Tesis Compuestos Aromatios Vino, Terpenos, Etc

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MEMORIA PRESENTADA POR LA LICENCIADA

ZULEMA PIEIRO MNDEZ
PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA EN CIENCIAS QUMICAS
______________________________________________________
Fdo. Zulema Pieiro Mndez

DR. D. CARMELO GARCA BARROSO y DR. D. MIGUEL PALMA LOVILLO,
Profesores del Departamento de Qumica Analtica de la Universidad de Cdiz
CERTIFICAN:
Que el presente trabajo de investigacin titulado Desarrollo de nuevos mtodos

de extraccin para el anlisis de compuestos de inters enolgico, ha sido realizado
bajo su direccin por D Zulema Pieiro Mndez para optar al grado de Doctora en
Ciencias Qumicas.
Y para que conste, expiden y firman la presente certificacin

En Puerto Real, a 13 de Junio de 2005
Fdo.: Dr. D. Carmelo Garca Barroso Fdo.: Dr. D. Miguel Palma Lovillo
DR. D. JOSE LUIS HIDALGO HIDALGO DE CISNEROS, Profesor de Qumica
Analtica y Director del Departamento de Qumica Analtica de la Universidad de Cdiz
CERTIFICA:
Que el presente trabajo de investigacin titulado Desarrollo de nuevos mtodos

de extraccin para el anlisis de compuestos de inters enolgico, constituye la
memoria que presenta D Zulema Pieiro Mndez para optar al grado de Doctora en
Ciencias Qumicas, habindose realizado la investigacin en el Departamento de
Qumica Analtica de esta Universidad bajo la direccin de los profesores Dr. D.
Carmelo Garca Barroso y Dr. D. Miguel Palma Lovillo.
Y para que conste, expido y firmo la presente certificacin

En Puerto Real, a 13 de Junio de 2005
Fdo.: Dr. D. Jose Luis Hidalgo Hidalgo de Cisneros

Deseo expresar mi ms sincero agradecimiento a todas aquellas personas que me
han ayudado en cualquier forma durante la realizacin de todo el trabajo que culmina
con la escritura de esta memoria.
A Patricia, por saber compartir todos los interminables das en el laboratorio..,

por animarme mientras cortaba y preparaba mis interminables muestras de uva, por la
alegra que transmite cuando habla, por compartir conmigo muchos intereses (quin
te convencera para estudiar Enologa????)., por nuestras charlas de ponerse al
da., por su amistad, hace falta que siga????
A Angie, por todos sus nimos, por su conversacin,... se te echa de menos!!. A

Cristina, por preguntar siempre como lo llevo, por estar siempre dispuesta a repetirme
una y mil veces alguna duda sobre el electroqumico. por ser mi nica compaera en
el CAIV durante una gran temporada
A Mauricio, por estar siempre ah, tan pendiente de todos por las copitas del
medioda, por cederme, algunas veces, su nmero en la cola para ser atendido por el
jefe, por su alegray tambin extiendo mi agradecimiento a Tania, no me olvido!..
A Gerardo, por ser mi compaero en el CAIV, cuando no estaba ni Cristina,

por interesarse siempre por como va la cosa, por no mantenerme ocupado mucho tiempo
al jefe
A Mach, por las charlas que tenemos a media tarde, por estar siempre dispuesta
a ayudarte, por sus nimos, por saludarme siempre cuando pasa por los pasillos del
CAIV.
A Skike, por compartir las confidencias y gustos cinematogrficos, por animar el

laboratorio con su arrolladora verborrea, por esa alegra que irradia, por renovar los
aires del laboratorio. por pelotearme diciendo que siempre llego la primera y
siempre me voy la ltima.
A Manolo Padilla, por dejarme muchas veces el turno en el cromatgrafo, por

preguntar siempre como me va, por sus amenas charlas viajeras, por su punto de vista
en muchos aspectos.
A Ana, por ayudarme pacientemente a pelar mis uvas, por su alegra, y

tambin a nuestras ltimas incorporaciones, Maitee, Al, Raquel y Pepa, por su
constante inters y apoyo.
A mis compaer@s de Qumica (M Jos, Nara, Rosario) y de Enologa (Isa,
Auxi, OC, Manolo), por preguntarme siempre, por interesarse, por darme nimos
Y aunque he empezado por, como dicen por aqu, las nuevas generaciones, no
quiere eso decir que me olvide de todos los dems compaeros de fatigas:
A Ramn, por su inters constante, por su activa participacin en los debates,

por compartir con todos su alegra y confianza, por participar cada lunes en el debate
cinematogrfico, por ayudarme siempre
A Reme, por estar siempre dispuesta a resolverme dudas, por recordarme

como funciona el cromatgrafo, por aportar siempre el toque realista de las cosas, por
animarme
A Valme, por resolverme mis dudas informticas, por las tardes de animadas
charlas que hacan ms llevadero el trabajo, por llevarme en su coche cuando no estaba
automovilizada.
A Domi, por demostrar que pase lo que pase, lo mejor es tomrselo con
muuucha tranquilidad, por ayudarme siempre que ha podido, por ser mi codirector de
beca (mi salvacin!).
A M Carmen, por ayudarme siempre que se lo he pedido, por animarme con esa
risa que contagia, por compartir conmigo su despacho,
Y ya le toca el turno a los jefes:
A Carmelo, por convencerme para hacer el doctorado mientras estudiaba

Enologa, por confiar en m, por prestarme su apoyo cuando ha hecho falta, por todas las
firmas.
A Miguel, qu te puedo decir?, por todo por estar siempre ah, pacientemente,
mientras iba tropecientas veces a preguntarte algo por animarme siempre, por
ensearme, o recordarme, una y mil veces como funciona el cromatgrafo, el
Millenium, el gases, el extractor, etc, por las interminables correcciones, por
animarme a ir a EEUU (gracias!), por tantas charlas y risas.
No poda olvidarme tampoco de quienes tengo ms cerca:
A mi gran familia, a todos mis hermanos, por preguntar siempre pero cuando
vas a acabar.?, por animarme, por entender que nunca est en casa, por confiar en
m, por aguantar mis malos humores, A mi madre, por la paciencia que tiene
conmigo, por aguantarme (en muchos aspectos) y por estar siempre ah. A Mara, mi
otra mitad, por estar siempre presente aunque sea en la lejana (que tendr Francia!), por
sus e-mail de nimo, por intentar entender que son los dichosos polifenoles, por
aconsejarme. por completarme.
A Manolo, por animarme, por su inters (si hasta entiende casi todo lo que
hago!), por estar siempre ah
Y a todos los dems que no he nombrado y que me han ayudado de alguna

forma, gracias.
Por ltimo, tambin quisiera agradecer su apoyo a:
La Junta de Andaluca, por haberme concedido la beca que me ha permitido

desarrollar una de mis pasiones... la investigacin, gracias, gracias, gracias!.
Y al CIFA Rancho de la Merced por proporcionarme todas las muestras de

uva y de vino analizadas, y todos los datos que he necesitado. En especial, quisiera
expresar mi ms sincero agradecimiento a D. Alberto Garca de Lujn y a Da. Beln
Puertas. Tambin a Elas por estar siempre dispuesto a ayudarme y a guardarme las
muestras cuando yo no poda ir personalmente. Gracias!!!.
INDICE
I. INTRODUCCION
I.1 JUSTIFICACION Y OBJETIVOS .......................................................................................... 1
I.2 COMPUESTOS FENLICOS ................................................................................................ 5

I.2.1 Introduccin .................................................................................................................... 5
I.2.2 Clasificacin.................................................................................................................... 7
I.2.2.1 Fenoles y cidos hidroxibenzoicos ......................................................................... 8
I.2.2.2 Ac. Hidroxicinamicos ............................................................................................. 9
I.2.2.3 Estilbenos ............................................................................................................... 10
I.2.2.4 Flavonoides............................................................................................................. 11
I.2.2.4.1 Antocianidinas ............................................................................................... 12
I.2.2.4.2 Flavonoles ...................................................................................................... 14
I.2.2.4.3 Flavanoles (flavan-3-oles).............................................................................. 14
I.2.2.4.4 Flavonas e isoflavonoides .............................................................................. 15
I.2.2.5 Taninos.............................................................................................................. 16
I.2.3 Propiedades de los compuestos fenlicos........................................................................ 17
I.2.4 Distribucin de compuestos fenlicos en uvas y vinos ................................................... 22
I.2.5 Inters del anlisis de compuestos fenlicos ................................................................... 25
I.3 DETERMINACION DE COMPUESTOS FENLICOS........................................................ 26

I.3.1 Tcnicas de preparacin de muestras .............................................................................. 27
I.3.1.1 Muestras lquidas.................................................................................................... 28
I.3.1.1.1 ELL ................................................................................................................ 28
I.3.1.1.2 EFS................................................................................................................. 30
I.3.1.2 Muestras slidas ..................................................................................................... 34
I.3.1.2.1 EAU ............................................................................................................... 35
I.3.1.2.2 EAM............................................................................................................... 35
I.3.1.2.3 EFSC.............................................................................................................. 37
I.3.1.2.4 EFP................................................................................................................. 39
I.3.2 Separacin, identificacin y cuantificacin..................................................................... 48
I.4 COMPUESTOS RELACIONADOS CON EL AROMA PRESENTES

EN UVAS Y VINOS .............................................................................................................. 53
I.4.1 Introduccin. Tipos de Aromas ....................................................................................... 53
I.4.2 El Aroma en la uva.......................................................................................................... 54
I.4.2.1 Aromas varietales libres ......................................................................................... 55
I.4.2.1.1 Compuestos terpnicos .................................................................................. 56
I.4.2.1.2 Pirazinas......................................................................................................... 60
I.4.2.1.3 C13-norisoprenoides ...................................................................................... 61
I.4.2.2 Precursores del aroma............................................................................................. 64
I.4.2.2.1 Monoterpenoles, dioles y polioles terpnicos ................................................ 64
I.4.2.2.2 Carotenoides .................................................................................................. 68
I.4.2.2.3Otros precursores (alcoholes, compuestos fenlicos, tioles voltiles) ............ 70
I.4.3 Aroma prefermentativo ................................................................................................... 71
I.4.4 Aroma fermentativo ........................................................................................................ 71
I.4.5 Influencia de las prcticas viticulturales y tecnolgicas en la componente aromtica .... 72
I.4.5.1 Influencia de las prcticas viticulturales ................................................................. 72
I.4.5.2 Influencia de las prcticas tecnolgicas.................................................................. 74
I.5 DETERMINACIN DE COMPUESTOS RELACIONADOS CON EL AROMA................ 75
I.5.1 Tcnicas de preparacin de muestras .............................................................................. 77
I.5.1.1 Tcnicas basadas en la destilacin.......................................................................... 78
I.5.1.1.1 Por destilacin con vapor .............................................................................. 78
I.5.1.1.2 Destilacin-extraccin simultnea ................................................................. 80
I.5.1.1.3 Otros mtodos de destilacin ......................................................................... 81
I.5.1.2 ELL......................................................................................................................... 81
I.5.1.3 EFS ......................................................................................................................... 85
I.5.1.4 Tcnicas basadas en el estudio del espacio de cabeza ............................................ 90
I.5.1.5 EAU........................................................................................................................ 95
I.5.1.6 EAM ....................................................................................................................... 96
I.5.1.7 EFSC....................................................................................................................... 97
I.5.2 Procedimiento cromatogrfico ........................................................................................ 99
Bibliografa Introduccin .............................................................................................................. 105
II PARTE EXPERIMENTAL .................................................................................................................. 131
II.1 Reactivos, disolventes y sustancias patrones.......................................................................... 131
II.2 Aparatos e instrumentos ......................................................................................................... 135
II.3 Tcnicas experimentales......................................................................................................... 141

II.3.1 Procedimientos de extraccin ........................................................................................ 141
II.3.1.1 para la determinacin de compuestos fenlicos .................................................... 141
II.3.1.1.1 para la EFP sobre muestras (orujos) ............................................................. 141
II.3.1.1.2 para el acoplamiento EFP-EFS sobre muestras (uvas) ................................. 141
II.3.1.1.3 EFP, extraccin asistida por ultrasonidos y agitacin magntica (pepitas) .. 142
II.3.1.2 Determinacin de compuestos relacionados con el aroma .................................... 143
II.3.1.2.1 Determinacin de precursores: EFS sobre muestras (mostos) ...................... 143
II.3.1.2.2 Determinacin de aromas libres: EFS sobre muestras (vinos)...................... 143
II.3.2 Procedimientos cromatogrficos.................................................................................... 144
II.3.2.1 para la determinacin de compuestos fenlicos en general .................................. 144
II.3.2.2 para la determinacin de trans-resveratrol ............................................................ 145
II.3.2.3 para la determinacin de catequinas...................................................................... 145
II.3.2.4 para la determinacin de compuestos relacionados con el aroma ......................... 146
II.3.3 Procedimiento de hidrlisis y medida espectrofotomtrica para la
determinacin de los precursores aromticos............................................................... 147
II.3.3.1 Procedimiento de hidrlisis ................................................................................... 147
II.3.3.2 Procedimiento de medida espectrofotomtrica...................................................... 147
II.4 Muestreo................................................................................................................................. 149
II.5 Preparacin de las muestras y cmaras de extraccin............................................................. 155

II.5.1 muestras de orujo ........................................................................................................... 155
II.5.2 muestras de uva y pepitas............................................................................................... 155
II.5.3 preparacin de la cmara para la EFP (orujos, pepitas) ................................................. 155
II.5.4 preparacin de la cmara para la EFP-EFS (uvas) ......................................................... 156
III RESULTADOS Y DISCUSION ......................................................................................................... 159

III.1 Extraccin de compuestos fenlicos en orujos con disolventes a alta temperatura (EFP). ... 159
III.1.1 Introduccin ................................................................................................................. 159
III.1.2 Estudio de la estabilidad de los compuestos fenlicos ................................................ 160
III.1.3 Propiedades analticas del mtodo................................................................................ 164
III.1.4 Aplicacin de la EFP a muestras reales (orujos) .......................................................... 165
III.2 Muestras slidas: EFP y EAU............................................................................................... 171

III.2.1 Introduccin.................................................................................................................. 171
III.2.2 Determinacin de catequinas mediante EFP, estudio comparativo con AM y EAU .... 172
III.2.2.1 Optimizacin de mtodo de CLAE ..................................................................... 172
III.2.2.2 Comparacin de los mtodos de extraccin ......................................................... 174
III.2.2.3 Optimizacin de la EFP y aplicacin a pepitas .................................................... 176
III.2.3 Evaluacin de las catequinas potencialmente extrables de pepitas de uva
mediante EAU.............................................................................................................. 179
III.2.4 Estudio de la influencia de la liofilizacin en la extractabilidad de catequinas ............ 186
III.3 Extraccin con fluidos presurizados acoplada con extraccin en fase slida........................ 189
III.3.1 Introduccin ................................................................................................................. 189
III.3.2 Desarrollo del mtodo para la determinacin de compuestos fenlicos ....................... 190
III.3.3 Diseo del mtodo EFP-EFS ........................................................................................ 203
III.3.4 Metodologa.................................................................................................................. 206
III.3.5 Caractersticas del mtodo............................................................................................ 207
III.3.6 Aplicacin a muestras reales (uvas liofilizadas)........................................................... 208
III.3.6.1 para la determinacin de compuestos fenlicos .................................................. 208
III.3.6.2 seguimiento de la maduracin de uvas .............................................................. 214
III.3.6.3 para la determinacin de trans-resveratrol ......................................................... 223
III.4 Aplicacin de la EFS en uvas y vinos ................................................................................... 231

III.4.1 Aplicacin de la EFS para la determinacin de glucsidos en uvas
durante la maduracin........................................................................................................ 231
III.4.1.1 Introduccin ......................................................................................................... 232
III.4.1.2 Preparacin de las muestras (mostos) ................................................................. 232
III.4.1.3 Determinacin de la glucosa glucosdica total (GGT) ......................................... 233
III.4.2 Aplicacin de la EFS a la determinacin de terpenos y otros voltiles en vinos .......... 247
III.4.2.1 Introduccin ......................................................................................................... 247
III.4.2.2 Determinacin de terpenos mediante EFS y CG.................................................. 248
III.4.2.2.1 Seleccin de fase slida y eluyentes........................................................... 249
III.4.2.2.2 Optimizacin de las variables de extraccin ............................................... 252
III.4.2.2.3 Propiedades analticas del mtodo............................................................... 255
III.4.2.2.4 Aplicacin a muestras reales (vinos) ........................................................... 256
III.4.2.3 Aplicacin del mtodo desarrollado a la determinacin
de la fraccin voltil de vinos jvenes monovarietales ................................................ 260
Bibliografa Experimental ............................................................................................................. 275
IV. CONCLUSIONES ............................................................................................................................. 281
ANEXO I
ANEXO II
I. INTRODUCCIN
Introduccin
I. Introduccin
I.1 Justificacin y objetivos

El sector vitivincola en Espaa est desarrollando una intensa modificacin en
sus condiciones y sistemas de produccin. Estas modificaciones se deben en primer
lugar al cambio en los hbitos de consumo de los espaoles y en segundo lugar a la
competencia, tanto a nivel nacional como internacional, de bodegas originarias de
pases que hasta hace pocos aos tenan poca relevancia en el mercado del vino.
Entre los cambios ms importantes se encuentra la introduccin en el mercado de

nuevos vinos, bien sea por la reorientacin de las producciones de las vias explotadas
anteriormente, bien por la puesta en produccin de nuevos viedos, con nuevos sistemas
de cultivo o con variedades no utilizadas anteriormente.
Todo esto lleva al personal tcnico de la bodega a enfrentarse con nuevas

problemticas que tiene que resolver, a veces, con una informacin limitada sobre
diversos parmetros de inters.
En la memoria que se presenta se ha pretendido dotar de nuevos sistemas para

generar informacin de inters para el sector vitivincola, tanto en la maduracin de la
uva, como en la posterior etapa de vinificacin. Estos nuevos sistemas son mtodos de
anlisis, basados en unos casos en tecnologas desarrolladas recientemente y, en otros,
en nuevas aplicaciones a soluciones tecnolgicas ya empleadas anteriormente, cuyos
parmetros han sido compuestos con una relacin con las propiedades organolpticas y
de estabilidad de los vinos; como son los compuestos fenlicos, y los compuestos
aromticos y sus precursores.
Concretamente, entre las nuevas tecnologas que se han aplicado en la presente

memoria, destaca la extraccin con fluidos presurizados, tcnica sta de amplia
aplicacin en anlisis ambiental y que se est introduciendo en los ltimos aos en el
anlisis de alimentos.
1
Justificacin y objetivos
Con esta tcnica se ha pretendido afrontar el desarrollo de mtodos de anlisis que

permitieran determinar la composicin fenlica en uvas enteras. Este es, precisamente,
uno de los aspectos ms interesantes que se plante abordar en la tesis, especficamente
el desarrollo de mtodos que permitan tratar la uva como tal y no el mosto.
Hasta el momento, para estudiar la maduracin de la uva, se recurre al anlisis de

la composicin del mosto resultante, es decir, no se analiza la uva, sino el producto de
su prensado. Este cambio en la muestra sometida al anlisis viene impuesto, en primer
lugar, por la ventaja que supone el tratamiento de una muestra lquida o semi-lquida,
como es el mosto, frente a una muestra semi-slida como es la uva. En segundo lugar,
no hay que olvidar que a la hora de la vinificacin, el inters se centra no tanto en la
composicin de la uva, sino en la composicin del mosto que se va a vinificar y, por
ello, en la preparacin de la muestra a nivel de laboratorio se ha pretendido reproducir,
lo ms cercano posible, el procesado de la muestra a nivel industrial.
El anlisis de la uva entera puede permitir evaluar la composicin global de la

misma en cuanto a los compuestos de inters en la obtencin del mosto, como son
algunos compuestos fenlicos, y as una vez sometida a los procesos de prensada, el
anlisis del mosto logrado, as como de los residuos de la vinificacin, pueden ser
indicadores de la etapa de obtencin del mosto.
Es por ello que al inicio de este estudio se plante la necesidad de abordar la

determinacin de parmetros de inters enolgico en uvas y en residuos slidos de la
vinificacin. Con esta informacin, desde la responsabilidad tcnica de la bodega, se
podran plantear modificaciones en el proceso de obtencin del mosto con el fin de
variar su composicin durante su obtencin, extrayendo de la uva aquellos compuestos
de inters y controlando la presencia de otros menos interesantes. Estas actuaciones
seran mucho ms difciles de plantear sin el conocimiento previo de la composicin de
la uva.
En relacin a los residuos slidos de la vinificacin, podra, llegado el momento,

plantearse como una fuente para la recuperacin de determinados compuestos de inters
econmico, y como una forma, por tanto, de incrementar la rentabilidad de las bodegas.
Debido a ello, durante el desarrollo de los mtodos analticos que se plantearon al inicio
de este estudio, se decidi prestar una especial atencin a estas muestras y determinar,
dentro de lo posible a nivel analtico, las mejores condiciones de recuperacin de
diversos compuestos de inters a partir de las mismas.
2
Introduccin
Respecto a la utilizacin de la tcnica de extraccin con fluidos presurizados con
vistas a facilitar el uso de la misma, se decidi intentar desarrollar mtodos lo ms
rpidos y selectivos posibles, de forma que, llegado el caso, un laboratorio centralizado
pudiera realizar un gran nmero de anlisis en un corto periodo de tiempo y facilitar, de
este modo, la informacin al mayor nmero de bodegas posible. Para ello, buscando una
mayor selectividad, se plante la utilizacin de tcnicas acopladas de forma directa,
reduciendo al mnimo la manipulacin de las muestras. Y buscando una mayor rapidez
de las determinaciones se pens en la utilizacin de sistemas cromatogrficos ms
rpidos (introduccin de nuevas columnas de separacin) y selectivos (modificacin de
los sistemas de deteccin).
El otro gran grupo de compuestos planteados como objetivo al principio de esta

memoria fueron los compuestos de tipo terpnico y sus precursores glucosilados,
compuestos estos de especial inters en la elaboracin de vinos jvenes.
Para abordar el estudio de estos compuestos se han seleccionado las tcnicas

basadas en la extraccin en fase slida, puesto que se trata de tcnicas simples,
abordables por personal con una preparacin bsica, y de coste no excesivamente alto.
Respecto a la determinacin del nivel de precursores glucosilados, el mtodo de la

glucosa glucosdica se presentaba como el ms apropiado para la determinacin rpida
de este parmetro, por lo que se decidi evaluar su aplicabilidad a las uvas cultivadas en
la zona de Jerez, dnde los niveles de glucosa son superiores a los obtenidos en zonas
donde se haba aplicado hasta el momento el mtodo citado.
Por otro lado, el estudio de la composicin terpnica se ha abordado aplicando la

tcnica de extraccin en fase slida como alternativa a los mtodos existentes hasta el
momento para el anlisis de la composicin aromtica de vinos. Debido al avance que la
tcnica de extraccin en fase slida ha tenido en los ltimos aos, se ha planteado el
estudio sistemtico del uso de nuevas fases slidas para la determinacin de la fraccin
terpnica, realizando un estudio comparativo de las mismas.
La utilidad de los resultados inicialmente se busc tanto en la informacin de la

caracterizacin de la composicin terpnica, como en la referente a precursores
aromticos de diferentes variedades de uva. Se pens que esto podra ser de especial
utilidad para bodegas que deban plantear la introduccin de nuevas variedades en sus
sistemas de produccin, para la realizacin de mezclas de vinos para la obtencin de
nuevos productos, y a la hora de tomar la decisin sobre la mejor fecha para la
vendimia.
3
Justificacin y objetivos
Se estim en cualquier caso, que la determinacin de la composicin aromtica y

de los precursores no es actualmente una medida que se realice de forma habitual en las
bodegas y por ello, se plante que sera interesante determinar la posibilidad de la
estimacin de sus valores, particularmente el valor de los niveles de precursores, a partir
de los datos que se obtienen de forma habitual durante el proceso de maduracin, por lo
que se decidi dedicar una atencin especial a este punto, empleando para ellos tcnicas
de tratamiento de datos.
Por todo ello, y con el objetivo fundamental de dotar al sector vitivincola de

mtodos analticos que permitan la obtencin de informacin de inters para el
desarrollo y mejora de sus productos, se plante el trabajo recogido en la presente
memoria, con los siguientes objetivos especficos:
1.- Evaluar la posibilidad del uso de la extraccin con fluidos presurizados en la

determinacin de la composicin fenlica de uvas y de residuos de vinificacin
2.- Desarrollar mtodos rpidos para la determinacin de polifenoles de inters,

concretamente steres, catequinas y resveratrol, en uvas y residuos de
vinificacin.
3.- Incrementar la selectividad de los mtodos desarrollados mediante

acoplamiento directo entre tcnicas de extraccin.
4.- Evaluar las diferentes fases slidas disponibles comercialmente para el

desarrollo de un mtodo de determinacin de compuestos terpnicos en vinos.
5.- Evaluar la utilizacin del mtodo de la glucosa glucosdica total en la

determinacin de precursores aromticos en uvas cultivadas en climas clidos y
estudiar la posible correlacin con los parmetros habitualmente controlados
durante la maduracin de esas uvas.
4
Introduccin
I.2 Compuestos fenlicos
I.2.1 Introduccin
Los compuestos fenlicos o polifenoles constituyen un grupo considerable de

compuestos que pueden definirse, de una forma concisa y desde el punto de vista
qumico como compuestos orgnicos presentes en la naturaleza que poseen, al menos,
un anillo aromtico, con uno o ms grupos hidroxilo unidos a l (esos grupos
funcionales pueden ser sustituidos por steres, metil-ster, glicsidos, etc...), aunque una
definicin ms precisa se basa en su origen metablico como aquellas sustancias
derivadas del metabolismo de la ruta del shikmico y de los fenilpropanoides.1
Los compuestos polifenlicos estn ampliamente distribuidos en el reino vegetal,

principalmente en forma de subproductos generados por el metabolismo, apareciendo
como metabolitos secundarios en todas las plantas.2
Estos compuestos pueden acumularse como productos finales de dos rutas

bioqumicas distintas (tal como se refleja en el esquema mostrado en la siguiente
pgina): la ruta del shikmico, que genera los fenilpropanoides y cumarinas, o la ruta del
acetato, que proporciona las fenonas ms simples y varias quinonas. Adems pueden
generarse a travs de una ruta metablica intermedia que genera flavonoides, siendo
ste el grupo ms importante y numeroso de los compuestos polifenlicos.
La naturaleza qumica de los compuestos polifenlicos es muy heterognea y

engloba un amplio surtido de disposiciones estructurales de familias de polifenoles que
pueden englobar desde estructuras libres a conjugadas (estructuras polifenlicas unidas
a otras sustancias de distinta naturaleza).3 Esto implica, con bastante frecuencia, la
participacin de azcares naturales, unidos qumicamente en virtud de su tamao
molecular a uno o ms grupos funcionales polifenlicos. De esa forma se unen
monosacridos como la glucosa, galactosa, arabinosa, rhamnosa, xilosa, manosa y
glucurnico, as como cidos galacturnicos. As, los flavonoides son compuestos
polifenlicos que reflejan un gran nmero de estos diseos estructurales. Los cidos
hidroxicinmicos tambin constituyen un ejemplo representativo de estructuras que
estn asociadas con otras sustancias, no necesariamente polifenoles, en la naturaleza.
5
Determinacin de compuestos fenlicos
Aminocidos Hidratos de Carbono

Ciclo de Calvin
COOH
CH3
C HO OH
O SCoA
OH
Acetil-CoA Acido Shikimico
HOOC CH2COCOOH
CH3
CH2
C
O SCoA OH
Malonil-CoA Acido prefnico
HO OH OH
OH
OH
HO OH
OH O
Chalcona
Flavonoides
Figura 1 Esquema de las rutas biosintticas de los compuestos fenlicos
6
Introduccin
I.2.2 Clasificacin de los compuestos fenlicos
Segn Harborne (1989) podemos clasificar los compuestos fenlicos basndonos

en su estructura. Los grupos seran los siguientes:
Estructura Clase fenlica

C6 Fenoles
C6-C1 cidos hidroxibenzoicos
C6-C2 Acetofenonas y cidos fenilacticos
C6-C3 cidos cinmicos, cumarinas,
Isocumarinas y cromonas
C6-C4 Naftoquinonas
C6-C1-C6 Benzofenonas, xantonas
C6-C2-C6 Estilbenos, antraquinonas
C6-C3-C6 Flavonoides: flavanonas, flavonoles,
Antocianidinas,chalconas,flavanolesI
Auronas, flavonas e isoflavonasII
(C6-C3)2 Lignanos
(C6-C3-C6)2 Bioflavonoides, biflavanos
(C6-C3)n Ligninas
(C6-C3-C6)n ProantocianidinasIII
I: principalmente estructuras flavan-3-oles

II: isoflavonoides
III: taninos condensados
Existe una clasificacin alternativa propuesta por el mismo autor en funcin de su

situacin y distribucin en el reino vegetal. Por lo que se sabe sobre estos compuestos,
podemos hacer una distincin clara entre aquellos que estn ampliamente distribuidos y
aquellos cuya presencia es casi espordica. As, por ejemplo, puede comprobarse que
los cidos hidroxibenzoicos e hidroxicinmicos, as como los flavonoides, estn
universalmente distribuidos en alimentos de origen vegetal. Por el contrario los
isoflavonoides constituyen un grupo discreto cuya presencia queda confinada a la
familia de las plantas leguminosas.
7
Si tenemos en cuenta la heterogeneidad y extensa distribucin de los compuestos

polifenlicos en el reino vegetal, puede deducirse fcilmente que este tipo de sustancias
forman parte integral de nuestra dieta diaria a travs de la ingestin de alimentos
preparados a partir de vegetales.
I.2.2.1 Fenoles y cidos hidroxibenzoicos
Son las estructuras ms simples dentro del conjunto de compuestos fenlicos, que
incluyen las estructuras C6 y C6-C2 respectivamente. A pesar de su simplicidad
estructural, los analitos resultantes se han citado en muchas ocasiones en estudios
centrados en la taxonoma de plantas, reflejando estrechamente el grado y la naturaleza
de las estructuras presentes con propiedades dadas de la planta.
Las estructuras de hidroquinonas son los fenoles ms representativos en trminos

de variedad y frecuencia de aparicin. Con respecto a las estructuras cidas, es
necesario enfatizar la importancia de los cidos vainillnico y glico, como las
estructuras polifenlicas ms representativas y ampliamente distribuidas.
Figura 2 cidos hidroxibenzoicos
R1=R2=R4=H, R3=OH ac. phidroxibenzoico

COOH
R1=OH, R2=R3=R4=H ac. saliclico
R1
R1=R4=H, R2=OCH3, R3=OH ac. vainillinico
R1=R4=H, R2=R3=OH ac. protocatquico
R4 R2
R3 R1=H, R2=R3=R4=OH ac. glico
A pesar de la pronunciada complejidad estructural el cido elgico puede

considerarse como otro miembro representativo de esta familia polifenlica que, con el
cido glico, constituye la base monomrica relacionada con los taninos hidrolizables.
Este tipo de compuesto es responsable de una funcin biolgica determinada siendo
necesario para actividades vitales de la planta como la germinacin de las semillas y el
propio crecimiento de la misma.
8
Introduccin
Figura 3 cido elgico
O
O C
HO OH
HO C O OH
O
I.2.2.2 cidos hidroxicinmicos
Constituyen el grupo ms ampliamente distribuido de los compuestos tambin

conocidos como fenilpropanoides. Entre ellos hay cuatro estructuras bsicas que existen
en su estado natural libre y se corresponden con los cidos cumrico, cafeico, ferlico y
sinpico.
Al igual que otros compuestos polifenlicos, la mayora de estas estructuras se

encuentran en el reino vegetal qumicamente asociados a otros tipos de compuestos. Un
ejemplo claro de importancia universal lo constituye la esterificacin del cido cafeico
con el cido qunico para formar una estructura ampliamente distribuida en comestibles,
el cido clorognico.
Muchas funciones biolgicas estn ntimamente relacionadas con la presencia de

estos compuestos en las plantas y comprenden propiedades antibiticas y relacionadas
con la inhibicin del crecimiento y germinacin.
Existen ismeros cis y trans de estos cidos, aunque en la naturaleza la ms

frecuente es la trans.
9
Figura 4 cidos hidroxicinmicos
COOH
R1=R2=H ac. pcumrico

R1=OH, R2= H ac. cafeico
R1=OCH3, R2=H ac. ferlico
R1=R2=OCH3 ac. sinpico
R1 R2
OH
I.2.2.3 Estilbenos
Familia de compuestos constituida por dos ciclos benceno, generalmente

enlazados por una cadena etano o etileno (C6-C2-C6). Entre los ismeros trans de estos
compuestos, destaca el resveratrol, o 3,5,4-trihidroxiestilbeno, por sus propiedades
beneficiosas para la salud, y que parece generarse en la uva como respuesta a una
infeccin fngica,4 o a situaciones de estrs.
Este compuesto se localiza en los hollejos, y se extrae fundamentalmente durante

la fermentacin de vinos tintos, aunque tambin se encuentra, en niveles ms bajos, en
vinos blancos. Sus concentraciones son del orden de 1-3 mg/l, aunque varan segn las
variedades, siendo al parecer la Pinot Noir especialmente rica.
Adems del resveratrol, se han identificado distintos oligmeros del mismo en

vias, as, Waterhouse,5 Lamuela-Ravents6 o Domnguez y col.7 detectan la presencia
de un glucsido del resveratrol denominado piceido.
10
Introduccin
Figura 5 Estilbenos
RO
C C
H OH
OH
R=H Trans-resveratrol
R = Glucosa Piceido
I.2.2.4 Flavonoides
Las principales estructuras de este grupo que podemos encontrar distribuidas en

alimentos son antocianinas, flavanoles, flavanonas, flavonoles, flavonas, isoflavonoides
y chalconas.
El trmino aglicona representa un flavonoide no unido a ninguna otra sustancia

qumica, independientemente del tipo de flavonoide que se considere. El trmino
glicsido, o ms generalmente estructura glicosilada se emplea para indicar
estructuras resultantes de la unin a cualquier tipo de azcar
Figura 6 Estructuras mayoritarias de flavonoides
Flavonol Flavona Flavanona
O O O
OH
O O O
11
Flavanol Isoflavona Antocianidina
+
O O O
OH OH
O
I.2.2.4.1 Antocianidinas
Son pigmentos que confieren colores a los frutos8,9 a pesar del hecho de que en
algunos de esos frutos (naranja y tomate) el mencionado color es debido a los
carotenoides. Las antocianidinas no glicosiladas (agliconas) puede encontrarse como
cationes en medio cido en forma de diferentes ismeros. Las propiedades de
pigmentacin de las antocianidinas han sido explotadas por la industria alimentaria
como aditivos en zumos y mermeladas10.
La estabilidad de las antocianidinas depende en gran medida del pH, debido a sus
propiedades cido-base.
Con respecto a las estructuras de antocianidinas ms ampliamente distribuidas en

el reino vegetal, los seis compuestos que se citan a continuacin son los responsables de
la mayora de la pigmentacin en los frutos: cianidina, normalmente encontrada en su
estado molecular libre (no glicosilado), es quizs la ms comn,11 seguida por la
delfinidina, peonidina, pelargonidina, petunidina y malvidina. Las antocianidinas
generalmente aparecen como glicsidos de las agliconas previamente citadas.
12
Introduccin
Figura 7 Antocianidinas
R1
OH
R1=R2=OH Delfinidina
HO O
+ R2=OCH3, R1=OH Petunidina
R2 R1=R2=OCH3 Malvidina
R1=OH, R2=H Cianidina
OH R1=OCH,3 R2=H Peonidina
OH
R1=R2=H Pelargonidina
Es posible detectar diferencias cuantitativas en su distribucin, basadas en el

grado de maduracin del fruto as como en las condiciones climticas bajo las cuales
crece, con la intensidad de la luz y la temperatura ambiental como los factores ms
decisivos.
Una de las principales caractersticas exhibidas por las antocianidinas deriva del
hecho de que, en la inmensa mayora de casos, estos compuestos tienden a estar
monoglicosilados. La glicosilacin de las antocianidinas siempre se lleva a cabo en la
posicin 3 a travs de un puente de oxgeno (enlace O-glicosdico) con glucosa,
arabinosa o galactosa.
La cianidina glicosilada con glucosa como azcar participante, es la estructura

ms abundante en frutos, aunque pueden encontrarse tambin otras estructuras
glicosiladas en la composicin total antocianidnica de este tipo de muestras.
Por otro lado, las antocianidinas acetiladas (qumicamente unidas a un cido)

estn distribuidas ampliamente en frutos, especialmente en uvas, donde la composicin
de estas sustancias es bastante compleja debido a la presencia de estructuras
monoglicosiladas originarias de las 6 agliconas diferentes. Al mismo tiempo pueden
aparecer acetiladas con cido actico o cumrico.12
13
I.2.2.4.2 Flavonoles
Este tipo de estructuras flavonoideas est ampliamente distribuido en el reino

vegetal, formando parte integral de nuestra dieta diaria. Por este motivo, y porque
recientemente se han descrito propiedades beneficiosas para la salud, son numerosos los
estudios llevados a cabo sobre su presencia en frutos.13,14
Basndonos en la informacin bibliogrfica, puede establecerse que las

estructuras glicosiladas de quercetina y kempferol son las ms abundantes en el reino
vegetal. Rutina, quercetina-3-rutinsido, y kempferol-3-rutinsido constituyen las
estructuras ms representativas de este tipo de compuestos.
Figura 8 Flavonoles
R1
OH R1=R2=H Kempferol
R1=OH, R2=H Quercetina
HO O R2 R1=R2=OH Miricetina
R1=OCH3, R2=H Isorhamnetina
OH
OH O
I.2.2.4.3 Flavanoles (flavan-3-oles)
Constituyen uno de las familias flavonoideas ms comnmente distribuidas en la

naturaleza.15,16 Dentro de su marco estructural es conveniente distinguir entre las
unidades monomricas correspondientes a las estructuras (+) catequina y (-)
epicatequina y estructuras oligomricas de las mismas, conocidas como procianidinas.
Las estructuras ms relevantes corresponden a las denominadas B1, B2, B3 y B4

procianidinas constituidas por asociaciones dimricas de (+) catequina y (-)
epicatequina. La estructura polimrica previamente mencionada tambin constituye la
base de los taninos denominados condensados.
14
Introduccin
Figura 9 Procianidina B1
OH
OH
HO O
OH
OH
OH
HO
OH O
OH
OH
Una de las caractersticas ms destacadas de los flavanoles es que generalmente

estn distribuidos en las plantas como agliconas.
I.2.2.4.4 Flavonas e isoflavonoides
Constituyen el grupo polifenlico menos representativo en alimentos. Las

agliconas ms ampliamente distribuidas son la apigenina y la luteolina. Como los
flavonoides, las flavonas pueden aparecer como estructuras glicosiladas. Con respecto a
los isoflavonoides, es necesario indicar que consituyen un grupo polifenlico
minoritario en alimentos en trminos similares a las flavanonas y flavonas.
Los isoflavonoides son caractersticos de las plantas leguminosas y se encuentran

ampliamente distribuidos en alimentos derivados.17,18 Como la inmensa mayora de este
tipo de compuestos polifenlicos, estas estructuras isoflavonoideas tambin aparecen
glicosiladas, habindose descrito, asimismo, su presencia en forma de acetil y malonil
derivados.
15
Figuras 10 y 11 Flavonas
R1
OH
HO R1=H , R2=H, R3=OH Apigenina

O
R1=OH , R2=H, R3= OH Luteolina
R2
R3 O
HO O
R1=H Daidzeina
R1=OH Genisteina
R1 O
OH
I.2.2.5 Taninos
En general, el trmino tanino se refiere a una fraccin de compuestos

polifenlicos especialmente astringentes, cuya caracterstica fundamental es su alto peso
molecular. Estas estructuras poseen una alta capacidad de asociacin con otros
polmeros biolgicos esenciales como las protenas y los hidratos de carbono.
En el reino vegetal los taninos se encuentran usualmente en dos amplias

modalidades metablicas: los taninos hidrolizables y los taninos condensados. Los
taninos hidrolizables son estructuras ms simples constituidas por unidades de cido
glico libre o esterificado, tambin conocidos como galotaninos.
Los taninos condensados, comnmente denominados proantocianidinas, son

polmeros naturales compuestos de unidades de flavan-3-oles. La ms comn de estas
estructuras son las proantocianidinas que estn basadas en (+) catequina y (-)
epicatequina, que forman unidades estructurales.
16
Introduccin
Figura 12 Ejemplo de estructura representativa de taninos hidrolizables
OH
HO OC OH OH
H2CO
HO CO O OH
OCO OH
O
O
HO O
OC OH
OC OH
OH
HO OH
OH
HO
I.2.3 Propiedades de los compuestos fenlicos
Existe un alto inters en los compuestos fenlicos en relacin a su potencial

actividad fisiolgica que depende de su actividad antioxidante, su habilidad para atrapar
especies de oxgeno activo y electrfilos, de quelatar iones metlicos, su potencial para
la autooxidacin y su capacidad para modular ciertas actividades enzimticas
celulares.19,20,21,22
A estos compuestos se les han asignado diversas propiedades biolgicas23 como

antioxidantes, anti-inflamatorios, antialrgicos, y actividad anticarcinognica,24 adems
se han empleado como marcadores en estudios taxonmicos, y tambin se relacionan
con la calidad alimentaria. Asimismo, recientemente se ha comenzado a evaluar la
capacidad que presentan dichos compuestos para inhibir la actividad bacteriana.25,26
17
Con respecto a su papel como metabolitos de plantas, es necesario mencionar que

los compuestos polifenlicos participan en el metabolismo de las plantas, siendo
responsables de su crecimiento y exhibiendo determinadas interacciones con otros
organismos vivos.
Entre otras funciones podemos citar la proteccin de la planta contra infecciones y

agresiones por otros microorganismos. Existen evidencias que sugieren que estos
compuestos son muy importantes para los ciclos vitales de las plantas, as los
compuestos polifenlicos puede servir como pantallas contra la radiacin UV, una
funcin crucial cuando las plantas estn sometidas a altas dosis de radiacin.27,28
Por otro lado estos compuestos son potentes antioxidantes, interceptan los
radicales libres, son agentes quelatantes de metales e inhiben la peroxidacin de lpidos.
Consecuencia de estas propiedades son los efectos que estos compuestos exhiben en la
prevencin de la oxidacin, inflamacin, alergias y cncer.29,30 Yilmaz y Toledo26
realizan una revisin sobre los aspectos relacionados con la salud de distintos
compuestos fenlicos (flavonoides) encontrados en uvas, considerando que existe una
estrecha asociacin entre su actividad antioxidante y su actividad contra varios tipos de
cncer, enfermedades cardiovasculares y varios desrdenes drmicos.
Respecto a sus propiedades anticarcinognicas, los flavonoles parecen ser

sustancias potencialmente anticarcinognicas y antimutagnicas. Entre los fenoles de la
uva y del vino, destaca especialmente el trans-resveratrol (3,5,4-trihidroxiestilbeno).
Este compuesto inhibe procesos celulares relacionados con la iniciacin, promocin y
progresin tumoral, adems de ejercer un efecto cardioprotector.31 Asimismo, tanto este
compuesto como sus derivados (glucurnidos) parecen presentar una potente actividad
inhibitoria contra la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia (HIV).32
El campo de estudio de las propiedades beneficiosas de los compuesto fenlicos

presentes en la uva ha comenzado a ampliarse ms all de la conocida como paradoja
francesa, relacionada con la prevencin de enfermedades cardiovasculares, de forma
que se han desarrollado estudios acerca de la capacidad que presentan los polifenoles de
uva en la proteccin frente a otro tipo de enfermedades, tales como enfermedades
drmicas24 o procesos neurodegenerativos,33 o de su actividad antibacteriana.27
Por otro lado la presencia de grupos hidroxilos permite a los polifenoles asociarse
con protenas y con hidratos de carbono, reduciendo la disponibilidad de los
macronutrientes. La solubilidad de estos compuestos va a predeterminar sus efectos
18
Introduccin
fisiolgicos. Los polifenoles solubles son absorbidos, mientras que los insolubles son
simplemente expelidos con las heces.34
En cuanto a sus propiedades de inters en enologa, stas son diversas en funcin

del tipo de compuesto fenlico en concreto.
Los cidos fenlicos, sin caractersticas organolpticas particulares en cuanto a

olor y sabor, son precursores de los fenoles voltiles, compuestos producidos por la
accin de ciertos microorganismos (levaduras del gnero Brettanomyces y bacterias) y
presentes tanto en vinos blancos como en tintos, con incidencia considerable en las
caractersticas aromticas de los vinos obtenidos.
Tambin los cidos hidroxicinmicos, concretamente los cidos p-cumrico y

cafeico, estn muy implicados en la acilacin de los antocianos, al esterificarse con la
molcula de azcar de los glucsidos de las antocianidinas. Esta esterificacin conduce
a una estabilizacin de los antocianos y de su capacidad colorante, debido al
establecimiento de interacciones hidrfobas intramoleculares (copigmentacin
molecular).
Estos cidos, que son los principales componentes fenlicos de la pulpa, son los
compuestos mayoritarios de los vinos blancos. Durante las operaciones prefermentativas
y la vinificacin se pueden desarrollar procesos de oxidacin que conllevan la
formacin de pigmentos pardos (pardeamiento), y una merma consecuente de la calidad
organolptica del vino obtenido. Los principales causantes de estos fenmenos son las
enzimas denominadas polifenoloxidasas (PPO).
Estas PPO tienen especial actividad sobre los derivados de cidos

hidroxicinmicos, especialmente de sus steres tartricos (cidos cutrico, caftrico...),
dando lugar a la formacin de o-quinonas. Estas quinonas, a su vez, son muy reactivas,
participando en reacciones posteriores de pardeamiento, puesto que oxidan otros
compuestos fenlicos que no son sustratos de la PPO, es lo que se denomina oxidacin
acoplada. Adems estas quinonas, primarias (producidas por la PPO) o sencundarias
(oxidacin acoplada), son capaces de reaccionar, a su vez, con otros polifenoles
presentes en el mosto. De esta forma, la mayor parte de los polifenoles, sean o no
sustratos de la PPO pueden encontrarse implicados en los fenmenos de pardeamiento
enzimtico. Por tanto, los cidos cinmicos son especialmente determinantes para la
calidad de vinos blancos.
19
Entre los flavan-3-oles se encuentran fundamentalmente monmeros de catequina

y epicatequina, as como formas ms o menos polimricas que constituyen los taninos
catquicos (proantocianidinas) a travs de la ruptura de las uniones intermonomricas.
La PPO oxida a las formas monomricas (catequina y epicatequina), pero no a las
polimricas.
Adems la o-quinona del cido caftrico reacciona con el glutatin (tripptido

abundante en la uva), formando el cido 2-S-glutationil-cafeoiltartrico o GRP (grape
reaction product). Este compuesto puede ser oxidado por las quinonas del caftrico en
exceso, una vez agotado el glutatin, con el resultado de un pardeamiento intenso.35 As
pues, la sensibilidad de los mostos de uva ante el pardeamiento oxidativo depende de su
riqueza relativa en glutatin y en cidos hidroxicinmicos.
Estas reacciones se pueden resumir en el esquema de la figura 13.
Uva
Prensado
Mosto Partes slidas
Acido Maceracin
caftrico
Glutatin
O-quinona de c. Pardeamiento del
GRP Flavanoles
caftrico vino
Quinona Quinonas de
de GRP Ac. caftrico flavanoles
Pardeamiento del mosto
Figura 13 Esquema de los mecanismos de pardeamiento oxidativo en mostos y vinos blancos.
20
Introduccin
En el caso de vinos tintos, el impacto de la oxidacin enzimtica es limitado,

mientras que la oxidacin qumica contribuye de forma importante al proceso de
maduracin de los vinos. Los productos resultantes de la oxidacin de otros
componentes (etanol, cido tartrico) tienen un papel importante en los procesos de
transformacin de los polifenoles durante el envejecimiento de los vinos. Intervienen
sobre todo en la polimerizacin de los taninos y en la formacin de combinaciones
taninos-antocianos, que producen a su vez una disminucin de la astringencia y una
evolucin del color de los vinos.
El color, la astringencia y el amargor de los vinos son esencialmente debidos a las

sustancias fenlicas y a los productos de sus reacciones. As pues, los compuestos
fenlicos juegan un papel primordial en las caractersticas organolpticas de los vinos,
tanto positivo (cuerpo, estructura, complejidad, redondez), como negativo (dureza,
aspereza, astringencia), estando basada la impresin organolptica final por el balance
harmonioso entre estos dos tipos de sensaciones, y directamente relacionada con el tipo
y concentracin de varios compuestos, como los antocianos, y los taninos.
En los vinos tintos el color evoluciona constantemente durante la maduracin y el

envejecimiento, pasando progresivamente de un color violceo a un color teja. Estas
modificaciones visuales, que se acompaan de una prdida de astringencia, se
relacionan con fenmenos de adicin, que transforman los antocianos y flavanoles en
otras especies moleculares.
Entre las distintas reacciones entre antocianos y taninos, se encuentran aquellas en

las que el antociano juega el papel de electrfilo y el tanino de nuclefilo, que conduce
a un desplazamiento del equilibrio hacia la forma coloreada, dando mayor estabilidad al
pigmento obtenido.
En otras ocasiones se producen adiciones tanino-antociano, o tanino-tanino, en la

que el electrfilo es un carbocatin liberado por la ruptura de las uniones polimricas de
los taninos, que reacciona con el antociano o con otra molcula de flavanol (generando
nuevas molculas de proantocianidinas).
El etanal presente en el medio, formado durante la fermentacin por oxidacin del

etanol o descarboxilacin del cido pirvico, tambin interviene favoreciendo estas
reacciones de adicin entre antocianos y flavanoles.
21
El color de las combinaciones antociano-taninos es rojo-anaranjado, ms intenso

que el de los antocianos libres, y no son sensibles al efecto del pH y del SO2. En
cambio, el color de los productos generados por reaccin de los antocianos con los
flavanoles en presencia de etanal es rojo-violeta. Este fenmeno ha sido interpretado
como un efecto de copigmentacin intermolecular.36
En general, las interacciones de los cationes flavilio con otros compuestos

fenlicos contribuyen a la intensidad y estabilidad del color de los vinos tintos por un
proceso de copigmentacin. Parece ser que la epicatequina es el mejor copigmento
flavonoide del vino, en lo que respecta a intensidad del color, pero los flavanoles y
cidos fenlicos establecen una unin ms fuerte con los cationes flavilio.
Por otra parte, la interaccin de los taninos con las protenas es el origen de la
sensacin de astringencia caracterstica de estas molculas y puede participar en el
desarrollo de turbios y precipitados negativos para la calidad del vino. Esta propiedad de
los taninos de reaccionar con las glicoprotenas de la saliva (mucina) y las protenas en
la boca, provocando una modificacin de su condicin y de sus propiedades lubricantes.
En funcin del tipo, peso molecular y concentracin de los taninos, puede producirse
una impresin suave y equilibrada, o, por el contrario, cierta agresividad que es
perceptible como cierto amargor al final del paladar o como astringencia en el post-
gusto.
I.2.4 Distribucin de los compuestos fenlicos en uvas y vinos
Las principales familias de estructuras polifenlicas encontradas en uvas, as como

en vinos, estn constituidas por cidos fenlicos y sus correspondientes steres,37,38
flavanoles, catequinas, proantocianidinas,39 adems de flavonoles y sus estructuras
glicosiladas.40,42 Adems en el caso de los vinos tintos tambin encontramos
antocianos.
Las estructuras representativas principales son los cidos glico y vainillnico.41,41

