Protocolo Fase 2 Metodos Alternativos de Control de Garrapatas
Protocolo Fase 2 Metodos Alternativos de Control de Garrapatas
Protocolo Fase 2 Metodos Alternativos de Control de Garrapatas
INTRODUCCIN.
La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, produce el mayor
problema global de ectoparsitos en la ganadera bovina de las regiones
tropicales (Rodrguez-Vivas et al., 2005). El impacto econmico se debe al
dao a las pieles por accin de las picaduras, prdida de sangre, efectos
txicos, reduccin en la produccin de leche, en la produccin de becerros y
altos costos en el control de la garrapata; adems de los agentes etiolgicos
que transmiten, en Mxico, Babesia bovis, Babesia bigemina y Anaplasma
marginale (Rodrguez-Vivas et al., 2005).
Los mtodos de control de las garrapatas se clasifican en qumicos y no
qumicos. En Mxico, el mtodo ms utilizado para el control de R. microplus
es el uso de productos qumicos (Rodrguez-Vivas et al., 2005, 2006). Sin
embargo, el uso irracional de estos productos ha generado el desarrollo de
cepas resistentes a diferentes ixodicidas en Mxico (Rodrguez-Vivas et al.,
2006). Esto ha motivado a los cientficos en la bsqueda de nuevas alternativas
de control tales como el control biolgico y el uso de extractos de plantas con
poder ixodicida (Rodrguez-Vivas et al., 2005).
El mtodo de control biolgico ms utilizado para el control de R.
microplus se basa en usar hongos entomopatogenos siendo M. anisopliae el
ms importarte, demostrando su eficacia como biorregulador de R. microplus
en condiciones de laboratorio (Samish et al., 2004). La infeccin del hongo
comienza con la adhesin y penetracin de las conidias a la cutcula del
hospedero, causando la muerte por procesos fsicos y enzimticos sobre el
hospedero. Tiene una distribucin cosmopolita y su patogenicidad depende de
factores climticos, estado fisiolgico de las esporas y la especificidad de las
cepas para parasitar a sus hospederos (Dantigny y Nanguy, 2009). Polar et al.
(2008) mencionan que la eficacia de M. anisopliae para el control de R.
microplus vara entre cepas, ya que dependen de la variabilidad de las
secreciones enzimticas de proteasas y quitinasas durante la infeccin.
Por otra parte se ha reportado el uso de extractos de plantas como
repelente de garrapatas o como agentes ixodicidas. Entre estos se encuentra
Melissa officinalis (Citronela), Convallaria majalia (Lili del valle), Ageratum
houstonianum (Tedonkeng et al., 2005), Azadirachta indica (rbol del Neem)
(Benavides et al., 2001), y el rbol del Mamey (Mammea americana) (Oliveros
et al., 1996). En estudios preliminares realizados en el laboratorio de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UADY con plantas
encontradas en Yucatn, se observ que Petiveria alliacea presenta la mayor
eficacia para el control de larvas R. microplus (99%). Por lo tanto, el presente
trabajo tiene como objetivo evaluar la actividad ixodicida del hongo
Metarhizium anisopliae y de extractos de especies vegetales, como mtodo
alternativo para el control de garrapatas R. microplus en fases de larvas y
adultas en el trpico mexicano.
ANTECEDENTES.
Los hongos entomopatgenos y los extractos de plantas han
demostrado ser las alternativas ms prometedoras para el control de
garrapatas. El hongo Metharizium anisopliae ha demostrado ser eficiente para
la bioregulacin de R. microplus en condiciones de laboratorio (Samish et al.,
2004).
En la primera fase del proyecto Mtodos alternativos de control de la
garrapata R. microplus en Yucatn, Mxico (financiado por la Fundacin
Produce Yucatn), se evalu el efecto de M. anisopliae para el control de R.
microplus en condiciones de laboratorio encontrandose que la mezcla de las
cepas Ma34+Ma14 de M. anisopliae present eficacia del 100% para el control
de garrapatas adultas y 90% para larvas (Ojeda-Chi, 2009). Sin embargo, se
requieren estudios adicionales para evaluar el efecto entomopatgeno del
hongo M. anisopliae para el control de R. microplus en la fase parsita (in vivo)
y no parsita (en pasto).
