Nombres:

Carlos
Rodolfo Lopez de Cardenas Yañez
Carlos ivan barragan zarate
Cristian ricardo bravo camarena
Salvador Flores matsura
Materia:
BIOLOGIA MOLECULAR Y GENETICA
9 de agosto del 2018
“REPORTE 1”
4to semestre
grupo A
INTRODUCCIÓN

Utilizando la información obtenida en el libro “Biología Molecular. Fundamentos y

aplicaciones en las ciencias de la salud” de Rodríguez et al. (2016) en el capitulo de 12
“Extracción de de ácidos nucleicos” nos habla de la lisis celular y liberación del DNA de la
siguiente forma.

El primer paso en la extracción es la homogeneización del tejido y la lisis con detergentes

como el Tritón o dodecilsulfato sódico (SDS, sodium dodecyl sulfate) que son capaces de
romper las membranas celular y nuclear y liberar el ácido nucleico de las células de las
que se extraerá el DNA. El procedimiento de lisis celular es crítico y debe ser lo
suficientemente agresivo como para lograr la fragmentación del tejido y la ruptura de la
membrana celular, pero sin dañar el ácido nucleico.

La disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo en un buffer de lisis,

que contiene sales, un detergente y proteinasa K, que libera el DNA de las histonas con
las que se encuentra empaquetado y proteoliza proteínas celulares. La incubación con la
enzima se realiza por 2 h a 65 °C. La homogeneización se lleva a cabo con un
homogeneizador manual para evitar la ruptura mecánica de la molécula; para el RNA se
emplea un homogeneizador eléctrico que gira entre 200 y 1 000 rpm. En el caso de
células con pared celular, como las células vegetales, se prefiere el empleo de
sonicadores, los cuales, mediante ondas sonoras, rompen la pared celular y la membrana
celular y nuclear, para liberar los ácidos nucleicos de interés.

Cuando la extracción se lleva a cabo a partir de células de sangre periférica, se

recomienda el empleo de tubos con anticoagulante. El más recomendable es el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA, 0.1 M al 0.02% V/V), ya que la heparina interfiere con las
enzimas que se emplearán en los pasos subsiguientes como las polimerasas o las
enzimas de restricción. También es necesario retirar los eritrocitos, ya que por su alto
contenido de hemoglobina y carencia de núcleo contaminan la muestra. La lisis de
eritrocitos suele realizarse por adición de una solución hipotónica a base de cloruro de
amonio.

La inactivación de nucleasas intracelulares previene la digestión enzimática de los ácidos

nucleicos, lo que permite lograr la obtención de fragmentos relativamente largos de DNA y
RNA. La lisis celular y la inactivación de las nucleasas intracelulares en general se llevan
a cabo en el mismo paso, ya que la solución de lisis está compuesta por sales
caotrópicas, como el EDTA, que secuestra cationes divalentes y, por lo tanto, inactiva las
DNasas.

En cuanto a extracción de proteínas y lípidos Rodriguez et al. (2016) recalcan lo siguiente.

Al concluir la lisis celular y la inactivación de nucleasas se retiran los restos celulares,

proceso conocido como purificación. Los métodos de purificación de ácidos nucleicos
combinan estrategias tan diversas como la extracción/precipitación, la cromatografía, la
centrifugación, la electroforesis y la separación por afinidad.

Para la extracción por la técnica del fenol-cloroformo se utiliza una solución que tiene una
relación 25:24:1 v/v de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico; por lo general, se añade
hidroxiquinolina al 0.1%, que funciona como antioxidante del fenol, además de ser un
inhibidor parcial de RNasas, quelante débil de iones metálicos y ayuda en la identificación
de la fase orgánica por el color amarillo que le confiere. El alcohol isoamílico se emplea
para reducir la espuma que puede generarse al agitar, desnaturaliza las proteínas (entre
ellas las nucleasas) y mantiene la separación de la fase orgánica y acuosa tras la
centrifugación de la muestra.

La eliminación de las proteínas y componentes no hidrosolubles del homogeneizado

celular se efectúa con la formación de dos fases con propiedades de solubilidad
particulares: a) una fase orgánica (fenólica) en la parte inferior del tubo de precipitado que
contiene lípidos, proteínas y debris celulares, y b) una fase acuosa en la parte superior
(menos densa), que contiene los ácidos nucleicos y otras pequeñas moléculas
hidrosolubles. En la interfase se ubican la mayor parte de las proteínas debido a su
contenido en aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos.