La familia de los cidos hidroxicinmicos est representada por los cidos cafeico,
cumrico, caftrico y cutrico,45 caracterizndose estos dos ltimos por ser steres con
el cido tartrico.
Dentro del grupo de los flavan-3-oles, (-) epicatequina,45 y especialmente (+)

catequina, as como sus correspondientes B1, B2, B3 procianidinas, son las estructuras
ms ampliamente encontradas.
22
Introduccin
En la uva, destacan los cidos hidroxicinmicos que se encuentran en las vacuolas

de las clulas del hollejo y de la pulpa bajo forma de steres tartricos, siendo los cidos
cafeico y cumrico, esterificados con cido tartrico, los ms caractersticos del zumo.
La forma natural es las trans pero los ismeros cis tambin existen aunque en forma
minoritaria. Estos mismos cidos estn adems implicados en la acilacion de los
antocianos. La presencia de los steres tartricos y la ausencia de los steres qunicos
(cido clorognico por ejemplo) son una de las especificidades del gnero Vitis si se
compara con la mayor parte de las dems frutas. En general, las concentraciones de los
steres hidroxicinmicos son mayores en el hollejo que en la pulpa.
En lo que concierne a los cidos benzoicos, la uva contiene principalmente cido

glico, presente bajo forma de ster de flavanoles. Las semillas (pepitas) contienen
cido glico y estructuras flavan-3-ol, constituyendo la parte ms simple de la uva en lo
que respecta a la composicin polifenlica.44
Aunque se han detectado trazas de monmeros y dmeros de flavan-3-oles en la

pulpa, en el seno de la baya se localizan principalmente en las semillas.42 Este hecho se
confirma con los estudios adicionales llevados a cabo en las pepitas donde las
estructuras (+) catequina, (-) epicatequina y sus correspondientes proantocianidinas han
sido ampliamente descritas.43
El vino contiene una alta diversidad de compuestos polifenlicos. Adems dicha

composicin puede variar notablemente de un vino a otro como consecuencia, en primer
lugar, de la influencia de la variedad de uva empleada para su elaboracin; y en segundo
lugar, del proceso de vinificacin, que altera de manera importante la composicin
polifenlica encontrada en la uva, as como el envejecimiento.
Durante la vinificacin y el envejecimiento, los compuestos fenlicos procedentes

de la uva participan en diversos tipos de reacciones. Adems en los vinos que han
permanecido en barrica, se puede notar la presencia de constituyentes extrados de la
madera utilizada durante la crianza. As pues, la composicin fenlica del vino depende
a la vez de la materia prima y del tipo de vinificacin desarrollada, influyendo tanto
sobre fenmenos fsicos (como la difusin de compuestos desde las partes slidas hacia
el mosto, o la extraccin de compuestos de las barricas) como sobre los fenmenos
bioqumicos y qumicos en los cuales estn implicados los polifenoles (oxidacin,
degradacin, condensacin).
23
Por otro lado, la bibliografa disponible45 cita estudios comparativos entre el

mosto y las muestras de vino tomadas a partir de distintas variedades de uva. Los
resultados correspondientes de este tipo de estudios han revelado que ambas matrices
comparten una composicin polifenlica similar, excepto para el tirosol, que est
presente en vinos pero ausente en los mostos correspondientes, siendo un producto del
metabolismo de las levaduras.
En ambas matrices estudiadas los cidos hidroxicinmicos parecen ser los

mayoritarios, seguidos por los flavonoides y los cidos hidroxibenzoicos,
principalmente glico y protocatquico. Sin embargo cuantitativamente hablando el
proceso de vinificacin es responsable de una prdida considerable de cidos
hidroxicinmicos (20%) y de una ganancia neta de la fraccin flavonoidea, mientras que
los niveles de cidos hidroxibenzoicos se mantienen constantes.45
Los polifenoles pueden ser indicativos de la variedad de uva, del conjunto de

condiciones de crecimiento43 y de los tratamientos de fermentacin.45 Por ello, la
concentracin de varios compuestos polifenlicos se ha utilizado en la determinacin
del tipo de vino, su edad y, ltimamente, de la calidad del mismo. Las propiedades
previamente comentadas del vino junto con sus conocidos beneficios para la salud, han
motivado el creciente inters en el estudio de los polifenoles presentes en este tipo de
muestras.
A nivel cuantitativo es posible establecer que el contenido polifenlico en vinos

tintos (740-2900 g/l) es mayor que en vinos blancos (260-700 mg/l) o vinos rosados de
acuerdo con el estudio llevado a cabo por Sato y col.44 en 31 muestras de distintos
vinos. En el caso de variedades cultivadas en zonas de clima clido, como la nuestra,
podemos citar, por ejemplo, los niveles encontrados por Morales y col.,45
concretamente para algunas variedades tintas cultivadas en Montilla Moriles, de en
torno a los 3000 mg/l, si bien hay que indicar que los propios autores afirman que con
una maceracin ms prolongada se conseguiran niveles ms elevados.
En general, las molculas preponderantes, tanto a nivel cuantitativo, como

cualitativo en el vino parecen ser los productos condensados derivados de los
constituyentes fenlicos del fruto.
24
Introduccin
I.2.5 Inters del anlisis de los compuestos fenlicos
La diversidad estructural de compuestos fenlicos y el efecto en sus propiedades

fisico-qumicas complican su determinacin. Adems, cierto nmero de compuestos
fenlicos son fcilmente hidrolizables y muchos son, relativamente, fcilmente
oxidables, lo que complica ms an el manejo de las muestras.
Tanto los frutos como otras partes de las plantas son una importante fuente de
sustancias fenlicas, tanto para la dieta, como para considerarlas a nivel comercial. Es
por ello por lo que la preparacin de la muestra es una etapa crtica en el anlisis,
especialmente en muestras de origen vegetal donde la complejidad de la matriz es
considerable.
En consecuencia los mtodos de extraccin de fenoles a partir de frutos

dependern entonces de distintos factores y los procedimientos usuales de
cuantificacin implican el uso de tcnicas de separacin. Lo que est claro es que para
determinar compuestos fenlicos en muestras vegetales slidas es necesario el empleo
de tcnicas de extraccin eficientes.
El conocimiento de la extraccin de sustancias fenlicas es tambin de

considerable inters por sus importantes aplicaciones prcticas en la industria
alimentaria. Por ejemplo, la extraccin de compuestos fenlicos durante la prensada de
la uva, la extraccin de compuestos fenlicos coloreados por maceracin de las partes
slidas en uvas tintas, o la extraccin de compuestos fenlicos de la madera por el vino
durante el envejecimiento en barriles,46 tiene consecuencias significativas para la
produccin de vinos de calidad.
Como micronutrientes, la medida de compuestos fenlicos no se considera

importante en el procesado (a pesar del hecho de que muchos casos de deterioro de
alimentos estn relacionados con reacciones de pardeamiento fenlico). Sin embargo,
con la tendencia actual hacia la concienciacin del consumidor y la demanda de
alimentos con propiedades beneficiosas para la salud podemos ver que se est
incrementando el inters por la cuantificacin de compuestos fenlicos en alimentos.
La adulteracin representa otra rea de la industria alimentaria donde la

cuantificacin de los compuestos fenlicos tiene potencial. As, recientemente Valentao
y col.47 han descrito la determinacin de flavonoides en el contexto del control de
calidad, y De Villiers y col.48 evalan la adicin de colorantes artificiales en vinos
25
tintos. La adulteracin de zumos de ctricos es otra rea donde la cuantificacin

fenlica es necesaria; sin embargo, a pesar de su potencial, todava no es de uso
rutinario. Como consecuencia de la demanda de mtodos de cuantificacin de rutina
para compuestos fenlicos, es de esperar que se incrementar el nfasis puesto en la
preparacin de la muestra.
I.3 Determinacin de compuestos fenlicos

El aislamiento de compuestos fenlicos de la matriz de la muestra es
generalmente un requisito previo para cualquier proceso de anlisis. El objetivo ltimo
es la preparacin de un extracto de la muestra uniformemente enriquecido en todos los
compuestos fenlicos de inters y libre de las formas interferentes de los otros
componentes de la matriz. Esto implica una serie de etapas que comprenden desde una
extraccin exhaustiva con disolventes y procedimientos de preconcentracin, que han
venido evolucionando en los ltimos aos desde la simple extraccin lquido-lquido o
la filtracin.
La preparacin de las muestras para estudios analticos que podran determinar la

composicin de compuestos polifenlicos en matrices vegetales consiste en varias
etapas, bsicamente condicionadas por la matriz y la naturaleza polifenlica de la
muestra. Este proceso puede ser bastante heterogneo, implicando gran nmero de
fases, o quedar reducido a lo mnimo.
El anlisis de los compuestos fenlicos en uvas es complejo debido a que su

composicin polifenlica depende de muchas variables y esto dificulta su
determinacin. Como ya hemos mencionado se hace necesaria una etapa previa de
extraccin, salvo en casos muy concretos. La extraccin debe realizarse con el
disolvente adecuado y bajo condiciones analticas optimizadas de temperatura, pH, etc..
Cuando los compuestos polifenlicos se encuentran en matrices lquidas, como

puede ser el caso del vino o los mostos, se suelen emplear las extracciones lquido-
lquido o si es necesario, una extraccin en fase slida (EFS). En cualquier caso la etapa
de extraccin es extremadamente importante, y el proceso depender de la liberacin de
los analitos propios de la matriz vegetal en el medio, que permitir la mayor o menor
determinacin cuantitativa en el extracto.
26
Introduccin
La determinacin de la recuperacin en muestras slidas es complicada al

constituir el fruto una matriz natural con una alta actividad enzimtica, por lo que deben
tomarse las precauciones necesarias para asegurar una correcta extraccin, desprovista
de modificaciones qumicas, que ocurren frecuentemente en el proceso.2 Un ejemplo es
la isomerizacin fotoqumica del trans-resveratrol al ismero cis.49 Los mtodos de
proteccin de estos compuestos frente a esos procesos degradativos incluyen la adicin
de antioxidantes durante la extraccin y el uso de atmsferas inertes. Las condiciones
empleadas deberan ser tan suaves como sea posible, para evitar la oxidacin,
degradacin trmica y otros cambios qumicos y bioqumicos en la muestra.
El procedimiento preciso depender de la naturaleza del analito (fenoles totales, o-

difenoles frente a otros fenoles, clases especficas de fenoles como glicsidos de
flavanonas o compuestos individuales) y de la muestra (tipo de fruto, porcin del
mismo, etc..) y particularmente de su estado fsico. En el caso de matrices lquidas, a
menudo se emplea la extraccin lquido-lquido o la extraccin en fase slida. Estos
mtodos convencionales tienen una aplicacin limitada a muestras slidas o semi-
slidas debido a los largos tiempos de extraccin y a las precauciones necesarias para
proteger las especies fenlicas altamente reactivas de los procesos de degradacin.
Por ltimo hay que indicar que en algunos casos debe llevarse a cabo una etapa de
hidrlisis, generalmente en medio cido, simultnea o posteriormente a la etapa de
extraccin. Una vez que la mezcla polifenlica es puesta en disolucin, puede ocurrir
que debido a su complejidad estructural, deban emplearse otras etapas posteriores de
fraccionamiento, con el propsito de separar compuestos polifenlicos en distintas
fracciones o simplemente para eliminar impurezas o sustancias no interesantes.
I.3.1 Tcnicas de preparacin de muestras
A continuacin se revisan y se comentan diversas aplicaciones de metodologas de

preparacin de muestras de utilidad en el anlisis de la composicin fenlica de
distintos tipos de muestras vitivincolas.
27
I.3.1.1 Muestras lquidas
Las tcnicas ms comunes empleadas para muestras lquidas incluyen la

extraccin lquido-lquido (ELL) y la extraccin en fase slida (EFS), analizndose
posteriormente los extractos por cromatografa lquida de alta eficacia (CLAE).
I.3.1.1.1 Extraccin lquido-lquido (ELL)
La distribucin de un soluto entre dos fases inmiscibles en un fenmeno de

equilibrio que sigue una ley de distribucin, donde la constante de equilibrio se define
como la relacin entre las actividades (o concentraciones) de los solutos entre las dos
fases. Por esta razn, para optimizar una nueva tcnica de extraccin lquido-lquido,
deberan considerarse diversas variables que pueden modificar la constante de
equilibrio, pero tambin aquellos que influyen en la cintica de distribucin de los
solutos entre las dos fases.
En relacin al equilibrio, las variables a considerar son la temperatura, la relacin

de volumen (o volumen de extractante) y la fuerza inica del medio. En relacin con la
cintica de la transferencia del material entre las dos fases, en todos los equilibrios de
particin debemos asegurarnos que el equilibrio se establece, por lo que la variable a
considerar deber ser el tiempo de extraccin.
Este mtodo ha encontrado aplicacin en la preparacin de muestras biomdicas,

farmacuticas, clnicas y biolgicas. Sin embargo, sus mayores desventajas incluyen la
formacin de emulsiones, las distintas eficiencias de extraccin para varios compuestos
con varios agentes extractantes y la baja sensibilidad. La sensibilidad puede ser
incrementada eliminando el disolvente extractante por calor o con el flujo de un gas
inerte. Desafortunadamente, esta etapa puede contribuir a las prdidas de analitos, y los
peligros de seguridad que implica el manejo de disolventes txicos e inflamables son
considerables.
Por otro lado el procedimiento de ELL es, generalmente, tedioso, implica un

elevado consumo de tiempo y es costoso (alto consumo de disolventes).
Para la extraccin de compuestos polifenlicos se han empleado distintos mtodos

de preconcentracin y separacin, particularmente extracciones con varios disolventes
principalmente acetato de etilo y ter dietlico.50,51 As, Baldi y col.52 extrajeron
28
Introduccin
polifenoles por ELL empleando acetato de etilo a dos niveles de pH (2 y 6), Pea-
Neira53 analiza la composicin fenlica de vinos espaoles con distinto origen
geogrfico mediante la extraccin con ter dietlico y con acetato de etilo. Gomes54
fraccion los compuestos fenlicos por medio de una extraccin con ter dietlico,
acetato de etilo y butanol; Downey y col.55 analizan flavan-3-oles y proantocianidinas
en pepitas y hollejos de la variedad Syrah tras su extraccin con acetona.
Bengoechea y col.56 extrajeron polifenoles a partir de mosto y vino por medio de

tres extracciones sucesivas con 10 ml de ter dietlico, seguido de otras tres extracciones
con 10 ml de acetato de etilo. Le Bon y col.57 tambin usaron acetato de etilo (a pH 2)
para extraer flavonoides.
Tambin Rodrguez-Delgado58,59 determina catequina, cido vainllico, cido

sirngico, epicatequina y trans-resveratrol mediante CLAE tras la extraccin previa con
ter dietlico a pH=2.
Incluso aunque las recuperaciones son mejores con acetato de etilo que con ter
dietlico,60 el acetato de etilo es menos conveniente debido a su mayor punto de
ebullicin, que implica una mayor posibilidad de degradacin de las muestras durante la
concentracin a mayores temperaturas o con tiempos ms prolongados.
Sin embargo, a pesar de que hay numerosos estudios que se centran en la

seleccin del extractante ms adecuado para los compuestos fenlicos, existen pocos
datos acerca de la cuantitatividad de las extracciones, la influencia de factores como la
fuerza inica del medio o la metodologa ptima para llevar a cabo la separacin en la
prctica y para minimizar la produccin de interferencias analticas durante la
separacin, como los trabajos de Barroso y col.73,61
Br y col.62 emplean la ELL para determinar compuestos fenlicos de bajo peso

molecular en vino, para ello disearon un sistema rotatorio y contino, como alternativa
a la extraccin convencional en varias etapas y a la extraccin diferencial, que permita
la extraccin simultnea de varias muestras con buenas recuperaciones y alta
sensibilidad, minimizando al mismo tiempo la aparicin de interferencias analticas
durante el proceso de extraccin. El disolvente empleado fue ter dietlico. Con este
mtodo se consiguieron recuperaciones superiores al 70% para todos los patrones
estudiados excepto para el cido glico con una recuperacin del 40%. En cuanto a las
desviaciones estndar todas fueron inferiores al 7% para los estndares y algo mayores
en las muestras de vino.
29
Si tenemos en cuenta los inconvenientes anteriormente mencionados es fcil

entender porque esta tcnica est siendo reemplazada por otras tcnicas que son ms
fciles de automatizar, consumen menor cantidad de disolventes y requieren menos
tiempo, como ocurre con la EFS.
I.3.1.1.2 Extraccin en fase slida (EFS)
El mtodo de EFS puede ser una tcnica de aislamiento que no requiera ningn
tratamiento de calor, y el tiempo de aislamiento es muy corto en comparacin con los
mtodos tradicionales existentes. Este mtodo elimina la formacin de emulsiones y
minimiza la exposicin del personal a disolventes, o muestras, peligrosos. Lo que es
ms, los peligros de incendio o toxicidad se reducen considerablemente cuando se
utiliza la EFS en comparacin con la ELL.
Aunque la ELL ha permanecido durante varios aos como la tcnica de

preparacin preferida para muestras lquidas, especialmente en el campo
medioambiental, desde comienzos de los aos 90, se ha incrementado
considerablemente el desarrollo de la EFS, con amplias mejoras en los formatos,
automatizaciones e introduccin de nuevas fases. Mientras que en la ELL slo pueden
utilizarse disolventes inmiscibles con el agua para aislar los analitos, casi no hay
restricciones en la eleccin de la fase mvil para los procedimientos de EFS.63
Entre los principales objetivos del desarrollo del procedimiento de EFS

encontramos la obtencin de extractos libres de interferencias con la matriz en pocas
etapas (preferiblemente en una cuando sea posible), por tanto, la selectividad es una
caracterstica importante a considerar.
Puede considerarse que la tecnologa de adsorbentes est especficamente y

especialmente desarrollada con vistas a conseguir ampliar el rango de polaridades64.
As, podemos citar el desarrollo de:
Las slices C18 monofuncionales y las slices C18 abiertas, con el objetivo de
incrementar el nmero de grupos silanoles no modificados en la superficie de
la slice para proporcionar interacciones polares secundarias con los analitos.
30
Introduccin
Adsorbentes con esqueleto base de carbono y copolmeros altamente

entrecruzados de poliestireno-divinilbenceno, para conseguir mejorar la
extraccin de analitos polares. Entre los primeros, los ms ampliamente
utilizados son carbones negros grafitizados obtenidos por el calentamiento de
carbones negros a alta temperatura (2700-3000C), teniendo la ventaja de
presentar varios centros activos cargados positivamente en la superficie, lo
que permite su aplicacin para el anlisis de pesticidas.65
Polmeros hidroflicos-lipoflicos (tal es el caso del denominado HLB Oasis,

que es un copolmero de divinilbenceno y N-vinilpirrolidona), que intentan
paliar la limitacin que presentan los adsorbentes de slice en fase reversa y
de los polimricos, por la que deben acondicionarse con algn disolvente que
los humedezca, y les permita permanecer en tal estado antes de la aplicacin
de la muestra.
Adsorbentes de par inico o intercambio inico para la extraccin de analitos

inicos o ionizables. Entre los de intercambio catinico se incluyen los
dbiles con grupos cido carboxlico y los fuertes, con grupos de cido
sulfnico, aromticos o no. Los de intercambio aninico estn constituidos de
grupos amino primarios o secundarios en el caso de los dbiles, mientras que
los fuertes son formas de amino cuaternario.
Adsorbentes con mezcla de mecanismos de retencin, permiten la extraccin

y limpieza de matrices biolgicas en la misma secuencia.66
Adsorbentes de EFS en fase normal: incluyen almina, Florisil (silicato

magnsico sinttico) y slice modificada qumicamente por grupos polares
como los grupos amino, ciano o diol.
Adsorbentes de extraccin por inmunoafinidad: emplean materiales

implicados en las interacciones antgeno-anticuerpo, proporcionando mtodos
de extraccin selectivos basados en el reconocimiento molecular. Los
anticuerpos estn unidos covalentemente en un adsorbente apropiado
formando el denominado inmunoadsorbente. Puesto que los anticuerpos son
altamente selectivos hacia el analito, suelen iniciar la respuesta inmune con
una alta afinidad, permitiendo que el inmunoadsorbente pueda extraer y aislar
el analito de matrices complejas en una sola etapa.
31
Polmeros grabados molecularmente (PGM): implican la preparacin de

polmeros con sitios de reconocimientos especficos para ciertas molculas.
La sntesis se realiza uniendo monmeros alrededor de una molcula molde,
y permitiendo la consiguiente polimerizacin al usar un entrecruzador y
proporcionarle un material rgido. Despus, las molculas molde se eliminan
y los polmeros resultantes presentan cavidades que son las huellas y que
sirven de sitios de reconocimiento permitiendo la unin a la molcula molde.
Al igual que los inmunoadsorbentes, el reconocimiento se debe a la horma o
forma y a una mezcla entre interacciones de hidrgeno, hidrofbicas y
electrnicas. Presentan las ventajas de ser ms rpida y fcilmente
preparables, usando mtodos bien definidos, y de ser estables a altas
temperaturas, en un amplio rango de pH y disolventes orgnicos.
Adsorbentes con carga metlica: empleados para preconcentrar compuestos

orgnicos que pueden formar complejos con iones metlicos.
Aunque el mtodo de EFS se ha aplicado frecuentemente para la limpieza,

concentracin y eliminacin de interferencias presentes en las muestras, su aplicacin
puede extenderse al aislamiento de componentes alimentarios y residuos qumicos.
Podemos emplear la EFS de dos formas diferentes para el aislamiento de los

compuestos de inters:
retencin y elucin: en primer lugar se acondiciona el adsorbente (fase slida),

se carga la muestra, se lavan los interferentes y se eluyen los compuestos de
inters.
eliminacin de los interferentes por retencin: primero se acondiciona el

adsorbente, se carga la muestra retenindose los interferentes en el mismo, y se
eluyen los compuestos de inters, quedando las interferentes unidos a la fase
slida.
En el anlisis de vinos se sigue empleando frecuentemente la EFS para conseguir

separar los analitos de inters del resto de componentes de la matriz. Csiktusndi Kiss y
col.67 evalan distintos tipos de adsorbentes (slice, octadecilslice, cianopropil, almina
acdica, almina bsica, almina neutra, diol, aminopropil, florisil, carbn negro) para la
extraccin de pigmentos en vinos tintos.
32
Introduccin
Revilla y Gonzlez-SanJos68 realizan una EFS con Amberlita XAD para estudiar
los cambios que experimentan ciertos compuestos fenlicos (fenoles de bajo peso
molecular y flavanoles) durante el almacenamiento de vinos tintos sometidos a
tratamiento con enzimas pectolticas.
Asimismo, existen varias publicaciones que coinciden en el uso de C18, para la

separacin previa al anlisis, de distintos analitos encontrados en el vino: polifenoles en
general,69,70 flavonoides,71 trans-resveratrol,65,72,73 u ocratoxina A.74,75 En otros casos, en
cambio, a pesar de analizarse el mismo tipo de muestras y de compuestos, se emplean
otros adsorbentes, tales como:
- copolmeros de estireno-divinilbenceno para el anlisis de trans-resveratrol

(LiChrolut EN),13 en la determinacin simultnea de polifenoles, cidos orgnicos
y azcares (SDB-L);76 para el anlisis de la evolucin del contenido en
compuestos fenlicos durante la maduracin en barrica de vinos tintos (Strata-
X);77 o para el anlisis de distintos compuestos fenlicos en vinos de crianza en
barrica (RP-101 y RP-105).78
- amina cuaternaria (SAX), o un copolmero de N-vinilpirrolidona y

divinilbenceno (Oasis HLB)79 para determinar compuestos fenlicos libres y
catequinas. Tambin se ha utilizado este ltimo adsorbente en el anlisis de
ocratoxina A en muestras de mosto, vino y cerveza (adems de cartuchos de
fenilsilano).80
Recientemente han comenzado a aplicarse los denominados PGM (polmeros

grabados molecularmente) sobre alimentos y otras matrices complejas. Como ya
mencionamos anteriormente, stos polmeros son adsorbentes selectivos con sitios de
reconocimiento molecular diseados para un analito en particular.
Chapuis y col.81 emplean estos polmeros para evaluar la extraccin de triazinas

en muestras de suelos y zumos de uva, para ello desarrollan dos polmeros grabados
molecularmente preparados en diclorometano con terbutilazina y ametrina como
molculas molde. Esta misma tcnica es desarrollada por Weiss y col.82 para la
extraccin de compuestos flavonoideos, y por Maier83 para evaluar las ventajas y
limitaciones que tendra a la hora de determinar ocratoxina A en vinos tintos.
33
En la tabla que se presenta a continuacin se da una descripcin de las dos

tcnicas de preparacin de muestras lquidas anteriormente mencionadas y se indica
aproximadamente el tiempo de extraccin, el coste, la facilidad de operacin y las
desventajas de las dos tcnicas ms empleadas:
ELL EFS
a) Analito retenido en un
adsorbente slido;
interferencias eliminadas con
Analito repartido entre dos un lavado del adsorbente.
Descripcin del sistema disolventes inmiscibles Desorcin del analito usando
un disolvente orgnico.
b) Retencin de las interferencias

en el adsorbente y elucin de
los analitos.
Tiempo extraccin Pueden superarse 24 h. Menos de 1 hora

Coste Bajo Bajo/Medio
Facilidad de operacin Fcil Adems de manuales, existen
sistemas automticos y robotizados
disponibles para rutina
Desventajas Requiere concentracin de Requiere el desarrollo de un
la muestra tras extraccin mtodo, eleccin de adsorbente y
optimizacin de su selectividad
Tabla 1 Caractersticas de ELL y EFS
I.3.1.2 Muestras slidas
Las muestras slidas presentan una problemtica adicional a las ya comentadas

para las muestras lquidas: una etapa previa de extraccin.
Las tcnicas ms comunes empleadas para muestras slidas incluyen la extraccin

Soxhlet, extraccin asistida por ultrasonidos (EAU), extraccin asistida con microondas
(EAM), extraccin con fluidos supercrticos (EFSC) y la extraccin con fluidos
presurizados (EFP). Hay que destacar que todas las tcnicas anteriores se incluyen en
alguno de los mtodos oficiales de anlisis empleados por la Agencia de Proteccin
Medioambiental estadounidense (EPA).
34
Introduccin
I.3.1.2.1 Extraccin asistida por ultrasonidos (EAU)
Se basa en el empleo de la energa derivada de los ultrasonidos (ondas de sonido

con frecuencias superiores a 16 kHz) para facilitar la extraccin, a partir de la muestra
slida, de los analitos por el disolvente orgnico seleccionado en funcin de la
naturaleza de los solutos a extraer. La extraccin se ve facilitada y acelerada gracias a
esa energa. Los resultados obtenidos son similares a los de una extraccin Soxhlet pero
la duracin no es superior a los 30 minutos en la mayora de los casos.
Este proceso de extraccin es rpido en comparacin con los mtodos

tradicionales, como ya hemos mencionado, debido a que el rea de la superficie de
contacto entre la fase slida y la lquida es mucho mayor.84
Son muy contadas las aplicaciones de esta tcnica en el anlisis de compuestos no

voltiles en uvas o vinos, habindose empleado nicamente en el anlisis de cidos
orgnicos.85
Por ltimo hay que indicar que en muchos de los estudios antes citados las
condiciones ptimas de extraccin se han establecido usando tcnicas de diseo
experimental. Se usan estas tcnicas porque deben optimizarse varias variables y dichas
tcnicas permiten determinar fcilmente las variables ms significativas.
I.3.1.2.2 Extraccin asistida por microondas (EAM)
Las microondas son ondas de alta frecuencia electromagntica situadas entre las
regiones de radio-frecuencia e infrarroja en el espectro electromagntico (con un rango
de frecuencias entre 0,3-300 GHz).
A diferencia del calentamiento convencional donde el calor penetra lentamente

desde el exterior al interior de un objeto, la energa de microonda es fra produciendo
calor, el calentamiento aparece justo en el ncleo del objeto que est siendo calentado, y
el calor se extiende desde el interior al exterior del cuerpo.
35
La energa de microondas afecta a las molculas por conduccin inica y rotacin

dipolar. En la conduccin inica los iones en solucin migrarn cuando se aplique el
campo electromagntico. La resistancia de la solucin a este flujo de iones producir la
friccin y, por tanto, el calentamiento de la solucin. La rotacin dipolar supone un
realineamiento de los dipolos con el campo aplicado, estos movimientos moleculares
forzados producen una friccin molecular y un calentamiento.
La seleccin del disolvente apropiado es la clave para una extraccin ptima. Para
seleccionar los disolventes se deben considerar las propiedades de absorcin de las
microondas por el mismo, la interaccin del disolvente con la matriz, y la solubilidad
del analito en el disolvente. Cuanto mayor sea el momento dipolar del disolvente ms
rpido se calentar el mismo bajo irradiacin de microondas.
Otros factores importantes a tener en cuenta son: la compatibilidad entre el

disolvente de extraccin y el mtodo analtico usado en el anlisis del extracto (los
disolventes menos polares parecen preferirse para el anlisis por CG, mientras que
disolventes ms polares son preferibles para anlisis por CLAE o tcnicas de
inmunoensayo) y la selectividad del disolvente. Se ha encontrado poca informacin
sobre la selectividad de la EAM en la bibliografa ya que la tcnica es tan eficiente que
no puede considerarse una tcnica selectiva de extraccin. Suele ser necesaria una etapa
de limpieza tras la extraccin en casi todos los casos.
La muestra y el disolvente son sometidos a la accin de las microondas en

recipientes sellados (EAM presurizada) o abiertos (EAM atmosfrica). Existen equipos
de EAM presurizada que permiten extraer simultneamente hasta 14 muestras, en
cambio la EAM atmosfrica slo es capaz de extraer una muestra por experimento.
Cuando la EAM se lleva a cabo en recipientes cerrados, la temperatura conseguida

durante la extraccin ser mayor que el punto de ebullicin de los disolventes. Para la
mayora de los disolventes la temperatura dentro del recipiente es dos o tres veces el
punto de ebullicin de los mismos. Estas elevadas temperaturas conducen a mejores
eficiencias de extraccin del analito de la matriz de la muestra.
Su aplicacin a la determinacin de compuestos fenlicos en alimentos es

limitada. Chu y col.86 han realizado estudios relacionados al determinar patrones (cido
glico, cido gentsico, cido vainllico, cido cafico, cido ferlico y cido p-
cumrico) tras su tratamiento con bis(trismetilsilil)acetamida e irradiacin con
microondas. En el caso de muestras enolgicas nicamente se ha encontrado en la
bibliografa un artculo sobre la extraccin de polifenoles en pepitas de uva.87
36
Introduccin
I.3.1.2.3 Extraccin con fluidos supercrticos (EFSC)
Esta tcnica ha recibido mucha atencin como posible alternativa para la

preparacin de muestras. La metodologa se basa en el principio de que un fluido (gas)
por encima de su punto crtico exhibe las propiedades de solvatacin de un disolvente
lquido. El fluido es supercrtico por encima de su punto crtico. La mayor ventaja de
esta tcnica sobre los mtodos tradicionales de preparacin de muestras es el uso de
fluidos supercrticos no txicos como el dixido de carbono.
Los fluidos supercrticos tienen propiedades nicas que los sitan entre los
lquidos y los gases. Sus viscosidades son mucho menores que las de los lquidos y sus
tensiones superficiales son muy bajas. Por ello pueden penetrar en los poros de los
slidos mucho ms fcilmente que los lquidos. Sus densidades, sin embargo, son
mucho mayores que las de los gases, por lo que sus capacidades para llevar materiales
disueltos son tambin similares a las de los lquidos.
Las extracciones pueden llevarse a cabo en modo esttico, dinmico o con

recirculacin. En el primer caso la clula se llena con el fluido supercrtico, se presuriza
y se permite que alcance el equilibrio. En el modo dinmico, el fluido supercrtico se
hace pasar a travs de la clula continuamente. En el ltimo caso, el mismo fluido es
bombeado repetidamente a travs de la muestra, y, despus del nmero requerido de
ciclos, se bombea hacia el vial de recoleccin. Durante la extraccin los analitos
solubles se reparten desde la matriz de la muestra hacia el fluido supercrtico, el cual se
descomprime, sin prdidas, a travs de un restrictor de flujo variable, hacia el vial de
recoleccin.
Aunque se han investigado muchos fluidos supercrticos (compuestos

fluorocarbonados, N2O, SF6, NH3), el ms comnmente usado como fluido supercrtico
es el dixido de carbono (CO2). Alcanza el estado supercrtico a una presin (72,9 atm)
y temperatura (31,3C) relativamente bajas. Es no txico, no inflamable, no corrosivo,
muy inerte qumicamente y fcil de conseguir. Es apolar, pero su polaridad puede
ajustarse con modificadores como la acetona, metanol o etanol. Su rpido poder de
penetracin y solvatacin proporciona altas recuperaciones para muchos analitos. Hay
que indicar adems que la polaridad del fluido seleccionado puede ser modificada
apropiadamente para optimizar el aislamiento de los compuestos de inters.
37
Los fluidos supercrticos pueden ser utilizados bajo un amplio rango de

condiciones. Tanto por encima del punto crtico como en zonas ligeramente inferiores.
La densidad y el poder de solvatacin del fluido supercrtico pueden variarse
cambiando la presin y temperatura, as como las velocidades de flujo, tiempos de
extraccin y modificadores. La eficiencia de la extraccin con fluidos supercrticos se
ve afectada por una multitud de variables, incluyendo el tipo de matriz, tipo de analito,
tipo de fluido, geometra del recipiente, orientacin del recipiente, tipo de restrictor, y
sistema de recoleccin de los analitos.
El potencial de esta tcnica reside en el hecho de que los parmetros fsicos

instrumentales pueden ser cambiados para modificar las interacciones qumicas
directamente. El fluido supercrtico tiene una densidad que es suficientemente elevada
para proporcionar una buena capacidad disolvente pero suficientemente baja para que
exista una alta difusibilidad y una rpida transferencia de masa a travs de la matriz de
las muestras.
La fase de recoleccin del soluto tras la extraccin tiene lugar, generalmente, de

una de las formas siguientes: mediante la deposicin en una trampa de fase slida o en
disolvente. Wenclawiak y col.88 usan un condensador Dewar para optimizar la
recoleccin en disolventes orgnicos. Eckard y Taylor89 comparan la recoleccin de
analitos de distintas polaridades en varias trampas de fase slida, llegando a la
conclusin de que la que proporciona mejores resultados es una mezcla de Porapak Q y
bolas de vidrio.
La EFSC ofrece cierto nmero de ventajas respecto a la recuperacin a partir de

muestras slidas y se ha estudiado el comportamiento de extraccin de los compuestos
fenlicos, usando dixido de carbono supercrtico, soportados en arena.90
La aplicacin de la extraccin con fluidos supercrticos a muestras de inters

alimentario es cada vez ms comn91. La popularidad de esta tcnica para estas
aplicaciones puede atribuirse directamente a la eliminacin de disolventes orgnicos, la
alta solubilidad de la materia lipoflica en CO2 supercrtico y a las bajas temperaturas
que permiten el anlisis del aroma. Valcrcel y Tena92 hacen una revisin de varias de
estas aplicaciones.
En el caso del anlisis de muestras enolgicas se centra ms bien en muestras

lquidas: se ha extrado trans-resveratrol y otros compuestos fenlicos93 (cido glico,
(+) catequina, (-) epicatequina, cido cafeico, cido p-cumrico, miricetina, quercetina y
cido saliclico) a partir de un soporte inerte (tierra de diatomeas) al que se han
38
Introduccin
adicionado dichos compuestos, recogindose sobre distintas trampas (octadecilsilano,

CN y Diol) y eluyndose con metanol o acetonitrilo. Tambin se ha empleado la EFSC
sobre muestras slidas, as se ha determinado trans-resveratrol a partir de hollejos de
uva (mediante el empleo de CO2 supercrtico modificado en un 7,5% con etanol),94 y
cidos grasos procedentes del aceite contenido en pepitas de uva.95
Palma y col.96 han llevado a cabo extracciones fraccionadas de compuestos

fenlicos (catequina, epicatequina, cido glico) a partir de pepitas de uva mediante el
empleo de CO2 modificado con metanol. Asimismo, Palma y Taylor97 han extrado 5-
hidroximetil-2-furaldehdo a partir de pasas estudiando el efecto de distintos
modificadores orgnicos del CO2 supercrtico. Arce y col.98 emplean la EFSC en forma
continua para la determinacin cuantitativa de polifenoles totales en la pasta de uva
resultante de la prensada, para ello concentran los analitos en trampas de PorapackQ y
ODS, y los eluyen posteriormente con metanol. De igual forma, Palenzuela y col.99
desarrollan un mtodo para la extraccin de polifenoles a partir de orujo de uva
mediante CO2 modificado con 5% MeOH, en el que se evala la retencin de los
analitos mediante dos tipos de trampas: slida (C18) o lquida (tampn salino fosfato).
Berna y col.100,101 y Murga102,103 realizan diversos ensayos para determinar la

solubilidad de distintos sistemas con CO2 supercrtico en los que se incluyen diversos
compuestos presentes en la uva y el vino (resveratrol, epicatequina, cido
protocatquico, protocatequialdehido, cido p-cumrico, cido cafeico y cido ferlico)
con vistas a su posterior aplicacin analtica. Asimismo Chafer y col.104 estudian la
solubilidad de quercetina en CO2 supercrtico modificado con etanol.
Tambin Tena y col.105 han analizado trans-resveratrol y otros compuestos

fenlicos mediante CO2 supercrtico puro o modificado con distintos porcentajes de
MeOH.
I.3.1.2.4 Extraccin con fluidos presurizados (EFP)
Se basa en la extraccin slido-lquido empleando el lquido por encima de su

punto de ebullicin y utilizando presiones lo suficientemente altas para mantenerlo en
estado lquido. Esta extraccin permite obtener extracciones cuantitativas, en algunos
casos, en menos de 15 minutos.106
39
La elevada temperatura a la que se somete la muestra durante la extraccin,

cuando la comparamos con la extraccin convencional Soxhlet, incrementa la capacidad
del disolvente para solubilizar el analito, y la elevada presin incrementa la velocidad de
difusin en los poros de la matriz, facilitando la transferencia de masa del analito en el
disolvente extractante. Sabemos que al incrementar la temperatura se facilita la ruptura
de los enlaces entre el analito y la matriz, y que se disminuye la viscosidad del
disolvente (una menor viscosidad significa una mejor penetracin en la matriz y por
tanto se incrementa el rendimiento de extraccin).
Respecto a las consideraciones fisicoqumicas de las extracciones a elevadas

presiones y temperaturas, hay dos razones por las que el uso de disolventes lquidos a
elevadas temperaturas y presiones proporcionar un mejor rendimiento que las
extracciones a temperaturas prximas a la ambiental y a presin atmosfrica: los efectos
de solubilidad y transferencia de masas y la interrupcin del equilibrio de superficie.
1. Efectos de solubilidad y transferencia de masas:
El uso de altas temperaturas incrementa la capacidad del disolvente de

solubilizar analitos. Por ejemplo, basndonos en clculos de la dependencia de la
solubilidad con la temperatura de una disolucin ideal, la solubilidad del
antraceno se incrementa en casi trece veces cuando se incrementa la temperatura
de 50 a 150C. Sekine y Hasegawa107 destacan que la solubilidad del agua en
disolventes orgnicos se incrementar al incrementar la temperatura. Esto podra
ser adecuado en los casos en que los disolventes a bajas temperaturas y
presiones queden excluidos de los poros ocluidos con agua que contengan
analitos. El aumento de la solubilidad del agua en disolventes orgnicos causado
por elevadas temperaturas facilitar la disponibilidad de esos poros ocluidos y
los analitos contenidos en su interior.
Como resultado del incremento de la temperatura de extraccin se consiguen

velocidades de difusin ms rpidas.
Si se renueva el disolvente empleado durante la etapa de extraccin esttica

(como ocurre con la extraccin Soxhlet y en EFSC) se consigue mejorar la
transferencia de masa y, por tanto, incrementar las velocidades de extraccin. La
renovacin del disolvente incrementar el gradiente de concentracin entre la
40
Introduccin
solucin presente en la cmara o clula de extraccin y la superficie de la matriz

de la muestra. Segn la primera ley de difusin de Fick, cuanto mayor sea el
gradiente de concentracin, ms rpida ser la velocidad de transferencia de
masa. El mismo efecto se consigue en la EFP realizando la misma en varios
ciclos, cada uno de ellos con disolvente nuevo.
2. Interrupcin del equilibrio de superficie:
El uso de altas temperaturas puede interrumpir las fuertes interacciones

soluto-matriz causadas por fuerzas de Van der Waals, enlaces por
puente de hidrgeno y atracciones dipolares de las molculas del soluto
y los sitios activos de la matriz. La energa trmica puede superar las
interacciones cohesivas (soluto-soluto) y adhesivas (soluto-matriz)
disminuyendo la energa de activacin requerida para el proceso de
desorcin.
Las elevadas temperaturas tambin disminuyen la viscosidad de los

disolventes lquidos, permitiendo una mejor penetracin en las
partculas de la matriz y favoreciendo la extraccin.
Tambin se disminuye la tensin superficial del disolvente, los solutos

y la matriz, permitiendo que el disolvente humedezca la matriz de la
muestra. Ambos cambios facilitan el mejor contacto de los analitos con
el disolvente y favorecen la extraccin. Una disminucin en la tensin
superficial del disolvente tambin permitir que los analitos se
disuelvan ms rpidamente en el disolvente.
Si se ejerce suficiente presin en el disolvente durante las extracciones,

se pueden utilizar temperaturas por encima del punto de ebullicin. El
uso de elevadas temperaturas y sus ventajas asociadas sera imposible
sin el uso de elevadas presiones para mantener los disolventes en
estado lquido.
41
El uso de la presin facilitar las extracciones a partir de muestras en

las que los analitos se encuentren atrapados en los poros de la matriz.
El uso de elevadas presiones (junto con elevadas temperaturas y la
reduccin de las tensiones superficiales) forzar al disolvente a que
entre en contacto con los analitos en los poros.
Aplicaciones de la EFP
Inicialmente se han desarrollado en anlisis de contaminantes.108,109
En los ltimos aos se ha empleado esta tcnica para el anlisis de alimentos,110,111

siendo las aplicaciones ms usuales la determinacin de pesticidas en alimentos y
vegetales,112 de grasas en una amplia variedad de alimentos, y de cidos grasos en
huevos y derivados, pollo y cereales. En algunas de aplicaciones puede inyectarse
directamente el extracto resultante.
Sin embargo en los ltimos aos ha comenzado a ampliarse el empleo de esta

tcnica para la determinacin de otros compuestos en alimentos: as Papagiannopoulos
y col. 113 determinan proantocianidinas en malta, para ello, realizan la EFP con acetona-
agua (80:20, v/v) a 60C y durante un ciclo esttico de 10 minutos; posteriormente
realizan una EFS (con poliamida como adsorbente), en lnea, para eliminar
interferencias de forma previa al anlisis por cromatografa lquida. Este mismo equipo
emplea ese mismo mtodo para el anlisis de polifenoles (cidos hidroxibenzoicos e
hidroxicinmicos, glicsidos de quercetina y kempferol) en infusiones,114 con la nica
diferencia de que realizan una preextraccin con pentano antes de la EFS.
Tambin Delgado-Zamarreo y col.115 emplean acetonitrilo, aunque en este caso al