Por otra parte, se evaluaron los extractos crudos de 15 plantas de la
regin y se encontr que 9 plantas tuvieron eficacia >80% sobre larvas de R.
microplus. Con base en estos resultados, se seleccionaron tres plantas con
mayor eficacia (Petiveria alliacea, Havardia albicans y Caesalpinha gaumeri),
las cuales fueron evaluadas nuevamente mediante bioensayos a diferentes
concentraciones (20%, 10%, 5% y 2.5%) contra garrapatas R. microplus en las
fases de larvas y adultas (20% y 10%) obtenindose que P. alliacea (tallo-
colecta Octubre 2007) fue la planta que present mayor eficacia en adultas
(mortalidad 87%), inhibicin de la oviposicin (91%) e inhibicin de la eclosin
larval (16%) (Rosado-Aguilar et al., 2010). Posteriormente se determin que la
actividad ixodicida fue conferida por los compuestos no polares del extracto
hexnico (mortalidad larval de 93.6%). La muestra hexnica fue analizada por
cromatografa de gases obtenindose 9 fracciones que fueron evaluadas contra
larvas de R. microplus (10% de concentracin) obtenindose la mayor eficacia
(50 %) en la fraccin 5. Se requieren de estudios adicionales sobre la
purificacin de esta fraccin para aislar los compuestos activos responsables
de la actividad ixodicida contra R. microplus. Por otro lado, se desconoce el
comportamiento de la planta a travs del ao. Ante esta situacin se hace
necesario evaluar la eficacia contra R. microplus de los extractos crudos de la
planta y sus metabolitos en poca de secas y de lluvias, as como probarlos in
vivo contra animales infestados con garrapatas adultas R. microplus.
PROBLEMTICA
JUSTIFICACIN
Hongos entomopatgenos.
Los hongos entomopatgenos poseen extrema importancia en el control
de ectoparsitos; virtualmente todos los ectoparsitos son susceptibles a las
enfermedades fungosas y existen aproximadamente 700 especies de hongos
entomopatogenos, de las cuales solo el 10% se usan para el control de
insectos (Samish et al., 2004). Dentro de los ms importantes se mencionan a
Beauveria spp y Metarhizium spp (Rodrguez-Vivas et al., 2005).
M. anisopliae es un hongo entomopatgeno verdadero, aislado por
primera vez en 1879 del escarabajo Anisoplia austriaca Herbst por Metchnikoff,
quien sugiere su uso como agente microbiano contra el parsito del insecto.
Actualmente, se ha aislado de insectos, suelo, sedimentos del ro y material
orgnico en descomposicin. M. anisopliae presenta la habilidad de crecer en
forma saprfita, facilidad de diseminacin de las conidias, capacidad de
sobrevivencia en el suelo y reproduccin asexual (Kurtii y Keyhani, 2008).
En trabajos realizados en condiciones in vitro, M. anisopliae ha
demostrado ser efectivo para el control de R. microplus. M. anisopliae produce
100% de mortalidad en garrapatas adultas a los 6-14 das post-tratamiento
(Fernandes y Bittencourt, 2008). Asimismo, reduce la eclosin de huevos en
24-66% (Fernandes y Bittencourt, 2008) e invade los huevos produciendo el
90% de micosis (Galindo, 2005). Para el control de larvas, M. anisopliae
produce mortalidades de 100% a los 10 das post-tratamiento y disminuye
tiempo de sobrevivencia larval de 11.8 a 9.3 das. Adems se observ que este
hongo produce mortalidades 80-95% en el control de ninfas de R. microplus
(Kaaya y Hassan, 2000). Por otra parte, nuestro equipo de trabajo evalu las
cepas Ma34 y Ma14, encontramos 100% y 62% de mortalidad en garrapatas
adultas y larvas respectivamente, adems la cepa Ma34 redujo la postura de
huevo en un 55.5% a los 10 das pos-tratamiento R. microplus (Ojeda-Chi,
2009). Sin embargo, se requieren estudios adicionales para evaluar el efecto
entomopatgeno del hongo M. anisopliae para el control de R. microplus en la
fase parsita (in vivo) y no parsita (en pasto).
Petiveria alliacea L.
