Practica 2 Molecular y Genetica
Practica 2 Molecular y Genetica
Practica 2 Molecular y Genetica
Carlos
Rodolfo Lopez de Cardenas Yañez
Carlos ivan barragan zarate
Cristian ricardo bravo camarena
Salvador Flores matsura
Materia:
BIOLOGIA MOLECULAR Y GENETICA
9 de agosto del 2018
“REPORTE 1”
4to semestre
grupo A
INTRODUCCIÓN
Para la extracción por la técnica del fenol-cloroformo se utiliza una solución que tiene una
relación 25:24:1 v/v de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico; por lo general, se añade
hidroxiquinolina al 0.1%, que funciona como antioxidante del fenol, además de ser un
inhibidor parcial de RNasas, quelante débil de iones metálicos y ayuda en la identificación
de la fase orgánica por el color amarillo que le confiere. El alcohol isoamílico se emplea
para reducir la espuma que puede generarse al agitar, desnaturaliza las proteínas (entre
ellas las nucleasas) y mantiene la separación de la fase orgánica y acuosa tras la
centrifugación de la muestra.
El DNA es poco soluble en fenol, por lo que previamente suele estabilizarse con una
solución amortiguadora de Tris que lo mantiene en un pH de 8 a 8.5, lo que hace que el
DNA permanezca en la fase acuosa. La modificación del pH de 8.5 a 5.2 en esta solución
puede favorecer la extracción de RNA frente a la de DNA.
Para facilitar la precipitación también suelen añadirse cationes monovalentes (K+, Na+,
NH4+) a la solución de ácidos nucleicos cargados negativamente, con el fin de generar
sales insolubles en alcohol de fácil precipitación. Si la cantidad del ácido nucleico en la
muestra es baja, es posible incrementar sus agregados utilizando algún compuesto inerte
que se asocie a los ácidos nucleicos y aumente su precipitación, sin interferir en futuras
reacciones, como por ejemplo el glucógeno, que por su gran tamaño molecular forma una
red que arrastra al ácido nucleico y facilita su precipitación. La precipitación se favorece al
incubar a bajas temperaturas (−20 °C); una centrifugación posterior permite la obtención
de una pastilla o botón del ácido nucleico en el fondo del tubo, al decantar el alcohol.
Por último respecto a la cuantificación de ácidos nucleicos los autores Rodríguez et al.
(2016) nos hablan al respecto, empezando con lo que es la espectrometría.
En el que:
- OD a 260 nm: absorbancia del ácido nucleico a 260 nm de longitud de onda.
Constante: proveniente del valor teórico de OD para cada ácido nucleico: a) 50 para el
dsDNA; b) 40 para RNA; c) 33 para oligonucleótidos, y d) 37 para ssDNA.
Dado que las proteínas (en particular los aminoácidos aromáticos) absorben luz a una
longitud de onda de 280 nm, por lo común el índice de absorción 260/280 nm se utiliza
para valorar la pureza de los ácidos nucleicos respecto a la contaminación con proteínas.
Cuando éste se encuentra entre 1.8 y 2, se considera óptimo, ya que valores cercanos a
1.8 indican que la muestra contiene casi exclusivamente DNA; para el RNA el índice
óptimo es de 2.
La presencia de proteínas hará disminuir este cociente, por lo que si la relación 260/280
es menor que 1.8, la cantidad de proteína en la muestra es alta y es conveniente realizar
un nuevo proceso de extracción.
Un índice mayor que valores de 2 indica una ruptura de las cadenas de los ácidos
nucleicos, y se considera que es un ácido nucleico de calidad insuficiente, por lo que en
este caso también se recomienda una nueva extracción. Sin embargo, este índice no es
infalible y puede modificarse si el pH del medio se modifica; la acidez puede hacer
disminuir hasta 0.2 a 0.3 unidades el índice, mientras que la basicidad puede aumentarlo.
Por otro lado, la composición de nucleótidos libres afecta también esta relación, ya que si
se calculase el índice 260/280 para cada nucleótido se obtendría: guanina: 1.15, adenina:
4.50, citosina: 1.51, uracilo: 4 y timina: 1.47; por ello, el RNA tendrá típicamente valores
mayores que el índice 260/280, por su contenido de uracilos, que difieren notablemente
del índice que producen las timinas.
El fenol tiene un pico de absorbancia de 270 nm, por lo que a 260 nm todavía absorbe
gran cantidad de luz. Debido a este efecto solapante, la contaminación con fenol (utilizado
en la extracción) sobrestima de forma significativa la concentración del ácido nucleico. Las
preparaciones de ácidos nucleicos sin contaminación fenólica presentan un índice
260/270 de alrededor de 1.2.
La absorción de luz UV a una longitud de onda de 230 nm significa que la muestra está
contaminada con iones fenolatos o tiocianatos, péptidos, compuestos aromáticos u otras
sustancias. Para muestras puras de ácidos nucleicos, el índice 260/230 se espera en el
rango 2 a 2.2; muestras con un índice menor indican la presencia de contaminantes que
absorben a 230 nm, como EDTA, carbohidratos y fenol. La solución fenólica con tiocionato
de guanidina empleada para la extracción de RNA absorbe luz UV tanto a 230 nm como a
270 nm.
SUJETOS Y METODOS
Imagen 1: Preparado
Imagen
de la
2: practica
extraccioó n de sangre
1.- 260/280 :
- Sangre: .043/.004 = 10.75
- Fresa: .049/.088 = .55681
- Fresa:
- V2= 100 ; C2= 50 ; C1=245
- V1= C2 x V2 / C1
- V1= (50 x 100) / 245 = 20.40816
Imagen 9: se separa la fase organiga de la inorgaó nica imagen 10: imantando la muestra para bajar las
proteinas
DISCUSIÓN
Discusión:
Los resultados obtenidos en el índice de absorción 260/280, para valorar la pureza de los
ácidos nucleicos, no fueron los óptimos. Ya que resultados dentro del rango de 1.8 - 2.0
se consideran óptimos, y siendo los resultados obtenidos 10.75 y .55681 no es posible
concluir que estos fueron óptimos. Siendo los resultados cercanos a 1.8 los que contienen
casi exclusivamente DNA, mientras que los que están más cercanos a 2.0 contienen
RNA.
La presencia de proteínas disminuye este cociente por lo que cifras menores a 1.8 están
relacionadas con una gran presencia de proteínas. Como en la muestra de fresa que
arrojó una cifra de .55681 lo que indica una gran presencia de proteínas en la muestra.
Mientras que resultados mayores a 2.0 nos hablan de una ruptura de las cadenas de los
ácidos nucleicos. Caso en el cual se encuentran los resultados obtenidos por la pruba de
sangre, al arrojar una cifra de 10.75. Donde los ácidos nucleicos de la muestra se
encuentran degenerados.
BIBLIOGRAFIA