100%, para extraer vitaminas en pepitas de girasol, nueces y avellanas, siendo la
temperatura de extraccin de 50C y con la misma duracin de la EFP que en el caso
anteriormente citado.
Esta tcnica, adems, se ha aplicado a la determinacin de isoflavonas en diversos

alimentos derivados de la soja, as Klejdus y col116 extraen genistena, daidzena, sus
glucsidos correspondientes (genistina, daidzina), formonetina y biochamina A,
mediante la EFP durante 5 minutos, con metanol acuoso al 90% a 145C, consiguiendo
extractos limpios que se pueden analizar directamente en CLAE (gracias a la colocacin
42
Introduccin
de algodn adsorbente en el interior de la cmara de extraccin). Rostagno y col.,117 en

cambio, emplean etanol acuoso al 70% durante 3 ciclos estticos de 7 minutos de
duracin, y a una temperatura de 100C, para determinar daidzina, glicitina y genistina,
as como sus derivados glucosilados y malonil-glucosilados, en granos de soja. Estos
autores ponen de manifiesto que las isoflavonas malonil-glucosiladas comienzan a
degradarse a partir de los 100C, y que a partir de los 150C, tambin lo hacen los
glucsidos correspondientes.
Alonso-Salces y col.118 determinan perfiles polifenlicos en distintas variedades

de sidra usando este mtodo de extraccin seguido de una CLAE en fase reversa con
deteccin con diodos alineados. Adems, este mismo grupo analiza polifenoles
(catequinas, glicsidos de floretina y quercetina, cidos hidroxicinmicos) presentes en
pieles y pulpas de manzanas119 mediante el empleo de la EFP, para ello, extraen dichas
muestras con metanol al 100%, a 40C durante 5 minutos, para posteriormente analizar
los extractos obtenidos por CLAE.
Tambin comparan los resultados obtenidos cuando se emplea la EFP y la EAU

como etapa previa de preparacin de muestra en la determinacin de compuestos
fenlicos de manzanas. 132
Gonzlez-Rodrguez y col. emplean lquidos sobrecalentados (mezclas de agua-

etanol) para la extraccin de diversos compuestos fenlicos a partir de residuos de
vinificacin120 o de madera.121,122
De la misma forma, Ju y Howard123 aplican la EFP a la determinacin

antocianinas en hollejos de uvas tintas, evaluando 6 tipos de disolventes, en
extracciones estticas de 3 ciclos de 5 minutos realizadas a 50C. Estos autores llegan a
la conclusin de que: el metanol acidificado consegua extraer los niveles mayores de
monoglucsidos totales y de antocianinas totales, mientras que con metanol-acetona-
agua-HCl (40:40:20:0.1) se consiguen los mayores niveles de compuestos fenlicos
totales y antocianinas aciladas totales.
Adems comprobaron que cuando se realizan las extracciones con agua

acidificada, a temperaturas entre 80-100C, se obtienen las mejores recuperaciones de
monoglucsidos totales, antocianinas totales aciladas, antocianinas totales y polifenoles
totales. Como conclusin afirman que el uso de agua acidificada es tan efectivo como el
de metanol al 60% a la hora de extraer antocianinas a partir de hollejos de uvas tintas.
43
Podemos concluir indicando que en el anlisis de alimentos esta reciente tcnica

est comenzando a ser considerada a la hora de preparar muestras slidas para su
anlisis, ya que, proporciona extractos relativamente limpios, es rpida, consume
pequeos volmenes de disolventes y puede utilizarse de forma automtica.
A pesar de que se ha empleado ampliamente para el anlisis de muestras

medioambientales, su potencial de aplicacin sobre otro tipo de muestras es
considerable, por lo que se trata de una buena alternativa a los mtodos tradicionales de
extraccin slido-lquido.
En la tabla que presentamos a continuacin se da una descripcin de todas las

tcnicas de preparacin de muestras slidas anteriormente mencionadas:
Tcnica de extraccin Descripcin

Soxhlet convencional La muestra se coloca en un recipiente de extraccin y se lixivia con
el disolvente caliente en un extractor Soxhlet durante 8-12 horas. La
evaporacin del disolvente se hace separadamente.
Soxhlet automatizada La muestra se coloca en un recipiente de extraccin y es introducida
en el disolvente hirviendo durante 30-60 min., el recipiente es
entonces sometido a la extraccin Soxhlet con reflujo del disolvente.
Es posible hacer una evaporacin del disolvente.
Fluidos supercrticos La muestra se coloca en una cmara a alta presin y es extrada con
el fluido supercrtico que puede circular a travs de la muestra en
circuito cerrado o abierto (p.ej. CO2 a presiones mayores de 72
atm. y a temperaturas mayores de 33C). Despus de la
despresurizacin los analitos son recogidos en un pequeo
volumen de disolvente orgnico o en una trampa slida.
Asistida con microondas La muestra se coloca en un recipiente abierto o cerrado y se introduce
en el disolvente, suministrndole energa en forma de microondas
para facilitar la extraccin
Fluidos presurizados La muestra se coloca en el recipiente de extraccin y se presuriza con
el disolvente calentado por encima de su punto de ebullicin, el
extracto es liberado y transferido a un vial
Tabla 2 Caractersticas de tcnicas de extraccin sobre muestras slidas
Cada una de estas tcnicas presenta una serie de ventajas y una serie de
inconvenientes:
44
Introduccin
Soxhlet: entre sus ventajas se incluye que permite el uso de grandes cantidades de
muestra (p.ej. de 10 a 30 g, la tcnica no es dependiente de la matriz y que
muchos extractores Soxhlet pueden utilizarse sin controlarlos continuamente, de
hecho existen algunos sistemas comerciales automticos.
Entre sus inconvenientes, se puede destacar, largos tiempos de extraccin (p.ej. >
24-48 h.), uso de grandes volmenes de disolvente, y la necesidad de
concentracin despus de la extraccin.
Ultrasonidos: entre sus ventajas encontramos que es ms rpido que la anterior

tcnica (30-60 min. por muestra) y permite la extraccin de gran cantidad de
muestra con un coste relativamente bajo. Sus inconvenientes son que se suelen
producir prdidas de compuestos voltiles. Adems se han descrito degradaciones
debidas a la generacin de radicales libres por los ultrasonidos.
Microondas: es una tcnica muy prometedora porque es rpida (p.ej. 20-30 min.
en discontino), usa pequeas cantidades de disolventes en comparacin con la
extraccin Soxhlet, permite un control completo de los parmetros de extraccin
(tiempo, energa, temperatura), permite hacer extracciones a alta temperatura.
Respecto a los inconvenientes que hacen que no sea una tcnica de gran
aceptacin podemos citar que necesita disolventes polares, es necesaria la
limpieza de los extractos porque las microondas son muy eficientes extrayendo y
la instrumentacin necesaria es cara.
Fluidos supercrticos: entre sus ventajas se incluye que utiliza para la extraccin
dixido de carbono (como tal o modificado con pequeos volmenes de
disolvente) que no es txico ni inflamable y es medioambientalmente aceptable.
La selectividad de la extraccin puede controlarse variando la presin y
temperatura del fluido supercrtico y por la adicin de modificadores, el
disolvente es de fcil eliminacin y desecho y existen sistemas de extraccin
disponibles comercialmente que permiten la extraccin de muestras en modo
automtico.
Entre sus desventajas podemos sealar que el dixido de carbono es un disolvente
relativamente apolar y, por esto, se necesitan aditivos ms polares como el
metanol para mejorar las eficiencias de extraccin de compuestos polares.
Adems tiene un alto coste de equipamiento y mantenimiento.
45
Fluidos presurizados: esta tcnica es atractiva porque es rpida (p.ej. el tiempo de

extraccin es aproximadamente de 15 minutos por muestra), usa volmenes
mnimos de disolvente y la instrumentacin permite operar automticamente.
Entre sus inconvenientes destacan la necesidad de comprobar la estabilidad de los
analitos a alta temperatura y el coste del equipamiento y mantenimiento.
De forma que podemos esquematizar las caractersticas de las tcnicas de

extraccin para la preparacin de muestras slidas mediante la tabla siguiente:
Caracterstica Sohxlet EAU EFSC EAM EFP

Rapidez -- + + + +
Cantidad de muestra ++ + + + +
Consumo de disolventes ++ + -- - -
Variedad de disolventes + + - + +
Necesidad de filtracin - + - + -
Necesidad de + - - - +
concentracin
Exposicin a disolventes ++ + - + -
Habilidad del operador - +/- + +/- +/-
Coste del equipamiento - - + + +
Nivel de automatizacin - - ++ ++ ++
Tabla 3 Comparacin de las extracciones Soxhlet, EAU, EFSC, EAM y EFP
La extraccin Soxhlet es el mtodo estndar con el que se suelen comparar al

resto de las tcnicas de extraccin de muestras slidas, sin embargo los largos tiempos
de extraccin necesarios y los grandes volmenes de disolventes que emplea
(atribuibles a la lenta difusin de los analitos desde la matriz de la muestra hacia el
fluido de extraccin y/o a la lenta desorcin de los componentes desde la matriz) hacen
de ella una tcnica que actualmente est siendo reemplazada por algunas de las
anteriores. La tendencia hacia la que se dirigen los mtodos de preparacin de muestras
actualmente implica: el uso de pequeas cantidades de disolventes con el consecuente
menor volumen de residuos, menor tiempo posible a que se vea sometido el analista
expuesto a disolventes peligrosos y menores costes operacionales, es por eso por lo que
a continuacin nos vamos a concentrar en las cuatro tcnicas alternativas a la Soxhlet.
46
Introduccin
Finalmente conviene sealar que existe tambin otro mtodo clsico de

preparacin de muestras slidas que sigue emplendose en la actualidad: extraccin
slido-lquido (ESL) o maceracin con disolventes, y que tambin suele utilizarse como
mtodo de estndar de comparacin entre distintas tcnicas extraccin sobre muestras
slidas.
Esta tcnica de extraccin tambin se emplea con vistas a desarrollar

procedimientos industriales para el aprovechamiento de subproductos u obtencin de
compuestos de inters. Es el caso de la industria relacionada con los derivados de la
industria enolgica, por ejemplo Lo Curto y col.124 sugieren el empleo del orujo de uva
rico en azcar sobrante de las destileras para la produccin de levaduras al obtener,
mediante una extraccin con agua caliente, una solucin rica en azcares, la cual a
travs de su fermentacin permite obtener altos niveles de biomasa. Puesto que los
subproductos de la uva son una econmica fuente de fenoles, Pinelo125 propone su
extraccin continua con agua a 50C para su empleo como conservantes alimentarios y
suplementos dietticos. Asimismo Mantell y col.126 evalan la extraccin de
antocianinas con metanol a partir de pasta de uva tinta; Gonzlez-Manzano127 extrae
flavan-3-oles a partir de pepitas y hollejos de uva usando etanol.
Por ltimo tambin podemos indicar que la ESL es tambin de utilidad en la

industria enolgica al permitir mejorar los procesos implicados en ella o al proporcionar
mtodos para anlisis de compuestos de inters. Serra y col.128 determinan ocratoxina A
en uvas tras someter a las mismas a una extraccin con una solucin de bicarbonato
sdico y polietilenglicol. En cuanto a la mejora del proceso de vinificacin, en el caso
de los vinos tintos se ha empleado la ESL para evaluar el potencial fenlico129 o la
composicin antocinica de los mismos, con etanol130 o con agua.131 Adems, Romero-
Prez y col.132 extraen trans-resveratrol y sus ismeros glucosilados, a partir de hollejos
de uva, con etanol-agua (80:20, v/v) a 60C durante 30 minutos.
47
I.3.2 Separacin, identificacin y cuantificacin
Las tcnicas analticas ms comunes empleadas para determinar compuestos

polifenlicos es la cromatografa lquida de alta eficacia (CLAE). En los ltimos aos se
ha comenzado a utilizar tambin la electroforesis capilar (EC), y, en menor medida, la
cromatografa micelar electrocintica (CME).133 Tambin se ha llegado a emplear la
cromatografa gaseosa (CG), pero, debido a la baja volatilidad de los compuestos
polifenlicos, supona la necesidad de derivatizar, existen, no obstante, algunas
aplicaciones, como el anlisis de flavonoides y flavononas en frutas ctricas.134
La CLAE es, sin duda, la tcnica analtica ms usual para la caracterizacin de

compuestos polifenlicos, tal como se comprueba en las revisiones realizadas por
Markham en 1982135 y por Robards y Antolovich en 1997.21 En efecto el papel jugado
por esta tcnica en la identificacin as como en la cuantificacin de estructuras
polifenlicas es destacado, por ejemplo, podemos mencionar que la separacin de
numerosas estructuras de antocianinas se consigue en 20 minutos bajo rgimen
isocrtico, o que podemos usar la inyeccin directa para la analizar muestras de vino
con la conveniencia de llevar a cabo la separacin de los compuestos polifenlicos por
medio de un gradiente de elucin en la fase mvil.136
Las fases estacionarias ms comunes se preparan con silice qumicamente

modificada conteniendo cadenas de hidrocarburos, donde las constituidas por 8 tomos
de carbono (C8) se usan en menor extensin que las constituidas por 18 tomos de
carbono (C18).
Por otro lado, la modalidad de elucin, isocrtica o por gradiente, depende de la

composicin polifenlica presente en las muestras. La elucin isocrtica ha sido
empleada en aquellas muestras cuya composicin polifenlica est constituida por el
mismo grupo o familia estructural.
Por este mtodo es posible determinar flavonoles (quercetina, miricetina y

kempferol) en muestras de vino.47
Sin embargo, es necesario indicar que en la mayora de los estudios

cromatogrficos publicados se usa la elucin en gradiente. Adems debemos mencionar
que la mayora de los expertos en cromatografa han empleado gradiente lineal bajo
flujo constante, y que cuando es necesaria la temperatura en la separacin, en general,
nunca debe ser muy alta.
48
Introduccin
Los estudios publicados proponen como disolventes participantes en la fase mvil

al metanol, acetonitrilo y, en menor extensin, tetrahidrofurano, as como la posibilidad
de incorporar al medio pequeas cantidades de cidos dbiles como frmico, actico,
sulfrico o fosfrico. Bajo las mencionadas condiciones es posible resolver varias
mezclas complejas originarias de vinos, frutas ctricas y manzanas. En efecto, un
mtodo de elucin con gradiente de fase mvil binaria y constituida por un 5% de cido
actico como disolvente de elucin de bajo grado en una mezcla constituida por
acetonitrilo acuoso, en presencia del mismo modificador cido permite resolver
numerosos picos en muestras de vino.40
Con respecto al sistema de deteccin usado en CLAE adecuado para la

determinacin de compuestos fenlicos, es necesario enfatizar que la deteccin UV-Vis
es, sin duda, el ms comn. Los sistemas de fluorescencia y de deteccin electroqumica
se utilizan en menor extensin y para casos especficos, como en la determinacin de
compuestos cuya absorbancia en el UV-Vis es muy baja.
La CLAE con deteccin mediante matriz de fotodiodos alineados ha sido, y es,

ampliamente utilizada para el anlisis de polifenoles en vinos con distintos fines. As
Gmez-Mnguez y Heredia137 estudian, mediante esta tcnica, el efecto que la
maceracin (vinificacin tradicional o maceracin carbnica) tiene en la composicin
antocinica y el color objetivo de vinos de la variedad Syrah. Tambin analizan la
composicin polifenlica mediante esta tcnica Guilln y col.138 en mostos en
fermentacin, Glvez y col.139 en vinagres, o Barroso y col.140 en brandies.
Con este tipo de cromatografa tambin se ha estudiado la influencia que las

distintas prcticas enolgicas empleadas durante las etapas de vinificacin o de
envejecimiento141,142 tienen en la composicin fenlica de los vinos y/o vinagres
obtenidos. As, Danza y col.143 estudian la evolucin que presentan vinos tintos de la
D.O. Cigales durante su envejecimiento en tres sistemas: en barricas, con virutas (chips)
de madera, o con duelas de madera. A su vez, se ensayaron distintos tipos de madera de
roble: americano, francs y hngaro. Las variables que estudiaron fueron los
monoglucsidos de delfinidina, cianidina, peonidina, petunidina y malvidina (como
esteres acticos y p-cumricos), as como vitisina A, y los parmetros de color.
Aprovechando este ensayo, este mismo grupo de investigadores, evalan

asimismo, el efecto que la adicin de virutas de roble tiene sobre los compuestos
fenlicos de bajo peso molecular.144
49
Tambin de Simn y col.145 estudian las familias de compuestos fenlicos y los

polifenoles de bajo peso molecular presentes en vinos envejecidos en barricas de roble
espaol, francs y americano.
Guilln y col.146 desarrollan un mtodo de CLAE con deteccin por fotodiodos

alineados, para la medida de diversos compuestos fenlicos en vinos. Para ello evalan
5 tipos de columna y varias fases mviles. Los mejores resultados los obtienen con la
columna LiChrospher C-18 y con un gradiente binario de metanol-agua (con 2% de
cido actico).
Este mtodo de separacin y anlisis se ha empleado frecuentemente en el anlisis

de antocianinas y otros compuestos relacionados con el color.147,148 Por ejemplo, Revilla
y col.149 estudian el uso del empleo de la CLAE en el anlisis de antocianinas para la
diferenciacin de distintas variedades de uvas tintas y de los vinos elaborados con ellas.
La CLAE es tambin el mtodo seleccionado mayoritariamente para la

determinacin de compuestos fenlicos en general.150,151,152 As, Moreno y col.153
estudian de esta forma la composicin fenlica de bajo peso molecular en vinos de
Jerez; Silva y col.154 analizan los compuestos fenlicos no coloreados presentes en vinos
tintos. Tambin Pozo-Bayn y col.155 utilizan esta tcnica para estudiar el efecto que el
rendimiento del viedo tiene en la composicin de vinos espumosos de la variedad
Parellada; Bentez y col.156 analizan los cambios que experimenta la composicin
polifenlica de vinos finos expuestos a radiacin UV y Vis durante su almacenamiento;
o Alonso y col.157 analizan de esta forma la composicin polifenlica de distintos tipos
de vinos y la relacionan con su poder antioxidante.
Kerem y col.158 desarrollan un mtodo rpido de CLAE con deteccin UV para el

anlisis de cidos orgnicos y polifenoles en vinos y mostos tintos. Un mtodo similar
es desarrollado por Revilla y Ryan159 para el anlisis de distintos compuestos fenlicos
con propiedades antioxidantes, presentes en extractos de uva y vinos, sin necesidad de
una etapa de preparacin de muestra previa a la CLAE.
Wang y Huang92 utilizan esta tcnica para analizar flavonoides, mientras que
Monagas y col.160 la emplean en la determinacin de flavan-3-oles.
En el caso particular del anlisis de trans-resveratrol y derivados en vinos y uvas,

son varios los autores que han empleado distintas alternativas de CLAE:161,162,13 Ratola
y col.163 analizan este compuesto en vinos mediante deteccin UV; Kolouchova-
Hanzlikova y col.164 emplean el mismo tipo de deteccin, adems de la deteccin
50
Introduccin
electroqumica; mientras que Vitrac y col.,165 en cambio, seleccionan la deteccin

fluorimtrica con este mismo fin.
Adems recientemente han comenzado a emplearse columnas con soporte

monoltico, con las que se consigue separaciones ms rpidas, como consecuencia de
sus ventajas hidrodinmicas,166 de hecho se han utilizado para el anlisis de compuestos
fenlicos en vinos.167
Finalmente, hay que indicar que la CLAE acoplada con la EM ha permitido la

resolucin de muchas mezclas complejas de compuestos polifenlicos, ya sea como tal
o en tandem (CLAE-EM-EM).
Prez-Magario y col.168 describen varias aplicaciones de CLAE-EM para el

anlisis de distintos compuestos fenlicos, entre los que se encuentran los flavan-3-oles.
Tambin Domnguez y col.13 analizan de esta forma resveratrol y derivados
glicosilados, o Borbaln y col.169 correlacionan la composicin polifenlica con la
actividad antioxidante en vinos blancos y tintos. De igual manera: Baderschneider y
Winterhalter170 analizan benzoatos, cinamatos, flavonoides y lignanos en vinos de la
variedad Riesling; o Heier y col.,171 Garca-Beneytez y col.172 o Revilla y col.173
determinan antocianinas en distintos tipos de vino.
La CLAE-EM-EM es empleada por: Stecher y col.174 en el anlisis de flavonoides

y estilbenos en vinos tintos; y al igual que Sun y col.175 en la determinacin de
procianidinas en vinos; o que Careri y col.176 al analizar cis- y trans-resveratrol en vino,
orujos y subproductos.
Respecto a la electroforesis capilar conviene resaltar el avance de esta tcnica en

los ltimos aos ha permitido su aplicacin a la resolucin de mezclas complejas de
polifenoles.
En el caso del anlisis de muestras de inters enolgico podemos citar: el empleo

de tetrafluoroborato de tetraetilamonio177 como electrolito en la separacin
electrofortica de compuestos fenlicos en extractos de pepitas de uvas; en la
determinacin de aldehdos aromticos en brandies;178 o al anlisis de vinos en
general,179,180,181 o de tintos en particular.182,183
Arce y col.244 emplean la EC para el anlisis de los polifenoles obtenidos

mediante la EFSC de orujos de uva. Tambin utilizan esta tcnica, Arce y col.184 al
analizar trans-resveratrol y otros polifenoles en vinos; Peng y col.190 en el anlisis de
51
polifenoles en vinos tintos; o Minussi y col.185 al determinar la composicin

polifenlica en vinos comerciales.
Otra alternativa habitualmente empleada dentro del EC, es la electroforesis

capilar de zona (ECZ), especialmente en el anlisis de vinos tintos.186,187,188 As,
Senz-Lpez y col. emplean esta tcnica para el anlisis de antocianinas en
vinos.189,190,191
Muchos autores mantienen que la electroforesis capilar y la CLAE son tcnicas

analticas indispensables, porque en muchos casos se complementan, especialmente
cuando se quiere tener informacin general fiable sobre la presencia de compuestos
polifenlicos en ciertos alimentos.192 ,193,194
Vanhoenacker y col.195 comparan la CLAE-MS con la EC-MS en el anlisis de

compuestos fenlicos en extractos, obtenidos con ter dietlico, de vinos tintos. Los
resultados obtenidos les permiten concluir que la EC-MS consigue una eficiencia en
la separacin mucho mayor que la CLAE-MS, sin embargo, esta ltima proporciona
mayor informacin de la estructura de los constituyentes. De forma que con la EC-
EM se identifican slo 13 compuestos, frente a los 24 identificados con la CLAE-EM.
52
Introduccin
I.4 Compuestos relacionados con el aroma presentes en uvas y vinos
I.4.1 Introduccin. Tipos de Aromas
El aroma del vino es de una gran complejidad, debida, por una parte, a su origen,
como consecuencia de un complejo conjunto de interacciones biolgicas, bioqumicas y
tecnolgicas, y, por otra, a la gran variedad de compuestos voltiles que es capaz de
contener, y cuyo intervalo de concentracin oscila desde los miligramos/litro a los
nanogramos/litro.
Los lmites de percepcin de estos compuestos varan, asimismo,

considerablemente. En consecuencia, el impacto olfativo de los compuestos voltiles en
el vino depender de la concentracin y del tipo de compuesto en concreto. As, ciertos
compuestos, presentes en cantidades traza, pueden jugar un papel fundamental en el
aroma, mientras que otros, mucho ms abundantes, pueden tener nicamente una ligera
contribucin al mismo. Adems, el impacto de cada componente en las caractersticas
organolpticas del vino depender de sus propiedades especficas.
En general, la complejidad del aroma del vino, se debe, como indicamos antes, a
la diversidad de mecanismos implicados en su desarrollo:
el metabolismo de la uva: dependiente de la variedad, suelo, clima, y de las

tcnicas de manejo de la via. En la mayor parte de las variedades de vinificacin,
generalmente poco aromticas, estos constituyentes son esencialmente
precursores: cidos grasos, glicsidos, carotenoides y compuestos fenlicos.
los fenmenos bioqumicos (oxidacin e hidrlisis) que ocurren antes de la

fermentacin, producidos en las etapas de extraccin del mosto y maceracin.
Estos constituyentes son esencialmente compuestos de 6 tomos de carbono.
el metabolismo fermentativo de los microorganismos responsables de las

fermentaciones alcohlica y lctica. La levadura tiene el papel esencial de
producir etanol a partir del azcar, y los constituyentes fermentativos del aroma
son de hecho los productos secundarios de su metabolismo, implicando nutrientes
no especficos del medio que provienen de la uva. Cuantitativamente, stos son
fundamentalmente los ms abundantes.
53
Determinacin de compuestos aromticos
las reacciones qumicas o enzimticas que se desarrollan tras la fermentacin,

y durante la conservacin (envejecimiento) del vino en depsito, en barrica o
en botella. Se trata de sustancias voltiles por s mismas o de precursores
varietales que se transforman en compuestos voltiles, que a su vez pueden
evolucionar tambin. El conjunto de estos procesos se corresponde con
transformaciones del aroma del vino durante esta fase.
Pueden distinguirse, por tanto, los siguientes tipos de aromas en el vino:
primario: constituyentes varietales procedentes, de una u otra manera, de la

uva.
secundario: consecuencia del metabolismo de las levaduras durante la

fermentacin.
terciario: desarrollado durante la conservacin y envejecimiento del vino.
Por tanto, en la apreciacin objetiva del aroma del vino y de su evolucin se ha de

tener en cuenta tanto el conjunto de los constituyentes voltiles (compuestos libres),
como los precursores (compuestos ligados), ya que, conjuntamente, constituyen el
potencial aromtico del vino. Con todo lo anterior, son muchos los factores que
condicionan el aroma de los vinos recin terminados, entre estos estn: la variedad, el
clon, el ao, la zona (terroir), las prcticas culturales, las manipulaciones de la uva antes
de la fermentacin, las fermentaciones o los efectos de la conservacin.
I.4.2 El aroma en la uva
Los compuestos odorferos procedentes de la uva (que reflejan la variedad, el

clima y el suelo) juegan un papel ms decisivo en la calidad y el carcter regional del
vino que otros componentes del aroma, ya que son los responsables de los aromas
varietales del vino.
54
Introduccin
Las denominadas variedades aromticas, como los Moscateles, producen mostos

con aromas similares a los del vino resultante, en cambio, cuando se emplean otras
variedades, ms simples desde el punto de vista aromtico, los mostos no presentan
prcticamente olor, an as producen vinos con aromas caractersticos que son
relativamente especficos de la variedad de uva de la que estn hechos. Esto se cumple
para la mayora de las variedades ms extendidas: Merlot, Cabernet Sauvignon,
Cabernet Franc, Sauvignon Blanc, Semillon, Pinot, Gamay, Chardonnay, Chenin Blanc,
etc... Todo esto nos lleva a la conclusin de que el concepto de precursores de aromas
varietales, esto es, formas inodoras de las sustancias que producen aromas varietales, es
una cuestin muy importante a considerar en la elaboracin de vinos.
Sin embargo, tambin hemos de considerar que el trmino aroma varietal no

implica que cada variedad de uva contenga compuestos voltiles especficos. De hecho,
los mismos compuestos odorferos y sus precursores estn presentes en los mostos y
vinos de diversas variedades de uva, as como en otras frutas y plantas. As pues, la
personalidad aromtica individual de los vinos elaborados con cada variedad de uva, se
debe a diversas combinaciones, y concentraciones, de varios compuestos.
En el potencial aromtico de la uva pueden distinguirse tres grandes grupos:
el aroma varietal libre (sustancias olorosas ligadas a la variedad).
precursores no voltiles e inodoros (glicsidos, cidos fenlicos, cidos

grasos, etc...).
compuestos voltiles, olorosos o no, inestables que se transforman en

otros compuestos olorosos (terpenoles, C13 norisoprenoides, dioles
terpnicos, etc...).
I.4.2.1 Aromas varietales libres
Podemos diferenciar, entre las sustancias voltiles relacionadas con la tipicidad

aromtica de la cepa, tres familias qumicas: los compuestos terpnicos, las pirazinas y
los C13-norisoprenoides.
55
I.4.2.1.1 Compuestos terpnicos
La amplia familia de compuestos terpnicos est muy extendida en el reino

vegetal. Dentro de la misma se incluyen los monoterpenos (compuestos con 10 tomos
de carbono) y sesquiterpenos (con 15 tomos de carbono), formados por dos y tres
unidades de isopreno respectivamente. Los monoterpenos aparecen en forma de
hidrocarburos simples (limoneno, mirceno, etc...), aldehdos (linalal, geranial, etc...),
alcoholes (linalol, geraniol, etc...), cidos (cido linlico, cido gernico, etc...), e
incluso en forma de esteres (acetato de linalilo, etc...). En la figura 14 se muestran las
estructuras de los compuestos terpnicos ms frecuentes, los monoterpenoles, y otros
terpenos.
Cordonnier, en 1956, confirm la hiptesis planteada por Austerweil diez aos

antes, sobre la implicacin de los compuestos terpnicos en el aroma del Moscatel, al
detectar la presencia de tres alcoholes monoterpnicos (linalol, alfa-terpineol y geraniol)
en uvas Moscatel. Desde entonces, se ha investigado ampliamente la presencia de
compuestos terpnicos en uvas y vinos.196,197
De hecho, estos son los compuestos odorferos que han sido estudiados en ms
detalle en Vitis vinifera. Tanto en vinos como en uvas se han identificado las formas
libres y los precursores inodoros, principalmente en sus formas glicosiladas. Se pueden
citar actualmente alrededor de 70 compuestos terpnicos identificados. En su mayor
parte se trata de monoterpenos, algunos sesquiterpenos y de los alcoholes y aldehdos
correspondientes.
En la constitucin del aroma varietal los compuestos terpnicos y derivados

juegan un importante papel, ya que, se forman en la uva y se les encuentra intactos o
relativamente poco transformados en el vino.198 Entre los compuestos encontrados en la
bibliografa, se pueden distinguir:
56
Introduccin
o hidrocarburos terpnicos en C10 de tipo limoneno, alfa-terpineno, p-

cimeno, mirceno o sesquiterpenos como el farneseno, o el gamma-
cadineno.
o alcoholes monoterpnicos, generalmente ms olorosos que los anteriores.

Tienen los olores florales caractersticos, y se ha puesto de manifiesto
que sin estos compuestos la nota tpica olorosa del moscatel no puede
aparecer. Podemos citar los siguientes: linalol, nerol, geraniol, ho-trienol,
citronelol, o alfa-terpineol.
o algunos alcoholes terpnicos como el farnesol o el gamma-cadinol.
o numerosos xidos: xidos de linalol o el nerol xido, que generalmente

son menos olorosos que los terpenoles precedentes.
o algunos aldehdos: geranial, neral, citronelal... muy olorosos pero

olfativamente ms agresivos que los alcoholes correspondientes.
o los dioles terpnicos existen con frecuencia y relativamente en gran

nmero.199 Al presentar las funciones alcohol suplementarias son ms
solubles, pero tambin bastante menos olorosas. Estos compuestos
tambin juegan un papel considerable como precursores.200
La biosntesis de este grupo de compuestos parece estar comprendida por varias

etapas que llevan desde la glucosa al cido mevalnico via acetil CoA, y despus de ste
cido al isopentenil pirofosfato, unidad base isoprnica de 5 tomos de carbono, a partir
de la cual van a construirse todos los terpenoides por condensacin.
57
a)
OH
OH
OH
Nerol Geraniol Linalol
OH
OH
OH
Ho-trienol Citronelol Alfa-terpineol
b)
Alfa-terpineno Gamma-terpineno (+)-limoneno
Figura 14 a) Alcoholes terpnicos, b) otros compuestos terpnicos
58
Introduccin
La localizacin en la baya de los terpenoles libres parece concentrarse en la parte

slida en ms del 50%, as el geraniol y el nerol se encuentran en un 90% en el hollejo,
mientras que el linalol se encuentra en un 50% en el zumo. Por ello, teniendo en cuenta
los pesos relativos de hollejo y pulpa, todas aquellas operaciones que impliquen un
aumento del contacto entre las partes slidas y el jugo, deben ser tenidas en cuenta por
su implicacin en las caractersticas finales, desde el punto de vista aromtico, del vino
a obtener.
El contenido en terpenoles parece estar influenciado por el estado sanitario de la

uva, puesto que stos no son insensibles a los ataques de la uva por los parsitos, como
la Botrytis cinerea. Se ha demostrado que linalol, nerol, geraniol y, en menor medida,
alfa-terpineol, disminuyen de forma importante en el mosto procedente de uvas con
pudricin, y que esta disminucin es tanto ms marcada, cuanto mayor incidencia tiene
el ataque.201 De hecho, en estas condiciones, el linalol, por ejemplo, produce una
decena de metabolitos, donde abunda un diol, el E-2,6-dimetil-2,7-octadieno-1,6-diol,
siendo este compuesto el nico diol oloroso identificado en la uva. Sin embargo,
tambin ha de indicarse, que no existe prueba de que estos metabolitos sean
exclusivamente consecuencia de la infeccin, as, el (Z)-8-hidroxilinalol forma parte los
mostos y vinos de la variedad Morio-Muscat, pero puede ser producido tambin por
Botrytis cinerea a partir de linalol.202
Como ya hemos mencionado anteriormente, estos compuestos juegan un papel

fundamental en el aroma de uvas y vinos de la familia Moscatel (Moscatel de
Frontignan o grano pequeo, Moscatel de Alejandra o de Mlaga, Moscatel de
Alsacia), al presentar, a menudo, concentraciones por encima de los niveles de
percepcin. Tambin ejercen ese mismo papel en el aroma de otras variedades de uva
alemanas y alsacianas: Gewrtztraminer, Pinot Gris, Riesling, Auxerrois, Muller-
Thurgau, etc...; o de las uvas Viognier, Albario o Muscadelle.
En cambio, aquellos vinos elaborados a partir de variedades consideradas no

aromticas (Sauvignon Blanc, Syrah, Cabernet Sauvignon, Merlot, etc...), presentan
concentraciones de monoterpenoles que estn generalmente por debajo de los umbrales
de percepcin. An as, existen, algunos clones de Chardonnay con el carcter
Moscatel.
59
I.4.2.1.2 Pirazinas
Se trata de compuestos con heterociclos nitrogenados producidos por el

metabolismo de los aminocidos. Fueron identificados por primera vez en uvas
(Cabernet Sauvignon) en 1975 por Bayonove y col.203
Las pirazinas estn asociadas con los aromas vegetales tpicos de las variedades
Sauvignon y Cabernet Sauvignon, relacionados con el carcter herbceo, y nicamente
aparecen en concentraciones por encima del umbral de reconocimiento en las uvas y
vinos de las variedades Sauvignon Blanc, Cabernet Sauvignon y Cabernet Franc, y, en
algunas ocasiones, en la Merlot.
Las especies mayoritarias son la 2-metoxi-3-isobutil-pirazina, la 2-metoxi-3-sec-

butil-pirazina y la 2-metoxi-3-isopropil-pirazina, relacionndose su presencia con notas
a pimiento verde, esprragos o notas terrosas.
N R
R: CH2CH(CH3)2 2-metoxi-3-isobutilpirazina
R: CH(CH3)2 2-metoxi-3-isopropilpirazina
R: CH(CH3)CH2CH3 2-metoxi-3-sec-butilpirazina
N OCH3
Figura 15 Principales pirazinas encontradas en uvas y vinos.
Allen y col.204 analizan la existencia de los distintos orgenes de pirazinas en uvas

y vinos, as parece que la ruta conducente a la formacin de 2-etil-3-metoxipirazina es
distinta a la de la 2-isobutil-3-metoxipirazina, puesto que el componente etilo no
muestra la dependencia que presenta el componente isobutilo con la variedad de uva,
grado de maduracin y condiciones de desarrollo de la via.
La concentracin en que aparecen estos compuestos va a estar influenciada por

distintos factores, siendo el primordial el grado de maduracin de la uva. As, la
concentracin es inversamente proporcional al grado de madurez, disminuyendo
apreciablemente a partir del envero y siendo prcticamente inapreciables en condiciones
ptimas de maduracin. En consecuencia, cualquier factor que influya en la maduracin
60
Introduccin
de la baya (clima, manejo del viedo, etc...) influir a su vez en la presencia de las
pirazinas. Se ha comprobado que la concentracin de estos compuestos es mayor en las
zonas con clima ms fro en el caso de las variedades Sauvignon Blanc y Cabernet
Sauvignon cultivadas en Australia;205 y que el suelo ejerce un papel decisivo en los
niveles de pirazinas, de forma que las vias cultivadas en suelos calizos y arcillosos
presentan mayor contenido de las mismas que los arenosos.
De Boubee y col.206 evalan el efecto que las condiciones ambientales (suelo y

clima) ocasionan en las concentraciones de 2-metoxi-3-isobutilpirazina, y, por tanto, en
el impacto organolptico, en vinos tintos de Burdeos y del Loira. Llegan a la conclusin
de que las uvas desarrolladas en suelos cenagosos contienen mayores contenidos de este
compuesto que las cultivadas en suelos arenosos. En cuanto al clima, la concentracin
se duplica en aos ms soleados y con menos precipitaciones.
Hashizume y Samuta207 asimismo, estudian el efecto que el grado de madurez de

la uva y la exposicin solar de la baya tiene sobre la concentracin de las pirazinas 2-
metoxi-3-isopropilpirazina y 2-metoxi-3-isobutilpirazina. Estos mismos autores tambin
determinan compuestos carbonilo alifticos y pirazinas en raspones y uvas,208 llegando a
la conclusin de que existe una relacin entre su presencia en el mosto y el incremento
del sabor herbceo que se aprecia cuando no se despalilla la vendimia.
I.4.2.1.3 C13-Norisoprenoides
La degradacin oxidativa de carotenoides, terpenos con 40 tomos de carbono

(tetraterpenos), da lugar a derivados de 9, 10, 11 o 13 tomos de carbono. Entre estos
compuestos, los derivados norisorprenoides de 13 tomos de carbono, presentan
interesantes propiedades odorferas.
Baumes y col.209 realizan una serie de ensayos para comprobar la biogeneracin

de compuestos C13-norisoprenoides a travs de la ruta apo-carotenoidea. Esta ruta
implicara la degradacin de carotenoides por oxigenasas regioespecficas. De acuerdo
con esta hiptesis, los carotenoides se sintetizan fundamentalmente desde la primera
etapa de formacin del fruto hasta el envero, y a partir de entonces se degradan, entre
envero y maduracin, para producir C13-norisoprenoides y otros compuestos
glicosilados.
61
Carotenoides
O
C13- Norisoprenoides
Figura 16 Ruptura de carotenoides conducente a la formacin de C13-norisoprenoides en uvas.
Desde el punto de vista qumico los derivados norisoprenoides se dividen en dos

grupos principales: megastigmanos y no-megastigmanos. El esqueleto megastigmano se
caracteriza por un ciclo de 6 tomos de carbono, sustituido en los carbonos 1,5 y 6, y
por presentar una cadena aliftica de 4 tomos de carbono unida al carbono 6.
Los megastigmanos (figura 17) son C13-norisoprenoides oxigenados en el

carbono 7 (serie de las damasconas) o en el carbono 9 (serie de las iononas). Entre estos
compuestos, la beta-damascenona, con un aroma complejo de flores y frutas tropicales,
presenta un lmite de percepcin relativamente bajo. Este compuesto fue inicialmente
identificado en zumos de uva Riesling y Moscatel, pero est probablemente presente en
todas las variedades de uva.210 Al igual que ste, la beta-ionona (con aroma
caracterstico a violetas) est presente en todas las variedades, y su contribucin al
aroma de los vinos blancos es innegable.
62
Introduccin
O O
a b
Formas megastigmano oxigenadas
OH
c d e
Formas no megastigmano
Figura 17 Principales familias de derivados C13-norisoprenoides en uvas. a: beta-damascenona,

b: beta-ionona, c: TDN, d: vitispirano, e: actinidol.
Entre los C13-norisoprenoides no megastigmanos (figura 17), el ms importante

es el 1,1,6-trimetil-1,2-dihidronaftaleno (TDN), que presenta un olor distintivo a
queroseno, jugando un importante papel en el aroma a petrleo de los vinos viejos de
Riesling. Este compuesto est generalmente ausente en uvas y vinos jvenes, pero
puede aparecer durante el envejecimiento en botella. Otros compuestos pertenecientes a
la misma familia son los actinidoles y el vitispirano, que presentan olores reminiscentes
del alcnfor.
Winterhalter211 describe cuales son las rutas mayoritarias que proporcionan

compuestos C13-norisoprenoides relacionados con el aroma, como theaspiranos,
vitispiranos, edulanos o beta-damascenona. Por ejemplo, se propone que la beta-
damascenona procede de un diol acetilnico (megastigm-5-en-7-ino-3,9-diol)
glicosilado.
63
Oliveira y col.212 estudian el efecto que algunos parmetros viticulturales (forma

de cultivo, estado de madurez, luz solar y exposicin a la sombra, altitud y altura
vegetativa) presentan sobre el perfil carotenoideo de distintas variedades tintas de uva.
As, llegan a las siguientes conclusiones: el contenido carotenoideo disminuye a lo largo
de la maduracin; es mayor en uvas sombreadas frente a las expuestas directamente a la
luz solar; es mayor en uvas cultivadas en terrazas elevadas (donde existe menores
temperaturas y mayor humedad), y es mayor en uvas cultivadas con elevadas alturas de
la vegetacin.
I.4.2.2 Precursores del aroma
Como se ha comentado en el apartado anterior, son varias las sustancias que

pueden actuar como precursores del aroma: monoterpenoles, dioles o polioles, cidos
grasos, carotenoides, compuestos fenlicos o compuestos azufrados. Sin embargo,
destacan especialmente los dos primeros tipos de compuestos. Estos precursores
varietales aparecen mayoritariamente en forma glicosdica. 213
I.4.2.2.1 Monoterpenoles, dioles y polioles trpenicos
La existencia de una fraccin no voltil e inodora en el aroma terpnico en uvas

de Moscatel que se revela qumica o enzimticamente, fue demostrada por primera vez
por Cordonnier y Bayonove en 1974. Posteriores estudios realizados por diversos
grupos de investigacin, han puesto de manifiesto que los principales monoterpenoles y
polioles terpnicos estn presentes en uvas en forma de glicsidos (con glucosa,
arabinosa, ramnosa o apiosa), tal como se muestra en la siguiente figura:
64
Introduccin
O CH2
O O O
O CH2
R O
HOH2C CH3
R
6-O-alfa-L-arabinofuranosil-beta-D-glucopiransido 6-O-alfa-L-ramnopiranosil-beta-D-glucopiransido
O CH2
O O HOH2C
HOH2C H O
R
R
6-O-beta-apiofuranosil-beta-D-glucopiransido beta-D-glucopiransido
Figura 18 Ejemplos de glicsidos terpnicos (o norisoprenoideos) identificados en uvas.

R= terpenol o C13-norisoprenoide.
En general, parece que las formas libres y conjugadas de los terpenoles se

acumulan en uvas maduras desde el envero. Sin embargo existen dos posturas respecto a
su evolucin concreta, as, algunos autores indican que se produce una acumulacin
continua de monoterpenos incluso en uvas sobremaduras,214,215 otros, en cambio,
comparten la opinin, ms extendida, de que los monoterpenos libres disminuyen antes
de que se alcance el mximo nivel de azcares.
Se han identificado cuatro tipos de glicsidos terpnicos: tres diglicsidos (6-O-

alfa-L-arabinosil-beta-D-glucopiransido, 6-O-alfa-L-rhamnosil-beta-D-
glucopiransido o rutinsido, y 6-O-beta-D-apiosil-beta-D-glucopiransido) y un
monoglucsido (beta-D-glucopiransido).
Entre las agliconas correspondientes, las ms frecuentes son terpenoles (linalol,

nerol, geraniol), xidos de los anteriores, dioles y trioles terpnicos.
Todas las variedades de uva contienen glicsidos similares, pero las variedades de
uva con aroma a Moscatel presentan mayores concentraciones. Las formas glicosiladas
son frecuentemente ms abundantes que las libres. Entre los glicsidos correspondientes
a las agliconas ms odorferas, los ms extendidos son los apiosilglucsidos y los
65
arabinosilglucsidos, seguidos de los rutinsidos y de los beta-glucsidos. Los

monoglucsidos terpnicos en la via, a diferencia de otras plantas, aparecen en minora
frente a los diglicsidos.
Los monoterpenos glicosilados aparecen en mayor concentracin en los hollejos,

ms que en la pulpa o el jugo, al igual que sucede con los terpenos libres. Park. y col.29
afirman que, aproximadamente el 90% de los monoterpenos estn unidos
glicosdicamente, sin embargo, hemos de considerar que la proporcin relativa de
compuestos libres o unidos depender de la variedad de uva. As, la variedad Moscatel
de Alejandra, contiene mayor cantidad de terpenoles unidos en el jugo, mientras que en
los hollejos hay una proporcin similar entre los libres y los unidos. En el caso de la
variedad Moscatel de Frontignan, la proporcin entre terpenos libres y conjugados es
aproximadamente la misma en el jugo y los hollejos.
Si tenemos en cuenta que los glicsidos son mucho ms solubles que las
agliconas, es lgico considerarlos como vectores para el transporte y acumulacin de
monoterpenos en plantas, de ah que se hayan identificado en primer lugar en hojas de
via.216
Hemos de considerar que, aunque la uva contiene beta-glicosidasas capaces de

liberar ciertos terpenoles odorferos de sus glicsidos inodoros, bajo las condiciones
habituales de vinificacin estas enzimas endgenas tienen un efecto limitado en el
desarrollo del aroma del mosto por distintas razones, entre ellas que su pH ptimo
actuacin sera pH=5. Adems, la fermentacin alcohlica tiene un efecto relativamente
dbil sobre el potencial glicosilado de las uvas, de manera que la concentracin
glicosdica en el vino es similar a la de las uvas.
Es por ello, por lo que se est evaluando el empleo de glicosidasas exgenas para
incrementar el potencial aromtico. El proceso constara de dos etapas en las que
estaran implicados varios sistemas enzimticos,217 as, en primer lugar, una alfa-L-
rhamnosidasa, alfa-L-arabinosidasa o una beta-D-apiosidasa hidrolizara el diglicsido;
y en la segunda etapa actuara la beta-glucosidasa liberando las agliconas odorferas
correspondientes. Este tipo de preparaciones enzimticas slo son efectivas en vinos
secos, ya que la glucosa inhibe a las beta-glucosidasas fngicas. El efecto de estas
66
Introduccin
enzimas exgenas se centra en la liberacin de los aromas de las variedades con aroma
a Moscatel, no ocurriendo lo mismo en el caso de otras variedades consideradas menos
aromticas por distintas razones (entre ellas, en que no todos los precursores del aroma
varietal tienen que estar necesariamente glicosilados y en que no todas las agliconas no
terpnicas son odorferas).
Por otro lado, los monoterpenoles son compuestos ms o menos sensibles a las
reacciones de hidratacin y de oxidacin.218 Estos fenmenos pueden desarrollarse
durante el envejecimiento del vino, as al transcurrir tres meses, pueden obtenerse a
partir del linalol los siguientes compuestos: nerol, geraniol, alfa-terpineol y 6-7-
dihidroxi-linalol,219 tal como se muestra en la siguiente figura:
OH
OH OH
Nerol Alfa-Terpineol
Linalol OH
OH
OH
OH
Geraniol 6,7-dihidroxi-linalol
Figura 19 Compuestos derivados del linalol formados durante el envejecimiento
Los dioles o polioles terpnicos se transforman a pH relativamente cidos, tales

como los de los mostos o vinos, en monoterpenoles con grados de oxidacin ms o
menos elevados. Si bien, mientras algunos compuestos pueden contribuir positivamente
67
al aroma, en otros casos, otros compuestos pueden influir negativamente en las

caractersticas organolpticas.5,14 Con la maduracin alcanzan valores ms elevados,
llegando algunos de estos compuestos a aumentar considerablemente, como el (E)-3,7-
dimetil-octa-1,5-dieno-3,7-diol, y llegando a sobrepasar al total de todos los dems
terpenoles.
I.4.2.2.2 Carotenoides
Los carotenoides parecen ser los compuestos responsables, al menos en parte, de

que a partir de variedades de uva no aromticas, se obtengan vinos de calidad que se
distinguen por unas caractersticas particulares, puesto que se les puede considerar como
precursores aromticos propios de la cepa.220
Estos compuestos tienen el mismo origen que los terpenoles, aunque con un grado
de polimerizacin ms elevado. Su contenido en la baya vara de 15 a 2000 mcg/kg
segn el compuesto, la cepa, la zona de produccin, etc...221
Entre los principales carotenoides identificados, los ms abundantes son la lutena

y el beta-caroteno, seguidos de la neoxantina, la flavoxantina y la violaxantina por
ejemplo. Se localizan en los cloroplastos de las clulas que constituyen las partes slidas
de la baya, pulpa y hollejo, siendo este ltimo el que presenta mayor contenido (entre
1.8-2.8 veces el de la pulpa).18
Parece que existe una correlacin estrecha entre el grado de maduracin de la uva
y la proporcin de derivados carotenoides (damascenona, vitispirano, etc..., es decir,
derivados C13-norisoprenoides), al igual que sucede con los compuestos terpnicos. Se
ha comprobado que durante la fase de crecimiento de la baya verde se produce un
aumento en el contenido de carotenoides, seguido de un fuerte descenso del mismo a
partir del envero hasta maduracin, aumentando al mismo tiempo las molculas
derivadas de los mismos,222 principalmente en formas glicosiladas. Estos cambios
probablemente requieren la accin de enzimas presentes en la uva, inicialmente en la
degradacin oxidativa de los carotenoides y posteriormente en los mecanismos de
glicosilacin.
68
Introduccin
Asimismo, parece que la exposicin de las uvas a la luz solar durante la

maduracin acelera la degradacin de los carotenoides y se acompaa por un
incremento del contenido glicosilado de derivados C13-norisoprenoides.22 As,
Razungles y col.223 evalan el efecto que la exposicin solar ejerce en los carotenoides y
glicsidos de C13-norisoprenoides en uvas de la variedad Syrah; o Steel y Keller224
estudian la influencia que la luz UV-B tiene en el contenido carotenoideo de los tejidos
de Vitis vinifera (hojas y bayas).
Se ha comprobado que en medio cido, varios C13-norisoprenoides oxigenados

no muy odorferos sufren modificaciones qumicas que pueden llevar a la formacin de
compuestos odorferos como la beta-damascenona,225 tal como se indica en la siguiente
figura:
O OH
Reduccin
OH OH
OH OH
Neoxantina 6,7-megastigmadieno-3,5,9-triol
+
H
O
beta-damascenona
Figura 20 Formacin de beta-damascenona en uvas y vino20
Los C13-norisoprenoides estn presentes en uvas, principalmente, en forma de

precursores no voltiles (carotenoides, o glucsidos, tales como el vomifoliol o el 3-
oxo-alfa-ionol).19,226 Los glicsidos de estos compuestos, identificados hasta ahora, son
todos monoglucsidos, y, aunque no son hidrolizados por las glicosidasas propias de la
69
uva o de las levaduras, si pueden ser liberados por glicosidasas fngicas exgenas. Sin
embargo, parece que todava no est muy claro cuales son los mecanismos implicados,
y actualmente se desconocen cuales son realmente las reacciones relacionadas con la
aparicin de derivados C13-norisoprenoides odorferos.
De Pinho y col.227 determinan los perfiles de carotenoides en uvas, mostos y vinos

fortificados de las variedades de uva cultivadas en la zona del Duero portugus.
Williams y col.228 relacionan los norisoprenoides voltiles encontrados en los

hidrolizados de los precursores existentes en uvas Chardonnay, con su procedencia a
partir de lutena, antheraxantina, violaxantina y neoxantina via 3-hidroxi-alfa-ionona, 3-
hidroxi-beta-ionona, 5,6-epoxi-3-hidroximegastigm-7-en-9-ona y 3,5-
dihidroximegastigma-6,7-dien-9-ona.
I.4.2.2.3 Otros precursores (alcoholes, compuestos fenlicos, tioles voltiles)
Entre los derivados glicosilados presentes en las uvas, y relacionados con el aroma
varietal, pueden encontrarse, adems de terpenos y derivados C13-norisoprenoides, los
constituidos por agliconas tales como:
- alcoholes lineales o cclicos (hexanol, feniletanol, alcohol benclico).