Petiveria alliacea), conocida comnmente como anamu, paich (en
Yucatn), es - es una hierba perenne de la familia Phytolaccaceae. La P.
alliacea puede ser encontrada en reas tropicales del Amrica central y del sur,
el Caribe, y frica. Las hojas y las races de la planta tienen un olor fuerte. Esta
planta contiene varios compuestos biolgicamente activos. La cantidad de
compuestos vara en las piezas de la planta. Los compuestos primarios en el
aceite esencial de las races incluyen: benzaldehdo, cido benzoico,
coumarina, trithiolaniacina, dibenzil sulfxido, hojas: benzyl-2-hydroxyethyl-
trisulfoxido, polifenoles, senfol y taninos; y en las semillas: iso-tiocianatos. En la
Repblica Dominicana, las races de P. alliacea se utilizan en los tratamientos
para los parsitos internos en ganado y como repelentes de insectos. Cuando
fue aplicada la raz de P. alliacea al suelo, las poblaciones de Meloidogyne
incgnitas fueron disminuidas compararon a los controles. Tambin, los
extractos del hexano de la planta demostraron una cierta actividad contra el
Trypanosoma cruzi in vitro. Los estudios han demostrado que los extractos
crudos del etanol exhiben una cierta actividad repelente contra R. microplus.
Dibenzyltrisulfoxido, uno de los compuestos en las races de la planta, es
insecticida (Cylas formicarius e Hypothenemus hampei) y acaricida (R.
microplus) (Ansci, 2006). En estudios hechos en Jamaica, Lyndon et al. (1999)
reportaron el potencial de actividad insecticida e ixodicida que tiene el
dibenzyltrisulfido (DBTS) aislado de las races de L. La CL50 a las 96 horas
obtenida para garrapatas adultas R. microplus tratadas tpicamente con DBTS
fue 0.920 g por garrapata. Las CL50 obtenidas de tres ixodicidas comerciales:
dimethoato, lindano y carbaril fueron 4.6, 9.3 y 6.9 g por garrapata
respectivamente. Las concentraciones inhibitorias de oviposicin al 50% y la
concentracin inhibitoria de eclosin al 50% in DBTS fueron 0.22 y 0.24 g por
garrapata respectivamente.
Con la colaboracin de investigadores del CICY y de la FMVZ-UADY
estn realizando estudios etnobotnicos para documentar las plantas nativas
con potencial ixodicida. Con ayuda de encuestas etnobotnicas, se han
identificado plantas que tienen efectos ixodicidas, las cuales estn siendo
evaluadas contra larvas de R. microplus en bioensayos in vitro. En la fase 1 del
proyecto se evaluaron extractos crudos metanlicos (hoja, tallo, raz y corteza)
de 15 plantas a una concentracin de 100 mg/ml (10%) contra larvas de R.
microplus. El tallo (99.2%) de Petiveria alliacea demostr la mayor actividad
ixodicida contra larvas de R. microplus. Sin embargo no han sido probado los
extractos de Petiveria alliacea a diferentes concentraciones (contra larvas y
adultas de R. microplus), en poca de secas y lluvias y en condiciones in vivo.
Se requiere tambin aislar y purificar los compuestos activos responsables de
la actividad ixodicida contra R. microplus.
PRODUCTOS ENTREGABLES.
Manejo del hato. El rancho deber contar con al menos una poblacin de 150
bovinos y con reas para el pastoreo de 200 a 250 ha con zacate Guinea
(Panicum maximum) y que utilice el sistema rotacional, donde todos los
animales permanezcan 2-4 das en cada potrero. Todos los animales debern
recibir suplementacin en poca de seca; su sistema de produccin deber ser
extensivo y la finalidad zootcnica la produccin de carne. Los animales
debern recibir vacunas tales como la aplicacin de la bacterina doble (carbn
sintomtico y pasteurelosis) cada seis meses, y anualmente la vacuna contra el
virus de la rabia paraltica bovina. Las razas de bovinos presentes en el rancho
debern ser cruzas de Bos indicus x Bos taurus.
Grupo Uno. Estar constituido por 15 bovinos que sern tratados por
aspersin de la cepa que present mejor eficacia y dilucin para el control de
R. microplus in vitro. La cepa del hongo ser diluido en Tween 80 (1 ml Tween/1
litro de agua) usando una bomba de mochila (5 litros por solucin preparada por
animal). Los tratamientos sern aplicados los das 0, 15, 30 and 45. Los animales
sern tratados en la tarde (6-7 PM) para evitar la radiacin solar (Polar et al.,
2005). De acuerdo a la literatura se asume que M. anisopliae persistir sobre el
bovino durante tres semanas (Kaaya et al., 1996).
Grupo Dos. Este grupo estar constituido por 15 bovinos que sern utilizados
como control y cada animal ser asperjado con Tween 80 (1 ml Tween/1 litro de
agua) usando una bomba de mochila. Esta manejo lo recibirn los das 0, 15, 30
and 45.
