Cap - 10 Criopreservación de Embriones Bovinos
Cap - 10 Criopreservación de Embriones Bovinos
Cap - 10 Criopreservación de Embriones Bovinos
Introducción
Técnicas de criopreservación
Refrigeración
Congelación convencional
25 “Seeding"
-7
0,3 - 0,6 ºC/min
- 30
-196
15 25 90
70
% de preñez
65 n:119
60
55 n:116
50 n:114
45 n:28
n:102
40
0 3 4 5 7 9 10
Método estándar
Este método posibilitó a Wilmut y Rowson (1973) obtener el primer ternero nacido
de la transferencia de un embrión congelado. El protocolo original comprendía varios
pasos que se detallan en el Cuadro 1.
154 Cabodebila & Teruel
Cuadro 1: Método de congelación estándar desarrollado por Wilmut y Rowson (1973)
embrión
Vitrificación
1. Exponer los embriones durante 10 min a temperatura ambiente (20°C), a una solución:
10% glicerol - 20% 1,2 propanodiol en PBSS (medio de vitrificación intracelular).
2. Pasar los embriones a una solución: 5% glicerol - 25% 1,2 propanodiol en PBSS (medio
de vitrificación extracelular).
3. Envasar en pajuelas de 0,25 ml de acuerdo al siguiente esquema:
a b c a a
3 cm 1 cm 7 cm
a) Solución extractora del crioprotector (1M sucrosa en PBS.)
b) Burbujas de aire (0,25cm)
c) Embrión en una gota del medio de vitrificación extracelular.
4.Sumergir inmediatamente la porción a-b de menor tamaño en el nitrógeno líquido y
luego progresivamente el resto de la pajuela.
5. Calentar en baño María a 20ºC.
6. Vaciar el contenido de la pajuela en una placa y esperar 10 min a 20ºC.
7. Lavar el embrión 1 a 3 veces en PBSS.
8. Transferir utilizando el método no quirúrgico.
De los nuevos protocolos surgidos debe mencionarse el de Rall (1992), quien utilizó
una solución de vitrificación que contenía glicerol, incorporado en 3 pasos de
concentraciones crecientes, como único crioprotector. Obtuvo un 66% de desarrollo en el
cultivo in vitro y 47% de preñez en las receptoras transferidas. Resultados similares -42,5%
de preñez- fueron informados por de Leeuw y col. (1992). El protocolo de Rall, (1992) ha sido
comparado con los métodos de congelación estándar y de transferencia directa, alcanzando
Criopreservación 163
similares porcentajes de preñez (Van Wagtendonk y col.,1994) y de desarrollo en el cultivo
in vitro (Dinnyes y col., 1995).
Otros investigadores incorporaron distintos azúcares a la formulación del medio de
vitrificación (Tachikawa y col., 1993; Saito y col., 1994; Saha y col., 1995 y 1996b; Saha y
Suzuki, 1997). La presencia de azúcares tiene como objetivo reducir el efecto tóxico de los
crioprotectores permeables, promoviendo la deshidratación de los embriones por ósmosis
(Kasai y col., 1990). Además, las macromoléculas tienden a darle mayor estabilidad a las
soluciones de vitrificación (Fahy y col., 1984). En el Cuadro 4 se presenta una reseña de
cada protocolo incluyendo los resultados obtenidos.
Tachikawa y col. (1993), además de la solución de vitrificación descrita en el Cuadro 4,
utilizaron otra reemplazando el etilenglicol por glicerol. Diversas pérdidas registradas en
ambos casos, hicieron que solamente el 21% (6/28) de los embriones transferidos
(transferencia bilateral) resultaran en terneros nacidos vivos. Este protocolo fue utilizado para
vitrificar embriones producidos in vivo e in vitro (Mahmoudzadeh y col., 1993 y 1995). En el
último caso, se observó un incremento del 20% en la reexpansión del blastocele cuando la
vitrificación se efectuó en 2 etapas. Otra conclusión importante de estos trabajos fue que los
porcentajes de reexpansión y de protrusión en el cultivo in vitro no variaban si la extracción
de los crioprotectores se efectuaba en PBSS, sin sucrosa.
El efecto beneficioso de efectuar la vitrificación de los embriones producidos in vitro en
2 etapas fue corroborado posteriormente (Delval y col., 1996; Rodriguez, 1996; Ohboshi y
col., 1997 y 1998).
Otros autores han utilizado protocolos que contemplan la transferencia directa del
embrión, sin necesidad de retirarlo de la pajuela para efectuar la extracción del crioprotector
(Ishimori y col., 1993; Kuwayama y col., 1994). En el Cuadro 5 se presenta una reseña de
estos protocolos incluyendo los resultados obtenidos.
En un intento por mejorar la resistencia de los embriones producidos in vitro a la
vitrificación, se incorporó el factor de crecimiento IGF-I al medio de cultivo sin obtener
resultados exitosos (Willemsen y col., 1995).
Por otra parte, teniendo en cuenta que la exposición de los embriones a altas
concentraciones de crioprotectores y su posterior vitrificación pueden afectar el citoesqueleto
(Overstrom y col, 1993; Dobrinsky, 1996), se han utilizado estabilizadores de los
microfilamentos y microtúbulos que componen el mismo observándose un efecto beneficioso
en los embriones cultivados in vitro pero no en los transferidos (Dobrinsky y col., 1995).