El DNA es poco soluble en fenol, por lo que previamente suele estabilizarse con una
solución amortiguadora de Tris que lo mantiene en un pH de 8 a 8.5, lo que hace que el
DNA permanezca en la fase acuosa. La modificación del pH de 8.5 a 5.2 en esta solución
puede favorecer la extracción de RNA frente a la de DNA.

Respecto a la precipitación de ADN la misma autora Rodriguez et al. (2016) afirman lo

siguiente.

El DNA disuelto en la solución acuosa se precipita con alcohol absoluto (isopropanol o

etílico) añadido, ya que los ácidos nucleicos son insolubles en soluciones alcohólicas.
Cuando se emplea etanol (EtOH), la cantidad que se requiere para la precipitación es dos
veces el volumen de la fase acuosa, mientras que con isopropanol (IprOH) se demanda
solamente 0.7 veces el volumen de fase acuosa. Por otro lado, al emplear IprOH puede
acelerarse el proceso, con un tiempo de incubación menor y la precipitación puede
realizarse a temperatura ambiente. Sin embargo, se ha indicado una mayor dificultad para
disolver ácidos nucleicos precipitados con IprOH que con EtOH.

Para facilitar la precipitación también suelen añadirse cationes monovalentes (K+, Na+,
NH4+) a la solución de ácidos nucleicos cargados negativamente, con el fin de generar
sales insolubles en alcohol de fácil precipitación. Si la cantidad del ácido nucleico en la
muestra es baja, es posible incrementar sus agregados utilizando algún compuesto inerte
que se asocie a los ácidos nucleicos y aumente su precipitación, sin interferir en futuras
reacciones, como por ejemplo el glucógeno, que por su gran tamaño molecular forma una
red que arrastra al ácido nucleico y facilita su precipitación. La precipitación se favorece al
incubar a bajas temperaturas (−20 °C); una centrifugación posterior permite la obtención
de una pastilla o botón del ácido nucleico en el fondo del tubo, al decantar el alcohol.

Por último respecto a la cuantificación de ácidos nucleicos los autores Rodríguez et al.
(2016) nos hablan al respecto, empezando con lo que es la espectrometría.

El fundamento de la espectrofotometría es que cualquier solución que contenga

moléculas suspendidas permite el paso de un haz de luz a través de ella en proporción
inversa a la cantidad de moléculas que contiene. Los nucleótidos de DNA y RNA
presentan la absorción máxima a una longitud de onda de 260 nm (UV, luz ultravioleta);
por lo tanto, los espectrofotómetros son los aparatos más utilizados para determinar la
concentración de ácidos nucleicos en solución. En la celda del espectrofotómetro un haz
de luz atraviesa la solución de ácidos nucleicos y cuando ha pasado por la muestra, un
fotodetector mide la intensidad de luz absorbida. Mientras más luz absorba la muestra
(absorbancia) mayor será la concentración de ácidos nucleicos.

La densidad óptica (OD) es la unidad de absorbancia y tiene valores particulares para

cada molécula específica en una determinada longitud de onda por unidad de distancia.
En el caso de los ácidos nucleicos, una OD de 1 a 260 nm equivale a 50 μg/ml de dsDNA,
37 μg/ml de ssDNA, 40 μg/ml de RNA o 33 μg/ml de oligonucleótidos.

Según estos valores, se estableció la siguiente fórmula para el cálculo de la concentración

de los ácidos nucleicos:
- μg/μl de NA = OD a 260 nm × dilución × constante/1 000

En el que:
- OD a 260 nm: absorbancia del ácido nucleico a 260 nm de longitud de onda.

Dilución: como se requieren volúmenes relativamente grandes de solución para cubrir la

capacidad de las celdas de los espectrofotómetros, suelen tratarse diluciones 1:100 a 1:1
000 del stock de DNA, en una solución en fosfato de sodio dibásico, 1.5 μm a pH 5.2
(Na2HPO4), que permite leer los nucleótidos sin interferencia. Algunos equipos permiten
la lectura directa del ácido nucleico, como un espectrofotómetro NanoDrop™, usando
volúmenes micrométricos (1 a 2 μm), en las que la muestra no se diluye sino que se
aplica directamente en el aparato.