El nmero de garrapatas adultas se cuantificarn los das 0, 1, 3, 5, 7 y
14 postratamiento. Al mismo tiempo, se obtendrn al menos 10 garrapatas
hembras adultas para su identificacin taxonmica de acuerdo a Rodrguez-
Vivas y Cob-Galera (2005). Los bovinos sern inspeccionados loa das de
tratamiento para verificar cualquier reaccin adversa.
Anlisis de datos. En cada medicin, las garrapatas del grupo control y tratado
sern contadas y comparadas usando la prueba de U Mann Whitney, la cual
nos determinar si el efecto de los tratamientos es significante (SAS, 1991). La
eficacia del tratamiento con M. anisopliae ser evaluada usando la metodologa
descrita por Morin et al. (1996).
Anlisis Probit. Para obtener las CL50 y CL99 de cada colecta se utilizar la
metodologa Probit con los resultados de mortalidad de las cuatro
concentraciones. Los resultados de la prueba sern analizados mediante el
programa Polo-Plus (Le Ora Software, 2004), el cual proporcionar tambin
informacin de la desviacin estndar, la pendiente y los lmites de confianza,
los cuales indican si existen diferencias significativas en la sensibilidad a un
insecticida determinado (Hubert, 1980).
Alimentacin del ganado en establo. Durante los cinco das que estn
estabulados los animales sern alimentados con pasto Taiwn cortado (ad
libitum), alimento balanceado al 14 % de protena cruda, agua limpia y
minerales en roca (ad libitum). A todos los animales se les colocar una
gamarra y se les atar en comedero individual con cobertizo y piso de concreto.
Evaluacin de los tratamientos y variables a estudiar. Una vez
efectuados los tratamientos se recolectarn a los 90 minutos postratamiento
(Chungsamarnyart y Jiwajinda, 1992a) 10 teleoginas de las zonas tratadas de
cada animal. Las teleoginas que caigan antes del tiempo no sern evaluadas.
Las teleoginas sern depositadas en tubos de ensayo y se llevarn al
Laboratorio de Parasitologa de la FMVZ-UADY.
Posteriormente las 10 teleoginas de cada grupo sern pesadas y se
incluirn aquellas que tengan un peso de 200 mg 20. Se formarn 3 grupos
homogneos de 10 garrapatas que sern transferidas a una placa de 24 pozos;
y con la finalidad que las garrapatas llevarn a cabo el proceso de oviposicin
sern incubadas en una cmara hmeda (80-90% de humedad) en completa
oscuridad a temperatura ambiente de 28C (Cen et al., 1998). En todos los
grupos se realizarn tres repeticiones incluyendo a los controles (270
teleoginas en total).
Se realizar la lectura por medio de un estereoscopio del nmero de
teleoginas vivas y muertas en los tratados y controles a las 24 h, 48 h y hasta
los l5 das despus del tratamiento para observar tambin si hay inhibicin de
la puesta (Chungsamarnyart et al., 1990). Posteriormente sern comparados
los 2 grupos con el control para determinar el IM y la CPH que sern calculados
de la misma manera que en el experimento uno (Guedes et al., 2000). Adems
sern evaluados el periodo de preoviposicin y de incubacin del huevo. El
periodo de preoviposicin de la teleogina, se medir del da en que se colecto
la garrapata hasta el primer da de postura. Una vez que las garrapatas
terminen la oviposicin, sern separados 50 huevos en un vial de vidrio de 10
ml con tapa de algodn con el fin de medir el periodo de incubacin, desde la
fecha que inicio la postura, hasta el primer da que las larvas eclosionen
(Bazan, 2002). Para calcular el porcentaje de mortalidad y mortalidad media se
usarn las mismas frmulas que en el experimento 1 (Rodrguez-Vivas y Cob-
Galera (2005).
Para el caso de las hembras preingurgitadas se observarn diariamente
(7 am y 6 pm) por 5 das a los animales estabulados para contabilizar las
garrapatas muertas; y aquellas que lleguen a teleoginas sern recolectadas y
se les dar el mismo manejo mencionado anteriormente (Chungsamarnyart y
Jiwajinda, 1992b). Las teleoginas que cayeran durante el tiempo de no
observacin no sern evaluadas.
Una vez transcurridos los 5 das, los grupos control y de los extractos
sern baados con amitraz al 12.5% a la dosis recomendada (4 litros x animal)
para posteriormente ser liberados con el resto de la manada. Todo este
procedimiento se repetir a los tres meses siendo dos muestreos que sern
evaluados.
PERSONAL
Honorarios Asimilables a Sueldos.
