UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE QUMICA, INGENIERA QUMICA E INGENIERA

AGROINDUSTRIAL
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE QUMICA

INFORME DE LABORATORIO
ENZIMAS II
Cintica de las reacciones enzimticas de -amilasa de la saliva.
Demostracin de la especificidad absoluta de la ureasa.

ALUMNOS:
Atarama Orejuela, Joel J.

05070078

Mendoza Jimnez, Vctor J.

05070093

Rabanal Len, Walter A.

05070025

PROFESOR:
Msc. Juan Carlos Woolcott

- LIMA, CIUDAD UNIVERSITARIA, OCTUBRE DEL 2008 -

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FQIQIA EAP QUIMICA

INTRODUCCIN
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son
catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica de una enzima permite explicar los
detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su
actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o
potenciada por otro tipo de molculas.
Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante
el cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se
consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los
cambios experimentados bien en la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien
en la concentracin de producto (que va aumentando).
Existen diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra permite
detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (segn la
concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o liberacin de
radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos
espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la
reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar
las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos
ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de
actividad enzimtica. Tambin se puede utilizar la espectrometra de masas para detectar
la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el sustrato es convertido en
producto.
Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de un
microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando
catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la
fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catlisis o bien unir
molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan detectar
movimientos ocurridos durante la catlisis. Estos estudios estn dando una nueva visin
de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios de
cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de
una poblacin de millones de molculas de enzima.
En la figura de la derecha se puede observar la
tpica evolucin de una curva obtenida en un
ensayo enzimtico. Inicialmente, la enzima
transforma el sustrato en producto siguiendo un
comportamiento lineal. A medida que avanza la
reaccin, se va agotando la cantidad de sustrato
y va disminuyendo la cantidad de producto que
se genera por unidad de tiempo (disminuye la
velocidad de la reaccin), lo que se manifiesta
en forma de curva asinttica en la grfica.
Dependiendo de las condiciones del ensayo y
del tipo de enzima, el perodo inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los
ensayos enzimticos suelen estar estandarizados para que el perodo inicial dure en

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torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas ms fcilmente. Sin embargo, los
modernos equipos de mezcla rpida de lquidos permiten llevar a cabo medidas
cinticas de perodos iniciales cuya duracin puede llegar a ser inferior a un segundo.
Este tipo de ensayos rpidos son esenciales para medidas de la cintica del estado
estacionario, discutida ms abajo.
La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo inicial, es
decir, en la zona lineal de la reaccin enzimtica. Sin embargo, tambin es posible
medir toda la curva de la reaccin y ajustar estos datos a una ecuacin no lineal. Esta
forma de medir las reacciones enzimticas es denominada anlisis de la curva de
progreso. Esta aproximacin es muy til como alternativa a las cinticas rpidas, cuando
el perodo inicial es demasiado rpido para ser medido con precisin.
Factores fsico-qumicos que pueden modificar la actividad enzimtica

Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse

modificada su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos
pueden llegar a variar sustancialmente de unas enzimas a otras. Normalmente, a
medida que aumente la temperatura, una enzima ver incrementada su actividad
hasta el momento en que comience la desnaturalizacin de la misma, que dar
lugar a una reduccin progresiva de dicha actividad.

pH: el rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes enzimas. Si

el pH del medio se aleja del ptimo de la enzima, esta ver modificada su carga
elctrica al aceptar o donar protones, lo que modificar la estructura de los
aminocidos y por tanto la actividad enzimtica

Concentracin salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la

concentracin de sales del medio es crucial para una ptima actividad
enzimtica. Una elevada concentracin o una ausencia de sales en el medio
pueden impedir la actividad enzimtica, ya que las enzimas precisan de una
adecuada concentracin de iones para mantener su carga y su estructura.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

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Reactivos:

Amilasa (Saliva).
cido Clorhdrico 10%.
Almidn.
Lugol.
Solucin Buffer Fosfato Citrato.
Urea 1%.
Fenolftalena 0.5%.
Solucin alcohlica.

Materiales:

Tubos de ensayo.
Gradillas.
Pipetas.
Baguetas.
Termmetro.
Hielo.
Balanza.