Constante: proveniente del valor teórico de OD para cada ácido nucleico: a) 50 para el
dsDNA; b) 40 para RNA; c) 33 para oligonucleótidos, y d) 37 para ssDNA.

A pesar de que la técnica de extracción de ácidos nucleicos esté bien realizada, es

prácticamente imposible eliminar la totalidad de las proteínas celulares que acompañan al
DNA, así como solventes u otros componentes orgánicos empleados en la extracción, los
cuales se presentan como contaminantes de la solución de ácido nucleico, lo que puede
repercutir en las técnicas en que se pretenda emplear el ácido nucleico.
Debido a que el espectro de absorción de luz de estas moléculas es característico, la
absorción en otras longitudes de onda de la muestra de ácidos nucleicos se compara con
la absorción a 260 nm, con el fin de valorar la pureza del ácido nucleico extraído. Así, para
el cálculo de estos índices, se procede a dividir la OD obtenida para la muestra de ácidos
nucleicos a 260 nm entre la OD de interés.

Dado que las proteínas (en particular los aminoácidos aromáticos) absorben luz a una
longitud de onda de 280 nm, por lo común el índice de absorción 260/280 nm se utiliza
para valorar la pureza de los ácidos nucleicos respecto a la contaminación con proteínas.
Cuando éste se encuentra entre 1.8 y 2, se considera óptimo, ya que valores cercanos a
1.8 indican que la muestra contiene casi exclusivamente DNA; para el RNA el índice
óptimo es de 2.

La presencia de proteínas hará disminuir este cociente, por lo que si la relación 260/280
es menor que 1.8, la cantidad de proteína en la muestra es alta y es conveniente realizar
un nuevo proceso de extracción.

Un índice mayor que valores de 2 indica una ruptura de las cadenas de los ácidos
nucleicos, y se considera que es un ácido nucleico de calidad insuficiente, por lo que en
este caso también se recomienda una nueva extracción. Sin embargo, este índice no es
infalible y puede modificarse si el pH del medio se modifica; la acidez puede hacer
disminuir hasta 0.2 a 0.3 unidades el índice, mientras que la basicidad puede aumentarlo.

Por otro lado, la composición de nucleótidos libres afecta también esta relación, ya que si
se calculase el índice 260/280 para cada nucleótido se obtendría: guanina: 1.15, adenina:
4.50, citosina: 1.51, uracilo: 4 y timina: 1.47; por ello, el RNA tendrá típicamente valores
mayores que el índice 260/280, por su contenido de uracilos, que difieren notablemente
del índice que producen las timinas.

El fenol tiene un pico de absorbancia de 270 nm, por lo que a 260 nm todavía absorbe
gran cantidad de luz. Debido a este efecto solapante, la contaminación con fenol (utilizado
en la extracción) sobrestima de forma significativa la concentración del ácido nucleico. Las
preparaciones de ácidos nucleicos sin contaminación fenólica presentan un índice
260/270 de alrededor de 1.2.

La absorción de luz UV a una longitud de onda de 230 nm significa que la muestra está
contaminada con iones fenolatos o tiocianatos, péptidos, compuestos aromáticos u otras
sustancias. Para muestras puras de ácidos nucleicos, el índice 260/230 se espera en el
rango 2 a 2.2; muestras con un índice menor indican la presencia de contaminantes que
absorben a 230 nm, como EDTA, carbohidratos y fenol. La solución fenólica con tiocionato
de guanidina empleada para la extracción de RNA absorbe luz UV tanto a 230 nm como a
270 nm.
SUJETOS Y METODOS

Fijar el baño de agua en 65°c, vértice el genecatcher magnético. Se

suspende de nuevo. Se tiene que confirmar los volúmenes del reactivo
necesarios para el tamaño de la muestra. Los volúmenes en la siguiente
son 10 ml de sangre y atar el DNA. Para 10 ml de sangre, añade el ul de
150 de gotas magnéticas de genecatcher al A el tubo de 50 ml. Al otro se
le añade 30 ml de almacenador intermediario de la lisis y revuelve el tubo
suavemente hasta suspender de nuevo. Se le añade 10 ml de sangre,
después se encapsula el tubo e invierte 3 veces. Se incuba en el
climatizador para 5 min. Coloca el tubo de 50 ml de magnético separado
por 3 min. Se quita y se desecha el sobrenadante, se quita el tubo del
imán. Se añade 5 ml de almacenador intermediario de lisis, entonces se
encapsula el tubo y lo inviertes 10 veces.se incuba en el climatizador por
10 segundos y el separador magnético para 20 segundos. Se quita y
desecha el sobrenadante, se quita el tubo del imán.