- compuestos fenlicos: cidos fenlicos y fenoles voltiles derivados (vainillina).
Adems, pueden encontrarse los denominados precursores de los tioles voltiles

derivados de la cistena, que parecen ser los responsables del intenso, especfico y
dominante olor de los vinos de Sauvignon Blanc, un olor que suele ser comparado con
el olor de arbustos verdes, o incluso, de orina de gato. Entre los compuestos aromticos
presentes en mostos, que apareceran como precursores inodoros en forma de S-
conjugados de la cistena,229 encontramos el 3-mercaptohexanol,230 4-metil-4-
mercaptopentan-2-ona y 4-metil-4-mercaptopentan-2-ol.231,232 Los aromas
correspondientes se liberarn durante la fermentacin alcohlica, probablemente debido
a la accin de una beta-liasa especfica. Parece ser, asimismo, que la cepa de
Saccharomyces cerevisiae empleada, influir en la intensidad de los aromas liberados.
70
Introduccin
Des Gachons y col.233 estudian la localizacin de los S-conjugados de la cistena

en la baya, y el efecto que le contacto con los hollejos tiene en el potencial aromtico de
mostos de Sauvignon Blanc.
I.4.3 Aroma prefermentativo
Los constituyentes voltiles de la etapa prefermentativa se revelan como

consecuencia de los diversos tratamientos que sufre la uva, desde que se decide realizar
la cosecha hasta que se inicia la fermentacin: operaciones de vendimia (especialmente
en el caso de que sea mecanizada), transporte (temperatura, mosteo, etc...), estrujado-
despalillado-prensado, maceracin, etc...
Durante estas operaciones mecnicas, se pone en contacto el mosto de la uva con

las partes slidas, inicindose toda una serie de reacciones enzimticas y qumicas,
potenciadas, en parte, por el aporte de oxgeno que se produce durante las mismas.
Entre las reacciones enzimticas que se desarrollan, adems de las implicadas en el
pardeamiento, se producen reacciones que darn lugar a compuestos aromticos, tales
como los alcoholes y aldehdos de 6 tomos de carbono, responsables de los olores
herbceos, a partir de cidos grasos poliinsaturados. La formacin de estos ltimos
compuestos parece variar en funcin del estado de madurez de la vendimia, de forma
que la mxima produccin de los mismos aparece antes de la maduracin.
I.4.4 Aroma fermentativo
Esta etapa esencial en la obtencin del vino implica dos procesos de

transformacin biolgica: la fermentacin alcohlica y la malolctica. Mientras que la
primera, comn a todos los vinos, conlleva la transformacin de los azcares en etanol y
productos secundarios gracias al metabolismo de las levaduras, la segunda, fundamental
en el caso de los vinos tintos (gracias a que disminuye la agresividad en boca del vino
obtenido al disminuir la acidez y otros caracteres organolpticos desagradables desde el
punto de vista organolptico), se basa en la degradacin del cido mlico en cido
lctico por las bacterias lcticas.
71
Desde el punto de vista aromtico, la fermentacin alcohlica es la responsable de

la aparicin de todos aquellos compuestos voltiles caractersticos comunes en los
distintos tipos de los vinos. Esta etapa es la que contribuye en mayor medida, a nivel
cuantitativo, a los constituyentes del aroma final del vino.
La fermentacin malolctica, en cambio, permite una modificacin sutil del vino,

un suavizado del mismo, como consecuencia de la reduccin de la presencia del cido
mlico. Su contribucin al aroma no est muy desarrollada, puesto que la disponibilidad
de cepas de bacterias lcticas para evaluar su influencia en las caractersticas
aromticas, es relativamente reciente.
Entre los principales compuestos voltiles fermentativos que contribuyen al aroma

del vino, podemos indicar los siguientes: alcoholes, cidos y sus steres; compuestos
carbonlicos; compuestos azufrados; compuestos nitrogenados; lactonas; o fenoles
voltiles.
I.4.5 Influencia de prcticas viticulturales y tecnolgicas sobre la componente

aromtica.
I.4.5.1 Influencia de las prcticas de cultivo
El efecto que distintas prcticas de cultivo de la vid tienen en la composicin

aromtica de la uva, ha sido estudiado por varios autores: Zoecklein y col.234 realizan
diversos estudios acerca de la influencia que el deshojado tiene en la concentracin de
compuestos glicosilados en uvas de las variedades Riesling y Chardonnay, llegando a la
conclusin de que la concentracin de estos precursores aromticos es superior en
aquellas uvas sometidas al deshojado a lo largo de la maduracin de ambas variedades
de uva.
Tambin Bureau y col.235 Estudian la influencia que la exposicin solar tiene en la

componente aromtica de las uvas para evaluar los efectos que el sombreado de la cepa,
con redes de polietileno, o de los racimos, mediante las hojas o con bolsas, tiene en los
precursores glicosilados de la variedad Syrah. En este caso observan una disminucin
cuantitativa de estos compuestos en los racimos sombreados, particularmente para los
glicsidos fenlicos y de C13-norisoprenoides. De la misma forma, el sombreado de la
cepa reduce el contenido de glicsidos de terpenoles, fenoles y C13-norisoprenoides.
Asimismo llegan a la conclusin de que el microclima del racimo afecta ms
72
Introduccin
determinantemente, a la composicin de la baya, que el ambiente que rodea a la cepa en

cuestin.
Ese mismo grupo realiza un estudio similar con la variedad Moscatel de

Frontignan,236 concretamente sombreando las cepas con una red que slo deja pasar el
50% y el 70%, y los racimos en un 90%. Llegan a la conclusin de que el sombreado
natural de la vegetacin no conlleva una disminucin en los niveles de compuestos
libres o conjugados, en comparacin con las uvas totalmente expuestas, y que, al igual
que en el caso de la variedad anterior, los racimos sombreados artificialmente muestran
menores niveles de monoterpenoles y C13-norisoprenoides.
Un estudio similar para evaluar como influye la exposicin solar en la

composicin aromtica, concretamente en las variedades de uva Moscatel Chileno,
Moscatel de Alejandra y Moscatel Rosada, es llevado a cabo por Belancic y col.237 Para
ello realizan ensayos con racimos completamente expuestos, racimos sombreados
artificialmente de forma que permitan el paso, nicamente, del 20% (sombreados) o del
50% (semi-sombreados) de la exposicin solar. Se encuentran las mayores
concentraciones de terpenoles libres en los racimos semi-sombreados, los sombreados
presentan las menores concentraciones de terpenoles. Adems llegan a la conclusin de
que la temperatura de la baya parece ser crtica para maximizar los niveles de
monoterpenos y el aroma a moscatel de la uva.
Sala y col.238 evalan la influencia que el tipo de disposicin de la vegetacin y la

exposicin solar tiene en el contenido de 3-alquil-2-metoxipirazinas en mostos y vinos
de la variedad Cabernet Sauvignon. Se observa una disminucin del contenido de estos
compuestos a lo largo del periodo de maduracin, as como que los racimos protegidos
de la luz solar desde el envero presentan un menor contenido de 3-isobutil-2-
metoxipirazina que las muestras de control.
Tambin se ha evaluado el efecto que el riego moderado tiene en el potencial

aromtico de las variedades espaolas Tempranillo y Manto Negro, 239 a travs del
ensayo de la glucosa glucosdica. Se observan diferencias claras en el potencial
aromtico entre ambos cultivos y tratamientos (secano, riego), al incrementarse en torno
al 20-30% en la variedad Manto Negro, y del 40-60% en la Tempranillo, cuando se
someten a irrigacin.
La influencia que el suelo y las caractersticas ambientales (terroir) tienen en la

expresin aromtica de la variedad Gewrtztraminer fue estudiada por Dirninger y
col.,240 concretamente realizaron ensayos en 5 parcelas con el mismo sistema de
73
conduccin y tratamiento del suelo. Los principales factores tenidos en cuenta fueron el
clon y el porta-injerto, la densidad de plantacin, la forma de conduccin, la edad de las
cepas, y la orientacin.
Asimismo, parece ser que tambin los fungicidas241 empleados durante el cultivo,
son capaces de influir en el aroma de las uvas, concretamente por su efecto inhibidor de
la biosntesis de esteroles. Los resultados sugieren que estos fungicidas (flusilazol y
triforina) no tienen influencia en la hidroxilacin de monoterpenos libres o en su
oxidacin posterior, pero s pueden influir en la biosntesis de monoterpenos en una
etapa temprana, por ejemplo, durante la isomerizacin del geranil pirofosfato para
formar derivados del linalol. Adems parecen influir tambin en las rutas de
glicosilacin de los monoterpenoles conjugados.
I.4.5.2 Influencia de las prcticas tecnolgicas
Las distintas prcticas desarrolladas de forma previa, durante o posterior a la

fermentacin, influirn en la composicin aromtica final del vino obtenido. De ah que
se hayan realizado numerosos estudios para evaluar cual es esa influencia.
De esta forma se estudian los cambios que las siguientes prcticas tienen en la
distribucin de compuestos aromticos libres y conjugados: la maceracin carbnica242
o la maceracin prefermentativa243 como medios para aumentar el aroma varietal de
vinos de la variedad Moscatel de Frontignan; la adicin de levaduras nativas o
seleccionadas en la glucosa glucosdica, terpenos libres y otras agliconas de vinos de la
variedad Riesling;244 o del efecto de la fermentacin, envejecimiento y envejecimiento
sobre las en los glucsidos totales y no fenlicos.245
Castro Vazquez y col.246 estudian la influencia que el tratamiento enzimtico con

glicosidasas o la maceracin prefermentativa tiene en vinos de las variedades
Chardonnay, Moscatel de Frontignan, Airn y Macabeo. Se observa que ambos
tratamientos incrementan la presencia de los compuestos responsables del aroma
varietal.
Tambin Selli y col.247 evalan el efecto que tiene el contacto con los hollejos
(durante 12 horas a 15C), en los compuestos aromticos libres y conjugados de los
vinos elaborados con la variedad de uva turca Narince.
74
Introduccin
Wilker y col.248 realizan distintos ensayos para determinar el efecto que tres tipos
de tratamientos (adicin de mosto, mezcla de vinos, parada de fermentacin) para el
endulzado de vinos blancos tiene en el aroma de los mismos. Tambin Hernndez-Orte
y col.249 estudian la influencia que la adicin, en este caso de amonio y aminocidos,
tiene en la composicin aromtica de mostos, concretamente de la variedad de uva
Airn.
Asimismo, Ortega-Heras y col.262 estudian la evolucin de los compuestos

voltiles en vinos varietales durante su envejecimiento en madera, llegando a la
conclusin de que la capacidad de extraccin de compuestos voltiles del vino a partir
de la madera depende de la variedad de uva empleada.
En resumen, se puede concluir indicando, como ya se ha mencionado a lo largo de

esta introduccin, que la componente aromtica de los vinos va a estar determinada
tanto por las distintas prcticas y tratamientos aplicados durante el desarrollo de la baya,
como por las distintas prcticas empleadas durante la elaboracin y conservacin del
vino obtenido.
I.5 Determinacin de compuestos relacionados con el aroma
Son varios factores los que complican el anlisis del aroma en alimentos. Es
fundamental la identificacin de los componentes del alimento que contribuyen al
aroma, stos estn habitualmente presentes en cantidades traza o ultra-traza implicando
una gran variedad de clases de compuestos qumicos (que puede llegar a incrementarse
por una manipulacin excesiva de la muestra). Las propiedades fsicas de estos
compuestos son igualmente diversas, variando desde que son gases permanentes a
sustancias con punto de ebullicin que excede varias centenas de grado. Esto facilita las
separaciones pero complica la recuperacin simultnea del conjunto de compuestos
aromticos.250
Las propiedades inherentes al tipo de muestras a analizar, en el caso de alimentos,

tienen como consecuencia que:251
75
las concentraciones de los analitos relevantes en el aroma sean

extremadamente bajas, implicando bajas concentraciones del umbral de
mnimo olor (definido como la mnima concentracin necesaria de una
sustancia odorfera que tiene el 50% de probabilidad de ser percibido
por un individuo), as, para la 2-etil-3,5-dimetilpirazina este umbral es
de 0.007 nL/L.252
la mayora de los aromas sean mezclas, extremadamente complejas, de

diversas sustancias. Kotseridis y Baumes253 identifican 48 sustancias
voltiles diferentes como odorantes con impacto en vinos de Burdeos.
para aquellos aromas que son generados biolgicamente (plantas,

animales), surjan dificultades adicionales debido a la naturaleza
dinmica de estos sistemas. As, la produccin de voltiles en plantas
puede estar afectada por diversos factores tales como la luz solar,
temperatura ambiental, las condiciones de estrs, o la presencia de
contaminantes, a niveles traza, en el ambiente.
algunos odorantes (aquellos compuestos con concentraciones por

encima del umbral de percepcin) presentan una estabilidad qumica
limitada, como resultado de reacciones de fotlisis, oxidacin, etc...
Kesselmeier y Staudt254 estiman que el tiempo de vida qumica
atmosfrica de los monoterpenos bajo condiciones de luz diurna, vara
desde menos de 5 minutos para el alfa-terpineno, a 3 horas para el alfa-
y beta-pineno.
En general las tcnicas analticas que se emplean para el estudio de los

compuestos aromticos en vinos son las mismas que se utilizan para el estudio del
aroma en otro tipo de matrices agroalimentarias. Sin embargo, es necesario destacar,
que en el caso particular del vino, hay que tener en cuenta varios aspectos al realizar los
anlisis: as, la presencia del etanol puede enmascarar algunos de los compuestos,
llegando a dominar los extractos de los compuestos relacionados con el aroma y los
cromatogramas. Adems, la presencia de otros componentes no voltiles, azcares,
cidos y compuestos fenlicos, puede complicar los anlisis al contaminar las columnas
cromatogrficas.255
76
Introduccin
Si tenemos en cuenta todo lo citado anteriormente, es lgico suponer que la

seleccin de las tcnicas de aislamiento de los analitos (preparacin de muestras) sea
una etapa crtica para el anlisis de los compuestos relacionados con el aroma, de hecho,
dependiendo del tipo de muestra y los objetivos planteados, a veces ser necesario
recurrir al empleo de ms de una de estas tcnicas. La tcnica seleccionada puede influir
en el perfil aromtico obtenido, por tanto, el analista debe tener presente en cada
ocasin cuales son las ventajas y desventajas de los distintos mtodos de aislamiento de
estos analitos.
En definitiva, la seleccin de las tcnicas de muestreo, de preparacin de muestra,

de separacin de los analitos, de deteccin y cuantificacin, ser determinante y
crucial256 para la adecuada caracterizacin qumica de los compuestos relacionados con
el aroma.
El mtodo analtico a desarrollar para el anlisis de estos compuestos, en

consecuencia, debe ser capaz de:
9 aislar los componentes voltiles del resto de los presentes en la matriz.
9 permitir una concentracin previa de los mismos (dadas las bajas

concentraciones en las que se suelen encontrar en las distintas muestras).
9 resolver una mezcla compleja, determinando compuestos presentes en

distintos intervalos de concentracin.
I.5.1 Tcnicas de preparacin de muestras
Histricamente, se han empleado cierto nmero de tcnicas entre las que se

incluyen la extraccin con disolventes, destilacin y destilacin/extraccin simultnea.
Las distintas tcnicas de muestreo ofrecen una serie de ventajas individuales pero
tambin presentan limitaciones especficas. Problemas comunes a todas ellas son la
destruccin potencial de los componentes aromticos y/o la produccin de interferentes.
77
La similitud entre el aroma inicial y el conseguido en el extracto por las tcnicas

de aislamiento, es el factor considerado a la hora de juzgar las distintas tcnicas
analticas. Las condiciones empleadas deben ser lo ms suaves posibles para evitar
oxidaciones, degradaciones trmicas, y otros cambios qumicos o bioqumicos en la
muestra, siendo esto particularmente importante en el caso de compuestos altamente
reactivos.
En resumen, el objetivo de esta etapa se reduce a conseguir la transferencia

cuantitativa de los analitos de inters a una fase analizable por cromatografa de gases,
en la que estos compuestos voltiles se encuentren en concentraciones adecuadas. Para
ello, hemos de considerar que, las propiedades determinantes a la hora de seleccionar la
tcnica mas adecuada, son: la volatilidad y su capacidad de ser retenidos selectivamente
en distintos materiales.
Entre las tcnicas ms empleadas para el anlisis de los compuestos voltiles en

alimentos y bebidas, destacan: las tcnicas basadas en distintos tipos de destilacin, la
extraccin lquido-lquido (ELL), la extraccin en fase slida (EFS), o las basadas en el
estudio del espacio de cabeza.
I.5.1.1 Tcnicas basadas en la destilacin
La destilacin est basada en la separacin de los compuestos en base a las

diferencias en sus presiones de vapor. Esta tcnica permite separar los compuestos
voltiles de los no voltiles. Sin embargo, apenas permite fraccionar ni concentrar los
mismos, por lo que debe utilizarse en combinacin con algn sistema de transferencia
de los analitos a una matriz orgnica que permita concentrarlos. Su capacidad para
obtener muestras limpias de solutos no voltiles es su principal ventaja, puesto que no
ocasiona problemas en los sistemas cromatogrficos.
I.5.1.1.1 Destilacin con vapor
Las tcnicas de destilacin ms habitualmente empleadas, se llevan a cabo de

dos formas:
78
Introduccin
o mezclando o suspendiendo la matriz a extraer con agua en un

recipiente provisto de un condensador y, mientras hierve la mezcla,
recolectando la fase condensada (hidrodestilacin). Despus del
proceso, la fraccin orgnica, insoluble en agua, puede ser separada del
agua.
o pasando vapor a travs de un recipiente que contiene la mezcla matriz-

agua (destilacin de arrastre de vapor) para obtener un condensado
similar.
La hidrodestilacin y la destilacin asistida por vapor son procedimientos

tradicionales para el aislamiento de compuestos voltiles relacionados con el aroma a
partir de muestras odorferas. Al ser procedimientos directos y simples, siguen siendo
utilizados ampliamente para la caracterizacin de aromas, solos o en combinacin con
otros procedimientos de preparacin de muestras.
La destilacin con arrastre de vapor tiene la ventaja de que con el aporte del vapor
se consigue reducir la presin en la cabeza de la muestra a destilar, consiguindose
arrastrar compuestos de altos puntos de ebullicin que no se conseguiran mediante una
destilacin simple. Adems permite prolongar la destilacin todo el tiempo que sea
necesario, al permanecer aproximadamente constante el volumen de sustancia a destilar,
y son ms rpidas. Entre sus inconvenientes hay que citar que no consigue buenas
recuperaciones de los solutos ms voltiles, que si no se utiliza vaco se produce la
formacin de artefactos por descomposicin trmica, y que adems los voltiles en el
destilado estn significativamente ms diluidos que en la destilacin simple.
Dimitriadis y Williams257 desarrollan una tcnica rpida para la determinacin de

terpenos voltiles libres (TVL) y potencialmente voltiles (TPV) mediante la destilacin
con arrastre de vapor. En el dispositivo propuesto, los TVL del mosto, a pH prximo a
la neutralidad, son arrastrados por vapor de agua, a continuacin se acidifica el mosto
(pH 2-2.2) con cido fosfrico y se recoge la fraccin que contiene los TPV.
Este mismo dispositivo es empleado por Girard258 para analizar los compuestos
terpnicos voltiles (libres y potenciales) en uvas de la variedad Gewrtztraminer.
79
I.5.1.1.2 Destilacin-Extraccin simultnea (DES)
Tambin conocida como mtodo de Lickens-Nickerson. Con este mtodo se

pretende superar los inconvenientes que presenta la destilacin con arrastre de vapor.
El aparato de Lickens-Nickerson opera a presin reducida para reducir el punto de

ebullicin de la muestra y minimizar la formacin de los artefactos trmicamente
inducidos. Este aparato consta de dos matraces, en uno se coloca la muestra con agua
destilada, y en el otro se recoge el disolvente extractante que es ms denso que el agua
(diclorometano, cloroformo, etc...). Ambos matraces se calientan, el agua y los vapores
del disolvente se conducen al cuerpo del extractor donde se condensan sobre la
superficie de una tubera fra. En esta operacin los analitos relacionados con el aroma
se eliminan de la matriz por el vapor de agua y se transfieren a la fase orgnica cuando
los lquidos condensan. Tanto el agua como el disolvente se recolectan en el cuerpo del
extractor despus de su condensacin y vuelven a los matraces correspondientes,
permitiendo un reflujo continuo.
Existen una serie de dificultades prcticas asociadas con su uso, y al hecho de que
el empleo de bajas presiones en la zona del extractante dificulta la retencin del mismo
en el aparato. Se han ensayado algunas modificaciones del mismo, como la inclusin de
un condensador de hielo seco/acetona seguido de una trampa de nitrgeno lquido, sin
embargo, no se ha conseguido eliminar esos inconvenientes.
Blanch y col.259 emplean esta tcnica para la extraccin de los compuestos

relacionados con el aroma en vinos, para ello ensayan tres modos diferentes de
operacin: DES a presin atmosfrica, DES a presin reducida y DES implicando la
concentracin del espacio de cabeza dinmico resultante de la purga de la muestra con
un gas inerte.
La DES es tambin empleada por Winterhalter y col.260 para analizar los

compuestos voltiles C13-norisoprenoides (TDN, vitispirano, damascenona) en vinos
Riesling.
Varios autores261,262 han detectado, con est tcnica, problemas de bajas

recuperaciones de compuestos con alta volatilidad, prdidas de analitos con formacin
de artefactos y oxidacin de componentes.
80
Introduccin
I.5.1.1.3 Otros mtodos de destilacin
Tanto la destilacin a presin atmosfrica como la destilacin-extraccin

simultnea, pueden presentar problemas a la hora de caracterizar compuestos
relacionados con el aroma, puesto que las temperaturas usualmente necesarias para la
operacin pueden provocar la degradacin de algunos analitos.
La destilacin a vaco, que puede desarrollarse en condiciones ms suaves, puede

superar los problemas anteriormente citados y es una alternativa a los mtodos comunes
de destilacin. Bouchilloux y col.263 realizan una destilacin, entre 35 y 45C y con
presiones entre 0.5 y 1.5 Pa, y derivatizacin simultnea con cido p-
hidroximercuribenzoico, para determinar, a niveles traza, tioles voltiles en vinos tintos
de Burdeos.
Sin embargo hemos de considerar que, a pesar de que si la destilacin se realiza a

presiones reducidas se reduce el riesgo de formacin de artefactos, tambin se reduce la
eficacia del proceso. Adems en el caso de muestras de alimentos, puede que las
temperaturas empleadas en esta destilacin permitan el funcionamiento de distintos
sistemas enzimticos que influirn en la composicin de la muestra.
I.5.1.2 Extraccin lquido-lquido (ELL)
El principio fundamental en el que se basa esta tcnica es en la solubilidad de los

analitos entre dos fases distintas. Dadas las caractersticas de los compuestos voltiles,
el reparto se suele dar entre una fase principalmente acuosa, la matriz de partida, y otra
fase orgnica de una polaridad determinada. Las mezclas azeotrpicas con disolventes
orgnicos permiten modificar el rango de polaridad de los compuestos extrados y
mejorar la eficiencia.
La extraccin simple con un disolvente, seguida de la concentracin bajo

nitrgeno o en un evaporador rotatorio, ha sido uno de los mtodos ms antiguamente
utilizados en el anlisis de compuestos relacionados con el aroma en alimentos. Dada la
complejidad de los aromas presentes en estas matrices, es necesario seleccionar un
disolvente que nos permita representar fielmente la composicin de la matriz original.
81
Esta extraccin puede realizarse en modo discontinuo o continuo. En forma

continua se consigue mejorar la sensibilidad, debido a que la recirculacin continua de
nuevo disolvente orgnico con baja concentracin del analito favorece la extraccin. La
extraccin continua requiere, en ocasiones, el calentamiento del disolvente extractante
hasta su punto de ebullicin, teniendo que tomar precauciones para minimizar la
degradacin trmica de los analitos extrados durante este proceso.
Si el disolvente empleado en la extraccin continua tiene poca afinidad por

algunos de los compuestos de inters, ser necesario alargar el tiempo de extraccin,
llegando a un momento en que la concentracin de voltiles existente en el extractante
que recircula es similar a la de la matriz, lo que se conoce como efecto de dilucin del
extracto.
Adems hemos de considerar que es inevitable, que junto con los voltiles de
inters pasen al extracto otros compuestos, que aunque no aparezcan en concentraciones
importantes, pueden dificultar posteriormente el anlisis. Por tanto, en estos casos ser
necesario incluir una etapa de limpieza previa al anlisis por CG.
A la hora de seleccionar el disolvente a emplear para realizar la extraccin hemos

de tener en cuenta que debe ser capaz de concentrarse fcilmente en la etapa posterior a
la extraccin, por tanto, es preferible que su punto de ebullicin sea lo ms bajo posible
para evitar la degradacin de compuestos termolbiles y para evitar prdidas durante su
evaporacin.
En las bebidas alcohlicas el etanol y otros productos mayoritarios de la

fermentacin pueden complicar el aislamiento de los compuestos voltiles. Sin
embargo, la presencia del etanol tiene un efecto importante en la capacidad de
extraccin de distintos sistemas de disolventes, ya que, las solubilidades de los
disolventes son mayores que las encontradas en el caso de matrices acuosas, y los
coeficientes de extraccin son significativamente menores que los encontrados en
muestras acuosas como consecuencia de la mayor solubilidad de la mayora de los
compuestos voltiles en sistemas hidroalcohlicos.
En este tipo de muestras, los sistemas que han mostrado mayores eficiencias en la
extraccin de compuestos aromticos son las extracciones continuas con
trifluorometano, diclorometano, o diversas mezclas azeotrpicas con ms de un
disolvente, lo que permite modificar el intervalo de polaridades de los compuestos
extrados y mejorar la eficiencia.
82
Introduccin
La eleccin del disolvente orgnico para la extraccin de muestras vnicas es

crtica, siendo los ms usados aquellos que presentan una baja afinidad por el etanol. El
triclorofluorometano (Freon 11) se ha utilizado ampliamente debido a su baja afinidad
por alcoholes de menos de 4 carbonos.264 Su bajo punto de ebullicin (23.7C) minimiza
la formacin de artefactos durante las extracciones continuas, asimismo permite la
evaporacin sencilla del mismo con mnimas prdidas.
Zhou y col.265 utilizan Freon-11 para determinar los componentes aromticos de

vinos de Moscatel, tambin Ebeler y col.266 emplean el mismo extractante para el
anlisis del aroma de muestras de brandy, donde comparan la ELL con la MEFS,
observando que con la ELL se extraen ms eficientemente los alcoholes superiores,
siendo mejor la selectividad para esteres y cidos en la MEFS. Asimismo, Miklsy y
Kernyi267 comparan de esta misma forma los componentes voltiles del aroma de
bayas con pudricin noble para la produccin de vinos de Tokaj, procedentes de dos
zonas de Hungra.
La reciente preocupacin sobre la contaminacin medioambiental ha limitado el

uso de los CFC, y, por tanto, del Freon 11 en investigacin. En consecuencia se esta
extendiendo el uso de otros disolventes, como la mezcla pentano-ter dietlico, o
diclorometano.
Lpez y Gmez268 extraen compuestos terpnicos (linalol, alfa-terpineol,

citronelol, nerol y geraniol) en vino artificial (12% v/v etanol en agua) con distintos
disolventes: ter dietlico, n-pentano, Freon-11, n-hexano, 1:1 ter dietlico-pentano, 1:1
ter dietlico-hexano y diclorometano. Los mejores resultados los obtienen con
diclorometano y 1:1 ter dietlico-pentano.
Kotseridis y col.269 analizan beta-damascenona en vinos tintos mediante la ELL

con ter dietlico-hexano (1:1), al igual que pirazinas, cetonas norisoprenoides,
terpenoles y alcoholes de 6 tomos de carbono en vinos de distintos clones de Merlot.270
Rocha y col.271 realizan la extraccin continua de mostos de las variedades de uva

blanca Maria Gomes y Bical, con diclorometano a 50C durante 25 horas, para analizar
los compuestos voltiles y potencialmente voltiles. Tambin utilizan este disolvente: el
mismo equipo para identificar los compuestos de impacto en el aroma de vinos tintos de
Baga; 272 Camara y col.273 para determinar sotolon (3-hidroxi-4,5-dimetil-2(5H)-
furanona) en vinos fortificados de Madeira; Ortega-Heras y col.274 al comparar la ELL
con tcnicas de espacio de cabeza esttica y dinmica en el anlisis de la composicin
83
aromtica de vinos; Schneider y col.275 para estudiar los compuestos voltiles

implicados en el aroma de vinos fortificados (vinos dulces naturales) de Garnacha tinta;
o Selli276 para el anlisis de vinos tintos de la variedad de uva Kalecik Karasi cultivada
en Anatolia.
Tambin emplean la ELL con diclorometano: Mallouchos y col.277 al evaluar el

efecto biocataltico del uso de Saccharomyces cerevisae inmobilizadas en hollejos de
uva en los compuestos voltiles del vino obtenido; Kotseridis y Baumes38 al identificar
los compuestos impactantes en el aroma de mostos y vinos tintos de Burdeos; Daz-
Plaza y col.278 cuando comparan los aromas de vinos, con distinto contenido tnico,
envejecidos en barricas de roble francs; o Morales y col.279 al estudiar la influencia que
la adicin de virutas de roble, para acelerar el envejecimiento, tiene en la composicin
aromtica de vinagres de vino.
Castro y col.280, en cambio, realizan una extraccin rotatoria y continua con una
mezcla de ter dietlico-pentano (2:1), para determinar compuestos voltiles (alcoholes,
cidos, esteres, lactonas, amidas y fenoles) en vinos finos de Jerez. Esta misma mezcla
es empleada por Prez-Prieto y col.281 para evaluar el efecto que el origen, volumen y
edad de la barrica empleada en vinificacin tiene en la composicin voltil del vino
obtenido; y por Pedersen y col.282 para analizar geraniol, nerol, linalol y alfa-terpineol
en vinos.
En el caso del anlisis de compuestos azufrados en el aroma del vino,283 la mezcla

pentano-diclorometano (2:1) es la preferida para llevar a cabo la extraccin,284,285 as
como el acetato de etilo.286 Cabaroglu y Canbas287 emplean este mismo sistema de
disolventes, para estudiar el efecto que el contacto con los hollejos tiene en la
composicin aromtica de vinos de Moscatel de Alejandra; al igual que Morales y
Duque,288 para determinar los voltiles libres y glicosilados presentes en manzanas
Mammea americana; y que Versini y col.289 para el estudio de los componentes del
aroma de vinos de las variedades gallegas Albario, Loureira y Godello.
84
Introduccin
I.5.1.3 Extraccin en fase slida (EFS)
En una aplicacin tpica los componentes del aroma recuperados por extraccin
con disolventes o destilacin se hacen pasar por el cartucho relleno con el adsorbente
adecuado. En sus inicios, surgieron varios problemas asociados con la adsorcin de
voltiles en las paredes del cartucho dando pobres recuperaciones, pero estas
limitaciones se han superado y existe gran diversidad de fases slidas disponibles a la
hora de seleccionar el adsorbente ms adecuado para la retencin de compuestos
aromticos mientras se eluyen los materiales interferentes, o viceversa.
Ferreira y col.290 realizan una comparacin entre 7 fases slidas, (Amberlita-

XAD-2, 4, 7 y 16, Porapak Q, C8 y C18), y 7 sistemas disolventes (diclorometano,
diclorometano-pentano (1:1), freon 113, ter dietlico-pentano (1:1 y 1:9) y acetato de
etilo-pentano (1:3 y 1:20) con o sin efecto adicional de la saturacin con sal) para
estudiar su habilidad a la hora de extraer compuestos aromticos en bebidas alcohlicas,
llegando a la conclusin de que en todos los casos las ELL pueden ser reemplazadas
satisfactoriamente por sistemas de EFS.
En el caso de muestras de vinos y derivados se ha aplicado la EFS a la

determinacin de precursores aromticos, tales como los precursores de damascenona
en uvas blancas (Chardonnay, Semillon y Sauvignon Blanc)291 o glicsidos de mono-,
di- y tri-terpenoles, y de alcoholes norisoprenoideos,292 mediante la adsorcin en C18; o
de glucsidos de C13-norisoprenoides293 empleando una resina de XAD-2 para el
aislamiento de los mismos y derivatizndolos (en forma de trifluoroacetilos) para su
posterior determinacin por CG-MS. Tambin utilizan esta ltima resina: Dieguez y
col.294 para evaluar la contribucin de los aromas primarios de la uva empleada a la
tipicidad de los destilados de Orujo; o Zhou y col.101 al comparar la ELL, con Freon-11,
con la elucin, mediante este mismo disolvente, de los compuestos voltiles retenidos
en este tipo de resina.
Este mismo tipo de adsorbente es utilizado por Kotseridis y Baumes38 al

identificar los compuestos odorantes de impacto en vinos y preparados comerciales de
levaduras; por Fondvillebagnol y col.295 al determinar compuestos voltiles en mostos
en fermentacin; o por Edwards y Beelman296 para el anlisis de alcoholes superiores,
esteres y cidos en vinos. Wada y Shibamoto,297 en cambio, determinan el mismo tipo
de compuestos voltiles en vino tinto Chablis, usando columnas de Porapak Q
(copolmero de etilvinilbenceno-divinilbenceno) y diclorometano para la desorcin.
85
Ortega y col.,298 asimismo, estudian los coeficientes de distribucin slido-lquido

en resinas de Porapak Q, para determinar sus propiedades de retencin con vistas a su
aplicacin al anlisis de alquil-metoxipirazinas y beta-damascenona en vinos. Los
resultados indican que es necesario un lecho de unos 5 cm para conseguir la
recuperacin cuantitativa de los analitos a partir de 500 ml de vino (diluido a 1000 ml
con agua previamente). El lmite de deteccin conseguido en la etapa de aislamiento se
sita por debajo de los 10 ng/l.
Moret299 desarrolla un mtodo para la determinacin cuantitativa de los

componentes aromticos en vino mediante su adsorcin en una columna con tierra de
diatomeas (de elevada rea superficial) y la posterior elucin con la mezcla pentano-
cloruro de metileno (2:1). Karsek y col.300 emplean Amberlita XAD-7 para la
identificacin de vinos monovarietales.
En la determinacin de clorofenoles en macerados de corchos y muestras de

vinos, Insa y col.87 comparan la MEFS con la EFS para la preconcentracin de estos
compuestos previa al anlisis por CG de sus derivados acetilados. De las dos fases
slidas ensayadas, C18 y Oasis HLB, se obtienen los mejores resultados con la segunda
de ellas. Dieguez,301 en cambio, selecciona el C18 para estudiar la evolucin de cidos
orgnicos voltiles en aguardientes durante su almacenamiento a distintas temperaturas.
En los ltimos aos, la fase slida con base poliestireno-divinilbenceno ha

comenzado a emplearse frecuentemente en este tipo de anlisis, as Lpez y col.302
determinan compuestos voltiles minoritarios y traza en vinos mediante la EFS con
cartuchos de LiChrolut EN, realizando la elucin con diclorometano.
Domnguez y col.303 la emplean para analizar fenoles voltiles (etil- y

vinilfenoles) en vinos finos de Jerez, para ello desarrollan un mtodo fcil, rpido y
repetible, que consta de una sola etapa, y que permite extraer simultneamente 12
muestras, para ello emplean un dispositivo de extraccin a vaco provisto de 12
posiciones para insertar los correspondientes cartuchos con la fase slida. La elucin de
los compuestos se realiza con diclorometano.
Para la determinacin cuantitativa de sotolon, maltol y furaneol en vinos, Ferreira

304
y col. realizan una EFS, en cartuchos rellenos con 800 mg de este tipo de adsorbente,
de 50 ml de vino. Los interferentes se eliminan mediante el paso 15 ml de pentano-
diclorometano (20:1), y se recuperan los analitos con 6 ml de diclorometano,
concentrndose posteriormente de forma previa a su anlisis por CG-MS.
86
Introduccin
En el caso de muestras de vinagre de vino, Morales y col.300 evalan los

compuestos cedidos por la madera durante su envejecimiento acelerado con la presencia
de virutas de roble, para ello ensayan dos tipos de presentaciones comerciales de
poliestireno-divinilbenceno (LiChrolut EN y BondElut ENV), llegando a la conclusin
de que se consigue extraer un intervalo ms amplio de compuestos voltiles con la
primera de ellas. Asimismo, Tesfaye y col.305 realizan la EFS, con este mismo
adsorbente, de los compuestos voltiles procedentes de la madera utilizada en el
envejecimiento acelerado de vinagres, para estudiar cual es la evolucin de la
composicin aromtica de los mismos.
Culler y col.306 la emplean en el desarrollo de un mtodo para fraccionar los

extractos de compuestos aromticos en vinos. En concreto, recuperan los voltiles,
previamente retenidos en un cartucho de LiChrolut EN, con 5 ml de diclorometano y a
continuacin se fracciona este extracto (tras concentrarlo hasta 0.1 ml) mediante el
empleo de un lecho preparado al rellenar un recipiente de polipropileno con 0.55 g de
LiChrolut EN hasta una altura de 5 cm. El extracto concentrado se adiciona gota a gota
dejando que se evapore cada una de ellas antes de aadir la siguiente. En primer lugar,
se obtiene una primera fraccin por elucin con 4 ml de pentano, la segunda fraccin se
consigue al fluir con una mezcla de pentano-diclorometano (9:1), y, por ltimo, la
tercera fraccin se recupera con 4 ml de diclorometano. La primera fraccin contiene
esteres etlicos y otros compuestos no polares, la segunda los alcoholes y algunos
fenoles voltiles, y la tercera los cidos grasos, derivados de la vainillina y algunas
lactonas.
Otra alternativa que surge del empleo de la EFS es la determinacin de

compuestos voltiles derivatizados directamente en el cartucho en el que se realiza la
extraccin, concretamente en el caso de LiChrolut EN. As Culler y col.307 analizan
aldehdos (de entre 5 y 8 carbonos) en vinos a travs de la formacin de sus O-
(2,3,4,5,6-pentafluorobencil)oximas en el propio cartucho, de esta forma consiguen
mejorar la selectividad y sensibilidad del mtodo.
De la misma forma, Ferreira y col.308 analizan octanal, nonanal, decanal, (E)-2-

nonenal y (E, Z)-2,6-nonadienal en vinos tras la formacin de sus O-(2,3,4,5,6-
pentafluorobenzyl)oximas en el cartucho de EFS.
Mencin aparte supone la aplicacin de la EFS como etapa previa para la

determinacin de los compuestos aromticos (libres y ligados) presentes en uvas y
vinos. El aislamiento de glicsidos a partir de vinos y mostos por su retencin selectiva
87
en un adsorbente es una tcnica comnmente empleada.309 Mediante el lavado de la fase

slida con agua tras la etapa de adsorcin, los azcares libres y otros constituyentes
polares pueden eliminarse, mientras los glicsidos, menos polares, permanecen
retenidos.
Los mtodos tradicionales de medida de los productos resultantes de la hidrlisis

de los glicsidos, suponen un elevado consumo de tiempo, requiriendo etapas de
aislamiento, hidrlisis y anlisis por CG,310 o restringen su aplicacin a variedades
aromticas con un elevado contenido en compuestos terpnicos.311
Williams y col.312 desarrollan un mtodo simple para la determinacin de la

composicin glicosdica total en una muestra mediante la cuantificacin de la glucosa
glicosdica (GG). Este mtodo se basa en la relacin molar uno-uno entre la glucosa y
los glicsidos encontrados en uvas. El mtodo implica el aislamiento de los glicsidos
por EFS con C18, seguido de una hidrlisis y determinacin enzimtica de la glucosa
liberada.
Puesto que la fraccin glicosilada en uvas tintas est dominada por las
antocianinas glicosiladas, Iland y col.313 mejoraron el mtodo anterior al realizar una
medida espectrofotomtrica de las antocianinas, y restrsela al valor GG obtenido para
obtener un valor de GG sin la interferencia de los compuestos responsables del color de
las uvas tintas.
Zoecklein y col.314 tambin modifican el mtodo GG total (GGT) desarrollado por

Williams,60 realizando la extraccin de los glicsidos a pH=13, de forma que los
glicsidos fenlicos no se retienen en la fase slida. Este mtodo de medida de GG libre
de fenoles (GGLF) intenta dar una estimacin ms exacta del conjunto de compuestos
precursores del aroma.
Gnata y col.315 proponen un mtodo para la extraccin y determinacin de

fraccin de componentes aromticos (alcohol benclico, 2-feniletilalcohol y terpenoles)
libres y glicosilados en mostos y vinos. Para ello la muestra de entre 50 y 100ml de
mosto o vino se pasa a travs de una columna de Amberlita XAD-2. Posteriormente se
lava el cartucho con 50ml de agua para eliminar azcares, cidos y otros componentes
solubles en agua. La separacin de la fraccin libre se realiza mediante la elucin de
50ml de pentano, y la fraccin glicosilada se obtiene al eluir con 50ml de acetato de
etilo.
88
Introduccin
Este mismo tipo de resina y de procedimiento ha sido ampliamente utilizado por

diversos autores, modificando en algunos casos los disolventes empleados para la
elucin, para el anlisis de: glicsidos monoterpnicos en uvas;316 compuestos
terpnicos, norisoprenoides y sus precursores en distintas variedades de uva (Cabernet
Sauvignon, Chardonnay, Riesling, Sauvignon Blanc, Smillon, Syrah);317 la
localizacin de compuestos aromticos libres y ligados entre el hollejo, el jugo y la
pulpa en uvas Monastrell, Cabernet Sauvignon y Tempranillo;318 componentes
aromticos (libres y ligados) en vinos de variedades de uva espaolas: Albario,142,319,320
Loureira,142,181 Godello,142 (Treixadura, Listan, Viura, Xarel.lo, Parellada, Garnacha,
Tempranillo),180, y Monastrell;321 el potencial aromtico de tres variedades de Moscatel
(de Alejandra, de Hamburgo, y de Frontignan);322 glicsidos en vino Moscatel;155
compuestos aromticos libres y glicosilados en uvas de variedades no florales (Chenin,
Colombard, Riesling, Smillon);323 compuestos voltiles liberados tras la hidrlisis de
los glicoconjugados de hojas y uvas de las variedades Moscatel de Alejandra y
Syrah;324 compuestos aromticos de la variedad Emir (cultivada en Anatolia);325 de las
intensidades aromticas de los compuestos voltiles liberados en los hidrolizados de los
precursores extrados de uvas Tempranillo y Garnacha.326
Asimismo Oliveira y col.327 realizan la separacin de las fracciones de

compuestos aromticos libres y de precursores glicosilados mediante la EFS con
Amberlita XAD-2, con vistas a la caracterizacin y diferenciacin de 5 variedades de
uva empleadas en la elaboracin de los Vinhos Verdes en base a sus compuestos
monoterpnicos.
Williams y col.328 emplean el C18 como adsorbente para el aislamiento de

glicsidos monoterpnicos y precursores norisoprenoides de mostos y vinos. En
concreto, despus de cargar la muestra de mosto o vino y de lavarla con agua, se realiza
la elucin con metanol. A esa fraccin se le elimina el disolvente y se seca, obteniendo
un residuo que se disuelve en agua y se extrae con Freon, y en el que no existen
compuestos aromticos libres, es por tanto, la fraccin donde se encuentran los
precursores de inters.
Este mismo grupo, estudia la presencia de glicsidos monoterpnicos