PRACTICA N 9:
CINTICA DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS DE AMILASA DE LA
SALIVA
Dependencia de la Velocidad de Reaccion de la Cantidad de Enzima.
Fundamento:
El mtodo de esta determinacin se fundamenta en la variacin de la velocidad de una
reaccin catalizada (la hidrlisis del almidn) por una enzima (la amilasa) en
funcin de la cantidad de enzima para catalizar la misma, la cual muestra una tendencia
lineal positiva, lo que quiere decir, que a medida que la velocidad de reaccin aumenta
cuando la cantidad de enzima utilizada para catalizar la reaccin sea mayor. Esta prueba
utiliza como revelador al lugol (mezcla de yodo con yoduro de potasio) el cual adoptar
una coloracin rojiza al estar en contacto con el almidn hidrolizado, esta coloracin se
debe a la etapa de formacin de eritodextrinas del almidn.
Curso de la Determinacin y Discusin de Resultados:
Se tom una muestra de saliva humana (presencia de amilasa) la cual se diluy en
20, 40, 80, 160 veces, estas diluciones nos ayudarn a determinar el cambio de la
velocidad de reaccin en funcin de la concentracin de la enzima; luego de esto, en
cuatro tubos de ensayo (correactamente etiquetados) se coloc en cada uno de ellos
1mL de las soluciones de saliva preparadas.Posterior a esto, a cada uno de los tubos se
le aadi 4mL de almidn y se coloc en un bao de agua a 38C y se control el
tiempo de inicio de la reaccin para cada tubo. (Ver figura 1.)

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Figura 1.
Despus de 1 o 2 minutos de iniciada la reaccin en cada uno de los tubos, se extrajo
con una bagueta una o dos gotas de muestra y se las coloc en una luna de reloj y
aadiendoles una gota de lugol, se observ la coloracin producida.
NOTA:

Para este tiempo la coloracin producida por las 4 muestras fue azul,
evidenciando la poca hidrlisis producida hasta el momento.

El tiempo de reaccin para cada tubo se tom cuando las muestras dieron
coloracin roja con el reactivo revelador (lugol), como se ve en la figura 2
(coloracin de reaccin negativa) y figura 3 (coloracin de reaccin positiva).

Figura 2.

Figura 3.

De la prueba se obtubieron los siguientes resultados:

N DE TUBO / (CONCENTRACIN)
Tubo N1 (1/20)
Tubo N2 (1/40)
Tubo N3 (1/80)

TIEMPO (SEGUNDOS)
2288
3365
44148

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Tubo N4 (1/160)

4815

Grfica:
Velocidad de Reaccin en Funcin de la Concentracin Relativa de la Enzima.

Dependencia de la Velocidad de Reaccion Enzimtica de la Temperatura.

Fundamento:
El mtodo de esta determinacin de la accin cataltica de una enzima en funcin de la
temperatua se basa en la reaccin de hidrlisis del almidn por la amilasa de la
saliva, sometiendo a la enzima a tres condiciones diferentes de temperatura antes de
usarla como enzima cataltica, las cuales determinarn el resultado del proceso, el
revelado de esta experiencia tambin con lugol y la velocidad de reaccin se compara
cualitativamente con la coloracin desarrollada en cada una de las pruebas realizadas.
Curso de la Determinacin y Discusin de Resultados:
En tres tubos de ensayo se coloc muestras de - amilasa con las siguientes
especificaciones:
Tubo N 1: 5 gotas de amilasa y hervir por 2 minutos.
Tubo N 2: 5 gotas de amilasa sin hervir.
Tubo N 3: 5 gotas de amilasa sin hervir.
A las tres muestras se les aadi 10 gotas de solucin de almidn y se colocarn los
tubos como se indica a continuacin:

Tubo N 1: Bao de agua a 38C.

Tubo N 2: Bao de agua a 38C.
Tubo N 3: Agua con hielo.

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NOTA:

La amilasa por ser una protena al ser calentada hasta hervir se desnaturaliza
perdiendo su actividad cataltica.

El bao de hielo o la disminucin de temperatura no desnauralizan la protena

aun que si retardan tu velocidad cataltica de reaccin.

Todos los tubos estuvieron en sus respectivos baos por un tiempo de 3 minutos, como
paso a final a cada tubo se aadio 1 gota de lugol y se compara el color desarrollado por
cada una registrandose los resultados en el siguiente cuadro:
ENZIMA
amilasa
amilasa
amilasa

SUSTRATO
Almidn
Almidn
Almidn

COLORACIN CON LUGOL

Azul Negruzco
Amarillo
Azul Violceo

TC
38C
38C
4C

Dependencia de la Velocidad de Reaccion Enzimtica del pH del medio.