CONCEPTO U. DE CANTIDAD PRECIO IMPORTE JUSTIFICACIN
MEDIDA UNITARIO
Asistente de pesos 1 7,000 84,000 Se requerir de un asistente de investigacin
investigacin especializado en bioensayos con ixodicidas y extractos
bioensayos y en la de plantas contra la garrapata R. microplus. As como
purificacin de los tambin para el aislamiento y purificacin de los
componentes activos compuestos activos de los extractos con actividad
ixodicida. Adems realizar las colectas de campo de
garrapatas y de plantas y ayudar en la redaccin de
informes parciales, de artculos de difusin y cientficos.
**PERSONAL TOTAL:
MATERIALES Y SUMINISTROS
Artculos Materiales y tiles Diversos.
CONCEPTO U. DE CANTIDAD P.UNITARIO IMPORTE JUSTIFICACIN
MEDIDA
Materiales y artculos Pesos 1 $86,000 $86,000 Durante la realizacin de la segunda etapa del proyecto
diversos se requerirn diversos artculos y materiales, que a
continuacin se describen: Bioensayos: viales de vidrio,
esptulas, recipientes de plstico, pinzas, papeles filtro,
guantes de latex natural y de plstico, cubrebocas,
papel aluminio, cristalera en general, algodn y alcohol
de caa, frascos para muestras, coladores, puntillas
para micropipetas, viales de microcentrfuga, papel de
cera parafilm, frascos de almacenamiento, sanitas,
detergentes y tapabocas. Fotoqumica: Se requiere la
compra de disolventes grado analtico industrial, as
como disolventes deuterados para la realizacin de la
pruebas espectroscpica elucidacin estructural,
materiales para la realizacin de las purificaciones
cromatogrficas que incluye, gel de slice, sephadex
LH20, cromatoplacas para cromatografa preparativa,
cromatoplacas para cromatografa de placa delgada
con indicador de UV, tanque de nitrgeno y material de
cristalera. Muestreo de campo: tubos de ensayo,
bolsas se plstico, marcadores, libretas, clips, maletn
para muestreo, cinta maskintape, nevera, arreador
elctrico, lmparas, bateras y sogas. Asimismo, se
requerir material de impresin (copias fotostticas,
catuchos de tinta, toner, hojas en blanca, impresin de
documentos de difusin tales como posters). Se
requerir de un termohigrmetro para medir la
temperatura y humedad en el mantenimiento de las
garrapatas en el laboratorio. Bomba de aspersin para
el tratamiento de los animales. Ixodicidas para el
tratamiento de animales.
SUBTOTAL: $86,000
SERVICIOS GENERALES
Servicios Externos y Comerciales.
CONCEPTO U. DE CANTIDAD PRECIO IMPORTE JUSTIFICACIN
MEDIDA UNITARIO
SUBTOTAL:
SUBTOTAL:
Ediciones e Impresiones.
CONCEPTO U. DE CANTIDAD PRECIO IMPORTE JUSTIFICACIN
MEDIDA UNITARIO
Impresiones pesos 1 10,000 10,000 Se difundirn los resultados y capacitarn a
productores en mtodos alternativos de control de
garrapatas. Para ello se elaborar un manual sobre
mtodos alternativos de control de garrapatas y se
imprimirn 300 ejemplares (primer ao) que sern
entregados a las asociaciones ganaderas
pertenecientes a la UGRY y a la UGROY, y a los
productores personalmente.
SUBTOTAL: 10,000
**SERVICIOS GENERALES TOTAL: 10,000
ENTRENAMIENTO Y CAPACITACIN.
Pasajes Para Eventos Tcnicos Cientficos.
SUBTOTAL:
SUBTOTAL:
**ENTRENAMIENTO Y CAPACITACIN TOTAL:
INFRAESTRUCTURA.
Equipo y Maquinaria.
CONCEPTO U. DE CANTIDAD PRECIO IMPORTE JUSTIFICACIN
MEDIDA UNITARIO
Equipo de laboratorio grs 1 25,000 25,000 Durante el proyecto se procesara material vegetal
(Balanza analtica) obteniendo extractos puros que necesitan pesarse en
miligramos (cantidades exactas) para realizar los
bioensayos contra larvas y adultas de R. microplus.
Adems se necesita pesar las garrapatas teleoginas
que sern utilizadas en las tcnicas de inmersin de
adultas para obtener los porcentajes de inhibicin de la
oviposicin, y pesaje de hongos liofilizados.
**INFRAESTRUCTURA TOTAL:
SUBTOTAL:
Chagas, A.C.S., Passos, M.W.M., Prates, H.T., Leite, R.C., Furlong, J., Fortes,
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