(disacridos)329 en uvas y vinos. Tambin proponen la seleccin de C18 para el
fraccionamiento de precursores glicosilados del aroma en uvas y vinos, Mateo y col.,159
y Batisttuta y col.330 As pues la EFS con C18, para la separacin de los compuestos
libres y ligados relacionados con el aroma, ha sido aplicada por numerosos autores,
tanto en uvas como en vinos.
89
En el caso de las uvas, se ha analizado el potencial aromtico de distintas

variedades, entre ellas Smillon,331 Sauvignon Blanc,191,332,333 Chardonnay,191,334,194
Merlot y Cabernet Sauvignon,335 Albario,336 Cortese,194 o Pinot Noir.337
Battistutta191 eluye la fraccin libre del vino retenido en el cartucho de C18 con
una mezcla de cloroformo-hexano (1:2), empleando metanol para la elucin de los
glicsidos monoterpnicos. Kotseridis y col.,118 en cambio, determinan los precursores
de la beta-damascenona en vinos tintos, tras la separacin de la fraccin libre con una
ELL previa con ter dietlico-hexano (1:1), mediante la elucin del cartucho de C18 con
etanol.
Recientemente, Schneider y col.338 han desarrollado un mtodo para el anlisis de

los glicoconjugados del aroma presentes en uvas mediante el uso de espectrometra
FTIR y el empleo de tcnicas quimiomtricas. Para ello, en primer lugar, aislan estos
compuestos del mosto usando cartuchos de C18, y los eluyen con metanol. Adems
previamente a la EFS utilizan PVPP para eliminar la mayora de los polifenoles, puesto
que interferirn en el anlisis por FTIR.
I.5.1.4 Tcnicas basadas en el estudio del espacio de cabeza
Estos mtodos se basan en las condiciones termodinmicas de las fases en

contacto, y en la existencia de una relacin entre las concentraciones de cada uno de los
componentes existentes en las distintas fases implicadas en un sistema heterogneo que
est en equilibrio.
Se trata de procedimientos basados en la manipulacin del espacio de cabeza en

contacto con los materiales odorantes. Se ha estudiado ampliamente las ventajas del
muestreo del espacio de cabeza para la recuperacin de compuestos voltiles asociados
con el aroma.
Este tipo de procedimientos pueden clasificarse en dos grupos: las tcnicas de

espacio de cabeza estticas y las dinmicas.
[ Estticas: implican la recuperacin en aquellas muestras en equilibrio dentro de

un recipiente sellado a una temperatura controlada, retirndose la muestra del espacio de
cabeza a travs del septum. De forma que el gas en equilibrio con la muestra de inters
90
Introduccin
es directamente analizado por CG o cualquier otra tcnica adecuada, sin otra etapa de
tratamiento de muestra.
Sin embargo, puesto que la preconcentracin de los analitos a la que conduce es

mnima o inexistente, si consideramos los niveles traza o ultra-traza a los que aparecen
los compuestos de inters, no suele emplearse para el anlisis de aromas; de forma que
la utilizacin de esta tcnica de muestreo est limitada fundamentalmente por los bajos
lmites de deteccin, si bien en los ltimos aos se han desarrollado sistemas que
permiten incrementar esos lmites.
[ Dinmicas: implica el paso de un gas inerte a travs de la muestra y la

recoleccin de los constituyentes voltiles arrastrados en una trampa o sistema de
retencin. De esta forma el equilibrio entre la muestra y el espacio de cabeza es
renovado continuamente, mejorando por tanto la sensibilidad.
Las distintas tcnicas de este tipo difieren en el tipo de trampa empleada y en la

forma de carga y descarga de la trampa, con mtodos entre los que se incluyen: la
trampa criognica, la adsorcin en un lecho de adsorbente, las trampas de vapor en
columna o el uso de trampas criognicas de columna completa.
La desorcin de los analitos atrapados para el posterior anlisis puede llevarse a

cabo con pequeos volmenes de los disolventes adecuados,339 o usando dispositivos
para la desorcin trmica (por calentamiento).340 Estos ltimos presentan la ventaja de
que pueden automatizarse, y el inconveniente de que pueden degradarse algunos
compuestos termolbiles.
Entre las trampas empleadas, las trampas de fro tienen la desventaja de que se
recoge agua junto con el material voltil, puesto que son condensadores por donde
circula nitrgeno lquido, generalmente, provocando la condensacin de los voltiles
arrastrados.
Las trampas de adsorbentes ms comunes son las de carbn activo, o las de

polmeros porosos, tales como el Tenax o el Porapak. As, Mamede y col.341 emplean
una trampa de Tenax para el anlisis de componentes aromticos en mostos
fermentados.
En concreto, en el anlisis de los compuestos voltiles del vino, ambos tipos de

tcnicas, estticas y dinmicas, han sido ampliamente utilizados. Sin embargo, puesto
91
que el procedimiento esttico a menudo ofrece poca sensibilidad para voltiles traza, es
ms frecuente el uso del procedimiento dinmico. En este ltimo caso, los analitos
suelen atraparse, criognicamente, en disolventes orgnicos, o en polmeros adsorbentes
como Tenax o Porapak Q. El primero es el ms ampliamente utilizado para el anlisis
de muestras de vino, debido a su baja afinidad por el agua y el etanol.342 As, Rosillo y
col.343 analizan los voltiles libres presentes en distintas variedades de Vitis vinifera, con
la finalidad de diferenciarlas, mediante el anlisis dinmico del espacio de cabeza, para
ello purgan las muestras de mosto con He durante 20 minutos y atrapan los voltiles en
una trampa de Tenax TA. Este mismo procedimiento es empleado por Girard y col.344
para evaluar los efectos que distintos tipos de vinificacin (a 30C, a 20C, a 15C y a
15C con mosto filtrado por gravedad previamente) tienen en los perfiles de CG de
vinos de Pinot Noir.
Los compuestos voltiles habitualmente identificados mediante las tcnicas

estticas y dinmicas de espacio de cabeza en muestras vnicas, son, generalmente,
esteres, alcoholes y cidos asociados con la fermentacin alcohlica.49,345,346 Tambin se
han determinado terpenos (linalol y alfa-terpineol) y norisoprenoides (vitispirano,
TDN).49,50
9 Microextraccin en fase slida (MEFS)
Suele ser una tcnica seleccionada a menudo para el anlisis de los compuestos
relacionados con el aroma, puesto que se trata de una tcnica libre de disolventes,
sensible, que permite un muestreo rpido con bajo coste, y es de fcil operacin. Esta
tcnica emplea una fibra de corta longitud (1-2 cm) de slice cubierta con un adsorbente.
Esta fibra se dispone inmersa directamente en la muestra acuosa o en el espacio de
cabeza existente por encima del la muestra lquida o slida. El equilibrio se alcanza
antes en la MEFS de espacio de cabeza (MEFS-EC), que en la MEFS de inmersin
puesto que no hay lquido que impida la difusin del analito en la fibra.347 Se trata de
una tcnica idnea para la obtencin de huellas digitales de los aromas de alimentos,
aunque su beneficio ms obvio es su habilidad para aislar y concentrar compuestos
voltiles sin interferencia de los componentes de la matriz.
La MEFS-EC muestra una sensibilidad, para compuestos aromticos voltiles y

semi-voltiles, mucho mayor que otras tcnicas convencionales de espacio de cabeza,348
aunque esta ltima tcnica ofrece mayor sensibilidad cuando se analiza compuestos
aromticos extremadamente voltiles.44
92
Introduccin
La extensin en que se produce la adsorcin en la fibra de MEFS depender de

varios parmetros relacionados con el analito y la fibra empleada, de forma que ha de
considerarse, entre otros factores, la volatilidad del analito, la concentracin del mismo
y la fuerza inica de la muestra. La seleccin de la fibra de apropiada polaridad y, en
menor extensin, el grosor del recubrimiento de la misma, es una etapa crtica para el
proceso y depende a su vez de la naturaleza del analito.
La selectividad de la adsorcin depender del uso de las fibras apropiadas.45,349

Esto es especialmente importante en aquellos casos de anlisis cuantitativo donde debe
controlarse efectivamente la adsorcin competitiva.
La MEFS es un mtodo sensible a las condiciones experimentales y cualquier

cambio en las mismas puede influir directamente en los coeficientes de distribucin y la
velocidad de adsorcin de los analitos, y, en consecuencia, en la cantidad de analitos
adsorbidos y en la reproducibilidad del mtodo. Para obtener resultados reproducibles,
deben controlarse cierto nmero de variables experimentales: mtodo de muestreo
(espacio de cabeza o inmersin), volumen de lquido y espacio de cabeza, pH de
muestra, contenido salino (puesto que la adicin de sal incrementa, usualmente, la
adsorcin),350 tiempo de muestreo, temperatura, profundidad de inmersin de la fibra,
condiciones de agitacin y calentamiento (de esta forma se consigue reducir el tiempo
en que se alcanza el equilibrio para los compuestos menos voltiles),351 etc...
En el caso particular de la MEFS, son varios los autores que han empleado esta
tcnica para el anlisis de compuestos voltiles en vinos, para ello, adsorben los analitos
en la fibra seleccionada, para posteriormente desorberlos mediante la introduccin de la
misma en el puerto de entrada del cromatgrafo de gases.352 Se han empleado distintos
tipos de fibras en estos anlisis353: PDMS (polidimetilsiloxano) para muestras de vino o
derivados en la determinacin de distintos compuestos aromticos354,355,356,357 o
tricloroanisoles358 y clorofenoles (tri-, tetra- y penta-clorofenoles);359 CAR-PDMS
(carboxen-polidimetilsiloxano) para el anlisis de compuestos azufrados360,361,362 en
vinos o de compuestos aromticos en vinagres;363 PA (poliacrilato) para analizar
compuestos azufrados364 o compuestos voltiles;55,365 CAR-DVB (carboxen-
divinilbenceno) para determinar diacetilo366 o benzotiazol367 en vinos; etc...
93
Buszewski y Ligor, 368 Baptista y col.369 y Begala y col.370 emplean fibras de PA

para determinar compuestos voltiles en vinos mediante MEFS-EC. Tambin Camara y
col.371 emplean la misma fibra para analizar los compuestos relacionados con el aroma
varietal (monoterpenos y C13-norisoprenoides) en cuatro variedades de uva empleadas
en la elaboracin de vinos de Madeira.
Numerosos autores han ensayado distintas combinaciones de fibras para el

anlisis de aromas en vinos as: Ferreira y de Pinho372 evalan 7 tipos de fibras en la
MEFS-EC de compuestos aromticos en vinos blancos (alcoholes, aldehdos, terpenoles
y C13-norisoprenoides), obteniendo la mejor eficiencia en la extraccin con la
combinacin de los recubrimientos DVB-CAR-PDMS; Bonino y col.373 emplean
combinaciones de PDMS-DVB, CAR-DVB y PDMS para la MEFS de compuestos
aromticos en el vino italiano Ruche, seleccionando finalmente la primera de ellas;
Demyttenaere y col.374 estudian la composicin aromtica de vinos blancos griegos con
cuatro tipos de fibras: PDMS, PA, CAR-DVB y DVB-CAR-PDMS, y escogen como
fibra ptima la de DVB-CAR-PDMS cuando el muestreo se realiza dentro del lquido, y
la PDMS cuando el muestreo se realiza en el espacio de cabeza; Sala y col.375 analizan
3-alquil-2-metoxipirazinas en mostos con fibras de PDMS, PDMS-DVB, CAR-PDMS y
CW (Carbowax)-DVB, llegando a la conclusin de que la fibra que mejor se adapta a
este anlisis es la PDMS-DVB; Mestres y col. evalan distintas fibras (PDMS, PDMS-
DVB, PA, CW-DVB, CAR-PDMS, Stable Flex DVB-CAR-PDMS,376 y CAR-PDMS,
Stable Flex DVB-CAR-PDMS377) para aplicarlas al anlisis de compuestos azufrados
con baja volatilidad, decidindose en el primer caso por la fibra de CAR-PDMS, y en el
segundo por la de DVB-CAR-PDMS; o Cabredo-Pinillos378 determina esteres,
alcoholes, terpenoles y cidos en vino de la D.O.C. Rioja mediante MEFS
automatizada, ensayando fibras de PDMS (100 y 7 micras), CW-DVB y PA, y
obteniendo los mejores resultados con la CW-DVB.
Mallouchos y col.,379 al igual que Vianna y Ebeler,380 emplean la MEFS como

tcnica de muestreo en la investigacin de la evolucin de distintos voltiles (alcoholes,
esteres acticos y esteres etlicos de cidos grasos) durante la fermentacin alcohlica
de mostos de uva. Tambin Vallejo-Cordoba y col.381 determinan esteres etlicos
mediante esta tcnica, aunque en este caso lo hacen en muestras de tequila. De la misma
forma, Roussis y col.382 estudian la disminucin de la concentracin de esteres voltiles
y terpenoles durante el almacenamiento en condiciones oxidantes de vinos de Moscatel
y Xinomavro.
94
Introduccin
Whiton y Zoecklein383 determinan carbamato de etilo en vinos mediante MEFS-

EC y CG-MS, para ello evalan distintos tipos de fibras, optimizando el mtodo de
muestreo con una fibra de CAR-DVB durante 30 minutos.
Recientemente se han desarrollado mtodos de MEFS en el que se produce la

derivatizacin de los compuestos a analizar de forma previa a la extraccin,384 o in
situ,385 concretamente se ha empleado en el anlisis de clorofenoles y cloroanisoles en
vinos.
9 Extraccin por sorcin en barra agitadora (ESBA)
Se trata de otra alternativa recientemente desarrollada para el anlisis de muestras

acuosas,386 que tiene los mismos fundamentos que la MEFS, con la nica diferencia de
que la retencin de los analitos se produce en el adsorbente (con forma de barra
agitadora) que se encuentra inmerso, o sobre la muestra. Para ello se emplea un imn
encapsulado y recubierto de PDMS, que se conoce como twister. La extraccin se
desarrolla mientras se agita la muestra con esta barra agitadora durante un tiempo
determinado (depender del volumen de muestra y de la velocidad de agitacin,
oscilando entre los 30 y los 60 minutos).387 Posteriormente, sta se desorbe en lnea con
el CG.
Esta tcnica se ha aplicado al anlisis de distintos tipos de compuestos: pesticidas

en frutas y vegetales388,389,390,391 o ts;392 voltiles en whisky de Malta393 o en infusiones
de caf;394 monoterpenos en distintas plantas;395 conservantes (cido srbico, etc..) en
bebidas, vinagres o salsas;396 o de contaminantes orgnicos (HAP, PCB, etc...) en
aguas.397,398,399,400
Adems se ha utilizado en el anlisis de muestras de vinos para la determinacin

de: diversos compuestos voltiles relacionados con el aroma,401,402,403 de
tricloroanisoles404,131 o de fungicidas;405 as como en el seguimiento de la evolucin de
los constituyentes voltiles durante la maduracin de uvas Monastrell.406
I.5.1.5 Extraccin asistida por ultrasonidos (EAU)
En el anlisis de la componente aromtica de alimentos en general, la aplicacin

de la EAU es relativamente reciente.
95
Cocito y col.407 desarrollan, ya en 1995, un mtodo para la extraccin rpida de

compuestos aromticos en mostos y vinos mediante ultrasonidos, consiguiendo buenas
recuperaciones, linealidad y reproducibilidad para la mayora de los compuestos
estudiados, as como mayor rapidez y simplicidad que utilizando las resinas de C18.
Vila y col.408 llevan a cabo la optimizacin de un mtodo para la extraccin de

compuestos aromticos en vinos mediante esta tcnica. Para ello, emplean una mezcla
de n-pentano-ter dietlico (1:2) como disolvente, y realizan un diseo factorial para
optimizar las variables del proceso.
Tambin emplean la EAU Gmez-Plaza y col.409 para investigar el aroma de los

vinos elaborados con 7 clones de la variedad de uva Monastrell, con vistas a la
caracterizacin y diferenciacin entre los distintos clones, realizando la extraccin con
diclorometano. Este mismo disolvente es empleado por Caldeira y col. 410 en la
determinacin de los compuestos aromticos presentes en los extractos hidro-
alcohlicos de madera empleados en la elaboracin de brandies, as como en brandies
envejecidos.
Asimismo, se ha aplicado esta tcnica al anlisis de tricloroanisoles en corchos,

comparndola con la ESL con agitacin y la extraccin Soxhlet, y empleando pentano
como disolvente en todos los casos.411
I.5.1.6 Extraccin asistida por microondas (EAM)
La aplicacin de la EAM al anlisis de la componente voltil de alimentos ha sido

muy limitada, centrndose los ejemplos encontrados en la bibliografa, precisamente, en
el anlisis de muestras de vino, mosto o uvas.
Razungles y col.412 desarrollan un mtodo rpido para el anlisis de compuestos

voltiles en uvas y vinos mediante EAM, comparndola con los resultados obtenidos
mediante la EFS con Amberlita XAD-2. Llegan a la conclusin de que, aunque los
rendimientos de extraccin obtenidos por ambos mtodos son muy similares en las
muestras de vino, la EAM es mucho ms rpida y proporciona mejores resultados para
compuestos polares. En el caso del anlisis de uvas, llegan a la misma conclusin: la
EAM puede utilizarse para extraer los precursores aromticos glicosilados, y as lo
demuestra el mismo grupo de investigadores al desarrollar un mtodo especfico para la
extraccin de los precursores glicosilados relacionados con el aroma, a partir de uvas y
mostos.413
96
Introduccin
Tambin Carro y col.414 emplean esta tcnica para la extraccin de

monoterpenoles (linalol, alfa-terpineol, citronelol, nerol y geraniol) en muestras de
mosto, concretamente con diclorometano.
I.5.1.7 Extraccin con fluidos supercrticos (EFSC)
Los compuestos del aroma y otros voltiles se pueden extraer de una forma
relativamente fcil con esta tcnica gracias, adems, a su selectividad y a la posibilidad
de acoplarlo directamente con el anlisis por CG.
En cuanto a la aplicacin de esta tcnica al anlisis de aromas en vinos podemos

citar los siguientes autores: Blanch y col.415 estudian la aplicabilidad de la EFSC al
anlisis del aroma del vino considerando tres aproximaciones distintas (EFSC off-line,
EFSC con recoleccin de los analitos en el vaporizador de temperatura programada
situado en el extractor, o la EFSC acoplada on-line a travs del vaporizador); asimismo
Carro y col.416 proponen la extraccin, con CO2 supercrtico modificado con MeOH, de
los componentes libres del aroma (compuestos terpnicos) de mostos y vinos, tras la
retencin previa en un soporte de Amberlita XAD-2; y Karsek y col.195 determinan de
igual forma la composicin aromtica de distintos tipos de vinos monovarietales. Palma
y col.417 parten de este mismo planteamiento para desarrollar un mtodo de EFSC de
glicsidos de uva.
Tambin Seorans y col. 418,419,420 han empleado la EFSC, concretamente en la

modalidad contracorriente, en el anlisis del aroma de destilados. Los progresos que
se han realizado en el aislamiento e identificacin de precursores aromticos no
voltiles, se deben en parte al desarrollo de la cromatografa en contracorriente (CC).
A diferencia de otros tipos de cromatografa, la CC no usa un soporte slido. La
separacin implica la particin de los analitos entre dos lquidos inmiscibles (en el
caso de la EFSC-CC, entre la muestra y el fluido supercrtico): la fase mvil lquida se
hace pasar continuamente a travs de la fase estacionaria que est retenida en la
columna por la fuerza centrfuga o gravitatoria.421,422 Esta tcnica permite el
aislamiento de precursores aromticos lbiles que no pueden ser aislados mediante
otras tcnicas (C18, XAD-2, etc...).423,424
97
En la tabla que presentamos a continuacin se da una descripcin de todas las

tcnicas de preparacin de muestras anteriormente mencionadas:
Tcnica de extraccin Descripcin

Basadas en la destilacin - Destilacin con vapor: la muestra en un recipiente se calienta para
permitir la separacin de los compuestos en funcin de sus presiones de
vapor, condensndose posteriormente la fraccin destilada.
- Destilacin-extraccin simultnea: la muestra se introduce en un

matraz con agua y en otro matraz se dispone el disolvente extractante,
al calentar ambos recipientes, los analitos se arrastran con el vapor de
agua y condensan en la fase acuosa recogida.
- Otros mtodos de destilacin: la destilacin se realiza a bajas

presiones
Basadas en el Espacio de - Estticas: consiste en la recuperacin de los analitos presentes en el
cabeza espacio de cabeza de un recipiente sellado que contenga la muestra.
- Dinmicas: sobre la muestra se hace pasar un gas para arrastrar los

analitos y recolectarlos posteriormente en una trampa o sistema de
retencin.
Extraccin lquido- La muestra se coloca en contacto con el disolvente extractante
lquido seleccionado durante el tiempo necesario.
Extraccin en fase slida La muestra se hace pasar por el adsorbente seleccionado permitiendo
que, tras quedar retenidos los analitos en la fase slida, se eluyan con
pequeos volmenes del disolvente adecuado.
Asistida con microondas La muestra se coloca en un recipiente abierto o cerrado y se introduce
en el disolvente, suministrndole energa en forma de microondas para
facilitar la extraccin
Asistida por ultrasonidos La muestra se coloca en un recipiente junto con el disolvente
seleccionado y se somete a la accin de los ultrasonidos para potenciar
la extraccin.
Con fluidos supercrticos La muestra se coloca en una cmara a alta presin y es extrada con el
fluido supercrtico que puede circular a travs de la muestra en circuito
cerrado o abierto. Despus de la despresurizacin los analitos son
recogidos en un pequeo volumen de disolvente orgnico o en una
trampa slida.
Tabla 4 Caractersticas de tcnicas de preparacin de muestras.
98
Introduccin
De forma que podemos esquematizar las caractersticas de las tcnicas de

extraccin anteriores mediante la tabla siguiente:
Caracterstica Esp.
Dest. Cab. ELL EFS EAU EAM EFSC
Rapidez - - - ++ ++ ++ ++
Cantidad de ++ ++ + + + + -
muestra
Consumo de ++ - ++ +/- + + -
disolventes
Variedad de + ++ ++ + + -
disolventes
Exposicin a ++ - ++ + + + -
disolventes
Habilidad del - +/- - - +/- +/- +
operador
Coste del - - - +/- +/- ++ ++
equipamiento
Nivel de - +/- - ++ - ++ ++
automatizacin
Tabla 5 Comparacin de las tcnicas Destilacin, Espacio de cabeza, ELL, EFS, EAU, EAM y
EFSC.
I.5.2 Procedimiento cromatogrfico
El anlisis por CG de los compuestos voltiles del vino se centr en sus inicios
(dcadas de los 50 y 60) en la identificacin de los alcoholes de fusel y esteres
presentes en concentraciones relativamente elevadas. Con el desarrollo de las
columnas capilares de alta resolucin y de detectores ms selectivos y sensibles, se
han llegado a identificar ms de un millar de compuestos relacionados con el aroma
del vino. En general, el tipo de fase estacionaria ms empleado en el anlisis de
muestras de vino es la constituida a partir de polietilenglicol (DB Wax, ZB Wax,
Carbowax, etc...).
99
En funcin del tipo de detector empleado podemos distinguir entre la CG-DIL

(detector de ionizacin de llama), la CG-EM (detector espectrometra de masas), o la
GC-O (deteccin olfatomtrica).
El uso de la espectrometra de masas (EM) en continuo como detector de CG

para la identificacin de estos compuestos, ha supuesto un importante desarrollo para
el anlisis de este tipo de muestras. De forma, que actualmente existe una gran
disponibilidad de cromatgrafos de gases con detectores de EM y son empleados
rutinariamente.
La CG-EM, adems de ser especialmente til en la identificacin de compuestos

desconocidos, est incrementando su utilidad en el anlisis cuantitativo de compuestos
voltiles. En los anlisis por CG es habitual emplear un patrn interno para seguir las
recuperaciones de los analitos y reducir la variabilidad asociada con la preparacin de
la muestra e inyeccin. La eleccin de este patrn interno puede ser complicada (por
ejemplo, no debe interferir con la separacin cromatogrfica pero s presentar un
comportamiento similar a los analitos a cualquier prdida que se pueda producir
durante la preparacin de muestra). Es en este punto donde surge la gran utilidad del
detector de EM, puesto que permite el empleo de patrones marcados isotpicamente
(con propiedades qumicas y fsicas casi idnticas al analito de inters, pero que no se
resuelven durante la separacin cromatogrfica) al poder buscar masas de iones
individuales concretos, y poderse cuantificar un analito separadamente de su patrn
marcado isotpicamente.
Dentro de la CG, podemos distinguir distintos procedimientos de anlisis: los

ensayos de dilucin isotpica (EDI), el anlisis por dilucin de extractos de aroma
(ADEA) o el anlisis por concentracin de extractos de aroma (ACEA).
A. Ensayos de dilucin isotpica (EDI)
Emplean patrones internos marcados isotpicamente, como mencionamos en el

prrafo anterior, corrigiendo de esa forma las prdidas que se producen durante la
preparacin de la muestra y el anlisis cromatogrfico.
100
Introduccin
Se ha utilizado para la determinacin de distintos compuestos voltiles en

muestras de vinos: pirazinas,425,426 tricloroanisoles,427 diacetilo,94 4-etilfenol,428
terpenoles (geraniol, nerol, linalol, alfa-terpineol),132 o compuestos azufrados.429
B. Anlisis por dilucin de extractos de aroma (ADEA)
Se trata de un mtodo para la caracterizacin de la fuerza o potencia de un

compuesto particular en relacin a su umbral de olor. En su forma ms simple, se lleva a
cabo analizando sucesivas diluciones de una muestra o extracto, hasta que la respuesta
odorfera de cada compuesto o regin de inters no sea detectado (es decir, los extractos
de los compuestos aromticos se diluyen hasta que no se percibe olor en el puerto sniff,
donde el analista coloca la nariz). El valor de la dilucin de olor (DO) o dilucin de
aroma (DA) es el asignado al valor de la dilucin de la muestra que conlleva la
extincin del olor en el detector olfatorio. Cuanto mayor sea el valor de DO/DA, ms
significativo ser ese compuesto en el aroma o perfil odorfero conjunto de la muestra.
Los resultados, por tanto, se expresan como factor de dilucin del aroma (DA),
que es la relacin entre la concentracin del odorante en el extracto inicial y su
concentracin en el extracto ms diluido en el que el olor es todava detectado por
olfatometra. Consecuentemente el factor DA es una medida relativa y es proporcional
al valor de actividad de olor de ese compuesto en el aire.
Esta tcnica es muy til en la determinacin del mayor contribuyente al perfil

aromtico de un extracto o del compuesto clave cuando se analiza una muestra para un
olor en particular.
Se ha aplicado a la caracterizacin y cuantificacin de diversos compuestos

activos desde el punto de vista aromtico, en vinos elaborados con distintas variedades
de uva: Merlot, Cabernet Sauvignon y Garnacha cultivadas en Espaa;430 Cabernet
Sauvignon y Merlot cultivadas en Burdeos;50 Garnacha (vino rosado),431 Chardonel
(hbrido francs-americano),432 Macabeo,433 o Garnacha del Priorato.434
101
As como a la bsqueda de perfiles aromticos clave para distinguir entre vinos

tintos de crianza de alta calidad elaborados en Espaa.435
C. Anlisis por concentracin de extractos de aroma (ACEA)
Es el mtodo contrario del ADEA. Se empieza con el extracto sin diluir que es
concentrado sucesivamente y despus de cada etapa se analiza una alcuota por CG
olfatomtrica. Este procedimiento evita una sobreestimacin de los factor DA de
odorantes inestables que se degradan en el ADEA.
Lpez y col.188 analizan las intensidades de los compuestos voltiles liberados por
la hidrlisis en medio cido de los precursores inodoros extrados de uvas Tempranillo y
Garnacha, con un experimento ACEA. Llegan a la conclusin de que los odorantes
liberados ms importantes son derivados de cidos grasos insaturados, cidos grasos y
algunas lactonas alifticas. Slo beta-damascenona y TDN son los odorantes de impacto
derivados de los carotenoides, y el farnesol y 3,7-dimetil-1-eno-3,7-diol de los
terpenoles.
Dentro de la aplicacin de la CG a la deteccin de compuestos relacionados con el

aroma podemos distinguir:
CG con captura electrnica: tiene escasa aplicacin para ese tipo de

analitos, puesto que se utiliza bsicamente para la determinacin de
compuestos halogenados. Juanola y col.206 determinan los contenidos
de tricloroanisoles en corchos mediante esta tcnica tras una extraccin
previa, al igual que Martnez-Urunuela y col.400
CG con olfatometra (CG-O), se ha aplicado a la determinacin

cuantitativa de odorantes de distintos tipos de vinos (mediante AEDA):
as, Ferreira y col.262 detectan 69 regiones odorferas en los perfiles de
CG-O, 63 de los cuales pudieron ser identificados; Culler y col.436
revelan la presencia de 85 notas aromticas de las que se identificaron
102
Introduccin
78 odorantes; y lo mismo hacen Lpez y col.257 en vinos de las

variedades Merlot, Cabernet Sauvignon y Garnacha; Buettner130 en
vinos de Chardonnay , o Cadwallader y col.259 en vinos de la variedad
hbrida Chardonel.
Asimismo Selli y col.147 utilizan la CG-O y el anlisis de los valores de

actividad odorfera para comprobar que el alcohol isoamlico,
hexanoato de etilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo, acetato de
isoamilo, 2-feniletanol y el cido octanoico, son compuestos de potente
aroma presentes en vinos tintos de la variedad Kalecik Karasi cultivada
en Anatolia.
CG con detector de ionizacin de llama (GC-DIL), ha sido empleada

por diversos autores para la determinacin de compuestos voltiles en
muestras de uva y vino, usando distintas tcnicas de preparacin de
muestras. As, Selli y col.147 utilizan la ELL con diclorometano previa
al anlisis por CG-DIL, al igual que Ortega-Heras y col.437 Bentez y
col.164, en cambio, tras la extraccin con ter dietlico-pentano (2:1); y
Ledauphin y col.438 tras la extraccin con pentano.
CG con detector de espectrometra de masas (CG-EM): se ha aplicado

extensivamente al anlisis de los compuestos relacionados con el aroma
de distintos tipos de muestras.
Esta es la tcnica ms comnmente empleada para analizar los componentes

voltiles, y el potencial aromtico, en muestras de inters enolgico. As, Girard y
col.55 emplean esta tcnica para determinar los compuestos voltiles relacionados con
el aroma varietal de uvas de la variedad Gewrtztraminer. De igual forma Miklosy y
col.439 analizan la fraccin aromtica de uvas con pudricin noble utilizadas en la
produccin de vinos de Tokaj.
Este tipo de deteccin tambin ha sido empleado en el anlisis de muestras de

mostos. Vianna y Ebeler108 utilizan la CG-EM para seguir la evolucin de los esteres
durante la fermentacin de mostos de uvas blancas. Tambin, Kotseridis y Baumes
determinan gracias a esta tcnica los compuestos voltiles en mostos de las variedades
Cabernet Sauvignon y Merlot, al igual que Cabaroglu y col.215 en mostos de la
variedad de uva Emir cultivada en Turqua.
103
En cuanto a su aplicacin a muestras de vino, son numerosos los autores que

seleccionan la deteccin por EM en la separacin por CG de compuestos voltiles.
As, Begala y col.98 la emplean para analizar vino Cannonau de Jerzu; Ferreira y
col.440 hacen lo mismo en el anlisis de vinos tintos; o Whiton y Zoecklein111 la
emplean en la determinacin de carbamato de etilo.
Tambin debemos indicar que diversos autores emplean la CG-FID y la CG-EM

como tcnicas complementarias para analizar el mismo tipo de muestras. Tal es el
caso de Aznar y col.441 para predecir las propiedades aromticas de vinos tintos
envejecidos a partir de su composicin qumica; de Ledauphin303 en la caracterizacin
de destilados Calvados; o de Falque y col.442 al analizar los componentes voltiles de
vinos de las variedades Loureira, Dona Branca y Treixadura.
104
Introduccin
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127
II. PARTE EXPERIMENTAL
Parte experimental
II. PARTE EXPERIMENTAL
II.1 REACTIVOS, DISOLVENTES Y SUSTANCIAS PATRONES
Los patrones de los compuestos fenlicos empleados durante el desarrollo

experimental del presente trabajo han sido los siguientes:
Patrn Casa comercial

Procatequialdehdo Fluka AG Buchs, Suiza
Acido gentsico Merck AG Darmstad, Alemania
Acido cafeico Fluka AG Buchs, Suiza
Siringialdehdo Fluka AG Buchs, Suiza
Acido p-cumrico Merck AG Darmstad, Alemania
Vainillina Fluka AG Buchs, Suiza
Epicatequina Sarsynthse, Lab. Sarget, Merignac, Francia
Acido vertrico Fluka AG Buchs, Suiza
Acido glico Merck AG Darmstad, Alemania
Acido p-hidroxibenzoico Fluka AG Buchs, Suiza
Acido ferlico Fluka AG Buchs, Suiza
Acido sinpico Fluka Chemika, Buchs, Suiza
Veratraldehdo Fluka AG Buchs, Suiza
Esculetina Sigma Aldrich Chemie Steinhelm, Alemania
Escopoletina Merck AG Darmstad, Alemania
Catequina Sigma Chemicals St. Louis, EEUU
2,5-dihidroxibenzaldehdo Fluka Chemika AG Buchs, Suiza
Trans-Resveratrol Sigma Chemicals St. Louis, EEUU
131
Reactivos, disolventes y sustancias patrones
Para la extraccin en fase slida se han utilizado los siguientes cartuchos:
Bond Elut PPL, polmero de estireno-divinilbenceno.Varian, California, EEUU.
Bond Elut C-18, octadecilslice. Varian, California, EEUU.
Discovery DSC-18, octadecilslice. Supelco, Pennsylvania, EEUU.
Strata C-18E, octadecilslice. Phenomenex, EEUU.
Chromabond EASY, polmero de estireno-divinilbenceno, Macherey-Nagel,

Dren, Alemania.
Strata SDB-L, polmero de estireno-divinilbenceno. Phenomenex, EEUU.
LiChrolut EN, polmero de poliestireno-divinilbenceno. Merck KgaA,

Darmstad, Alemania.
GGT: Strata C-18T, octadecilslice. Phenomenex, EEUU.
Como soporte inerte durante las pruebas de estabilidad de los compuestos

fenlicos en la EFP se ha usado: arena de mar lavada, grano grueso, laboratorios
Panreac, Barcelona.
Los disolventes empleados en la cromatografa lquida de alta eficacia (CLAE) y

en los distintos ensayos de EFP son:
CLAE Casa suministradora

Metanol (grado CLAE) Scharlau Chemie, Barcelona
Acido actico glacial (para anlisis) Merck KGaA, Darmstad, Alemania
Acido sulfrico (Suprapur) Merck KGaA, Darmstad, Alemania
132
Parte experimental
EFP Casa suministradora

Etanol (95-96%vol.,Rectapur) Prolabo, Fontanay S/Bois
Acetato de etilo(R.P. Normapur) Prolabo, Fontanay S/Bois
Eter dietlico (Extrapur) Scharlau Chemie, Barcelona
Metanol (grado CLAE) Scharlau Chemie, Barcelona
Diclorometano (grado CLAE) Merck KGaA, Darmstad, Alemania
El agua que se utiliza en todos los ensayos se somete a una destilacin y posterior
paso a travs de una resina de intercambio inico (agua Milli-Q).
Los disolventes de la CLAE son sometidos a una desgasificacin en un bao de

ultrasonidos.
Los reactivos empleados en los ensayos de la Glucosil-Glucosa son:
Reactivo Casa suministradora

Trietanolamina Fluka, Alemania
Hidrxido Sdico Panreac, Barcelona
Glucosa Panreac, Barcelona
cido sulfrico (Suprapur) Merck KGaA, Darmstad, Alemania
Para el anlisis espectrofotomtrico de la glucosa liberada, se emplea un kit

enzimtico Boehringer-Mannheim para la determinacin de glucosa en alimentos,
basado en las siguientes reacciones:
Hexoquinasa
D-Glucosa + ATP Glucosa-6-fosfato + ADP
G6P-DH
Glucosa-6-fosfato + NADP+ D-gluconato-6-fosfato + NADPH + H+
133
Aparatos e instrumentos
134
Parte experimental
II.2 APARATOS E INSTRUMENTOS
II.2.1 Equipo de extraccin con fluidos presurizados
ASE (Accelerated Solvent Extractor) modelo 200, Dionex, Sunnyvale,

California (EEUU).
Consta de:
un panel de control para seleccionar las condiciones de la extraccin y el

funcionamiento del mismo.
dos carruseles giratorios para la colocacin de las cmaras de extraccin (de

acero inoxidable, disponibles en tamaos de 11, 22 y 33 mL de capacidad) y de
los viales de recoleccin de vidrio (de 40 o 60 mL de capacidad).
135
El esquema de funcionamiento de este equipo es el siguiente:
Colocar la muestra
Llenar la clula con Bomba

disolvente
Calentar y
presurizar
Mantener muestra
a P y T fijadas
Dte.
Horno
Cmara de extraccin
Bombear dte.
nuevo en la clula
Purgar el dte. de la
cmara con N2
Vial de recoleccin
Extracto listo para

anlisis
II.2.2 Equipos de cromatografa lquida
Se han empleado los equipos descritos a continuacin:
Equipo cromatogrfico de lquidos Waters compuesto por:
o Dos bombas modelo 510.

o Controladora de bombas PCM.
o Inyector automtico modelo 717.
o Detector UV-visible de matriz de fotodiodos alineados M996
o Detector de Fluorescencia 474.
o Software de control e integracin de datos cromatogrficos, denominado
Estacin Millenium 2010.
La columna utilizada ha sido LiChrospher 100, RP-18 (5micras), 250x3 mm.
136
Parte experimental
Equipo cromatogrfico de lquidos Dionex compuesto por:
o Sistema de bombas P680.

o Inyector automtico ASI 100.
o Horno para columna TCC 100.
o Detector UV-visible de matriz de fotodiodos alineados PDA 100.
o Detector de Fluorescencia RF 2000.
o Software de control e integracin de datos cromatogrficos, denominado
Chromeleon 6,60.
La columna utilizada en este caso ha sido Chromolit Performance PR-18e

(100x4.6mm) tipo monoltica.
II.2.3 Equipos de cromatografa gaseosa
Equipo cromatogrfico de gases Hewlett-Packard 5890 Series II:
con columna capilar DB-WAX (J&W Scientific, Folson,

California, EEUU) de 60m x 0.32 mm.
acoplado a un detector de ionizacin de llama.
Equipo cromatogrfico de gases GC800 (Fison Instruments, Milan, Italia):
acoplado con un detector de masas MS800, operando en modo

EI+ (impacto electrnico) a 70 eV en el intervalo de 40 a 400
u.m.a.
137
II.2.4 Equipo de liofilizacin
Liofilizador EZ-Dry, modelo EZ 585 Q, FTS Systems, Stone Ridge,

Nueva York.
Bomba de vaco Telstar G-6/2G-6, Tarrasa, Espaa.
II.2.5 Equipo de extraccin asistida con ultrasonidos
Sonda ultrasnica de alta intensidad, modelo UP 200S (con

reguladores de intensidad y de frecuencia), Dr. Hielscher GMBH,
Alemania.
Bao termosttico Frigiterm, J.P. Selecta, Barcelona, Espaa.
138
Parte experimental
II.2.6 Otros
9 Balanzas Mettler PL200 y Mettler AE240.
9 Equipo de desionizacin de agua, Water-Millipore, modelo Milli-Q50.
9 Turbo-Vap II de Zymark para la concentracin de los extractos mediante un

bao a una temperatura fijada y una corriente de N2.
9 Molinillo de sobremesa.
9 Dispositivo de calentamiento mediante bloques de aluminio VWR,

Inglaterra.
9 Dispositivo de EFS Visiprep (12 posiciones), Supelco, Bellefonte,

Pennsylvania, EEUU.
9 Dispositivo de EFS automtica Rapitrace (marca registrada), Zymark,

Hopkinton, Massachussets, EEUU.
9 Espectrofotmetro UV-visible de doble haz, Jasco, Japn.
9 Agitador magntico SM4, Stuart Scientific, Reino Unido.
9 Bao de ultrasonidos 360W, J.P. Selecta, Barcelona, Espaa.
139
Tcnicas experimentales
140
Parte experimental
II.3 TCNICAS EXPERIMENTALES
II.3.1 Procedimientos de extraccin:
II.3.1.1 para la determinacin de compuestos fenlicos
II.3.1.1.1 para la extraccin con fluidos presurizados (EFP) sobre muestras

(orujos)
9 Disolvente: Metanol
9 Temperatura: 150C
9 Presin: 100 atmsferas
9 Ciclos de extracc. esttica: 3 ciclos de 10 minutos.
9 Purga: 60 segundos.
II.3.1.1.2 para el acoplamiento EFP-EFS sobre muestras (uvas)
9 Disolventes: Agua (1 etapa), Metanol (2 etapa).
9 Temperatura: 40C (agua), 100 o 150C (metanol).
9 Presin: 40 atmsferas.
9 Ciclos de extracc. esttica: 3 ciclos de 5 minutos
9 Purga: 300 segundos
141
II.3.1.1.3 para la EFP, extraccin asistida por ultrasonidos (EAU) y

extraccin con agitacin magntica (AM) sobre muestras de pepitas de uva.
a) EFP
9 Temperatura: 130C
9 Presin: 100 atmsferas.
9 Ciclos de extracc. esttica: 2 ciclos de 5 minutos
9 Purga: 60 segundos
b) EAU
9 Temperatura: 10 y 60C
9 Sonda ultrasnica (2mm): 200W, 24kHz, 100% poder nominal
9 Duracin de la extraccin: 10 minutos
c) Extraccin con agitacin magntica
9 Temperatura: 10 y 60C
9 Agitacin: 50% del valor mximo
9 Duracin de la extraccin: 10 minutos
142
Parte experimental
II.3.1.2 para la determinacin de compuestos relacionados con el aroma
II.3.1.2.1 para la determinacin de precursores: EFS sobre mostos
Fraccin glucosdica total (GGT)
9 Cartucho de EFS: Strata C-18t
9 Acondicionamiento: 5ml MeOH, 10ml H2O
9 Volumen de muestra: 2 ml ajustados a pH = 2.25
9 Lavado: 30ml
9 Secado: 2 minutos a vaco (-0,67 atm)
9 Elucin: 1,5 ml EtOH + 3ml H2O
II.3.1.2.2 para la determinacin de aromas libres: EFS sobre vinos
9Acondicionamiento: 4ml CH2Cl2, 4ml MeOH,

4ml H2O-EtOH (12% v/v)
9 Volumen de muestra: 50 ml
9 Lavado: 10ml H2O
9 Secado: 10 minutos a vaco (-0.67 atm)
9 Elucin: 2ml CH2Cl2
143
II.3.2 Procedimientos cromatogrficos:
II.3.2.1 para la determinacin de compuestos fenlicos en general (CLAE)
9 Fases mviles: disolvente A (5% metanol, 2% c. actico en agua)

disolvente B (90% metanol, 2% c. actico en agua)
9 Flujo: 0,5 mL/min.
9 Vol. inyeccin: 40 l para muestras de patrones y 80 l para muestras

reales.
9 Deteccin: matriz de diodos alineados: registrando un espectro por

segundo. Resolucin 1,2 nm. Barrido de 240 a 390 nm.
detector de fluorescencia: longitud de onda de excitacin
351 nm y de emisin de 453 nm.
9 Columna: LiChrospher 100, RP-18 (250x3mm, 5micras).
9 Gradiente: Pasando de un 0% a un 100% de disolvente B en 85 min.,

segn la siguiente tabla de gradiente:
Tiempo %A %B Curva
0 100 0 -
5 85 15 6
45 50 50 7
80 50 50 6
85 0 100 6
Se registra durante 100 minutos. Finalmente se hace pasar metanol 100% para
limpiar el sistema durante 15 minutos volvindose a las condiciones iniciales para
otra inyeccin mediante un programa en 10 minutos y posteriormente se deja 20
minutos de estabilizado.
144
Parte experimental
II.3.2.2 para la determinacin de trans-resveratrol (CLAE)
9 Fases mviles: disolvente A (0,1 % c. actico en agua)

disolvente B (0,1 % c. actico en metanol)
9 Flujo: 5 mL/min.
9 Vol. inyeccin: 20 l.

detector de fluorescencia: longitud de onda de
excitacin 310 nm y de emisin de 403 nm.
9 Columna: Chromolit Performance PR-18e (100x4.6mm) monoltica.
9 Gradiente: Isocrtico a 30%A, 70%B
Se registra durante 5 minutos (el tiempo de elucin del trans-resveratrol es de

2,0 minutos). Finalmente se hace pasar metanol 100% B para limpiar el sistema
durante 5 minutos volvindose a las condiciones iniciales para otra inyeccin
mediante un programa en 5 minutos y posteriormente se deja 5 minutos de
estabilizado.
II.3.2.3 para la determinacin de catequinas (CLAE)
9 Fases mviles: disolvente A (2% c. actico en agua)

disolvente B (90% metanol, 2% c. actico en agua)
9 Flujo: 0,3 mL/min.

detector de fluorescencia: longitud de onda de
excitacin 290 nm y de emisin de 320 nm.
145
9 Columna: LiChrospher 100, RP-18 (250x3mm, 5micras).
9 Gradiente: Pasando de un 0% a un 100% de disolvente B en 21 min.,

segn la siguiente tabla de gradiente:
Tiempo %A %B Curva
0 80 20 -
10 75 25 6
20 50 50 7
21 0 100 6
Se registra durante 20 minutos (el tiempo de elucin de catequina y

epicatequina est en torno a los 10 y 15 minutos respectivamente). Finalmente se
hace pasar metanol 100% B para limpiar el sistema durante 10 minutos
volvindose a las condiciones iniciales para otra inyeccin mediante un programa
en 5 minutos y posteriormente se deja 10 minutos de estabilizado.
II.3.2.4 para la determinacin de compuestos relacionados con el aroma (CG)
9 Gas portador: Helio
9 Temperatura inyector: 200C
9 Deteccin: ionizacin de llama

espectrometra de masas: impacto electrnico
+ 70 eV, intervalo 40-400 u.m.a.
9 Columna: slice recubierta con DB-WAX (60m x 0,32 mm).
9 Gradiente: Pasando de 40C a 230C en 100 minutos con las

siguientes condiciones:
Temperatura inicial: 40C, tiempo inicial: 5min.
Temperatura final: 230C, Velocidad: 2C/min.
146
Parte experimental
Se registra durante 100 minutos. Finalmente se limpia el sistema durante 20

minutos a 230C, volvindose a las condiciones iniciales, para otra inyeccin, de
forma automtica.
II.3.3 Procedimiento de hidrlisis y medida espectrofotomtrica para la

determinacin de precursores aromticos:
II.3.3.1 procedimiento de hidrlisis
9 cido sulfrico 2,25M: 2mL.
9 Vol. muestra o patrn: 1mL.
9 Temperatura: 100C
9 Duracin: 60 minutos
II.3.3.2 procedimiento de medida espectrofotomtrica
9 Neutralizacin: - 0,4 mL NaOH 3M