En la purificación de la DNA se añade 5 ml de almacenador intermediario

de la proteasa y ul de 40 de la proteasa al tubo. Se capsula el tubo y el
vórtice para dispersarse con la pelotilla, se incuba en 65° por 10 minutos
y el vórtice en caso de necesidad a suspender de nuevo.

Se permite que el tubo se refresque a la habitación y entonces se añade

5 ml de alcoholes 100% isopropilos. Se invierte en el tubo para
mezclarse hasta una visible. Se coloca el separador magnético durante
30 segundos, se quita y desecha la sobrenadante entonces quitas el tubo
del imán y añades 30 ml de IPA e inviertes el tubo por 20 segundos.
Colocas el tubo en el imano para durante 20 segundos para después
quitar el líquido. Quitas el tubo del imán durante 1 minuto entonces quitas
el líquido adicional y lavas las gotas, añades suavemente el UL de 250 al
almacenador intermediario de lavado incuba durante 1 minuto. Quitas y
desechas el sobrenadante y repites los pasos de lavado. Añades 1 ml del
almacenador intermediario de la elusión. Al tubo se le devuelve
suavemente con el imán hasta que se separe del tubo. Incubas en 65°
durante 1 hora y mides con una pipeta hacia arriba y hacia abajo para
dispersar. Colocas el tuvo con el imán para separar el sobrenadante para
que quede totalmente claro y descolorido, quitas el DNA flotante y
purificas el tubo.
 RESULTADOS

Imagen 1: Preparado
Imagen
de la
2: practica
extraccioó n de sangre

Imagen 3: extraccion de agua destilada a Imagen 4: integrando el agua destilada a

la muestra la muestra

Imagen 5: poniendo los imanes para que el adn se

empiece a separar Imagen 6: juntaó ndose el ADN y las perlas
Imagen 7: decantacioó n figura 8:metimos las muestras a banñ o maria
Resultados:

1.- 260/280 :
- Sangre: .043/.004 = 10.75
- Fresa: .049/.088 = .55681

2.- Ido x FD x 260 =

- Sangre: 50u x 100 x .043 = 215 = C1
- Fresa: 50u x 100 x .049 = 245 = C1

3.- C1V1 = C2V2

- Sangre:
- V2= 100 ; C2= 50 ; C1=215
- V1= C2 x V2 / C1
- V1= (50 x 100) / 215 = 23.25581

- Fresa:
- V2= 100 ; C2= 50 ; C1=245
- V1= C2 x V2 / C1
- V1= (50 x 100) / 245 = 20.40816
Imagen 9: se separa la fase organiga de la inorgaó nica imagen 10: imantando la muestra para bajar las
proteinas

Imagen 11: extraccioó n de adn y colocando el

adn y guardar la muestra
Resultados:

DISCUSIÓN

Discusión:
Los resultados obtenidos en el índice de absorción 260/280, para valorar la pureza de los
ácidos nucleicos, no fueron los óptimos. Ya que resultados dentro del rango de 1.8 - 2.0
se consideran óptimos, y siendo los resultados obtenidos 10.75 y .55681 no es posible
concluir que estos fueron óptimos. Siendo los resultados cercanos a 1.8 los que contienen
casi exclusivamente DNA, mientras que los que están más cercanos a 2.0 contienen
RNA.
La presencia de proteínas disminuye este cociente por lo que cifras menores a 1.8 están
relacionadas con una gran presencia de proteínas. Como en la muestra de fresa que
arrojó una cifra de .55681 lo que indica una gran presencia de proteínas en la muestra.

Mientras que resultados mayores a 2.0 nos hablan de una ruptura de las cadenas de los
ácidos nucleicos. Caso en el cual se encuentran los resultados obtenidos por la pruba de
sangre, al arrojar una cifra de 10.75. Donde los ácidos nucleicos de la muestra se
encuentran degenerados.

BIBLIOGRAFIA

- Rodríguez, Ana Soledad Sandoval, et al.. "Extracción de ácidos nucleicos."

Biología Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud, 2e
Eds. Adriana María Salazar Montes, et al. New York, NY: McGraw-Hill, ,
http://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?
bookid=1803&sectionid=124155671.