Estos resultados, sumados a otros donde la transferencia de los embriones vitrificados
a receptoras sincronizadas se realizó con escaso éxito (Ostashko y col., 1992, Cutini y col.,
1998), demuestran la variabilidad que se registra aún con esta técnica. A pesar de ello, el
espectro de utilización de la vitrificación se amplía día a día siendo empleada en la
criopreservación de embriones ovinos (Martinez y col., 1996, Schiewe y col., 1991) y
porcinos (Dobrinsky y Johnson, 1993). También han sido vitrificados exitosamente ovocitos
bovinos destinados a ser fecundados in vitro (Hamano y col., 1992; Vajta y col., 1998) y
ovocitos en estado de pronúcleo, 15 horas post-fecundación in vitro (Saha y col., 1996a). En
la metodología desarrollada por Vajta se emplean velocidades de enfriamiento y
calentamiento extremas (más de 20.000 ºC/min), esto permite reducir el período de
exposición de los embriones a la solución de vitrificación a menos de 30 segundos. Según
Massip (1999), el futuro de esta metodología resulta promisorio teniendo en cuenta que un
25% de los ovocitos vitrificados alcanzó el estadio de blastocisto luego de la fecundación in
vitro y que permitió vitrificar exitosamente estadios tempranos de desarrollo embrionario.
164 Cabodebila & Teruel
Si bien generalmente las soluciones son suplementadas con suero o albúmina sérica,
se ha demostrado que tanto la congelación convencional como la vitrificación pueden
efectuarse en soluciones sin suplementación proteica (Palaz y col., 1986).
Medio de
extracción del Resultados Referencias
Medio de vitrificación y Cultivo in vitro
crioprotector y Transferencia
tiempo de exposición
tiempo de n % n %
exposición
40% EG + 30%F + 0,5M S en 0,5 M en PBS: 1 nc 74-77l 10 80,0 Tachikawa y col. (1993)
PBS: 1 ó 2 min. ó 2 min.
Medio de extracción
Medio de vitrificación y del crioprotector y Resultados Referencias
tiempo de exposición tiempo de exposición Cultivo in vitro Tranferencia
n % n %
25% G + 25% EG en 0,5M S en PBSS: 5 25 20{ Ishimori y
PBSS: 2 min. min. col. (1993)
El protocolo desarrollado por Massip y col. (1987) ha sido aplicado con éxito a la
vitrificación de embriones sometidos a micromanipulación, ya sea para la identificación del
sexo (Agca y col., 1995) o la producción de individuos idénticos (Massip y col., 1988). Por su
parte, el protocolo desarrollado por Vajta y col., (1998) fue aplicado exitosamente en la
vitrificación de embriones donantes de núcleo para efectuar clonación (Massip, 1999).
La transferencia de embriones vitrificados según lo descrito por Massip y col. (1987)
fue utilizada también para producir mellizos. Uno ó 2 embriones fueron transferidos
dependiendo si la receptora había sido o no inseminada previamente obteniéndose
resultados similares a los logrados con la transferencia de embriones congelados, utilizados
con el mismo fin (Agca y col., 1996).
Congelación ultrarrápida
Esta técnica fue desarrollada por Takeda y col. (1984), se asemeja a la vitrificación
(Figura 5), salvo que en la congelación ultrarrápida se produce cristalización del agua intra
y extracelular.
Temperatura
Estabilización
(ºC) 25
-9
“Seeding”
-30
Vitrificación (---)
Congelación ultrarrápida ( _ )
-196
15 25 Tiempo (min)
Fig 5. Tasas de enfriamiento utilizadas en la vitrificación y en la congelación ultrarrápida
de embriones.
166 Cabodebila & Teruel
Los embriones son deshidratados parcialmente y luego se los expone a una mezcla
compuesta por una solución 2 a 4,5M de un crioprotector permeable como el glicerol,
propanediol, DMSO o etilenglicol y 0,25 a 0,5M de un soluto extracelular no permeable
como la sucrosa, trealosa, lactosa o galactosa (Shaw y col, 1991; Rayos y col., 1992).
Esta segunda deshidratación, deja a los embriones en condiciones de ser enfriados
rápidamente. Las pajuelas son colocadas en el cuello del contenedor de nitrógeno líquido.
Existe un lugar óptimo para colocar la pajuela según el nivel de nitrógeno existente en el
contenedor, para que la cristalización ocurra espontáneamente sin producirse la elevación
de la temperatura relacionada con el cambio de fase. Las pajuelas, luego de permanecer
cinco minutos en el cuello del termo, son sumergidas en el nitrógeno. Al producirse la
congelación del agua extracelular durante el congelado rápido, la osmolaridad de la
solución de congelación aumenta, causando la pérdida de agua congelable de las células
embrionarias. No obstante, bajo estas condiciones la formación de hielo intracelular es
posible pudiendo ocurrir daño embrionario si se aplican posteriormente, tasas de
calentamiento inapropiados.
El método de congelación ultrarrápida ha sido utilizado exitosamente para congelar
embriones de animales de laboratorio (Takahashi y Kanagawa, 1990; Zuh y col., 1990).
En bovinos, se lo ha evaluado, cultivando los embriones descongelados y los resultados
obtenidos fueron dispares según el estadio de desarrollo del embrión congelado (Chupin,
1986). Buscando perfeccionar la técnica, se modificó el tiempo de exposición a la segunda
solución deshidratante a la vez que se varió la temperatura a la que ésta ocurría (Chupin,
1987). No obstante, las tasas de supervivencia obtenidas fueron de alrededor del 30%
(Niemann, 1991).
Esta técnica también ha sido aplicada en embriones producidos in vitro, variando las
concentraciones de crioprotectores y tratando de lograr la combinación óptima de los
mismos, lográndose porcentajes de protrusión de alrededor del 70% utilizando 1.5M de
glucosa y 0.25M de sucrosa (Huang y col., 1992)
Conclusiones
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