Fundamento:
El mtodo de esta determinacin se
fundamenta en la variacin de la velocidad de
una reaccin catalizada por una enzima (la
hidrlisis del almidn por accin de la
amilasa) en funcin del pH del medio, para
esto se determinar el tiempo de accin
catalitca de la amilasa a un determinado
pH revelndolo con lugol, el tiempo de
reaccin ser el tiempo en el que la hidrlisis
del almidn se haya dado por completo
(cuando la coloracin por accin del lugol sea
rojiza), estos resultados representados
graficamente nos pueden ayudar a determinar
el pH optimo de la accin de la enzima.

Figura 5.

Curso de la Determinacin y Discusin de Resultados:

Preparacin de las Soluciones Buffer: (Figura 5)
pH
5.6

SOLUCION 0.2M
FOSFATO
5.8 mL

SOLUCION 0.1M
CITRATO
4.2 mL

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6.4

6.9 mL

3.1 mL

6.8

7.7 mL

2.3 mL

7.2

8.7 mL

1.3 mL

8.0

9.7 mL

0.3 mL

Figura 6.
En 5 tubos de ensayo se aadi 10 gotas de las soluciones buffer fosfato citrato con
los valores de pH calculados y preparados con las datos de la tabla anterior. A cada uno
de estos tubos se agreg 5 gotas de salia diluida y 10 gotas de solucin de almidn
colocando los tubos en un bao de agua a una temperatura de 38C. (Ver figura 6).
Despus de 1 o 2 minutos de iniciada la reaccin en cada uno de los tubos, se extrajo
con una bagueta una o dos gotas de muestra y se las coloc en una luna de reloj y
aadiendoles una gota de lugol, se observ la coloracin producida.
NOTA:

El tiempo de reaccin para cada tubo se tom cuando las muestras dieron
coloracin roja con el reactivo revelador (lugol), como se ve en la figura 7
(coloracin de reaccin negativa) y figura 8 (coloracin de reaccin positiva).

Figura 7.

Figura 8.

De la prueba se obtubieron los siguientes resultados:

N de TUBO pH
TUBO N 1 5.6
TUBO N 2 6.4
TUBO N 3 6.8
TUBO N 4 7.2
TUBO N 5 8.0

TIEMPO (SEGUNDOS)
2874
1818
1680
1632
3004

Grfica:

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Velocidad de Reaccin en Funcin del pH del medio.

De la grfica podemos obtener resultados como el de pH ptimo para que la enzima

trabaje con mayor eficiencia; en este caso el pH ptimo es:

Segn la Curva de Tendencia

6.8

Segn la Curva Experimental

7.1

PRACTICA N 10:
ESPECIFICIDAD DE LA ACCIN DE LOS ENZIMAS
Demostracin de la Especificidad Absoluta de la Ureasa.
Fundamento:
El mtodo se basa en la determinacin de amoniaco que se forma por la accin de la
ureasa de la harina de soya sobre la urea. El desprendimiento de amoniaco de detecta
por el olor, el cambio de coloracin de la fenolftalena y/o el papel de tornasol.
Curso de la Determinacin y Discusin de Resultados:

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En tubo de ensayo se coloc 1mL de urea (no se
realiz la prctica con tiourea y acetamida debido a
que no se cont con los reactivos), al tubo se le
agreg 100mg de harina de soya en polvo y 2 gotas
de fenolftaleina, se mezcl cuidadosamente con una
bagueta y se dejo reposar a temperatura de
ambiente. El amoniaco desprendido en medio
acuoso forma hidroxido de amonio el cual da una
coloracin grosella a la fenolftaleina, esta
coloracin es la que nos indica la presencia de la
enzima ureasa en la harina de soya y su
especificidad sobre la urea. El resultado se ve en la
figura 9.
Figura 9.

CONCLUSIONES

La cantidad de enzima para catalizar una reaccin, muestra una tendencia lineal
positiva, lo que quiere decir, que a medida que la velocidad de reaccin aumenta
tambien lo hace la cantidad de enzima que se necesita para catalizar la reaccin
sea mayor.

El lugol se utiliza como reactivo revelador debido a que adquiere una coloracin
especfica al darse la formacin de las eritrodextrinas.

La amilasa por ser una protena al ser calentada hasta hervir se desnaturaliza
perdiendo su actividad cataltica.

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El bao de hielo o la disminucin de temperatura no desnauralizan la protena

aun que si retardan tu velocidad cataltica de reaccin, la disminucin de la
temperatura puede usarse para mantener estable a la protena y su actividad
biolgica como catalizador.

El pH del medio tambin regula la velocidad de reaccin, si el pH no es ptimo

entonces el enzima ver modificada su carga elctrica al aceptar o donar
protones, lo que modificar la estructura de los aminocidos y por tanto la
actividad enzimtica.

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