- 0,6 mL tampn trietanolamina (pH = 7,6)
- 0,4 mL muestra o patrn
9 Cubeta: 1 cm.
9 Longitud onda: 340 nm
9 Tampn TRA/NADP/ATP: 1mL
9 Vol. muestra: 100L.
9 Vol. H2O: 1,9mL.
9 Vol. enzima: 20L.
147
Muestreo
148
Parte experimental
II.4 MUESTREO
Las muestras de orujo de uva Palomino Fino analizadas en el apartado III.1

fueron tomadas a la salida de una prensa de agotamiento en una bodega de la zona.
Previamente las uvas haban sido prensadas mediante prensas horizontales de platos.
Todas las muestras de uva analizadas en los apartados III.3 y III.5 durante el
desarrollo de este trabajo se han recolectado en Jerez de la Frontera, concretamente en
el CIFA (Centro de Investigacin y Formacin Agraria) Rancho de la Merced. El
mismo origen tienen las pepitas de uva analizadas en el apartado III.2, puesto que estas
ltimas se obtuvieron a partir de las uvas anteriormente mencionadas.
El muestreo se realiz seleccionando, en primer lugar, entre 8-10 cepas del lineo
en estudio de forma que sean lo ms representativas posible. De cada una de las cepas
seleccionadas en el viedo para el control de maduracin, se corta una porcin (con
unos 6-10 granos de uva, que se correspondan con distintas partes del mismo, es decir,
de las puntas, alas, etc..) de cada uno de los racimos que hayamos seleccionado por
presentar, a priori, distintas condiciones de desarrollo (exposicin directa al sol,
sombreados, ms cercanos al terreno, ms alejados, etc...) para que el muestreo sea lo
ms representativo posible de las cepas consideradas durante el seguimiento de la
maduracin.
Asimismo el da de vendimia, se seleccionan distintas porciones de varios racimos

elegidos aleatoriamente en las espuertas utilizadas para la recoleccin de la uva.
Las fechas de muestreo son las indicadas en las siguientes tablas:
Tabla 1 Das de muestreo (en amarillo durante la maduracin y en verde el da de vendimia) de

uvas analizadas en el apartado III.3
2001
23 30 6 13 20 Vendimia
Julio Julio Agosto Agosto Agosto
Viura 21/8
25 1 8 14 21
Julio Agosto Agosto Agosto Agosto Vendimia
Tempranillo 20/8
149
Muestreo
Tablas 2 y 3 Das de muestreo, indicados en amarillo, y de vendimia, en verde, de las uvas y pepitas
analizadas en los apartados III.5 (aos 2002 y 2003) y III.2 (ao 2002) respectivamente.
Ao 2002
12/7 19/7 26/7 2/8 9/8 16/8 23/8 30/8 Vendimia Fecha
vend
Chardonnay 06/8
Mosc.Alej. 29/8
Sauv.Blanc 13/8
Viura 30/8
Garrido 04/9
Pno.testigo 28/8
Traminer 01/8
Mosc.Front. 30/8
Pno.riego 28/8
Vijiriega 04/9
Cab.Sauv. 30/8
Tempranillo 30/8
Syrah 30/8
Pno.negro 02/8
Tint.Rota 30/8
Graciano 05/9
Ao 2003
22/7 29/7 05/8 12/8 19/8 Vendimia
Mosc.Alej. 21/8
Sauv.Blanc 06/8
Viura 19/8
Garrido 26/8
Pno.testigo 19/8
Pno.riego 19/8
Vijiriega 21/8
Cab.Sauv. 19/8
Tempranillo 14/8
Syrah 19/8
Tint.Rota 22/8
Graciano 19/8
22/7 25/7 29/7 31/7 05/8 Vendimia
Chardonnay 05/8
Traminer 31/7
Pno. negro 31/7
150
Parte experimental
Durante el ao 2003 se produjo una ola de calor, hacia la mitad del periodo, que
afect a la maduracin, en mayor o menor medida, de las variedades estudiadas, lo que
unido al hecho de que se comenz a realizar el muestreo ms tarde condujo a que el
nmero de muestreos sea inferior al del ao anterior. Adems se realizaron muestreos
ms frecuentes en las variedades ms tempranas (Traminer, Palomino Negro y
Chardonnay), y en el caso de la variedad Moscatel de Frontignan (Moscatel de Grano
Pequeo), slo se pudo tomar dos muestras, puesto que la uva se pasific rpidamente,
optndose por no incluirla en el estudio realizado sobre las muestras del 2003.
En cuanto al apartado III.4, los vinos comerciales analizados fueron los

indicados a continuacin:
Nombre Variedad G. alcoh. Bodega Ao Zona

Castillo de Liria Moscatel 15 Vicente 2001 Valencia
Ganda Pl
Castillo de Aguarn Garnacha 13,5 Soc. Coop. 2000 Cariena
San Roque
Via Mireia Moscatel- 12 Pinord, 2001 Peneds
Traminer S.A.
Mandols Furmint 14,5 Vega Sicilia 2000 Tokaji
Oremus (Hungra)
Tokaji Furmint
Gran Feudo Moscatel de 12,5 Julin 1998 Navarra
Blanco dulce de Moscatel Frontignan Chivite
Castillo de Irache Chardonnay 13 Irache, S.L. 2001 Navarra
Moscatel Dorado Moscatel 18 Csar 2001 Jerez-
Florido Manzanilla
Sanlcar
Via Esmeralda Moscatel- 11 Torres 2002 Peneds
Traminer
Sauvignon Sauvignon 12,5 Hered. de 2002 Rueda
Marqus de Riscal Blanc Marqus de
Riscal
Original Muscat Moscatel - 12 Miquel 2001 Mallorca
Moscatel de Oliver,S.L.
Frontignan
Cresta Real Verdejo 13 Ahold 2001 Rueda
Ribera del Puerto Palomino 11 501 del 2002 Vinos Tierra
Puerto,S.A de Cdiz
151
Muestreo
Los vinos jvenes monovarietales analizados en ese mismo apartado, fueron

proporcionados por el CIFA Rancho de la Merced, y se elaboraron en sus
instalaciones durante la campaa del 2002. Con algunas variedades se realizaron
distintos ensayos de vinificacin, tal como se indica en la siguiente tabla:
Muestra Variedad/tipo de muestra Origen Tipo de

variedad vinificacin
Chard Chardonnay Universal Blanco
Cabsauv Cabernet Sauvignon Universal Tinto
Garrido Garrido Regional Blanco
Graciano Graciano Nacional Tinto
Moscmal Moscatel de Mlaga Universal Blanco
Moscmalr Moscatel de Mlaga riego Universal Blanco
Pno Palomino Autctona Blanco
Pnor Palomino riego Autctona Blanco
Pnoenz Palomino enzimas Autctona Blanco
glucosidasas Adicin enzimas al
final fermentacin
Pnomac Palomino maceracin Autctona Blanco maceracin
Pnoneg Palomino Negro Regional Tinto
Pnonegbt Palomino Negro baja Regional Tinto
temperatura
Pnonegmc Palomino Negro Regional Maceracin
maceracin carbnica carbnica
Syrah Syrah Internacional Tinto
Temprani Tempranillo Nacional Tinto
Trami Traminer Internacional Blanco
Tramimac Traminer maceracin Internacional Blanco maceracin
Tinrota Tintilla de Rota Autctona Tinto
Tinrotar Tintilla de Rota riego Autctona Tinto
Vijirieg Vijiriega Regional Blanco
Viura Viura Nacional Blanco
Viuramac Viura maceracin Nacional Blanco maceracin
Viuraenz Viura enzimas Nacional Blanco
glucosidasas Adicin enzimas al
final fermentacin
Hay que indicar que no todas las variedades de uva controladas durante la
maduracin en el ao 2002 se vinificaron, puesto que esa decisin est sujeta a la
disponibilidad de las instalaciones, a la maduracin de las distintas variedades
cultivadas y a la planificacin particular de cada ao en el CIFA Rancho de la
Merced, que es el centro que elabora los vinos anteriormente mencionados y que nos
proporciona posteriormente las muestras a analizar.
152
Parte experimental
Los ensayos de riego se realizaron de la siguiente forma:
Riego
Variedad Modalidad Dosis total L/m2 Dosis mensual
de uva de riego (Abril-Julio) L/m2
Palomino fino por goteo 300 75
Moscatel por goteo 150 37,5
Tintilla de Rota por goteo 150 37,5
Maceracin pelicular: Viura, Traminer y Palomino
La uva vendimiada se despalill y se le aadieron 100 ppm de SO2. Una hora ms

tarde se le adicionan enzimas con actividad pectinasa (celulasa y hemicelulasa)
VINOZYM FCE G, en dosis de 2g/100Kg uva. Se mantuvo durante 6 horas a 4 C y
posteriormente se prens en prensa neumtica. Se realiz el desfangando durante 12
horas a 4 C.
A continuacin el mosto se traseg a un depsito de acero inoxidable, donde se

inocul con levaduras Fermiblanc arom (20g/Hl) previamente hidratadas. La
temperatura de fermentacin fue de 18 C.
Adicin de enzimas glucosidasas: Viura, y Palomino
Una vez vendimiada la uva, se moltur en moledora de rodillos y se prens en

prensa horizontal de platos. Al mosto obtenido se le aadieron 60 ppm de SO2 y
enzimas con actividad pectinasa NOVOCLAIR FCE G (1g/Hl de mosto),
desfangndose durante 24 horas a 4 C.
Posteriormente se traseg el mosto a un depsito de acero inoxidable, donde se

inocul con levaduras Fermiblanc arom (20g/Hl) previamente hidratadas. La
temperatura de fermentacin fue de 18 C.
Una vez finalizada la fermentacin alcohlica, y con un contenido en azcares

residuales inferiores a 2 g/L, se le aadieron enzimas con actividad -glucosidasa
NOVAROM (5g/Hl de vino).
153
Muestreo
Maceracin carbnica: Palomino Negro
En primer lugar se satur un depsito con CO2. La uva vendimiada se despalill

manualmente y se introdujo en el depsito anteriormente mencionado. Durante los tres
primeros das del encubado se adicion CO2 para asegurar una atmsfera de CO2.
Cuando el grado Baum del mosto fue inferior a 1, se prens la uva y se termin
de fermentar a 18 C. No se aadieron enzimas ni levaduras, ni se corrigi la acidez.
Una vez finalizada la fermentacin se corrigi el SO2 y la acidez.
Fermentacin a baja temperatura: Palomino negro
Se realiz como una fermentacin tradicional en tinto, con la nica diferencia de

que la temperatura de fermentacin fue de 18 - 20 C.
Las enzimas utilizadas fueron VINIZYM G (2 g/100 Kg uva), y las levaduras

inoculadas fueron FERMIROUGE (en dosis de 20 g/100 Kg uva).
154
Parte experimental
II.5 PREPARACIN DE LAS MUESTRAS Y DE LAS CAMARAS DE

EXTRACCIN
II.5.1 Muestras de orujo
En primer lugar se separan hollejos y pepitas. A continuacin se muelen en

secuencias de 15 segundos para evitar el calentamiento de la muestra, y se secan a 40C
en una estufa durante 24 horas.
II.5.2 Muestras de uva y pepitas
Las uvas de las distintas variedades de uva estudiadas fueron recogidas a lo largo
de su periodo de maduracin, tal como se ha indicado en el apartado anterior.
En primer lugar se les retira el pedicelo, y se cortan por la mitad para separar las
pepitas del resto de la baya. A continuacin se guardaban las pepitas, una vez limpias,
en un refrigerador a -20C.
Las uvas, una vez retiradas las pepitas, se recogan en distintos recipientes para
proceder a su liofilizacin, que se prolongaba el tiempo necesario para que el peso se
mantuviese constante.
Una vez liofilizadas, se trituraban con un molinillo de sobremesa y se conservan a

-20C hasta su anlisis.
II.5.3 Preparacin de la cmara para la EFP (orujos, pepitas)
Cada cmara de extraccin se prepara de la siguiente forma:
arena
muestra filtro
arena
155
Preparacin de las muestras y de las cmaras de extraccin
se aade como material soporte arena de mar, llenndose la cmara hasta

aproximadamente tres cuartas partes de su capacidad.
se adiciona la disolucin de patrones o la muestra, y se aade ms arena

hasta que se llene la cmara, cerrando posteriormente la misma con la tapa
superior.
II.5.4 Preparacin de la cmara para la EFP-EFS (uvas)
muestra
arena Fase
filtro
slida
El sistema planteado se prepara de la siguiente forma:
se aade la fase slida de LiChrolut EN sobre un filtro, en torno a 2,5 g,

llenndose la cmara hasta casi completar su capacidad, y colocndose
otro filtro encima.
en el caso de las disoluciones de patrones, se adiciona la disolucin sobre

la arena que se aade encima de la fase slida, aadindose, si fuese
necesario, ms arena hasta que se llene la cmara y cerrando
posteriormente la misma con la tapa superior. En el caso de muestras,
sta se aade directamente sobre el filtro que se coloca encima de la fase
slida (como indica la figura).
156
III. RESULTADOS Y DISCUSIN
Resultados y discusin
III RESULTADOS Y DISCUSION
III.1 EXTRACCIN DE COMPUESTOS FENLICOS EN ORUJOS CON

DISOLVENTES A ALTA TEMPERATURA1 (EFP)
En este apartado se pretende evaluar la estabilidad de distintos compuestos

fenlicos en la extraccin con disolventes a alta temperatura que se desarrolla cuando se
emplea la tcnica de extraccin con fluidos presurizados (EFP). Los resultados se
compararn con los obtenidos cuando se mantienen los mismos compuestos con el
disolvente seleccionado en el punto de ebullicin del disolvente y en contacto con el
aire, para comprobar la influencia que el aire tiene en la degradacin de los mismos.
Una vez determinada la estabilidad de estos compuestos, se determinar la

viabilidad de la EFP y se aplicar el mtodo de extraccin desarrollado a la extraccin
de compuestos fenlicos a partir de muestras de orujo.
III.1.1 Introduccin
Entre los distintos mtodos de preparacin de muestras para la determinacin de

compuestos fenlicos en alimentos,2 el ms empleado es la maceracin de la muestra
slida con disolventes orgnicos o con mezclas acuosas.
Se ha propuesto como tcnica alternativa la extraccin con fluidos supercrticos

(EFSC), puesto que ofrece la ventaja de ser ms rpida y menos contaminante. Sin
embargo, cuando se pretende utilizar el CO2 sub- o supercrtico para la extraccin de
compuestos fenlicos, son necesarios elevados porcentajes de modificador orgnico
para incrementar la polaridad del fluido extractante.3,4,5 En consecuencia, la selectividad
entre los compuestos se ve reducida sustancialmente.
159
Extraccin de compuestos fenlicos con disolventes a alta temperatura (EFP)
Otra alternativa a los mtodos clsicos es la extraccin con fluidos presurizados

(EFP), que, al igual que la EFSC, ofrece la posibilidad de desarrollar extracciones bajo
atmsfera inerte y protegidas de la luz. Esto supone una gran ventaja, especialmente en
el caso de que lo que se pretenda sea analizar compuestos fenlicos sensibles a esos dos
factores. Adems el empleo de estas tcnicas permite reducir el tiempo de extraccin, y
por tanto, se reduce asimismo el efecto adverso que la actividad enzimtica pueda tener.
En la EFSC, su principal ventaja es la alta capacidad de difusin ofrecida por el

fluido de extraccin para acceder a los compuestos presentes en la matriz de la muestra.
En la EFP, se emplean altas temperaturas y altas presiones para acelerar el proceso de
extraccin. La presin permite incrementar el contacto entre el fluido extractante y la
muestra. La temperatura se utiliza para provocar la ruptura de los enlaces analito-matriz.
Adems, la temperatura puede modificar considerablemente la permitividad relativa del
fluido extractante incrementando la selectividad.6
Antes de proponer un mtodo de extraccin basado en el empleo de disolventes

sobrecalentados, es necesario comprobar que:
9 los analitos no se degradan bajo las condiciones de extraccin.

9 los analitos pueden extraerse con el fluido extractante.
Los compuestos fenlicos son fcilmente degradables a altas temperaturas, por

tanto es esencial comprobar que no se degradarn durante la EFP.
III.1.2 Estudio de la estabilidad de los compuestos fenlicos durante la

extraccin a altas temperaturas
El primer punto de este apartado es el estudio de la estabilidad de los compuestos

fenlicos durante la extraccin, usando metanol como fluido extractante, a distintas
temperaturas (40-150C) como medida de la influencia de la atmsfera inerte en la
extraccin. Los resultados se compararn con los obtenidos cuando se someten los
mismos compuestos a temperatura alta pero en contacto con el aire.
Se prepararon disoluciones en metanol de los siguientes patrones de compuestos

fenlicos:
160
cidos benzoicos: cido glico (204 ppm), cido vertrico (106 ppm),
cido p-hidroxibenzoico (424 ppm) y cido gentsico (100 ppm).
cidos cinmicos: cido ferlico (220 ppm), cido p-cumrico (53 ppm),
cido cafeico (99 ppm) y cido sinpico (203 ppm).
aldehdos benzoicos: vainillina (152 ppm), protocatequialdehdo (153

ppm), veratraldehdo (205 ppm) y siringialdehdo (509 ppm).
flavan-3-oles o catequinas: catequina (72 ppm) y epicatequina (55 ppm).
cumarinas: esculetina (230 ppm) y escopoletina (200 ppm).
Se tomaron esas cantidades de patrones para asegurar suficiente seal en los

cromatogramas de los extractos obtenidos, con idea de determinar con facilidad las
recuperaciones de los mismos respecto a las referencias diarias de las disoluciones de
partida.
Como patrn interno se utiliz el 2,5-dihidroxibenzaldehdo, preparndose una

disolucin acuosa del mismo de 2,918 g/l.
Una vez preparada la cmara o clula de extraccin (tal como se indica en el

apartado II.5.3) se define el mtodo de extraccin a utilizar, para ello se fija cual va a
ser la temperatura de extraccin, la presin, la duracin y nmero de ciclos de
extraccin y la duracin de la purga y secado.
En este caso vamos a evaluar la estabilidad de dichos compuestos fenlicos

cuando se someten a una extraccin con el mismo disolvente (metanol puesto que es un
disolvente en el que sabemos que se disuelven esos compuestos) y el mismo mtodo de
extraccin a distintas temperaturas. Se utilizaron como condiciones comunes: 3 ciclos
de 10 minutos a 100 atmsferas de presin y una purga de 60 segundos, y se realizaron
las extracciones a 40, 50, 100 y 150C (hubiera sido interesante establecer la estabilidad
de los compuestos a temperatura ambiente, 25C, sin embargo el equipo instrumental no
permite trabajar a esta temperatura, siendo 40C la mnima temperatura de extraccin
posible).
El proceso de extraccin tiene lugar, entonces, de la siguiente forma:

161
1. Se introduce la cmara en el horno, se presuriza, se llena la cmara

con el disolvente elegido (metanol) y es calentada durante los 5 7 minutos
predeterminados por el equipo dependiendo de si se calienta a temperaturas
inferiores o superiores a 150C respectivamente.
2. Comienza el primer ciclo de extraccin y se desarrolla una extraccin

en esttico durante 10 minutos.
3. Se lleva a cabo la purga con N2, con el fin de arrastrar los posibles
restos de disolvente que hubieran quedado en la clula, recogindose todos los
efluentes en el mismo vial.
4. Se descomprime la clula y se devuelve al carrusel, finalizando el

mtodo con un lavado de los conductos con el disolvente empleado (que se
desecha).
Diariamente se preparan dos disoluciones que servirn como referencias (antes de

la primera y antes de la ltima extraccin diaria respectivamente) con 1mL de la
disolucin estudiada, ms 1 mL de patrn interno y se llevan aproximadamente al
mismo volumen que el del extracto obtenido.
Asimismo 1mL de la disolucin patrn, diluida hasta aproximadamente 40 mL

(volumen aproximado de los extractos) con metanol, se mantiene en el punto de
ebullicin del metanol (65C) en una estufa y en viales abiertos para determinar si se
produce degradacin de los compuestos fenlicos en contacto con el aire durante el
mismo tiempo que dura la extraccin en el equipo de EFP.
Los extractos de EFP, las disoluciones patrn de la estufa y las referencias diarias
se analizan por CLAE, tras haber sido filtradas a travs de una membrana de nylon de
0,45 micras de poro. Las condiciones cromatogrficas empleadas fueron las comentadas
en el captulo II.3.2.1
Las reas de los picos se miden automticamente y se corrigen respecto al patrn

interno. Cada muestra se proces por triplicado, obtenindose las siguientes
recuperaciones medias (en porcentajes respecto a la media de las dos referencias
preparadas diariamente) y desviaciones estndar relativas:
162
Compuesto 40C 50C 100C 150C Referencia Estufa, 65C

fenlico
Ac. gentsico 103,0 4,3 98,6 2,3 97,6 0,5 100,6 2,9 100,8 1,5 85,5 1,6*
Ac. cafeico 101,4 1,9 99,4 2,6 102,8 1,4 101,9 2,9 99,7 1,4 92,5 6,8
Protocatequiald. 100,3 0,4 98,9 2,1 103,6 1,0 103,6 1,4 100,9 1,4 96,2 4,8
Siringialdehido 101,8 4,2 94,4 1,5 101,8 2,6 101,6 0,8 101,1 2,8 92,8 2,2*
Catequina 99,4 1,2 98,9 3,1 92,6 4,9 87,4 3,0* 96,6 4,9 63,7 8,7*
Ac. p-cumrico 101,2 6,8 99,2 2,4 102,3 1,3 98,8 8,6 100,3 0,3 109,1 9,3
Ac. vertrico 97,1 6,5 97,5 2,0 99,9 1,4 103,8 4,9 100,2 0,3 100,8 0,3
Epicatequina 101,8 1,6 98,6 1,5 94,1 1,7* 86,0 2,0* 99,5 1,7 63,4 7,9*
Vainillina 96,4 6,5 95,8 2,5 98,1 1,7 100,7 2,1 99,3 1,4 99,2 1,1
Ac. glico 93,5 4,5 95,8 5,2 92,4 6,9 96,12,5* 100,3 0,3 95,2 1,3*
Ac. pOHbenzo. 97,6 4,5 101,2 4,6 98,0 3,1 103,1 7,1 99,3 1,4 92,8 2,2*
Esculetina 96,4 6,0 98,13,6 98,1 6,9 99,2 5,4 100,2 0,3 99,3 1,1
Ac. ferlico 101,4 7,4 102,2 4,6 96,6 6,0 96,5 6,2 100,9 1,4 92,6 2,1*
Escopoletina 99,1 5,4 101,1 5,6 96,7 5,7 100,3 9,0 100,8 1,3 109,0 8,0
Ac. sinpico 97,9 5,1 100,2 5,1 95,8 6,2 99,0 10,0 99,7 1,3 101,8 4,9
Veratraldehdo 101,3 6,4 102,7 4,5 96,6 4,8 97,7 3,6 101,1 2,8 84,3 0,2*
*: diferencia significativa respecto a la referencia con un nivel de confianza del 95%
Tabla 1 Porcentajes de recuperacin +/- desv. est. de los compuestos analizados
Como puede observarse, las recuperaciones medias para todos los compuestos
extrados estn en torno al 90%, con las excepciones de la catequina y epicatequina a
150C. Se han realizado comparaciones estadsticas (ANOVA) para determinar si hay
series de datos significativamente distintas a las referencias y tan slo lo han dado la
catequina sometida a extraccin a 150C, la epicatequina a 100 y a 150C, y el cido
glico a 150C (vase las representaciones whisker & plot correspondientes en el anexo
I). De forma que, cuanto mayor es la temperatura de extraccin, menores
recuperaciones se obtienen.
Debe indicarse que las catequinas son los compuestos ms fcilmente

degradables7,8 de entre todos los analizados y son los que presentan mayores problemas
de recuperacin en las tcnicas de extraccin slido/fluido.3 El cido glico al presentar
tres grupos hidroxilo es tambin fcilmente degradable.
163
Las recuperaciones obtenidas de las disoluciones patrn sometidas a 65C en

contacto con el aire en la estufa (durante el mismo tiempo que se prolongan las
extracciones con el equipo de EFP) son generalmente inferiores a la referencia. Existen
diferencias estadsticas significativas (obtenidas mediante el empleo del ANOVA) en
los siguientes compuestos: cido gentsico, siringialdehdo, catequina, epicatequina,
cido glico, cido p-hidroxibenzoico, cido ferlico y veratraldehdo. Sus
concentraciones son significativamente menores que las referencias. Concretamente, en
el caso de la catequina y la epicatequina, donde la concentracin es un 34% y un 36%
inferior a la referencia respectivamente.
De esta forma se ha comprobado que varios compuestos fenlicos reaccionan

fcilmente a alta temperatura (65C) cuando estn en contacto con el aire. Sin embargo,
cuando se aplican mayores temperaturas bajo atmsfera de nitrgeno (como en la EFP),
no hay degradaciones, por lo que podemos deducir que el proceso de degradacin de los
compuestos fenlicos es un proceso oxidativo que requiere la presencia de oxgeno.
As pues se ha comprobado la estabilidad de los mencionados compuestos

fenlicos al someterlos a extracciones a elevadas temperaturas, por lo que esta tcnica
(EFP) es viable para la extraccin de dichos compuestos con una temperatura igual o
inferior a 100C.
III.1.3 Propiedades analticas del mtodo
Se realizaron extracciones, por triplicado y ensayando distintas temperaturas de

extraccin, en distintos das, determinndose las recuperaciones de cada compuesto, que
presentaron las desviaciones estndar mostradas en la tabla 2.
Como puede observarse la repetibilidad proporcionada por la EFP para todos los
compuestos supone desviaciones inferiores al 10%. Se puede comprobar como la
temperatura de extraccin no tiene un efecto apreciable sobre la repetibilidad de la
extraccin.
164
Compuesto Desv. est. a Desv. est. a Desv. est. a Desv. est. a

fenlico 40C (n=3) 50C (n=3) 100C (n=3) 150C (n=3)
Ac. gentsico 4,3 2,3 0,5 2,9
Ac. cafeico 1,9 2,6 1,4 2,9
Protocatequiald. 0,4 2,1 1,0 1,4
Siringialdehido 4,2 1,5 2,6 0,8
Catequina 1,2 3,1 4,9 3,0
Ac. p-cumrico 6,8 2,4 1,3 8,6
Ac. vertrico 6,5 2,0 1,4 4,9
Epicatequina 1,6 1,5 1,7 2,0
Vainillina 6,5 2,5 1,7 2,1
Ac. glico 4,5 5,2 6,9 2,5
Ac. pOHbenzo. 4,5 4,6 3,1 7,1
Esculetina 6,0 3,6 6,9 5,4
Ac. ferlico 7,4 4,6 6,0 6,2
Escopoletina 5,4 5,6 5,7 9,0
Ac. sinpico 5,1 5,1 6,2 10,0
Veratraldehdo 6,4 4,5 4,8 3,6
Desv. est. media 4,5 3,3 3,5 4,5
Tabla 2 Desviaciones estndar (n=3) de los compuestos fenlicos estudiados, obtenidas en la

EFP a las distintas temperaturas ensayadas.
III.1.4 Aplicacin de la EFP a muestras reales (orujos)
Tras comprobar el comportamiento de los compuestos fenlicos a distintas

temperaturas, se procedi a la extraccin de los mismos a partir de muestras reales.
Concretamente se sometieron a extraccin pepitas de uva y hollejos procedentes de los
residuos de vinificacin (orujos), usando las mismas condiciones que las aplicadas a los
patrones. A los extractos obtenidos se les aade el patrn interno y tras filtrarlos se
analizan por CLAE.
165
El inters de este tipo de muestra radica en que se puede plantear la recuperacin

de compuestos de tipo fenlico a partir de estos residuos de vinificacin, generando un
valor aadido para los mismos. Para ello ser necesario en primer lugar, determinar el
contenido de los compuestos de inters en los mismos, por lo que se pens en la
utilizacin de la EFP para el desarrollo de este mtodo de anlisis.
De esta forma la EFP sera una alternativa que podra plantearse a nivel industrial
como forma de recuperar los compuestos de inters en los orujos. Por ello, el apartado
que aqu se plantea como desarrollo de un mtodo de anlisis, podra servir adems
como inicio de un estudio de la aplicabilidad de un sistema industrial basado en esta
tcnica, establecindose aqu la influencia de diversos parmetros de extraccin en la
recuperacin de los compuestos. Obviamente, el sistema, en caso de plantearse, deber
ser escalado y las variables ajustadas. En este caso concreto, se ha desarrollado un
proyecto fin de carrera de Ingeniera Qumica donde se han estudiado estos aspectos y
se ha realizado el diseo de una planta a nivel industrial para la recuperacin de
polifenoles a partir de orujos.
Preparacin de muestras
Los orujos se obtuvieron a partir de uvas de la variedad Palomino Fino a la salida

de prensa, se separaron las semillas de los hollejos y se molieron en un molinillo de
sobremesa durante 2 minutos, en secuencias de 15 segundos para evitar el calentamiento
de la muestra.
Hay que indicar tambin que el hecho de realizar la separacin entre hollejos y
pepitas se debe a la diferente composicin entre ambos y, sobre todo, a que ello es
posible desde un punto de vista industrial y se lleva a cabo actualmente, por ejemplo,
para la obtencin a nivel industrial de aceite de pepitas de uva.
Las muestras molidas se secaron durante 24 horas a 40C en una estufa y se

mantuvieron a 20C antes de la extraccin (vase apartado II.5.1).
Para todas las extracciones la cantidad de muestra usada fue de 4 gramos. De esta
manera es posible comparar la capacidad de extraccin del disolvente usado a distintas
temperaturas.
166
Resultados
Los cromatogramas obtenidos a 280 nm de los extractos resultantes de las

muestras de hollejo son los siguientes (la identificacin de los compuestos se realiza
basndonos en la biblioteca de espectros elaborada previamente en el grupo de
investigacin):
50C
0.7
Absorbancia (AUFS)
p.i.
0.5
1 5
0.3 2
3
0.1 4
-0.1
0 25 50 75 100
Tiem po (m in)
Figura 1 Cromatograma a 280 nm del extracto obtenido a partir de los hollejos a 50C.
1= cido glico, 2= cido cis-cutrico, 3= cido caftrico, 4= catequina, p.i.= patrn interno
(2,5 dihidroxibenzaldehdo), 5= epicatequina.
100C
0.7
Absorbancia (AUFS)
p.i.
0.5
0.3 1
2 5
34
0.1
-0.1
0 25 50 75 100
Tiem po (m in)
Figura 2 Cromatograma a 280 nm del extracto obtenido a partir de los hollejos a 100C. 1=
cido glico, 2 = cido cis-cutrico, 3 = cido caftrico, 4 = catequina, p.i. = patrn interno
(2,5 dihidroxibenzaldehdo), 5= epicatequina.
167
150C
0.7
Absorbancia (AUFS)
p.i.
0.5
1 5
0.3 2
3
0.1 4
-0.1
0 25 50 75 100
Tiem po (m in)
Figura 3 Cromatograma a 280 nm del extracto obtenido a partir de los hollejos a 150C. 1=
cido glico, 2 = cido cis-cutrico, 3 = cido caftrico, 4 = catequina, p.i. = patrn interno
(2,5-dihidroxibenzaldehdo), 5= epicatequina.
En el caso de las muestras de pepitas, los cromatogramas a 280 nm son los

mostrados a continuacin:
50C
0.7
Absorbancia (AUFS)
0.5
0.3
p.i. 2
0.1 1
-0.1
0 25 50 75 100
Tiem po (m in)
Figura 4 Cromatograma a 280 nm del extracto obtenido a partir de las pepitas a 50C.
1= cido glico, 2= epicatequina, p.i.= patrn interno.
168
100C
0.7
Absorbancia (AUFS)
0.5
0.3
p.i. 2
1
0.1
-0.1
0 25 50 75 100
Tiem po (m in)
1= cido glico, 2= epicatequina, p.i.= patrn interno
150C
0.7 3
Absorbancia (AUFS)
0.5
0.3
2
p.i.
1
0.1
-0.1
0 25 50 75 100
Tiem po (m in)
1= cido glico, 2= epicatequina, 3= epigalocatequingalato, p.i.= patrn interno.
Se observan pocas diferencias en los extractos de hollejos extrados a distintas

temperaturas, el cido cis-cutrico se incrementa un 1% con el aumento de la
temperatura de extraccin de 50 a 100C, y disminuye un 2% de 100 a 150C. La
recuperacin del cido caftrico se incrementa un 3% de 50 a 100C pero disminuye un
7% de 100 a 150C, en el caso de la epicatequina, aumenta un 3% de 50 a 100C y
disminuye un 2% de 100 a 150C, de tal forma que podemos considerar estas
diferencias no significativas.
169
Respecto a los extractos de las pepitas, los resultados son bastante diferentes en
las temperaturas ensayadas. Usando 50, 100 o 150C existen grandes diferencias tanto
en la identidad como en la recuperacin de los compuestos fenlicos extrados. Por
ejemplo, la catequina se incrementa un 30%, y la epicatequina un 44%, al aumentar la
temperatura de extraccin de 50 a 100C. Cuando se hace la extraccin a 150C la
catequina se incrementa en un 32%, y la epicatequina en un 99%, respecto a la
recuperacin de la extraccin a 50C. Existen algunos compuestos que no se detectan en
todas las extracciones llevadas a cabo a 50C y 100C, pero que si son detectados en las
extracciones a 150C, por lo que como conclusin podemos decir que deben utilizarse
los 150C para la EFP en pepitas de uva.
Si consideramos que el efecto ms importante de la temperatura ms alta est

relacionado con la ruptura de los enlaces entre los analitos y la matriz, parece que los
analitos en las pepitas de uva estn ms fuertemente unidos a la matriz que en los
hollejos.
Podemos concluir que la EFP es una tcnica viable a la hora de analizar

compuestos fenlicos en orujos, adems en la extraccin a alta temperatura (100C) el
mximo grado de degradacin sufrido por los compuestos fenlicos es del 10%, incluso
para los compuestos ms oxidables.
En el caso del desarrollo de mtodos a escala industrial para la recuperacin de

compuestos fenlicos a partir orujos, sera ms interesante realizar las extracciones a
150 C de forma que, aunque se degraden parcialmente algunos compuestos como las
catequinas, las recuperaciones totales seran mayores. Obviamente habra que evaluar
otros parmetros, como el coste que supone el incremento de la temperatura desde 100
hasta 150 C o lo que ello implica en cuanto a requerimientos de los equipos donde se
desarrollara el proceso.
170
III.2 EXTRACCIN DE MUESTRAS SLIDAS: EFP Y EAU
En este apartado se estudiar la aplicacin de la tcnica de EFP a la extraccin de

catequina y epicatequina con distintos disolventes, comparndose los resultados con los
obtenidos cuando se realiza la extraccin mediante agitacin magntica (AM) y asistida
con ultrasonidos (EAU).Una vez seleccionada la tcnica y el disolvente que
proporcionan las mejores recuperaciones, se proceder a la optimizacin del mtodo
para su aplicacin a la determinacin de los niveles de catequina y epicatequina totales
presentes en muestras de pepitas de uva, puesto que stas son las fuentes primordiales
de catequinas en vinos.
A continuacin se emplear la EAU para evaluar el contenido de catequinas que

pueden ser potencialmente extradas, durante la vinificacin, de las pepitas. Esta tcnica
es rpida y sencilla, por lo permite procesar gran nmero de muestras, por ello se
aplicar en las muestras de pepitas tomadas a lo largo del periodo de maduracin de
diversas variedades de uva. Tambin se establecern las correlaciones entre esta
evolucin y la de los parmetros de rutina controlados en este periodo.
Por ltimo se aplicar la EAU, al tiempo que se compara con la AM, para evaluar
la influencia que la liofilizacin previa de las muestras tiene en la extractabilidad de
catequinas.
As pues, con este apartado lo que se pretende es evaluar los factores que afectan a
la extraccin de catequinas mediante diversas tcnicas, facilitando de esta manera
mtodos rpidos de determinacin de las mismas. Adems se pretende establecer los
efectos de diversas condiciones de extraccin en la recuperacin de las mismas, lo que
podra ser usado posteriormente en el diseo de un proceso de recuperacin de
catequinas a nivel industrial, bien sea empleando fluidos presurizados, extraccin
asistida por ultrasonidos o extraccin por maceracin.
III.2.1 Introduccin
La catequina y la epicatequina son dos flavanoles presentes en muchos alimentos

de origen vegetal. El inters que existe en el anlisis de estos compuestos se debe a su
amplia variedad de efectos beneficiosos para la salud humana (tal como se indic en la
introduccin de esta memoria).
171
Extraccin de muestras slidas: EFP, EAU
Estos compuestos pueden ingerirse a partir de alimentos vegetales o de bebidas

derivadas de ellos. As, se ha comprobado la absorcin de catequina y la formacin de
derivados en sangre de seres humanos tras la ingestin de vino tinto.9
La determinacin analtica de estos dos compuestos en muestras lquidas se ha

desarrollado ampliamente, fundamentalmente por CLAE.10 Su anlisis en alimentos
slidos requiere una extraccin, son varias las alternativas, a los mtodos clsicos de
maceracin, a considerar en su determinacin.
Como ya hemos mencionado anteriormente, la EFP ofrece la ventaja de llevar a

cabo extracciones protegidas del aire y de la luz. Puesto que las catequinas son
compuestos fotosensibles y fcilmente oxidables (estando implicados en los fenmenos
de inestabilidad oxidativa, pardeamiento, etc... de vinos), la EFP constituye una
excelente opcin para el anlisis de las mismas en muestras slidas.
Las otras dos tcnicas evaluadas en este apartado se emplean como tcnicas de
referencia, sencillas de usar y de bajo coste.
III.2.2 Determinacin de catequinas mediante EFP, estudio comparativo con AM

y EAU.11
Antes de poner a punto el mtodo de extraccin para la determinacin de

catequinas, se procede a la optimizacin del mtodo cromatogrfico. Para ello, adems
del detector de matriz de diodos, emplearemos un detector de fluorescencia, puesto que
las catequinas son compuestos fluorescentes.12 De esta forma lo que se pretende es
conseguir un mtodo ms selectivo, especfico, y con un menor lmite de deteccin que
en el caso de la deteccin UV.
Asimismo se realiz una comparacin previa a la optimizacin del mtodo de

EFP, para comprobar que las recuperaciones que se consiguen con este mtodo son
superiores a otros mtodos tambin aplicables al anlisis de estos compuestos.
III.2.2.1 Optimizacin del mtodo de CLAE
En primer lugar se registraron los espectros de excitacin y de emisin de

catequina y epicatequina:
172
400
350 320nm
excitacin
300 emisin
250 290nm
200
150
100
50
0
225 325 425 525 625 725 825 925
Figura 7 Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia de catequina.
1400
1200 excitacin
290nm
1000 emisin
800
600
400
320nm
200
0
225 325 425 525 625 725 825 925
Figura 8 Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia de epicatequina.
En base a ellos, se selecciona, como condiciones de medida para la deteccin

selectiva de ambas catequinas, una longitud de onda de excitacin 290 nm y de emisin
de 320 nm. Estas condiciones son similares a las descritas en la bibliografa.33
Para acortar el tiempo de anlisis se realizaron diversos ensayos cambiando la

composicin de la fase mvil. Las condiciones finalmente empleadas permiten registrar
el pico de catequina alrededor de los 10 minutos y el de epicatequina sobre los 17
minutos, reducindose el tiempo de anlisis cromatogrfico a unos 20 minutos (vase
apartado II.3.2.3).
173
Con estas condiciones, se obtienen cromatogramas como el obtenido en la figura

9. Concretamente, dicho cromatograma es el resultante del anlisis del extracto
correspondiente a una muestra de pepitas de uva.
La repetibilidad del mtodo cromatogrfico se evalu empleando extractos de

muestras reales, siendo la desviacin estndar relativa (n=5) de 0,8 y 0,7 % para
catequina y epicatequina respectivamente.
58
48
catequina
38
epicatequina
mV
28
18
8
-2
0 5 10 15 20
tiem po (m in)
Figura 9 Cromatograma de un extracto obtenido por EFP de pepitas de uva. Condiciones de

deteccin por fluorescencia: excitacin 290nm, emisin 320nm.
III.2.2.2 Comparacin de los mtodos de extraccin
Se realiz una comparacin de las recuperaciones obtenidas, empleando distintos

disolventes, a partir de pepitas de uva (0,5 g) empleando la extraccin con agitacin
(EA), la extraccin asistida por ultrasonidos (EAU), y la extraccin con fluidos
presurizados (EFP).
En los tres sistemas de extraccin, se ensayaron cuatro disolventes: agua, metanol,

etanol, y acetato de etilo.
En el caso de la AM y la EAU, se realizaron las extracciones a dos temperaturas

diferentes: 10 y 60C. En la EFP se realizaron las extracciones a 100C.1
174
Los resultados obtenidos se presentan mediante las siguientes grficas:
2,00
1,60
catequina (mg/g)
EFP
1,20 EAU-60C
EA-60C
0,80
EAU-10C
0,40 EA-10C
0,00
agua metanol etanol acetato etilo
Figura 10 Recuperaciones de catequina obtenidas mediante EFP, EAU (10 y 60C), y EA (10 y 60C).
0,80
epicatequina (mg/g)
0,60
EFP
EAU-60C
0,40
EA-60C
EAU-10C
0,20
EA-10C
0,00
agua metanol etanol acetato etilo
Figura 11 Recuperaciones de epicatequina obtenidas mediante EFP, EAU (10 y 60C), y EA (10 y 60C).
Se puede comprobar como a 60 C, los mejores resultados se obtienen empleando

metanol como disolvente. Las recuperaciones obtenidas con metanol son
apreciablemente mayores que las que se obtienen con cualquier otro disolvente, tanto en
el sistema EA como en el sistema EAU y tanto para catequina como para epicatequina.
175
Los resultados obtenidos en las experiencias desarrolladas a 10 C son similares en

cuanto a la conclusin del mejor disolvente, nuevamente el metanol es quien produce
mayores recuperaciones. En este caso hay que destacar que los cuatro disolventes
producen recuperaciones entre un 30 y un 50 por ciento inferiores a las obtenidas
cuando se emplean 60 C como temperatura de extraccin y especialmente notable es el
caso del agua, ya que en los extractos obtenidos con agua a 10 C no se detectaron ni
catequina ni epicatequina.
En cuanto a los resultados obtenidos empleando la EFP, nuevamente es el metanol

el disolvente que produce los mejores resultados, en este caso tambin con diferencias
notables con respecto a los otros tres disolventes. Hay que destacar asimismo que los
resultados de los extractos obtenidos mediante EFP son mejores que los obtenidos con
las otras dos tcnicas para metanol y para etanol, mientras que para el agua las mejores
condiciones de extraccin son la EAU a 60 C. Para el acetato de etilo, las
recuperaciones obtenidas empleando la EFP son incluso inferiores a las que se obtienen
usando la EAU o la EA a 10 C.
Por todo ello, se puede concluir que el empleo de la EFP usando metanol como
disolvente, produce unos resultados en cuanto a recuperacin de catequina y de
epicatequina notablemente superiores a cualquiera de las otras condiciones de
extraccin ensayadas para el caso de las pepitas de uva. En el caso de la EFP presenta
adems la posibilidad de emplear un mayor intervalo de temperaturas, incluso por
encima de 100 C, que podran incrementar la recuperacin o incluso disminuir el
tiempo necesario para obtener la misma recuperacin.
III.2.2.3 Optimizacin de la EFP y aplicacin sobre pepitas
En primer lugar se desarrollan extracciones entre 100 y 200C (mxima

temperatura admitida por el equipo) para determinar la temperatura ptima para la
extraccin de catequina y epicatequina a partir de pepitas de uva (obtenidas segn
apartado II.5.2). Se emplearon tiempos de extraccin de 5 y 10 minutos.
Los resultados de las recuperaciones de ambos compuestos se presentan en las

siguientes grficas:
176
3,0
10 min
2,5
catequina (mg/g) 5 min
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
100 120 140 160 180 200
temperatura de extraccin
Figura 12 Recuperaciones de catequina a partir de pepitas de uva durante la EFP a distintas

temperaturas, usando dos tiempos de extraccin diferentes: 5 y 10 minutos.
1,50
1,25 10 min
epicatequina (mg/g)
5 min
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
100 120 140 160 180 200
temperatura de extraccin
Figura 13 Recuperaciones de epicatequina a partir de pepitas de uva durante la EFP a

distintas temperaturas, usando dos tiempos de extraccin diferentes: 5 y 10 minutos.
Podemos comprobar que para ambos tiempos de extraccin, el comportamiento

es similar: la extraccin de catequinas se incrementa notablemente a partir de 100C
hasta el intervalo entre 160-180C, disminuyendo posteriormente de forma drstica
hasta la mxima temperatura ensayada (200C).
Este comportamiento puede atribuirse a la superposicin de dos efectos

diferentes durante el incremento de temperatura. El primero de ellos es la mayor
facilidad de extraccin a temperaturas ms elevadas debido al debilitamiento de las
uniones entre las catequinas y la matriz. El segundo efecto, en este caso de
177
consecuencias contrarias, es la degradacin de estos compuestos a altas temperaturas,

incluso en una atmsfera de nitrgeno, como es la que se tiene durante la EFP.
Es adems llamativo el hecho de que en las extracciones que se desarrollan tan

slo durante 5 minutos, las recuperaciones obtenidas a temperaturas entre 150 y 180 C
son sensiblemente superiores a las obtenidas cuando la duracin de la extraccin es de
10 minutos. Este hecho slo tiene explicacin considerando que a esas temperaturas, el
efecto de la degradacin en 10 minutos, es superior al efecto de incremento de la
extraccin desde la muestra.
Para comprobar esta suposicin se determin la estabilidad de catequina y

epicatequina durante extracciones de 10 minutos de duracin a diferentes temperaturas,
empleando para ello una disolucin patrn de esas sustancias.
Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente grfica:
110
catequina
epicatequina
recuperacin (%)
100
90
80
75 100 125 150 175
temperatura de extraccin (C)
Figura 14 Recuperaciones de los patrones de catequina y epicatequina durante la EFP a

distintas temperaturas.
Se puede comprobar que la recuperacin es superior al 95% con temperaturas de

extraccin de hasta 130 C. A partir de dicha temperatura, la degradacin de ambos
compuestos es superior al 5% de la muestra sometida a extraccin. De esta forma queda
178
comprobado el efecto del incremento de la degradacin de las catequinas durante la

extraccin de 10 minutos de duracin a temperaturas superiores a 130 C. Este efecto se
hace ms intenso conforme mayor es la temperatura, llegando a compensar el
incremento del grado de extraccin de las catequinas a partir de las muestras reales.
Por ello, la mxima temperatura de extraccin que se puede aplicar en el sistema

de EFP es de 130 C cuando la duracin de la misma es de 10 minutos.
Tras la determinacin de la temperatura ptima de extraccin, se procedi a la

aplicacin del mtodo de EFP desarrollado sobre pepitas de uva. Para determinar la
repetibilidad del mtodo se realizaron extracciones sobre alcuotas de la misma muestra.
Se obtuvo que, para catequina, la desviacin estndar relativa del mtodo es del 3,21%,
y para epicatequina fue del 2,96% (n=5).
Podemos concluir que la aplicacin de la EFP permite la determinacin de

catequina y epicatequina en muestras reales con mtodos de extraccin rpidos (10
minutos) y reproducibles. La degradacin que ambos compuestos sufren a 130 C no
resulta ser significativa y por ello se puede emplear esta temperatura durante la
extraccin de dichos compuestos.
III.2.3 Evaluacin de las catequinas potencialmente extrables de pepitas de uva

mediante EAU
Con este apartado lo que se pretenda es obtener informacin sobre los niveles de
catequinas que podran ser extrados a partir de las pepitas durante la posterior
vinificacin, por sus implicaciones en la calidad de los vinos obtenidos. Estas
catequinas, que se extraen durante el proceso de maceracin slido-lquido desarrollada
durante la fermentacin, lo hacen fundamentalmente a partir de la superficie de las
pepitas.
179
La tcnica de EAU, junto con el empleo de metanol (con la que se obtienen

buenos resultados en la EAU de estos compuestos11), proporciona una alternativa rpida
y sencilla, que nos permite acelerar el proceso de extraccin producido durante la
vinificacin. De esta forma este mtodo rpido tiene dos ventajas, por un lado, se
minimizan los procesos de degradacin a los que son especialmente susceptibles las
catequinas (oxidacin), y por otro, es posible analizar gran nmero de muestras, tal
como nos interesa en nuestro caso, puesto que se pretende adems conocer cual es la
evolucin de estos compuestos a lo largo del periodo de maduracin.
Como muestras se utilizan las pepitas tomadas a lo largo del periodo de

maduracin del ao 2002 de las siguientes variedades de uva: Traminer (TRM),
Palomino Negro (PNN), Chardonnay (CHA), Sauvignon Blanc (SBL), Syrah (SYR),
Tempranillo (TMP), Palomino riego (PNR), Palomino (PNO), Moscatel de grano
pequeo Frontignan (MGP), Moscatel de Mlaga o Alejandra (MAL), Cabernet
Sauvignon (CBS), Viura (VIU), Vijiriega (VIJ), Garrido (GRR), Tintilla de Rota (TTR)
y Graciano (GRA).
Con el conocimiento de la evolucin de la concentracin de catequinas fcilmente

extrables de las pepitas se pretende proporcionar al enlogo informacin que le permita
evaluar las consecuencias que tendra la eleccin de una determinada fecha de
vendimia, para que de esa forma pueda, si es necesario, establecer a tiempo las acciones
correctoras que considere ms adecuadas. Esto es, si, por ejemplo, en la vinificacin de
una uva blanca tras evaluar los parmetros habituales de control en maduracin se
decide adelantar la fecha de vendimia a un punto donde la concentracin de catequinas
es considerablemente mayor, se podra plantear la realizacin de operaciones como la
hiperoxidacin del mosto o bien la aplicacin de dosis mayores de dixido de azufre,
que permitan controlar el desarrollo de oxidaciones en el mosto.
En definitiva, no se pretende aqu aadir otro parmetro a controlar para decidir la

fecha de vendimia, sino incrementar la informacin disponible para el enlogo a la hora
de la planificacin de las tareas a realizar durante el proceso de vinificacin.
Las extracciones se realizan de la siguiente forma: se emple como disolvente el

