JUSTE, UTILIZACIN DE LA PCR
COMO TCNICA DE DIAGNSTICO DE PARATUBERCULOSIS A
PARTIR DE HECES, XXII, NEIKER (Instituto Vasco de Investigacin y
Desarrollo Agrario), 1998.
http://www.exopol.com/seoc/docs/jr6spo5b.pdf
3. M. Palacios, II Congreso Mundial de Biotica EL NUCLVULO:
CLONACIN TERAPUTICA, Gijn, ESPAA.
http://www.sibi.org/sib/doc/curr/mp/mpNuclovulo.pdf
4. GENES Y CROMOSOMAS, versin 2, Junio 9 del 2009.
Consultado el 13/2/14 a las 19: 20
http://22q.es/archivos/Genes-y-Cromosomas.pdf
5. ENZIMAS, prctica Universitaria
Consultado el 13/2/14 a las 20:34
http://www.fmvuba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico/segundo_a
%C3%B1o/bioquimica/Seminario%206-Enzimas.pdf
6. PLSMIDOS, prctica Universitaria
Consultado el 15/2/2014 a las 10:25
http://blogs.verleyen.fr/martha/files/2008/02/plasmidos.pdf
7. L. lvarez, A. Dolera, M. Menndez, C. Vilarrub; enfermedades
transmitidas por vectores, prctica universitaria.
Consultado el 15/2/14 a las 11:05
http://www.vhebron.net/documents/10165/11328174/Enfermedades
%20transmitidas%20por%20vectores.pdf
8. Octanol, hoja tcnica del producto, prctica universitaria
Consultado el 15/2/14 a las 11:20
http://nextbar.net/tecnica/HTE160%20OCTANOL.pdf
9. G. Alfonso, S. Ramrez; Metanol y Etanol, Octubre 2009, Energa y
ambiente maestra en ingeniera y ambiente.
Consultado el 15/2/14 a las 11:32
http://profesores.fib.unam.mx/l3prof/Carpeta%20energ%EDa%20y
%20ambiente/MetanolEtanol.pdf
10. J.A. Corts, extraccin casera de ADN, prctica universitaria
Consultado el 15/2/14 a las 13:25
http://platea.pntic.mec.es/~jpascual/vida/biomoleculas/ExtraccionADN.pdf