MeOH, a 60C, durante 15 minutos y con una cantidad de muestra de 3 pepitas enteras
(entre 0,10-0,15 g).
Los extractos se analizan con el mtodo de CLAE optimizado en el apartado

anterior y los resultados obtenidos son los presentados en las tablas 3 y 4.
180
-56das -49das -42das -35das -28das -21das -14das -7das Vend. Fecha vend.
TRM 2,01 1,72 0,51 0,12 0,17 01-ago
PNN 0,70 n.d. 0,41 0,32 01-ago
CHA 4,20 0,00 1,45 0,63 0,86 06-ago
SBL 1,23 0,95 0,65 0,60 0,42 13-ago
SYR 3,50 1,84 1,49 1,28 1,04 0,83 1,11 23-ago
TMP 2,01 1,72 0,51 0,12 0,17 27-ago
PNR 0,10 0,11 0,06 0,04 0,01 0,01 0,01 0,01 28-ago
PNO 1,19 0,94 0,28 0,33 0,71 0,41 0,25 28-ago
MGP 6,15 1,41 1,40 1,16 0,93 0,00 1,28 0,26 29-ago
MAL 2,32 6,99 6,18 2,25 1,04 0,78 0,62 0,68 29-ago
CBS 6,78 3,78 3,23 1,58 1,32 1,41 1,75 03-sep
VIU 2,69 2,54 0,51 0,31 0,36 0,18 0,21 03-sep
VIJ 3,32 1,93 0,56 0,57 0,44 0,15 0,20 04-sep
GRR 2,94 n.d. 1,73 2,11 0,72 0,40 0,42 0,30 04-sep
TTR 0,29 0,66 5,14 7,00 0,44 0,61 05-sep
GRA 3,34 2,02 2,00 1,15 0,39 0,49 0,12 05-sep
Tabla 3 Concentracin de catequina (mg/g) en pepitas muestreadas a lo largo de la maduracin.
-56das -49das -42das -35das -28das -21das -14das -7das Vendimia Fecha vend.
TRM 3,61 2,70 1,01 0,55 0,56 01-ago
PNN 1,41 0,01 0,77 0,67 01-ago
CHA 10,49 0,01 3,38 1,61 2,32 06-ago
SBL 5,03 2,22 2,50 1,66 1,63 13-ago
SYR 6,56 4,92 6,68 5,11 2,87 2,46 3,36 23-ago
TMP 3,61 2,70 1,01 0,55 0,56 27-ago
PNR 0,02 0,02 0,02 0,02 0,03 0,02 0,02 0,02 28-ago
PNO 1,17 1,08 0,48 0,51 0,93 0,60 0,48 28-ago
MGP 8,06 3,23 2,51 1,93 1,79 0,00 2,00 0,63 29-ago
MAL 1,05 5,49 5,18 2,82 1,60 1,10 1,02 1,22 29-ago
CBS 4,95 4,72 5,15 2,78 2,20 1,91 3,64 03-sep
VIU 2,73 2,52 1,26 0,74 0,59 0,52 0,62 03-sep
VIJ 2,63 2,04 1,78 1,69 1,42 0,44 0,34 04-sep
GRR 5,15 0,01 3,45 4,24 1,96 1,62 1,25 0,71 04-sep
TTR 1,64 1,34 4,45 6,06 0,95 1,18 05-sep
GRA 3,97 4,98 5,60 2,92 1,67 1,99 0,12 05-sep
Tabla 4 Concentracin de epicatequina (mg/g) en pepitas muestreadas a lo largo de la maduracin.

n.d.: no detectado. Las celdas en amarillo se refieren a muestras no disponibles.
181
Sobre estas condiciones de extraccin concretas hay que indicar que no se han
optimizado, sino que han sido adaptadas a partir de los estudios realizados en el grupo
de investigacin sobre compuestos de estructuras similares y sobre otro tipo de semillas.
Como se ha comentado no se pretende una extraccin cuantitativa de las catequinas de
las pepitas, sino determinar la evolucin de la concentracin relativa de las mismas en
las partes ms externas de las pepitas.
El tipo de evolucin que muestran las variedades analizadas, en todos los casos, es
que a partir de un cierto grado de maduracin (entre 21 y 28 das antes de la fecha de
vendimia) se produce una disminucin apreciable de los contenidos de catequina y
epicatequina en las pepitas.
Con el fin de determinar si hay diferencias apreciables en los tipos de

comportamiento de las distintas variedades, se realiza un anlisis de agrupaciones donde
se emplean como variables las evoluciones de catequina y epicatequina. El resultado
queda recogido en las figuras 15 a) y b).
En estos dendogramas se puede ver como hay un gran grupo relativamente

diferenciado del resto de variedades particulares que presentan un comportamiento
distinto, concretamente estas variedades son TTR, TMP, GRA, VIJ y MGP.
a)
TTR
TMP
SYR
CBS
SBL
PNN
PNO
CHA
TRM
VIU
MAL
GRR
PNR
GRA
VIJ
MGP
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Distancia de Unin
182
b)
TTR
CHA
VIU
MAL
GRR
PNO
SYR
CBS
TRM
PNR
SBL
PNN
TMP
VIJ
MGP
GRA
0 500 1000 1500 2000 2500

Distancia de Unin
Figura 15 Dendogramas representando los agrupamientos en funcin de la evolucin de

catequina (a) y epicatequina (b).
Si se representan los valores medios del grupo formado por SYR, CBS, SBL,
PNN, PNO, CHA, TRM, VIU, MAL, GRR y PNR frente a los valores individuales de
las otras variedades podemos ver que la diferenciacin es clara:
7,00
6,00
-56das
5,00 -49das
catequina (mg/g)
-42das
4,00 -35das
-28das
3,00
-21das
2,00 -14das
-7das
1,00 vendimia
0,00
TMP MGP VIJ TTR GRA grupo
Figura 16 Evolucin de catequina en las variedades con el mismo (grupo) y distinto

comportamiento.
183
9,00
8,00
-56das
7,00
epicatequina (mg/g)
-49das
6,00 -42das
5,00 -35das
4,00 -28das
-21das
3,00
-14das
2,00 -7das
1,00 vendimia
0,00
TMP MGP VIJ TTR GRA grupo
Figura 17 Evolucin de epicatequina en las variedades con el mismo (grupo) y distinto

comportamiento.
Se puede describir la evolucin ms general de los valores de catequina y de

epicatequina como un ligero incremento hasta unos 45 das antes de la vendimia y
posteriormente un descenso acusado hasta unos 20 das antes de vendimia, donde se
produce una estabilizacin de los valores en niveles que rondan los 0,8 mg/g para
catequina y los 1,2 mg/g para epicatequina.
En el caso de la variedad TMP (Tempranillo), los valores tanto de catequina como

de epicatequina presentan una disminucin continuada durante la maduracin y la
estabilizacin final se produce en unos niveles inferiores a la media de los valores de las
variedades agrupadas. El no registrar el incremento en los primeros muestreos puede
deberse a que se produjera con anterioridad al comienzo del muestreo.
La diferencia entre la variedad MGP (Moscatel Grano Pequeo) y la media de las

otras variedades se encuentra tanto al principio como al final de la maduracin y as los
niveles de catequina y epicatequina son alrededor del 100% superiores a la media en el
primer punto de muestreo y del 50% en la fecha de vendimia. Adems la evolucin es
un continuo descenso sin que se haya registrado el incremento encontrado al principio
de la maduracin para otras variedades.
De la misma manera la variedad VIJ (Vijiriega) tampoco muestra el incremento

de valores registrado en las otras variedades, en cambio presenta unos niveles de
catequina y epicatequina menores durante toda la maduracin, adems de un descenso
continuado que se acenta al final en la semana cercana a la vendimia.
184
La variedad TTR (Tintilla de Rota) es la que presenta un comportamiento ms

diferenciado de las dems, puesto que presenta un incremento tanto para catequina
como para epicatequina hasta una fecha ms prxima a la vendimia que el resto de
variedades. Tras alcanzar un mximo a 33 das de la vendimia luego registra una
disminucin de ambos parmetros de forma rpida.
La variedad GRA (Graciano) es la nica que presenta un comportamiento

diferenciado para los dos parmetros. Mientras que la epicatequina registra una
evolucin similar a la media de las variedades, el comportamiento encontrado para la
catequina es totalmente distinto, con una disminucin continuada desde el comienzo del
seguimiento. Es esta diferenciacin entre el comportamiento de catequina y
epicatequina lo que hace que esta variedad se diferencia con respecto a las dems.
Tras la caracterizacin de la evolucin de ambos parmetros se ha intentado

encontrar alguna correlacin entre los niveles de los parmetros analizados y los niveles
de los parmetros determinados de forma rutinaria durante la maduracin, estos han
sido concretamente en este caso: grado Baum, acidez total, pH, cido tartrico, peso
medio de baya y residuo seco (vase anexo II). A fin de poder determinar si la
correlacin es posible, se realiz un anlisis de conglomerados de variables entre los
citados parmetros de rutina y los valores encontrados para catequina y epicatequina,
tras realizar la estandarizacin de los mismos, para evitar de esta manera la influencia
de las distintas formas de expresin y unidades.
En el anlisis por mnimos cuadrados parciales no se obtuvieron resultados

positivos, siendo 0,56 el valor ms alto de correlacin entre los valores de catequina y
epicatequina y los valores de las variables de rutina. Este valor se alcanz empleando
nicamente aquellas variedades que presentan un comportamiento similar en cuanto a
evolucin de las catequinas, resultando valores inferiores cuando se emplean todas las
variedades analizadas en el seguimiento de maduracin. Por ello, no es posible estimar
los valores de las catequinas disponibles en las variedades analizadas a partir de los
datos de los parmetros de rutina.
185
III.2.4 Influencia de la liofilizacin en la extractabilidad de catequinas
La disponibilidad de muestras de uva en los seguimientos de maduracin se

concentra en una poca concreta del ao (Julio-Septiembre), acumulndose un nmero
considerable de muestras, siendo necesario el almacenamiento y acondicionamiento
(desecado) de las muestras para disponer de ellas en el desarrollo del mtodo de
anlisis.
Existen varias tcnicas de desecacin posibles: qumica, trmica y la

liofilizacin. La desecacin qumica implica el empleo de agentes qumicos, tales como
el sulfato sdico anhidro, pero puede implicar la introduccin de contaminantes y
supone una mayor manipulacin de la muestra. La desecacin trmica, aunque es el
mtodo ms simple, puede producir prdidas por evaporacin o descomposicin. La
liofilizacin es una alternativa interesante porque no introduce contaminantes y las
posibilidades de degradacin son reducidas debido a las bajas temperaturas de
operacin.
Por este motivo se recurri al proceso de liofilizacin y congelacin como medio

de conservacin. La liofilizacin produce, al eliminar el agua, una concentracin de los
analitos de inters, pero justamente el hecho de secar la muestra podra afectar al
proceso de extraccin, por lo que se crey conveniente evaluar si la liofilizacin
condiciona o no los resultados del proceso de extraccin.
Se ha estudiado la influencia de la liofilizacin en la extraccin de diversos

compuestos a partir de distintas matrices slidas, as, se ha comparado el empleo de las
microondas frente a la liofilizacin en la extraccin, a partir de material vegetal, de
azcares, cidos orgnicos y aminocidos13; Inakuma y col.14 evalan el efecto que la
liofilizacin tiene en la extraccin de licopeno (carotenoide) de la piel de tomate,
mediante dixido de carbono supercrtico. Tambin se ha estudiado como influyen
distintos mtodos de preparacin de muestras, entre los que se incluye la liofilizacin,
en el anlisis de compuestos fenlicos en hojas de abedul.15
A la vista de la bibliografa consultada puede deducirse que la posible influencia

que la liofilizacin tenga sobre la extraccin de los analitos de inters depender, tanto
del tipo de muestra a liofilizar, como del analito en cuestin, siendo necesario, por tanto,
evaluar en cada caso el efecto que esta etapa puede tener en el anlisis.
186
Para determinar la influencia de este proceso en la extractabilidad de catequinas se

realizan extracciones en un bao de ultrasonidos a 60C (EAU). La duracin de la
extraccin es de 10 minutos y el disolvente empleado es MeOH. A su vez estas
extracciones se comparan con las recuperaciones conseguidas cuando se realizan
extracciones a la misma temperatura con ayuda de un agitador magntico (EA), de esta
forma podemos comprobar si la influencia de la liofilizacin depende del tipo de
extraccin a realizar. Todas las extracciones se realizan por duplicado.
Puesto que lo que se pretende es estudiar la influencia que la liofilizacin tiene en

la extraccin de los analitos, se realizan extracciones de las muestras (pepitas de uva)
antes y despus de su liofilizacin (la cual conlleva una prdida de peso media del
11,6%).
En el anlisis de pepitas de uva (figura 18) los mejores resultados para ambas
catequinas se consiguen con el empleo de los ultrasonidos como tcnica de extraccin y
se comprueba que la liofilizacin de las mismas favorece la extraccin en ambos casos,
destacando especialmente las recuperaciones obtenidas cuando se realiza la extraccin
con ultrasonidos de las pepitas liofilizadas.
pepitas de uva
14300
13300
12300 EA-no liofil.
11300
EA-liofil.
10300
mg/kg
9300 EAU-no liofil.

8300 EAU-liofil.
7300
6300
5300
4300
catequina epicatequina
Figura 18 Recuperaciones de catequina y epicatequina obtenidas mediante EAU y EA, a

partir de muestras de pepitas de uva, liofilizadas y sin liofilizar.
187
Podemos concluir que, independientemente de la tcnica de extraccin empleada,

puede evidenciarse que la liofilizacin previa de las pepitas permite conseguir mayores
recuperaciones.
El motivo puede encontrarse en una mayor accesibilidad del disolvente hacia los
compuestos a extraer. En cualquier caso, se ha comprobado que la liofilizacin permite,
adems de la conservacin de las muestras, incrementar las recuperaciones de los
compuestos de inters antes que producir degradaciones o prdidas de analitos.
188
III.3 EXTRACCIN CON FLUIDOS PRESURIZADOS ACOPLADA CON

EXTRACCIN EN FASE SLIDA (EFP-EFS)
En este apartado se proceder al desarrollo de un mtodo de extraccin basado en

el acoplamiento de una EFP con una EFS con vistas a la obtencin de un mtodo
selectivo para la determinacin de distintos compuestos en uvas.
Para ello se ensayarn distintos disolventes, y condiciones de presin y

temperatura, optimizando el mtodo en funcin del compuesto a analizar (compuestos
fenlicos en general, o trans-resveratrol en particular). Asimismo, se pondr de
manifiesto la utilidad de esta tcnica en el seguimiento de la maduracin de uvas.
III.3.1 Introduccin
Con el fin de obtener extractos ms limpios y para conseguir anlisis

cromatogrficos con menos interferencias se plante la posibilidad de acoplar una fase
semi-slida dentro de la cmara de extraccin de la EFP, con idea de intentar obtener
una mejor separacin de los analitos del resto de componentes de la muestra slida a
analizar (uvas), especialmente de los azcares. En el caso de hollejos y pepitas de orujos
esta separacin no es necesaria debido a la baja concentracin de azcares en las
mismas.
Mediante el uso de la EFS, tras una primera EFP, se puede conseguir un mayor
grado de selectividad. Se han desarrollado varios mtodos de extraccin de EFP seguida
de una EFS. Sin embargo, la mayora de ellos llevan a cabo la EFS fuera de la cmara
de extraccin.16,17 nicamente Mller y col. realizan una etapa de limpieza de aceites,
en lnea, dentro de la cmara de extraccin durante la EFP.18
Para la determinacin de compuestos fenlicos en uvas, vinos y otras bebidas, se

han estudiado distintas fases slidas para la EFS. Los polmeros de estireno-
divinilbenceno producen buenos resultados, especialmente si se compara con las fases
slidas basadas en octadecilslice (C18), que conducen a pobres resultados para aquellos
compuestos fenlicos ms polares.
189
Acoplamiento EFP con EFS
As pues, el principal objetivo de esta investigacin es el desarrollo de un mtodo

de EFP (puesto que ya se ha comprobado la estabilidad de estos compuestos en la
extraccin a altas temperaturas)1 con una etapa de limpieza en lnea (EFS), que permita
obtener extractos con compuestos fenlicos, pero minimizando la presencia de azcares
en los mismos.
III.3.2 Desarrollo del mtodo para la determinacin de compuestos fenlicos 19
La cmara de extraccin se prepara, con la fase slida estudiada en cada caso

(LiChrolut EN o PPL) tal se indica en el apartado II.5.4
Antes de llevar a cabo la extraccin se debe pasar metanol a travs de la fase

slida para activarla, para ello se aplica un mtodo de 3 ciclos de 1 minuto a 40C y a 40
atmsferas (mnima presin y temperatura admitidas por el equipo).
En primer lugar se determinan las recuperaciones de compuestos utilizando el

sistema con la fase slida. Las pruebas se desarrollan empleando una disolucin que
contiene cidos benzoicos, cidos cinmicos, aldehdos y cumarinas. Primero se utiliz
un relleno basado en poliestireno-divinilbenceno (LiChrolut EN), puesto que se
encuentran descritos en la bibliografa mtodos de EFS empleando este adsorbente con
buenos resultados sobre compuestos fenlicos.20 Esta fase slida presenta interesantes
ventajas, concretamente y de forma especialmente interesante, la prdida de compuestos
polares es pequea en comparacin con otras fases slidas como el C18, clsicamente
utilizada en la EFS para la determinacin de polifenoles en vinos y otras bebidas.
Para disear un mtodo de extraccin con una alta selectividad para compuestos
fenlicos es necesario determinar el disolvente adecuado para llevar a cabo la
extraccin, para ello se realizaron extracciones con varios disolventes que cubren un
amplio intervalo de polaridades (tabla 5).
190
Disolventes Acetato etilo Agua Etanol ter etlico Metanol

Cte. dielctrica 6,02 (25C) 78,54 (25C) 24,3 (25C) 4,34 (20C) 32,63 (25C)
Pto. ebullicin 77,1C 100 C 78,54C 34,6C 64,51C
Tabla 5 Constantes dielctricas y puntos de ebullicin de los disolventes considerados
El metanol ha mostrado capacidad para la extraccin de compuestos a partir de

matrices similares, sin embargo se ensayaron adems los otros disolventes puesto que
son habitualmente utilizados para la extraccin de polifenoles por maceracin, siendo
stos suficientemente solubles en los mismos. El agua se ensay con idea de probar un
disolvente capaz de extraer compuestos polares de la matriz pero con un bajo poder
elutrpico del relleno slido empleado.
Para cada extraccin se aada 1 ml de la mezcla de patrones, sobre la arena

situada por encima de la fase slida, dentro de la cmara de extraccin. Para cada
disolvente se ensayaron distintas condiciones de extraccin, por duplicado, usndose 3
ciclos de 10 minutos a 40 y a 100C, y con 40 y con 150 atmsferas (para comparar
distintas combinaciones de extraccin con una temperatura y una presin bajas, y con
temperatura y presin altas) dado que hay que tener en cuenta que los cambios de
presin, y sobre todo de temperatura, afectan a las polaridades de los disolventes, y, por
ello, a sus capacidades elutrpicas. Adems no se dispona de datos sobre el
comportamiento de la fase slida en condiciones de alta presin y/o temperatura. A los
extractos obtenidos se les aada el patrn interno y se filtraban inyectndose en el
cromatgrafo, excepto en el caso del acetato de etilo y el ter dietlico, que se
concentraban hasta sequedad bajo una corriente de N2 (tras aadir el patrn interno), y
se recogan con unos 20 mL de metanol (volumen aproximado de los restantes
extractos), antes de filtrar.
Se obtuvieron de esta forma las recuperaciones medias representadas en la figura

19, cuando se realizaron las extracciones a 40C y 40 atmsferas de presin.
191
40C, 40 atm.
120
100 ac.glico
% recuperacin
80 ac.pOHbenz
esculetina
60
ac.ferlico
40 escopol.
20 ac.sinpico
veratrald.
0
AGUA ETANOL ETER ETIL. ACET.ETIL. METANOL
disolvente
Figura 19 Representacin de las recuperaciones obtenidas con los distintos disolventes a 40C
y 40 atmsferas de presin
Estas son las condiciones ms suaves de extraccin y como puede observarse el

agua muestra bajas recuperaciones de la fase slida usando estas condiciones. Slo se
detecta el cido glico en los extractos de agua. Este comportamiento es lgico puesto
que este compuesto es el ms polar de los compuestos estudiados en este caso y
prcticamente el polifenol ms polar presente en las muestras reales.
El empleo de etanol como fluido extractante conduce a recuperaciones superiores

al 90% para todos los compuestos, excepto para el veratraldehdo, donde la
recuperacin est en torno al 70%.
El metanol produce recuperaciones medias cuantitativas de todos los compuestos

considerados, as el porcentaje mnimo de recuperacin obtenido es del 93% en el caso
del veratraldehdo.
Con el acetato de etilo se obtienen distintas recuperaciones medias para los

distintos compuestos fenlicos, abarcando, desde una recuperacin mnima del 54%
para el caso de la esculetina, hasta una mxima de un 118% para el veratraldehdo.
192
En cuanto al ter etlico, se obtienen recuperaciones similares a las conseguidas

con el acetato de etilo y con similar tendencia en cuanto al tipo de compuesto fenlico
extrado, aunque en general son de mayor magnitud (recuperacin media del 90%) que
las anteriores, presentando, desde un 76% de recuperacin para el cido glico, a un
103% para el cido ferlico.
Por todo ello podemos deducir que es factible el empleo de etanol, metanol e
incluso de ter etlico para la recuperacin de compuestos fenlicos retenidos en la fase
estacionaria de poliestireno-divinilbenceno a 40C y 40 atmsferas.
Se ha descrito en la bibliografa21,22 que la presin tiene una baja influencia en el

poder extractante de los lquidos en la EFP. Sin embargo, como sta es la primera
ocasin en que se acoplan la EFP y la EFS es muy interesante determinar si la presin
puede afectar a la retencin de los distintos compuestos en la fase slida.
A continuacin se muestran los resultados obtenidos al emplear 150 atmsferas en

la extraccin a 40C.
40C, 150 atm.

120
100 ac.glico
% recuperacin
80 ac.pOHbenz
esculetina
60
ac.ferlico
40 escopol.
ac.sinpico
20
veratrald.
0
AGUA ETANOL ETER ETIL. ACET. ETIL. METANOL
disolvente
Figura 20 Representacin de las recuperaciones con los distintos disolventes a 40C y 150
atmsferas de presin
193
En este caso se comprueba que su influencia es realmente alta, as puede verse que
las recuperaciones, en general, son menores para todos los fluidos extractantes cuando
se emplean 150 atmsferas en lugar de 40 atmsferas a la misma temperatura (figura
20)
El agua sigue logrando bajas recuperaciones: nicamente en el caso del cido

glico se supera el 25% del mismo, siendo, para el resto de los compuestos, inferiores al
5%.
El mayor poder extractante se consigue con el acetato de etilo, este disolvente es

el nico de los ensayados que mantiene un poder extractante similar al alcanzado en el
experimento anterior. Presenta una media de un 99% de recuperacin y tan slo para el
cido glico (con un 80%) y el cido p-hidroxibenzoico (con un 89%) presentan
recuperaciones por debajo del 90%.
El resto de los disolventes empleados consiguen, en general, recuperaciones

medias inferiores a las conseguidas cuando la presin utilizada, en la extraccin a la
misma temperatura, es inferior. As el ter etlico presenta una recuperacin media del
57%, y el etanol de un 70%. En los dos casos anteriores, y en el caso del metanol, hay
compuestos cuyas recuperaciones no superan el 50%.
Por tanto, el incremento de la presin no mejora las recuperaciones con respecto a

las extracciones realizadas a 40C y 40 atmsferas, tan solo el acetato de etilo presenta
unos resultados mejores cuando la presin es de 150 atmsferas. En este caso pensamos
que el menor rendimiento de la extraccin puede estar relacionado con el desarrollo de
caminos preferenciales en el seno de la fase slida y por tanto, con una insuficiente
elucin de los polifenoles desde dicha fase. Para explicar esto hay que considerar que
cuanto mayor es la presin de trabajo, ms brusca es la despresurizacin de la cmara de
extraccin, puesto que en el equipo empleado se realiza sta de forma instantnea desde
la presin de trabajo, sea cual sea, hasta presin atmosfrica. Y es durante esta
despresurizacin cuando se supone que se forman los canales preferenciales.
A continuacin se evalu el comportamiento del sistema a alta temperatura.
Los resultados obtenidos empleando como condiciones de trabajo 100C y 40 atm

se presentan en la figura 21.
194
100C, 40 atm.
120
100 ac.glico
% recuperacin
80 ac.pOHbenz
esculetina
60
ac.ferlico
40 escopol.
20 ac.sinpico
veratrald.
0
disolvente

atmsferas de presin
Como puede observarse una mayor temperatura produce cambios en el poder

elutrpico de los disolventes estudiados. Al aumentar la temperatura se debera producir
un incremento de la recuperacin desde la fase estacionaria, ya que el incremento de
temperatura debe de facilitar la rotura de las uniones entre dicha fase estacionaria y los
compuestos retenidos. No es este el caso, al ser la arena un soporte inerte.
Por otro lado, los lquidos calentados por encima de su punto de ebullicin
presentan propiedades elutrpicas distintas a las mostradas a temperaturas inferiores,
puesto que, entre otras propiedades, se modifica su polaridad. Hay que tener en cuenta
que las altas temperaturas afectan a la constante dielctrica de los disolventes,
modificando su capacidad de elucin de distintos compuestos, de forma que a elevadas
temperaturas puede disminuir la constante dielctrica y por tanto aumentar el poder
elutrpico del disolvente, especialmente para los compuestos de menor polaridad.
El agua nuevamente presenta una recuperacin alta para el cido glico, sin
embargo no se detectan ms compuestos fenlicos en las extracciones realizadas con
este disolvente.
195
Los otros fluidos extractantes producen, en general, menores recuperaciones para

el cido glico y p-hidroxibenzoico que en las condiciones previamente ensayadas (a
40C), aunque se consiguen mejores recuperaciones para otros compuestos, tal como
ocurre con el cido ferlico y el sinpico (excepto en el caso del ter etlico).
Con metanol se consiguen las mejores recuperaciones, con una media del 101%,
de los compuestos de inters (>90% en todos los compuestos, excepto para el cido
glico) y es el disolvente que presenta un comportamiento ms uniforme. El etanol, en
cambio, tan slo permite la recuperacin cuantitativa para la esculetina, cido sinpico y
veratraldehdo, estando las dems recuperaciones por debajo del 90%.
En el caso del ter etlico, para la mayora de los compuestos presenta unas
recuperaciones bajas, oscilando entre el 46% del cido sinpico, y el 90% del
veratraldehdo, y con una media del 63%.
Por ltimo el acetato de etilo, con un 91% de media, presenta menores

recuperaciones para el cido glico y la esculetina. Podemos concluir que slo el
metanol y, para varios compuestos, el acetato de etilo, resultan eficientes en estas
condiciones de extraccin.
Los resultados obtenidos trabajando a 100C y 150 atmsferas se presentan en la

figura 22. Con estas condiciones de extraccin, el acetato de etilo y el metanol producen
recuperaciones medias cuantitativas (>90%) de todos los compuestos estudiados con la
excepcin del cido glico.
El acetato de etilo muestra un comportamiento extractante muy similar al que

presenta cuando se emplean como condiciones de extraccin 40C y 150 atmsferas, a
diferencia de lo que ocurre en el caso de que se emplee metanol como fluido
extractante, ya que, este ltimo extrae mayores cantidades de los compuestos fenlicos
en estudio cuando se incrementa la temperatura (llegando a duplicarse la recuperacin
del cido ferlico y a cuadruplicarse la del veratraldehdo).
En el caso del etanol la recuperacin media fue del 81%, estando slo el cido
glico por debajo del 50%, y los restantes compuestos ensayados cercanos o por encima
del 80%.
196
100C, 150 atm.

120
100 ac.glico
% recuperacin
80 ac.pOHbenz
esculetina
60
ac.ferlico
40 escopol.
ac.sinpico
20
veratrald.
0
disolvente
atmsferas de presin
El ter etlico volvi a mostrar un comportamiento no satisfactorio con tan slo un

49% de recuperacin media.
El agua extrae nicamente tres compuestos bajo estas condiciones, cido

glico, cido p-hidroxibenzoico y esculetina, sin embargo, slo el cido glico tiene una
recuperacin significativa, del orden del 35%.
Para poder optimizar las condiciones de extraccin cuando se acopla una fase
slida a la EFP, es necesario estudiar la influencia de la temperatura y la presin en las
recuperaciones de los compuestos fenlicos estudiados. Se puede pensar que un
incremento de la temperatura debe facilitar la recuperacin de los compuestos tanto
desde la muestras como desde la fase slida. Por el contrario un incremento de la
presin de trabajo, puede producir la aparicin de caminos preferenciales en la fase
slida en el momento de la despresurizacin y por tanto una elucin poco efectiva de los
compuestos retenidos.
197
Por ello, y con los datos mostrados anteriormente, se ha evaluado la influencia de

ambos parmetros de forma independiente.
Influencia de la temperatura: a continuacin se presentan las recuperaciones

medias de los compuestos estudiados empleando distintas temperaturas para una misma
presin de trabajo:
40 atm
100.0
40 C
100 C
50.0
0.0
agua etanol eter etlico acetato etilo metanol
Figura 23 Comparacin de las recuperaciones medias con los distintos disolventes a 40 y

100C con 40 atm. de presin
150 atm
100.0
40 C
100 C
50.0
0.0
agua etanol eter dietlico acetato etilo metanol
Figura 24 Comparacin de las recuperaciones medias a 40 y 100C con 150 atm. de presin
198
Como ya se ha comentado en la introduccin, la temperatura es la variable con

mayor influencia en los procesos de EFP cuando se trabaja con muestras reales. El
efecto de liberacin de enlaces entre los analitos y la matriz que producen las altas
temperaturas es crucial. Sin embargo en el caso de las extracciones aqu presentadas, los
compuestos se extraen a partir de un soporte inerte y, por tanto, el efecto de la
temperatura, si lo hubiera, debera ser otro. Concretamente hay que suponer que el
efecto sobre la constante dielctrica del disolvente puede afectar a la solubilizacin de
los compuestos en el mismo.
Podemos comprobar que el efecto de la temperatura a presin constante no est

muy claro (no existe una tendencia clara, en algunos disolventes aumenta y en otros
disminuye, aunque siempre de forma moderada), as en el caso del metanol, al aumentar
la temperatura, aumenta la recuperacin cuando trabajamos a 150 atmsferas de
presin; sin embargo, si se utilizan 40 atmsferas, la temperatura apenas influye en la
recuperacin, es posible que en este caso el motivo sea que se produce una total
recuperacin en ambos casos.
En el caso del ter etlico ocurre el efecto contrario, de forma que la recuperacin
es mayor cuanto menor es la temperatura utilizada cuando se emplean 40 atmsferas de
presin, y apenas influye cuando la presin usada es de 150 atmsferas. Esto es
probablemente debido a que es el nico disolvente de los ensayados que a 40C ya se
encuentra en estado gaseoso fuera de la cmara de extraccin.
Efecto de la presin: a continuacin se presentan las recuperaciones medias de

los compuestos estudiados empleando distintas presiones con la misma temperatura:
40 C
100.0
40 atm
150 atm
50.0
0.0
Figura 25 Comparacin de las recuperaciones medias a 40C con 40 y 150 atm. de presin
199
En aquellas extracciones llevadas a cabo a baja temperatura, cuanto menor es la

presin, mayor es la recuperacin para la mayora de los disolventes ensayados, excepto
para el caso del acetato de etilo, que muestra el comportamiento contrario. En el caso
del metanol, por ejemplo, si se comparan los resultados obtenidos a 40C, se comprueba
que se obtuvieron menores recuperaciones cuanto mayor es la presin, pasando de una
recuperacin media del 105% a 40 atmsferas, a una del 65% a 150 atmsferas.
100 C
100.0
40 atm
150 atm
50.0
0.0
Figura 26 Comparacin de las recuperaciones medias a 100C con 40 y 150 atm. de presin
Cuando se usan altas temperaturas, la presin muestra una influencia pequea en

las recuperaciones, as en el caso del etanol las recuperaciones medias pasan de un 88%
a un 81%, las del ter etlico de un 63% a un 49% o las de metanol de un 100,6% a un
93,2%.
Una vez que se ha estudiado el poder extractante de cinco disolventes distintos, y

la influencia de la temperatura y de la presin en la capacidad de recuperacin de
distintos compuestos fenlicos cuando la EFP se acopla con una fase slida, podramos
seleccionar, a la vista de los resultados, como mejores alternativas para la extraccin de
compuestos fenlicos en muestras reales (uvas), el empleo de agua y metanol
sucesivamente.
Con el agua se ha comprobado que apenas existen recuperaciones de los

compuestos fenlicos (excepto del cido glico, lo cual es debido a su polaridad), por
lo que podramos extraer en primer lugar con agua, para eliminar los compuestos ms
polares presentes en la matriz de la muestra slida, tales como azcares, lo que nos
200
permitira obtener el extracto posterior de los compuestos de inters. Tras la extraccin

con agua se empleara el metanol. Como ya se ha visto, con este disolvente se consiguen
recuperaciones cuantitativas de todos los compuestos fenlicos estudiados retenidos en
la fase slida. El metanol presenta adems la ventaja de que los extractos se pueden
concentrar fcilmente bajo corriente de N2 a temperatura ambiente (mtodo de
concentracin ms adecuado para los compuestos de este tipo). De esta forma se pueden
disminuir los lmites de deteccin y de cuantificacin del mtodo de anlisis.
Con esta propuesta, en principio, entre los compuestos ensayados el nico

problema lo va a presentar el cido glico, que se pierde parcialmente durante la
extraccin con agua, por ello, y ante la imposibilidad de la retencin de la totalidad de
este compuesto en la fase slida ensayada, se ensay una nueva fase slida, tambin del
tipo estireno-divinilbenceno, denominada comercialmente PPL (Bond Elut PPL, Varian,
California).
Se ensayaron las condiciones en las que la EFS no presentaba buenos resultados,

concretamente utilizando agua como disolvente (puesto que lo que nos interesa es
reducir las prdidas de los compuestos fenlicos ms polares) a 40 y a 100C, y con 40
atmsferas de presin.
Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:
% RECUPERACIN CON FASE SLIDA PPL
Compuesto 40C, 40 atm 100C, 40 atm

c. Glico (1) 88,3 77,2
p-OHbenzoico (2) 17,7 50,7
Esculetina (3) 4,3 7,6
c. Ferlico (4) 0,0 0,0
Escopoletina (5) 6,3 6,3
c. Sinpico (6) 6,2 6,0
Veratraldehdo (7) 0,0 0,0
Tabla 6 Porcentajes de recuperacin de los compuestos de referencia usando como fase slida la
PPL con distintas condiciones de extraccin
201
A continuacin se comparan las recuperaciones conseguidas con la fase slida

PPL, y con la LiChrolut EN, en las mismas condiciones de presin y temperatura
usando agua como fluido extractante:
Recuperacin en agua PPL vs. EN

a 40C
90
80
70
% recuperacin
60
PPL
50
EN
40
30
20
10
0
1 2 3 4 5 6 7
compuesto
Figura 27 Comparacin de la recuperacin en agua con PPL o EN a 40C
Recuperacin en agua PPL vs. EN

a 100C
120
100
% recuperacin
80
PPL
60 EN
40
20
0
1 2 3 4 5 6 7
compuesto
Figura 28 Comparacin de la recuperacin en agua con PPL o EN a 100C
202
As pues se comprob que el Bond Elut PPL, adems de permitir la

recuperacin/prdida del cido glico, conduce a la recuperacin, aunque en pequeos
porcentajes, de otros compuestos estudiados, por lo que no presentaba ventaja alguna
frente al LiChrolut EN.
Como conclusiones de este apartado cabe destacar:
El acoplamiento EFP-EFS es posible y permite la recuperacin cuantitativa

de todos los polifenoles ensayados salvo del cido glico.
Con el sistema acoplado EFP-EFS la presin pasa a tener un papel

importante en el sistema de EFP. Esto que puede en ocasiones ser un
inconveniente, al tener que ajustar otro parmetro experimental, se puede
usar para incrementar la selectividad de los mtodos de extraccin, que es
uno de los grandes retos de la EFP.
III.3.3 Diseo del mtodo EFP-EFS
Con todo lo visto hasta el momento, y teniendo como objetivo el diseo de un

mtodo acoplado de EFP-EFS que permita, en una primera etapa, la limpieza de la
muestra, y en una segunda, la elucin efectiva de los polifenoles, adems de una
extraccin adicional, se consideran como mejores condiciones de trabajo las siguientes:
a) primera etapa: limpieza/extraccin/retencin:
El nico disolvente que puede satisfacer los requerimientos de extraccin con la

menor prdida posible de compuestos fenlicos es el agua, puesto que con cualquier
otro, la prdida de compuestos es sustancialmente mayor.
De entre las condiciones de presin y temperatura evaluadas, las ms adecuadas

son: 40C y 150 atmsferas.
203
b) segunda etapa: extraccin/elucin:
El mejor disolvente es el metanol y las mejores condiciones 100C y 40

atmsferas. Si comparamos las recuperaciones obtenidas con metanol con las distintas
condiciones de extraccin ensayadas, las condiciones que conduciran a las mayores
recuperaciones de todos los compuestos fenlicos estudiados seran de 40C y 40
atmsferas.
Sin embargo seleccionamos como las ptimas las de 100C y 40 atmsferas

porque en la EFP cuanto mayor es la temperatura mejor es la extraccin a partir de
muestras slidas y hemos de considerar que lo que pretendemos es desarrollar un
mtodo para la extraccin de los compuestos fenlicos a partir de muestras slidas
(uvas, ..), de forma que aunque las recuperaciones de escopoletina y glico son algo
menores que a 40C, con los 100C la extraccin sobre muestras reales se ver ms
favorecida y adems se ha comprobado que en esas condiciones las recuperaciones de
todos los compuestos son superiores al 90%, salvo para el caso ya comentado del cido
glico.
As pues para el anlisis de compuestos fenlicos en muestras slidas (uvas)

mediante EFP-EFS, el mtodo consta de dos etapas y se desarrollara de la siguiente
forma:
- Primera etapa: proceso extraccin/retencin
Los compuestos fenlicos son extrados de la muestra y retenidos en la fase

slida. Los compuestos ms polares atraviesan la fase slida con el lquido
extractante, mientras que los compuestos menos polares quedan retenidos en ella.
Como lquido extractante se utiliza agua.
Se realiza una purga con nitrgeno para eliminar todo el lquido que quede de
esta primera etapa antes de llevar a cabo la segunda.
204
- Segunda etapa: proceso extraccin/lavado
Se extraen compuestos adicionales de la muestra. Simultneamente todos los

compuestos fenlicos retenidos en la fase slida son liberados por el lquido
extractante, en esta etapa metanol, recogindose sobre el vial de recoleccin.
De esta forma los compuestos fenlicos estarn en el segundo extracto, mientras

que los compuestos ms polares de la muestra no estarn en l, sino en el primer
extracto, incluyendo el cido glico. El esquema del proceso se muestra en la siguiente
figura:
1)H2O 2)N2 3) Metanol
muestra muestra muestra
Fase slida Fase slida Fase slida
arena arena arena
Primer Extracto Segundo Extracto

Compuestos Compuestos
ms polares menos polares
Figura 29 Representacin esquemtica del mtodo de extraccin desarrollado
205
III.3.4 Metodologa
Se realizan 2 extracciones consecutivas, primero con agua y despus con metanol,

de 3 ciclos de 10 minutos, a 40C y 150 atmsferas, y a 100C y 40 atmsferas
respectivamente, aumentando el tiempo de purga al mximo admitido por el equipo
(300 seg) para conseguir que el relleno quede lo ms seco posible.
Tanto al extracto obtenido con agua como al de metanol se le aade el patrn

interno, se filtran y se analizan por CLAE (apartado II.3.2.1)
La fase slida, una vez completados los dos ciclos de extraccin, debe lavarse para
poder volver a utilizarse, para ello se define un mtodo de lavado que consiste en 1 ciclo
de extraccin de 5 minutos con metanol, con 300 segundos de purga, para garantizar
que el relleno est limpio y seco para la siguiente extraccin. Los lavados con metanol
fueron analizados, no detectndose en ellos restos de los compuestos fenlicos.
A continuacin se presentan los cromatogramas obtenidos de los extractos, acuoso

y metanlico, resultantes de la aplicacin del mtodo desarrollado. Puede comprobarse
que en el extracto acuoso nicamente aparece el cido glico, apareciendo el resto de
los compuestos fenlicos ensayados en el extracto metanlico.
1 fraccin (acuosa)
750
Absorbancia (AUFS)
650
550
450
350
250
150 p.i.
50 1
-50
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)
Figura 30 Cromatograma a 280 nm del extracto acuoso de la disolucin de patrones

empleada. 1: cido glico, p.i. : patrn interno (2,5-dihidroxibenzaldehdo).
206
2 fraccin (metanlica)
750
650 5 7
Absorbancia (AUFS)
550
450
350
6
250
2 p.i. 3 4
150
1
50
-50
0 10 20 30 40 50 60
Tiem po (m in)
Figura 31 Cromatograma a 280 nm del extracto metanlico de la disolucin de patrones

empleada. 1: c. glico, 2: c. p-hidroxibenzoico, p.i.: patrn interno, 4: esculetina, 5: c.
ferlico, 6: escopoletina, 7: c. sinpico.
III.3.5 Caractersticas del mtodo
Se realizaron cuatro aplicaciones del mismo mtodo en das distintos y con

referencias diarias para la misma disolucin, y se determin el porcentaje de
recuperacin de cada compuesto estudiado respecto de la referencia, los resultados son
los siguientes:
Compuesto extracc.1 extracc.2 extracc.3 extracc.4 Media D.E.R.

c. glico 76,2 61,0 58,6 61,3 64,3 13,1
pOHbenzoico 96,3 99,3 98,7 101,9 99,1 2,2
Esculetina 98,4 93,0 100,6 104,0 99,0 4,4
c.ferlico 93,5 97,0 96,1 94,8 95,4 1,6
Escopoletina 91,6 92,6 93,4 94,8 93,1 1,4
c.sinpico 93,9 93,3 95,8 91,0 93,5 2,2
Veratraldehido 91,7 93,6 93,3 91,4 92,5 1,2
Tabla 7 Repetibilidad del mtodo: porcentajes de recuperacin y desviacin estndar (n=4).
207
Hay que destacar que la repetibilidad del mtodo de extraccin es muy buena. La
repetibilidad es una propiedad analtica que se ve muy afectada por los procesos de
extraccin dentro de los mtodos de anlisis. En este caso permanece en valores
inferiores al 5% de D.E.R. para todos los compuestos ensayados, salvo el cido glico.
III.3.6 Aplicacin a muestras reales (uvas liofilizadas)
III.3.6.1 Para la determinacin de compuestos fenlicos
Este mtodo se ha empleado sobre uvas de las variedades Viura (blanca) y

Tempranillo (tinta) para la determinacin de compuestos fenlicos.
La preparacin de muestras de uva se realiza tal como se indica en el apartado

II.5.2, obteniendo de esa forma uvas liofilizadas y separadas de las pepitas.
La preparacin de la cmara de extraccin se lleva a cabo segn el esquema

siguiente:
arena Fase
filtros
slida
Hay que destacar que el inters de no mezclar la fase slida con la arena o la
muestra reside en que tras cada extraccin y lavado de la misma puede volver a
utilizarse para otras extracciones.
208
A su vez se hacen extracciones similares (mismas condiciones, disolventes y

cantidad de muestra) pero empleando arena como soporte para comparar los resultados
con el acoplamiento de la EFP con una fase slida.
Tras filtrarlos por un filtro de nylon de 0,45 micras, se analizan en el equipo de

CLAE. Los cromatogramas de los extractos obtenidos por EFP-EFS se comparan con
los obtenidos mediante la EFP en las mismas condiciones y con la misma cantidad de
muestra pero usando arena como soporte de la misma, puede observarse como los
extractos acuosos obtenidos con la EFP presentan varios compuestos, en cambio los
obtenidos con la EFP-EFS apenas presentan seales.
En el caso de los extractos con metanol, con la EFP aparecen pocos compuestos y
con la EFP-EFS adems de aparecer todos los que aparecen en el extracto acuoso de la
EFP, aparecen en mayor nmero y con seales ms intensas.
a) b)
0.10 0.10
Abs or bancia (280 nm )
Abs orbancia (280 nm )
0.05 0.05
0.00 0.00
0 20 40 60 0 20 40 60
tiempo (min) tiem po (m in)
Figura 32 Cromatogramas de los extractos acuosos sobre arena (a) y sobre la fase slida (b) de la variedad
Napolen.
209
a) b)
0.10 0.10

0.05 0.05
0.00 0.00
0 20 40 60 0 20 40 60
tiem po (m in) tiempo (m in)
Figura 33 Cromatogramas de los extractos metanlicos sobre arena (a) y sobre la fase slida (b) de la
variedad Napolen
Como puede comprobarse, gracias al empleo de la fase slida en la EFP-EFS, los

compuestos de inters aparecen mayoritariamente en los extractos metanlicos, lo que
nos proporciona la ventaja de que dichos extractos pueden concentrarse permitiendo
disminuir los lmites de deteccin/cuantificacin.
Utilizando la biblioteca de espectros desarrollada por el grupo de investigacin, se

puede realizar la identificacin de algunos de los compuestos presentes en las uvas, as
se puede detectar la presencia de los tres esteres cinmicos mayoritarios en las uvas
durante la maduracin: caftrico, trans-cutrico y cis-cutrico, as como de catequina y
epicatequina.
Asimismo empleando las rectas de calibrado (tabla 8) de los cidos cinmicos

correspondientes a dichos steres (cidos cafeico y p-cumrico) y aplicando el
coeficiente de correccin molar, puesto que no hay patrones de los mismos disponibles
comercialmente, se puede cuantificar esos compuestos fenlicos en la uva de partida a
partir del anlisis por CLAE de los extractos metanlicos filtrados (tabla 9). Para la
determinacin de catequina y epicatequina se emplea la deteccin por fluorescencia,
puesto se necesita un mtodo de deteccin ms sensible que la espectroscopia UV-Vis
(seleccionndose, tras hacer el barrido de los espectros de ambos patrones, como
longitudes de onda de excitacin 280 nm y de emisin a 310 nm).
210
Tambin se puede detectar en los cromatogramas de dichas muestras la presencia

de galatos, epigalocatequingalato o epicatequingalato (sin ser posible su identificacin
completa), aunque por debajo de los lmites de cuantificacin.
Absorbancia (AUFS)
0,010
1
0,008
4
0,006
2 3
0,004
0,002
0,000
0 10 20 30 40 50 60
Tiem po (m in)
Figura 34 Cromatograma a 320 nm del extracto metanlico sobre la fase slida de la variedad
Viura. 1: cido caftrico, 2: cido cis-cutrico, 3: cido trans-cutrico, 4: compuesto tipo galato.
0,009
Absorbancia (AUFS)
1
0,007 4
0,005
3
0,003 2
0,001
-0,001
0 10 20 30 40 50 60
Tiem po (m in)
Figura 35 Cromatograma a 320 nm del extracto metanlico sobre la fase slida de la variedad
Tempranillo. 1: cido caftrico, 2: cido cis-cutrico, 3: cido trans-cutrico, 4: galato.
211
65
55 1
45
mV 35 2
25
15
3
5
-5
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)
Figura 36 Cromatograma de fluorescencia del extracto metanlico sobre la fase slida de la

variedad Viura. 1: catequina, 2: epicatequina, 3: trans-resveratrol.
Compuesto ordenada pendiente intervalo ppm LD LC

Trans-cutrico 4796,4 235008 0,115-1,15 0,051 0,170
Caftrico -9708,4 322515 0,103-1,03 0,037 0,125
Cis-cutrico 2497,1 242543 0,115-1,15 0,042 0,139
Catequina* -169026 1000000 0,548-5,48 0,183 0,609
Epicatequina* -271924 1000000 0,744-7,44 0,207 0,689
Tabla 8 Rectas de calibrado empleadas para cuantificar los steres cinmicos, as como la
catequina y epicatequina. *: deteccin por fluorescencia.
Compuesto Viura vendimia Tempranillo vendimia

Trans-cutrico 3,06 mg/kg uva 3.84 mg/kg uva
Caftrico 9,79 mg/kg uva 13,96 mg/kg uva
Cis-cutrico 3,08 mg/kg uva 3,38 mg/kg uva
Catequina 93,35 mg/kg uva 78,99 mg/kg uva
Epicatequina 111,45 mg/kg uva 45,64 mg/kg uva
Tabla 9 Cuantificacin de steres cinmicos, catequina y epicatequina en muestras de vendimia
212
Adems se determin la reproducibilidad del mtodo al realizar 4 extracciones de

la misma muestra de uva (concretamente de la muestra de Viura muestreada el 13-8-01)
en distintos das:
Compuesto Media D.E.R.

Trans-cutrico 3,65 mg/kg 11,13
Caftrico 9,99 mg/kg 9,67
Cis-cutrico 3,18 mg/kg 5,88
Catequina 173,62 mg/kg 10,26
Epicatequina 129,57 mg/kg 4,8
Tabla 10 Reproducibilidad de la EFP-EFS sobre muestras reales para polifenoles en general
Como puede comprobarse este mtodo aplicado sobre muestras reales tiene una
reproducibilidad aceptable, con un mximo de desviacin estndar relativa de un 11%
para el caso del trans-cutrico.
Asimismo, se realizaron reextracciones de las muestras tras llevarse a cabo la

segunda etapa (elucin con metanol) del mtodo. Se emplearon para ello las mismas
condiciones que en dicha etapa. No se detectaron compuestos fenlicos en los re-
extractos.
As pues, con el acoplamiento, en lnea, de la EFP con la EFS, se consiguen

extracciones satisfactorias de compuestos fenlicos a partir de uvas. La etapa de
limpieza en lnea se puede aplicar automticamente y el mtodo de extraccin se
desarrolla completamente bajo atmsfera inerte. Adems este acoplamiento conduce a
una menor manipulacin de las muestras, y por tanto, a menores probabilidades de
degradacin de los compuestos extrados.
213
III.3.6.2 Seguimiento de la maduracin de uvas
El estudio de maduracin de la uva tiene un inters claro, como es el

conocimiento de la evolucin de compuestos de inters y la determinacin de la fecha
ptima de vendimia, siendo varios los parmetros que interesa controlar durante el
seguimiento de la maduracin de la uva, entre los que destacan los compuestos
fenlicos por su implicacin en fenmenos de configuracin del color, inestabilidad
oxidativa, etc..., teniendo especial inters los steres cinmicos, as como la catequina y
epicatequina.23
As, la determinacin de la catequina, epicatequina y de los steres cinmicos

trans y cis-cutrico y caftrico, son de especial importancia en el caso de la vinificacin
de vinos blancos, puesto que al hidrolizarse durante el proceso de elaboracin del vino,
liberan los correspondientes cidos cinmicos que son especialmente susceptibles a la
oxidacin.
Se realizan extracciones de las distintas muestras tomadas durante el periodo de

control de la maduracin de las variedades de uva antes mencionadas, con el mtodo
desarrollado en el apartado III.3.4.
Los resultados obtenidos son los presentados en la figura 37.
Hay que destacar la ausencia de compuestos en los extractos obtenidos con EFP-
EFS con agua, salvo una mnima cantidad (muestras 6/8 y 21/8).
214
t-cutrico de Viura
6,00
mg/kg uva fresca 4,00

EFP-EFS agua
EFP-EFS metanol
2,00
0,00
23-jl 30-jl 06-ago 13-ago 21-ago
das de seguim iento
caftrico de Viura
15,00
mg/kg uva fresca
10,00
EFP-EFS agua
EFP-EFS metanol
5,00
0,00
das de seguim iento
c-cutrico de Viura
12,00
mg/kg uva fresca
8,00
EFP-EFS agua
EFP-EFS metanol
4,00
0,00
das de seguim iento
Figura 37 Esteres extrados en la variedad blanca Viura durante la maduracin.
215
Para seguir la evolucin de estos steres durante la maduracin se considerarn los

extractos metanlicos sobre la fase slida, puesto que a partir de ellos se determinar su
concentracin en la uva de partida de forma ms fiable que los equivalentes extractos
acuosos sobre arena (en los que aparecen los steres de inters) donde la presencia de
otras sustancias en el extracto impide su cuantificacin fiable.
Esteres de Viura durante la maduracin

16,00
mg/kg uva fresca
12,00
t-cutrico
8,00 caftrico
c-cutrico
4,00
0,00
23-jul 30-jul 06-ago 13-ago 20-ago
dias de seguim iento
Figura 38 Evolucin de los steres de la variedad Viura durante la maduracin.
La evolucin de los steres durante la maduracin (con condiciones de elevada

insolacin, altas temperaturas, baja humedad, y precipitaciones prcticamente nulas) es
similar para los tres, se produce la disminucin de su concentracin, probablemente
debido a la hidrlisis de los mismos.
Para la vinificacin de esta variedad sera interesante que la concentracin de estos

compuestos fuera la mnima posible puesto que despus pueden provocar problemas de
pardeamiento en los vinos acabados, por lo que en principio la fecha de vendimia es
concorde con esta idea, ya que prcticamente se estabiliza su evolucin en esa fecha.
La fecha de vendimia se decidi al considerar otros parmetros bsicos, tales

como el Baum, el peso medio de la baya, la acidez total, el pH y el cido tartrico.
216
La evolucin de estos parmetros ha sido la siguiente:
Parmetros clsicos de control para la fijacin

de la fecha de vendimia (Viura)
12
8 peso
pH
Tartrico
4
0
23-jul 28-jul 02-ago 07-ago 12-ago 17-ago
das de seguim iento

de la fecha de vendimia (Viura)
16
12
Baum
A.T.
8
4
23-jul 02-ago 12-ago
das de seguim iento
Figura 39 Evolucin de los prametros clsicos de control para la fijacin de la fecha

ptima de vendimia de la variedad Viura
Respecto a la variedad tinta Tempranillo, los resultados fueron los siguientes:
217
t-cutrico de Tempranillo
8,00
mg/kg uva fresca

6,00
EFP-EFS agua
4,00
EFP-EFS metanol
2,00
0,00
25-jl 01-ago 08-ago 14-ago 20-ago
das de seguim iento
caftrico de Tempranillo
25,00
20,00
mg/kg uva fresca
15,00 EFP-EFS agua
10,00 EFP-EFS metanol
5,00
0,00
das de seguim iento
c-cutrico de Tempranillo
5,00
4,00
mg/kg uva fresca
3,00 EFP-EFS agua
1,00
0,00
das de seguim iento
Figura 40 Esteres extrados en la variedad tinta Tempranillo durante la maduracin.
218
Esteres de Tempranillo durante la

maduracin
25,00
15,00 t-cutrico
10,00 caftrico
c-cutrico
5,00
0,00
25-jul 04-ago 14-ago 24-ago
das de seguim iento
Figura 41 Evolucin de los steres de la variedad Tempranillo durante la maduracin.
Respecto al seguimiento de la maduracin y a la fijacin de la fecha ptima de

vendimia, podemos ver la evolucin de los tres steres con la maduracin en la figura
anterior.
La evolucin de los otros parmetros considerados para la fijacin de la fecha de

vendimia fue la siguiente:

de la fecha de vendimia (Tempranillo)
9
8
7
6 peso
5
pH
4
3 Tartrico
2
1
0
das de seguim iento
219

de la fecha de vendimia (Tempranillo)
16
12
Baum
8
A.T.
0
das de seguim iento
Figura 42 Evolucin de los parmetros clsicos de control para la fijacin de la fecha

ptima de vendimia para la variedad Tempranillo
Como puede comprobarse la fecha de vendimia suele coincidir con la mnima

concentracin de los mencionados steres, por lo que, la evolucin de stos debera ser
controlada a la hora de fijar la fecha de vendimia, puesto que la relacin entre esteres y
parmetros de rutina no tiene porque ser repetitiva.
En la figura 43 se presentan los resultados obtenidos con las catequinas
a)
catequina de Viura
300,00
mg/kg uva fresca
200,00
EFP-EFS agua
EFP-EFS metanol
100,00
0,00
das de seguim iento
220
b)
epicatequina de Viura
200,00
EFP-EFS agua
EFP-EFS metanol
100,00
0,00
das de seguim iento
Figura 43 Cantidades extradas de catequina (a) y epicatequina (b) de la variedad blanca

Viura durante la maduracin.
La evolucin de ambos compuestos es prcticamente idntica, producindose una

disminucin de su concentracin al final de la maduracin. En este caso, al no haberse
muestreado en sobremaduracin no puede determinarse si la disminucin sera an
mayor.
Seguimiento de catequina y epicatequina

durante la maduracin (Viura)
300
mg/kg uva fresca
250
200 cat
150
epi
100
50
0
23-jul 30-jul 06-ago 13-ago 20-ago
dias de seguimiento
Figura 44 Evolucin de las catequinas de la variedad Viura durante la maduracin.
221
En el caso de la variedad Tempranillo los resultados obtenidos se representan en

las grficas mostradas en las figura 45.
a)
catequina de Tempranillo
250,00
200,00
mg/kg uva fresca
150,00
EFP-EFS agua
50,00
0,00
25-jl 1-ag 8-ag 14-ag 20-ag
das de seguim iento
b)
epicatequina de Tempranillo
200,00
mg/kg uva fresca
150,00
EFP-EFS agua
100,00
EFP-EFS metanol
50,00
0,00
25-jl 1-ag 8-ag 14-ag 20-ag
das de seguim iento
Figura 45 Cantidades extradas de catequina (a) y epicatequina (b) de la variedad Tempranillo

durante la maduracin.
En este caso se observa claramente que las mayores concentraciones de catequina

y epicatequina se consiguen en los extractos con metanol de EFP-EFS, no extrayndose
ninguno de los dos compuestos con el agua.
222
Seguimiento de catequina y epicatequina

durante la maduracin (Tempranillo)
250
mg/kg uva fresca
200
150 cat
100 epi
50
0
25-jul 04-ago 14-ago 24-ago
das de seguimiento
Figura 46 Evolucin de las catequinas de la variedad Tempranillo durante la maduracin.
Respecto al seguimiento de la maduracin de esta variedad tinta, presenta una

evolucin similar a la de la variedad Viura, aunque en este caso existen mayores
diferencias en cuanto a concentracin de catequina y epicatequina. La evolucin de
estos compuestos al final de la maduracin sigue siendo la disminucin de su
concentracin.
Se ha comprobado, pues, que la EFP-EFS es un mtodo aplicable a la

determinacin de compuestos fenlicos a lo largo del periodo de maduracin de uvas,
siendo capaz de cuantificar los compuestos identificados a pesar de los cambios fsicos,
qumicos y bioqumicos que experimenta la baya durante su desarrollo. La informacin
que aporta este mtodo puede ser de utilidad tanto en la evaluacin que distintas labores
de manejo de la via pueden tener en la composicin de las uvas, como en permitir una
planificacin previa del equipamiento a utilizar en la vinificacin de estas uvas en
funcin de su composicin.
III.3.6.3 Aplicacin a la determinacin de trans-resveratrol24
Este compuesto se cuantifica fcilmente en vinos y otras bebidas utilizando CLAE

mediante inyeccin directa,25 acoplndose en algunos casos a la espectrometra de
masas,26 o mediante electroforesis capilar.27 Sin embargo para llevar a cabo su anlisis
en matrices slidas de alimentos, se hace necesario una etapa previa de extraccin.
223
Generalmente se ha utilizado la ESL (maceracin de las muestras slidas) para su

extraccin,2 aunque en algunos casos tambin se ha empleado la EFS28,29 sobre los
extractos obtenidos mediante la ESL o la EFS directamente del mosto.28 Sin embargo,
puesto que estos mtodos de maceracin generalmente implican largos periodos de
tiempo para la extraccin, suponen un incremento de la probabilidad de que se
produzcan degradaciones.30 Otra alternativa tambin empleada en el anlisis de este
compuesto es la EFS.
Estas condiciones de extraccin son especialmente problemticas en el caso del

trans-resveratrol, puesto que es un compuesto fotosensible y fcilmente oxidable. Por
ello, los procesos de extraccin deben desarrollarse de forma especialmente cuidadosa,
protegiendo las muestras del aire y de la luz.
La EFP supone una buena alternativa a los mtodos clsicos de extraccin, puesto
que evita los procesos de oxidacin o fotodegradacin, siendo por tanto, un mtodo
particularmente recomendable para extraer compuestos que reaccionan fcilmente con
el oxgeno31 y son fotosensibles, como es el trans-resveratrol.
9 Estudio de la estabilidad del trans-resveratrol
En primer lugar, como ya se ha mencionado al inicio de este apartado, hay que

estudiar la estabilidad de este compuesto cuando se somete a la accin de las altas
temperaturas que se emplean en la EFP, especialmente si se tiene en cuenta que se han
publicado trabajos donde se indica la degradacin de este compuesto durante los
procesos de extraccin.18
Se realiz este estudio de forma similar al descrito en el apartado III.1.2 (3 ciclos

de 10 minutos con metanol a 50,100 y 150C, con 40 atm. de presin), empleando para
ello una disolucin de patrn de trans-resveratrol de 27,5 ppm (dicha disolucin se
almacena en un recipiente que la preserva de la accin de la luz y se guarda en el
frigorfico hasta que no se lleva a cabo la extraccin).
Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla:
Temp. Extracc. (C) 50 100 150

% recup. D.E.R. 104,2 4,5 106,6 4,3 99,5 5,7
Tabla 11 Porcentajes de recuperacin de trans-resveratrol +/- desviacin estndar relativa a
las temperaturas ensayadas.
224
Se comprueba pues que la atmsfera inerte empleada en la EFP, as como la

ausencia de luz durante la extraccin, permiten que el trans-resveratrol no se degrade
durante la extraccin y se recupere completamente incluso a 150C (99,5%).
Por otro lado hemos de considerar que, dados los niveles de concentracin de este
compuesto en las muestras slidas (uvas), se hace necesario el uso de algn mtodo de
deteccin que sea ms sensible que la deteccin por espectroscopia UV-Vis, por lo que
se utiliza un detector de fluorescencia.
Se registraron los espectros de fluorescencia de emisin y excitacin del patrn de

trans-resveratrol para determinar los mximos que presenta el mismo y fijar las
condiciones ptimas de deteccin del compuesto en el detector de fluorescencia.
A continuacin se presentan las espectros obtenidos, como puede verse los

mximos de excitacin y emisin son de 310 y 403 nm respectivamente, de forma que
se fijan esas longitudes de onda en el detector de fluorescencia.
100
90
80
70
60
310 nm emisin
mV
50
403 nm
40 excitacin
30
20
10
0
200 400 600 800
longitud de onda (nm)
Figura 47 Espectros de excitacin y emisin del trans-resveratrol
Con las columnas habitualmente empleadas en cromatografa de lquidos es

frecuente que los tiempos de retencin sean demasiado elevados para este compuesto.
De hecho, cuando se aplica el procedimiento cromatogrfico empleado para el anlisis
de los compuestos fenlicos (usando el mismo gradiente de elucin pero con deteccin
por fluorescencia), el trans-resveratrol se eluye en torno a los 55 minutos (vase figura
36)
225
Las columnas de tipo monoltico permiten separaciones ms rpidas y se han

empleado en la determinacin de distintos compuestos fenlicos en vinos, entre ellos el
trans-resveratrol. 32
As pues, se plante la posibilidad de emplear una columna cromatogrfica sobre

un soporte monoltico. De esta forma, al permitir utilizar flujos ms elevados, se
pretende conseguir una elucin mucho ms rpida del trans-resveratrol en comparacin
con otros mtodos encontrados en la bibliografa, donde Domnguez y col.16 consiguen
la elucin de este compuesto alrededor de los 50 minutos, o a los 30 minutos segn
Castellari y col.19
Se realizaron varios ensayos empleando porcentajes del disolvente A (0,1% cido

actico en agua) entre 90-60% en modo isocrtico. Como muestra se emple un extracto
de uva Tempranillo extrado segn la metodologa propuesta de EFP-EFS. La mejor
separacin del pico correspondiente al trans-resveratrol se obtiene con las condiciones
de 70% de disolvente A y 30% del B (0,1% cido actico en metanol).
Adems, se evalu el efecto que la temperatura (10, 25 y 40C por triplicado) a la

que se encuentra la columna durante la separacin puede tener en la resolucin y
anchura de pico del trans-resveratrol:
Parmetro 10C 25C 40C

Ancho de pico promedio n.d 0,18 0,24
Resolucin promedio n.d. 1,30 0,83
Tabla 12 Efecto de la temperatura (10, 25 y 40C) en la elucin (ancho de pico y

resolucin) del trans-resveratrol (n=3).
n.d.: no disponible, picos no resueltos.
En funcin de estos resultados, se selecciona como condiciones ptimas para la

elucin: 25C de temperatura, en modo isocrtico de 30% en disolvente B-70%
disolvente A, con un flujo de 5 ml/min. De esta forma conseguimos la elucin del trans-
resveratrol en 2,0 minutos (vase figura 48).
226
Asimismo se evalu la repetibilidad del mtodo cromatogrfico resultante, con

una desviacin estndar relativa (n=6) de 1,04% en cuanto al tiempo, y de 1,94% en
cuanto al rea.
900
700
500 trans -resveratrol

mV
300
100
-100 0 1 2 3 4 5
tiempo (min)
Figura 48 Cromatograma de Fluorescencia del extracto metanlico de la variedad Tempranillo.
Para evaluar la repetibilidad del mtodo completo se realizaron 6 anlisis

completos de una muestra real (Viura), en distintos das, obtenindose los siguientes
resultados expresados en mg/kg uva:
Compuesto Extr.1 Extr. 2 Extr. 3 Extr. 4 Extr. 5 Extr. 6 media Desv. Est. D.E.R.
resveratrol 2,09 2,23 2,33 2,14 2,06 2,25 2,18 0,1 4,75
Tabla 13 Repetibilidad de la EFP-EFS de trans-resveratrol
Como puede comprobarse la desviacin estndar relativa que presenta la EFP-

EFS en muestras reales, para el caso del trans-resveratrol, tambin es inferior al 5%, por
lo que el mtodo desarrollado se puede considerar de una repetibilidad aceptable para el
anlisis del resveratrol.
227
Para cuantificar el trans-resveratrol se hacen curvas de calibrado analizando en el

equipo de CLAE disoluciones patrn del mismo a distintas concentraciones y
representando el rea del pico correspondiente frente a la concentracin, obteniendo las
siguientes rectas de calibrado:
Deteccin Ord. origen pendiente coef regresin intervalo (ppm) LD LC

280 nm -4261,5 158621 1,0000 0,11-2,75 0,010 0,032
320 nm -4060,1 135372 1,0000 0,11-2,75 0,017 0,058
fluoresc. -188091 42113985 0,9998 0,11-2,75 0,003 0,004
Tabla 14 Rectas de calibrado de trans-resveratrol
Como puede comprobarse con los valores de las pendientes de las rectas de
calibrado, la sensibilidad del mtodo empleando deteccin por fluorescencia es 250
veces mayor que la obtenida usando deteccin UV.
En el caso de variedad de uva tinta Tempranillo, se han encontrado niveles, en las

muestras tomadas el da de la vendimia, de 3,11 mg/kg de peso de uva entera seca
(preparada tal como se indica en el apartado II.5.2).
De la misma forma pueden determinarse los mg/kg de trans-resveratrol en la

variedad de vinificacin Viura el da de vendimia, y en la variedad tinta de uva de
mesa denominada Napolen.
Compuesto Viura vendimia Napolen (uva mesa)

Trans-resveratrol 2,18 mg/kg uva 0,11 mg/kg uva
Tabla 15 Cuantificacin de trans-resveratrol en distintas variedades de uva
Asimismo podra realizarse el seguimiento de este compuesto durante la

maduracin de esas dos variedades de vinificacin.
En el caso de la variedad Viura, puede apreciarse como, durante la maduracin, el

trans-resveratrol va aumentando, aunque se aprecia una disminucin en su
concentracin el da de vendimia. Hay que tener en cuenta que se est analizando el
resveratrol en la uva entera y su concentracin se puede ver afectada por dos efectos que
pueden ser contrapuestos, como son la variacin en el peso de la baya y la radiacin
solar.
228
Trans-resveratrol de Viura
2,00 EFP-EFS agua

EFP-EFS metanol
1,00
0,00
das de seguim iento
Figura 49 Cantidades extradas de trans-resveratrol de la variedad blanca Viura durante

la maduracin.
En el caso de la variedad Tempranillo:
Trans-resveratrol de Tempranillo
3,00
mg/kg uva fresca
2,00 EFP-EFS agua

EFP-EFS metanol
1,00
0,00
das de seguim iento
Figura 50 Cantidades extradas de trans-resveratrol de la variedad tinta Tempranillo

durante la maduracin.
Se puede apreciar como en esta variedad el trans-resveratrol se mantiene

aproximadamente constante durante la maduracin salvo en la ltima semana donde se
aprecia un aumento.
229
En definitiva con el mtodo desarrollado, el tiempo requerido para la extraccin se

reduce a unos 40 minutos (una reduccin considerable si se compara con los mtodos
tradicionales de maceracin de muestras slidas). Adems permite cuantificar este
compuesto en uvas completas, y no nicamente en hollejos (que es donde suele
determinarse habitualmente).
Presenta adems ventajas concretas respecto a la EFP sin EFS, como es una
mayor limpieza de la muestra y, por tanto, menor nmero de interferencias.
Asimismo el mtodo cromatogrfico desarrollado posibilita determinar este

compuesto de una forma extremadamente rpida (en torno a los 2 minutos), y el mtodo
de deteccin por fluorescencia desarrollado, permite incrementar la sensibilidad del
anlisis 250 veces si se compara con la deteccin por espectroscopia UV-Vis.
En conjunto, el mtodo completo permite determinar el contenido de trans-

resveratrol, en unos 45 minutos y con una desviacin estndar relativa inferior al 5%, en
uvas maduras y a lo largo del periodo de maduracin.
230
III.4 APLICACIN DE LA EFS EN UVAS Y VINOS
III.4.1 APLICACIN DE LA EFS PARA LA DETERMINACIN DE

GLUCSIDOS EN UVAS DURANTE LA MADURACIN
En este apartado se pretende determinar los compuestos glucosilados presentes en

uvas a lo largo del periodo de maduracin de 15 variedades durante dos aos (2002 y
2003), mediante el mtodo de la glucosa glucosdica total (GGT).
Con esto lo que se pretende es evaluar la capacidad del mtodo para el anlisis de
muestras de uva cultivadas en climas clidos, donde la concentracin de azcar presente
en la baya ser superior que las encontradas en uvas cultivadas en zonas ms
meridionales, tales como las de la zona en la que se desarroll el mtodo de la GGT.
Para ello se seguir el protocolo desarrollado por B. Zoecklein para la

determinacin de la GGT en mostos, con la variacin de que en nuestro caso en vez de
analizar el mosto obtenido, se analiza el mosto obtenido tras realizar la resuspensin de
las muestras de uva liofilizadas.
Todos los ensayos correspondientes a este apartado se realizaron en el

laboratorio del grupo de investigacin Enology Grape Chemistry Group, ubicado en
el edificio de Food Science & Technology, perteneciente a la Virginia Polytechnic
Institute & State University, localizada en Blacksburg, Virginia, EEUU.
231
Aplicacin EFS a la determinacin de glucsidos en uvas durante la maduracin
III.4.1.1 Introduccin
Los metabolitos secundarios sintetizados en la uva son fuentes primordiales del

aroma, sabor y color del vino. Los compuestos aromticos estn presentes en forma de
voltiles libres y, en parte, como precursores no voltiles unidos a azcares
(glicsidos).33
Se han identificado cuatro grupos de glicsidos en uvas: beta-D-glucopiransidos,

6-O-(alfa-L-ramnopiranosil)-beta-D-glucopiransidos, 6-O-(alfa-L-arabinofuranosil)-
beta-D-glucopiransidos, y 6-O-(beta-D-apiofuranosil)-beta-D-glucopiransidos.34,35
Los tipos de agliconas son ms complejos y se han identificado varios compuestos

relacionados biogenticamente: monoterpenoles y monoterpendioles, alcoholes, cidos,
compuestos fenlicos y C13-norisoprenoides.
Debido a su papel potencial en las caractersticas del aroma del vino, su

cuantificacin puede ser til para los enlogos y viticultores para ayudar a determinar,
por ejemplo, el grado ptimo de madurez de las uvas o la necesidad de uso de distintos
procedimientos durante la vinificacin para potenciar la mximo su contribucin a las
caractersticas organolpticas del vino a obtener.
El mtodo de GGT (glucosa glucosdica total) se ha empleado para examinar los

efectos que distintas prcticas de cultivo tienen en la calidad de la uva;36,37 y el efecto
que las distintas tcnicas de procesado empleadas en la elaboracin de vinos tienen en
los niveles de glicsidos encontrados.38,39 Sin embargo, hasta el momento no se ha
caracterizado la evolucin de los compuestos glicosilados durante la maduracin.
III.4.1.2 Preparacin de las muestras (mostos)
Las uvas muestreadas se liofilizan (vase apartado II.5.1) para facilitar su

conservacin, se trata de evitar evitando de este modo los procesos de degradacin que
suelen sufrir durante su almacenamiento, aunque ste se realice a baja temperatura.
Posteriormente se rehidratan con agua bidestilada, llevndose a un volumen fijo.
Finalmente se filtran por filtro de nylon de 0,45 micras antes de proceder a su anlisis.
232
III.4.1.3 Determinacin de la glucosa glucosdica total (GGT)
Estos ensayos se realizan, una vez obtenida la muestra de mosto tal como se
indica en el apartado anterior, siguiendo el protocolo de anlisis habitualmente
empleado por el grupo del Dr. B. Zoecklein, que a su vez est basado en el mtodo
desarrollado por Abbott y col.40 El mtodo seguido aparece descrito en el apartado
II.3.3.
Considerando el peso de muestra analizado, y el porcentaje de liofilizacin de la

misma, los resultados obtenidos son los presentados en la tabla 16
GGT 2002 (mg/g uva fresca)

1 2 3 4 5 6 7 8
Chardonnay 0,121 0,162 0,129 0,163 0,147*
Mosc.Alej. 0,206 0,177 0,140 0,131 0,186 0,173 0,177*
Sauv.Blanc 0,118 0,100 0,104 0,156 0,166 0,143*
Viura 0,201 0,163 0,163 0,123 0,149 0,141 0,111 0,128*
Garrido 0,138 0,128 0,158 0,115 0,149 0,182 0,103 0,172*
Pno.testigo 0,120 0,098 0,152 0,096 0,104 0,156 0,203 0,210
Traminer 0,226 0,214 0,237 0,226*
Mosc.Front. 0,207 0,265 0,195 0,246 0,268 0,293 0,202 0,290*
Pno.riego 0,113 0,107 0,139 0,092 0,126 0,107 0,105 0,199*
Vijiriega 0,186 0,109 0,103 0,115 0,147 0,123 0,162 0,139*
Cab.Sauv. 0,244 0,204 0,338 0,569 0,572 0,510 0,553*
Tempranillo 0,198 0,252 0,239 0,256 0,422 0,455 0,544*
Syrah 0,230 0,262 0,295 0,350 0,403 0,465 0,498*
Pno.negro 0,303 0,286 0,420 0,372*
Tint.Rota 0,190 0,256 0,421 0,308 0,384 0,596 0,641*
Graciano 0,180 0,248 0,368 0,423 0,621 0,507 0,673 0,659*
Tabla 16 Concentracin de glucosa glucosdica total (mg/g uva fresca) a lo largo del periodo de
maduracin del ao 2002. *: muestra de vendimia.
Durante el segundo ao de muestreo, ao 2003, se produjo una ola de calor que

aceler la maduracin de prcticamente todas las variedades estudiadas, entre 1 y 3
semanas. De forma, que en este ao el nmero de muestras se redujo en comparacin
con el ao anterior. En el caso de la variedad Moscatel de Frontignan, la uva se
pasific muy rpidamente, permitiendo tomar solamente un muestra, por lo que
optamos por no incluir esta variedad en el estudio del ao 2003 (tabla 17).
233
GGT 2003 (mg/g uva fresca)

1 2 3 4 5 6
Chardonnay 0,138 0,138 0,131 0,141 0,215*
Mosc.Alej. 0,118 0,122 0,137 0,191 0,185 0,189*
Sauv.Blanc 0,098 0,100 0,147 0,18*
Viura 0,078 0,123 0,143 0,183 0,253*
Garrido 0,108 0,081 0,117 0,154 0,160 0,129*
Pno.testigo 0,083 0,094 0,115 0,176 0,200*
Traminer 0,199 0,236 0,204 0,272*
Pno.riego 0,100 0,086 0,137 0,157 0,109*
Vijiriega 0,167 0,078 0,122 0,159 0,117 0,136*
Cab.Sauv. 0,373 0,354 0,457 0,396 0,265*
Tempranillo 0,238 0,313 0,279 0,349 0,312*
Syrah 0,242 0,310 0,365 0,373 0,513*
Pno.negro 0,414 0,237 0,428 0,433*
Tint.Rota 0,210 0,339 0,400 0,426 0,522 0,595*
Graciano 0,208 0,312 0,402 0,508 0,714*
Tabla 17 Concentracin de glucosa glucosdica total (mg/g uva fresca) a lo largo del periodo de
maduracin del ao 2003. *: muestra de vendimia.
Con el fin de caracterizar los comportamientos de las distintas variedades

estudiadas y con vistas a agilizar la interpretacin de los datos obtenidos, se recurre al
anlisis de agrupaciones. Adems, para que realmente se tenga en cuenta la evolucin
en puntos similares de maduracin, se ordenan los datos segn el nmero de das que
resten hasta la fecha de vendimia, de forma que para cada variedad se tiene en cuenta su
nivel especfico de madurez.
Con todo esto, si estudiamos como se agruparan las distintas variedades de uva
estudiadas en funcin de la evolucin de la GGT durante la maduracin, a lo largo de
los muestreos realizados en el ao 2002, se obtiene el siguiente dendograma de la figura
51.
234
Diagrama de rbol para los 15 casos de la variable GGT 2002
GARRIDO
VIURA
PNO.
A PNO.RIEG
VIJIRIEG
CHARDONN
SAUV.BLA
MOSCATEL
B TRAMINER
GRACIANO
CAB.SAUV
PNO.NEGR
C TEMPRANI
SYRAH
T.ROTA
0 1 2 3 4 5 6 7 8
distancia de unin
Figura 51 Dendograma representando la agrupacin de las 15 variedades en funcin de la

evolucin de la variable GGT a lo largo de la maduracin del ao 2002.
Puede observarse como se aprecia una separacin clara entre variedades blancas
y tintas en el ao 2002, diferencindose tres grupos: uno formado por las variedades
Moscatel de Alejandra y Traminer (las variedades ms aromticas), otro formado por el
resto de las variedades blancas, y el ltimo constituido por las variedades tintas.
Las distancias de unin de las variedades tintas son mayores que las de los otros
grupos, por lo que se aprecia un comportamiento ms heterogneo entre ellas.
La evolucin de la GGT en cada en esos tres grupos es la obtenida al representar

los promedios de la GGT existente en cada uno de los grupos diferenciados en funcin
del da de muestreo, tal como se aprecia en la figura 52.
235
Evolucin de GGT en variedades aromticas

B
0,25
0,2
mg/g uva fresca
0,15
0,1
0,05
0
-35 das -28 das -21 das -14 das -7das vendimia
das de seguim iento vs vendim ia
Evolucin de GGT en resto variedades blancas

A
0,25
0,2
mg/g uva fresca
0,15
0,1
0,05
0
Evolucin de GGT/2 en variedades tintas

C
0,25
0,2
mg/g uva fresca
0,15
0,1
0,05
0
Figura 52 Evolucin promedio de GGT para cada uno de los grupos
236
Se puede comprobar que la justificacin de los agrupamientos observados en el

diagrama de rbol se encuentra en las distintas evoluciones de la GGT en los tres grupos
formados. En las variedades blancas se aprecia un leve descenso de la GGT al inicio del
periodo, para luego aumentar de forma paulatina a lo largo de la maduracin y llega a
estabilizarse antes de vendimia. En el caso de las variedades ms aromticas (Moscatel
y Traminer) el contenido en GGT es en torno a un 20% superior al del resto de las
variedades blancas, y se aprecia un aumento mucho ms acusado de la GGT a partir de
la mitad del periodo muestreado, para luego estabilizarse antes de vendimia. En el caso
de las tintas, se aprecia un aumento continuo en la concentracin de GGT a lo largo de
la maduracin, llegndose a duplicar, triplicar, o incluso cuadruplicar, los niveles de
compuestos glucosilados respecto a las variedades blancas. Se trata, por tanto, de tres
comportamientos claramente diferenciados.
Si se realiza el anlisis discriminante lineal (ADL) para la variable GGT a lo largo

del periodo de maduracin 2002 (figura 53), y se representan la clasificacin de las
variedades en funcin de las variables cannicas obtenidas, se comprueba que se forman
tres grupos, que corroboran la agrupacin observada en la figura 51, es decir, un grupo
formado por las dos variedades ms aromticas (en rosa), otro por el resto de variedades
blancas (en naranja) y el formado por las variedades tintas (en rojo).
ADL variable GGT 2002

variable cannica 2
Moscatel
Palomino negro
Traminer
Tempranillo
Vijiriega Garrido Syrah
Sauvignon Blanc
variable cannica 1
Viura
Palomino
Tintilla de Rota
Chardonnay
Graciano
Palomino riego
Cabernet Sauvignon
Figura 53 Clasificacin de las variedades estudiadas en funcin de las variables cannicas resultantes
del ADL de la evolucin de la GGT en el ao 2002.
237
En el ao 2003 (figura 54), en cambio, la influencia de la ola de calor provoca

modificaciones considerables en el comportamiento de las distintas variedades (en
mayor o menor medida), y, aunque, an as, el comportamiento de las variedades
blancas es distinto del de las tintas, tambin se comprueba como el comportamiento
particular de las variedades ms aromticas no se repite como en el ao anterior.
Diagrama de rbol para los 15 casos de la variable GGT 2003
MOSC.ALE
CHARDONN
VIURA
PNO.
SAUV. BL
PNO. RI
VIJIRIEG
GARRIDO
TRAMINER
PNO. NEG
GRACIANO
T.ROTA
TEMPRANI
SYRAH
CAB. SAU
0 1 2 3 4 5 6
distancia de unin
Figura 54 Dendograma representando la agrupacin de las 15 variedades en funcin de la

evolucin de la variable GGT a lo largo de la maduracin del ao 2003.
Este mismo comportamiento se comprueba al realizar el ADL (figura 55) de la

evolucin de la variable GGT a lo largo del periodo de maduracin del 2003. As, se
aprecia que la variedad Moscatel ha desplazado su posicin en el dendograma de la
figura 54 respecto al ao 2002 (figura 51), incluyndose dentro del grupo de variedades
blancas.
238
ADL variable GGT 2003
variable cannica 2
Syrah
Vijiriega
Graciano Moscatel
Tintilla de Rota Tempranillo Viura
Garrido Pno riego
Palomino Sauvignon
Chardonnay Blanc
Cabernet Sauvignon
Palomino Negro
Traminer
variable cannica 1
Figura 55 Clasificacin de las variedades estudiadas en funcin de las variables cannicas

resultantes del ADL de la evolucin de la GGT en el ao 2003.
La determinacin de las GGT conlleva un elevado consumo de tiempo (mximo

10 muestras, por triplicado, al da por persona) que requiere, adems, de algunos
aparatos no habituales en los laboratorios de las bodegas, por ello se intent realizar una
estimacin de los valores de GGT a partir de otros datos resultantes de anlisis ms
cortos y habitualmente realizados durante la maduracin.
Puesto que se dispone de la evolucin de los distintos parmetros de rutina

empleados habitualmente en maduracin: B, acidez total, cido tartrico, pH, peso
medio de baya y residuo seco (vase anexo II) se podra comprobar, en primer lugar,
como se agruparan todos los parmetros (clsicos y la GGT) en funcin de su
evolucin a lo largo de maduracin en las distintas variedades estudiadas, para despus
intentar determinar algn tipo de correlacin.
La agrupacin de los parmetros habitualmente analizados en maduracin y de la

GGT a lo largo del periodo de maduracin del ao 2002 se muestra en la figura 56.
239
Diagrama de rbol para las 42 variables 2002
B_VEND
RES_VEND
B__7
RES__7
B__14
RES__14
B__21
RES__21
B__28
RES__28
B__35
RES__35
GGT__28
GGT__35
GGT__7
GGT_VEND
GGT__21
GGT__14
A_T__VEN
A_T___28
PH__28
TART__28
A_T___7
A_T___14
A_T___21
PH__21
A_T___35
PH__35
TART__35
TART_VEN
TART__7
TART__14
TART__21
PH_VEND
PH__7
PH__14
PESO_VEN
PESO__14
PESO__28
PESO__7
PESO__35
PESO__21
0 1 2 3 4 5 6 7 8
distancia de unin
Figura 56 Dendograma representando la agrupacin de todas las variables estudiadas: grado

Baum (B), acidez total (A.T), [H+] (PH), cido tartrico (TART), peso medio de baya (PESO),
residuo seco (RES) y GGT, a lo largo de la maduracin en todas las variedades ensayadas en 2002.
Como se puede apreciar, la GGT presenta un comportamiento distinto del resto

de los parmetros estudiados, apareciendo todos sus datos agrupados, aunque similar en
cierto modo al del residuo seco y del Baum. Asimismo se aprecia cierta similitud,
lgica, entre el comportamiento de la acidez total y el cido tartrico, y la [H+]. El peso
medio conforma el tercer grupo que se distingue.
Si se representa el contenido promedio (de todas las variedades) de cada uno de

los parmetros que constituyen los tres grupos diferenciados en el anterior dendograma
(como indican las llaves situadas en el lado izquierdo de la figura 56) a lo largo de los
das de muestreo (vendimia, 7 das antes, 14 das antes, 21 das antes, 28 das antes y 35
das antes) del ao 2002, se obtienen las siguientes figuras:
240
Evolucin de B, residuo seco y GGT ao 2002
20,00
15,00
B
resid.seco
10,00
GGT*50
5,00
0,00
das de seguim iento
Figura 57 Evolucin del contenido promedio de B, residuo seco y GGT en maduracin ao 2002.
Evolucin de acidez total, cido tartrico y [H+] ao 2002
15,00
10,00 Acidez Total

Ac. Tartrico
[H+]*15000
5,00
0,00
das de seguim iento
Figura 58 Evolucin del promedio de acidez total, cido tartrico y [H+] en maduracin ao 2002.
Evolucin de peso medio de baya ao 2002
2,00
peso medio
1,00
0,00
das de seguim iento
Figura 59 Evolucin del contenido promedio del peso medio de baya la maduracin ao 2002.
241
En estas grficas se pone de manifiesto la tendencia ascendente a lo largo de la

maduracin del B, residuo seco y GGT (aunque ligeramente distinta a la de los dos
parmetros anteriores), y la descendente de acidez total, cido tartrico y [H+]. El peso,
por su parte, presenta una tendencia, aunque tambin ascendente, ms heterognea que
los anteriores parmetros. De esta forma se justifican los tres grupos diferenciados en la
figura 56.
Asimismo se realiza el anlisis de conglomerados para todas las variables,

clsicas y GGT, en las 15 variedades ensayadas, y se comprueba que en este caso no se
aprecia la misma separacin que en la figura 60.
Diagrama de rbol para los 15 casos 2002
GARRIDO
VIURA
MOSC.ALE
VIJIRIEG
PNO.
TEMPRANI
PNO.RIEG
CHARDONN
SAUV.BLA
TRAMINER
SYRAH
PNO.NEGR
GRACIANO
CAB.SAUV
T.ROTA
2 4 6 8 10 12 14 16
distancia de unin
Figura 60 Dendograma representando la agrupacin de todos los casos estudiados, variedades de

uva, con todas las variables, a lo largo de la maduracin en el ao 2002.
242
El hecho de que GGT, B y residuo seco presenten la misma tendencia a lo largo

de la maduracin, indica un cierto grado de correlacin en los comportamientos de las
GGT y otros parmetros, pero queda por establecer si habr o no algn tipo de regresin
que los relacione.
Por tanto vista la correlacin que parece existir entre B, residuo seco y GGT, se
podra plantear el desarrollo de un mtodo para estimar la GGT a partir de los otros dos
parmetros mencionados.
Para ello se aplica la tcnica de regresin por mnimos cuadrados parciales (PLS).
A fin de aprovechar al mximo todos los datos disponibles, se emplean todas las
variables de rutina analizadas en la regresin por PLS (teniendo como variable objetivo
la GGT y como variables dependientes los datos de los parmetros de rutina), figuras
61-63.
40
% de varianza explicada
30
20
10
0
CP1 CP2 CP3 CP4
Figura 61 Representacin de las varianzas explicadas por las componentes principales del
ACP desarrollado previamente al PLS.
En el estudio de componentes principales previo al PLS (Figura 61) se puede

apreciar como la varianza explicada por cada componente principal es menor que la
explicada por el componente anterior, lo que confirma la bondad de la agrupacin en las
componentes principales seleccionadas por el programa. La primera componente
principal contribuye con el 38% de la varianza total.
243
Con la representacin de la componente principal CP1 frente CP2 (figura 62),

podemos comprobar que tanto el Residuo Seco (loading = 0.901) como el Baum
(loading = 0,372) contribuyen a la misma componente principal (CP1) y con el mismo
signo, esto es, presentan un comportamiento similar al igual que se haba concluido tras
el anlisis de agrupaciones. Por lo que respecta al resto de parmetros de rutina, la
Acidez Total es la principal variable con importancia en la otra componente principal
(loading = 0.904) al igual que la concentracin de cido tartrico (loading = 0,375),
mientras que el resto de parmetros presenta poca contribucin a las dos componentes
principales.
CP2
1
AT
0,8
0,6
0,4
TH2
0,2
Res.Seco
[H+]
0
-0,2 Peso 0pH 0,2 0,4 0,6 0,8 1
B
-0,2
CP1
Figura 62 Representacin de la componente principal CP1 frente a la CP2.
Por ltimo, y por lo que respecta al resultado de la regresin en s, el resultado del

coeficiente de regresin es de 0,734, pero al representar los valores medidos frente a los
predichos con el modelo elaborado por el programa, (figura 63), se obtiene una
pendiente de 0,539, esto es, los resultados predichos de GGT segn el modelo elaborado
empleando las variables de rutina, se quedan muy alejados de los valores reales.
Con todo esto se puede concluir que no es posible establecer una regresin entre
el comportamiento de la variable objetivo GGT y el de los parmetros de rutina
analizados en maduracin.
244
Correlacin:
0,7341
Pendiente:
0,5390
Figura 63 Ajuste de los valores medidos frente a los predichos por el modelo de ACP.
Como ya se ha mencionado anteriormente, en el ao 2003 se produjo una ola de

calor durante el periodo de maduracin, que afect en mayor o menor medida a la
maduracin de las distintas variedades estudiadas.
Si se observan ahora las agrupaciones formadas cuando se evalan todas las

variables en el ao 2003 (figura 64), puede comprobarse como la influencia de esta ola
de calor se traduce en menores distancias de unin entre las variables analizadas, y,
aunque la GGT sigue presentando un comportamiento similar al B y residuo seco, las
condiciones climticas influyen de tal modo que las agrupaciones formadas no son tan
claramente distintas como en el 2002.
Cuando se representa el dendograma de los 15 casos (variedades) con todas las

variables en el ao 2003 (figura 65), se comprueba que tampoco se reproducen los
grupos formados en el ao anterior.
245
Diagrama de rbol para las 35 variables 2003
B_VEND
B__7
RES__7
RES__21
GGT__21
GGT__7
GGT__14
GGT_VEND
B__14
B__21
RES__14
RES_VEND
B__28
RES__28
TART__28
GGT__28
A_T__VEN
A_T___14
PH__14
A_T___7
PH__7
PH_VEND
A_T___21
PH__21
TART__14
TART__21
A_T___28
PH__28
PESO__28
TART_VEN
TART__7
PESO_VEN
PESO__7
PESO__14
PESO__21
0 1 2 3 4 5 6 7
distancia de unin
Figura 64 Dendograma representando la agrupacin de todas las variables estudiadas: grado

Baum (B), acidez total (A.T), [H+] (PH), cido tartrico (TART), peso medio de baya (PESO),
residuo seco (RES) y GGT, a lo largo de la maduracin en todas las variedades ensayadas en 2003.
Diagrama de rbol para los 15 casos 2003
MOSC.ALE
PNO.
PNO.RIEG
TEMPRANI
TRAMINER
GARRIDO
VIURA
PNO.NEGR
VIJIRIEG
CHARDONN
SAUV.BLA
GRACIANO
T.ROTA
SYRAH
CAB.SAUV
0 2 4 6 8 10 12
distancia de unin
Figura 65 Dendograma representando la agrupacin de todos los casos estudiados, variedades de

uva, con todas las variables, a lo largo de la maduracin en el ao 2003.
246
Por tanto, puede comprobarse como las condiciones climticas existentes durante
el periodo de maduracin son realmente determinantes en la composicin de la uva y,
particularmente, en los niveles de GGT.
III.4.2 APLICACIN DE LA EFS A LA DETERMINACIN DE TERPENOS Y

OTROS COMPUESTOS VOLTILES EN VINOS.
En esta parte del trabajo se desarrollar un mtodo de EFS/CG para la

determinacin de compuestos terpnicos y otros voltiles relacionados con la
componente aromtica de distintos vinos.
Para ello se optimizarn las distintas variables que pueden afectar a la

recuperacin de los terpenos en la etapa de EFS.
El mtodo desarrollado se aplicar sobre distintos tipos de vinos: comerciales y

jvenes monovarietales proporcionados por la estacin experimental CIFA Rancho de
la Merced (Jerez de la Frontera) y obtenidos empleando distintas variedades de uva y
procedimientos de elaboracin.
III.4.2.1 Introduccin
La variedad de uva influye considerablemente en el aroma final del vino

resultante, especialmente en vino jvenes. Existen diferentes compuestos voltiles
presentes como tales en uvas, o como compuestos derivados de aquellos relacionados
con el aroma del vino. Como se ha comentado en la introduccin de esta memoria, se
sabe que los compuestos terpnicos son responsables del aroma de Moscatel y estn
relacionados con el aroma de otras variedades de uva aromticas, como la
Gewrtztraminer.41
247
Aplicacin de la EFS a la determinacin de terpenos y otros voltiles en vinos
En concreto, los terpenoles se consideran un conjunto de compuestos que

permiten, en buena parte, caracterizar la tipicidad de un vino en funcin de la variedad
de origen. De hecho, junto con las pirazinas, constituyen las dos familias qumicas a las
que pertenecen las sustancias voltiles ligadas a la tipicidad aromtica de la cepa.
En la uva y el vino existe una gran variedad de compuestos terpnicos

identificados, en su mayor parte se trata de monoterpenos y sus derivados (entre los que
se incluyen los alcoholes y aldehdos correspondientes).42
Los umbrales de percepcin de estos compuestos son especialmente bajos y esto

hace que, a pesar de sus bajas concentraciones, sean, en muchos casos, componentes
activos del aroma del vino.43
La tcnica de separacin usualmente empleada para el anlisis de los compuestos

relacionados con el aroma del vino es la cromatografa gaseosa (CG). Sin embargo,
generalmente requiere una etapa de extraccin/concentracin previa, como
consecuencia de las bajas concentraciones en que se encuentran estos compuestos en los
vinos. Una de las alternativas es el uso de la EFS.
Recientemente Lpez y col.44 analizan compuestos voltiles traza y minoritarios

con CG-EM tras la EFS sobre un copolmero de poliestireno-divinilbenceno. Asimismo
se ha realizado un amplio estudio sobre la habilidad de distintas fases slidas para
retener compuestos aromticos a partir de vinos, pero no se evaluaron las fases de
estireno-divinilbenceno.
III.4.2.2 Determinacin de terpenos mediante EFS y CG45
El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un mtodo de EFS-CG para la

determinacin cuantitativa de compuestos terpnicos en muestras de vino. Para ello se
estudiar qu tipo de adsorbente (entre distintas fases slidas basadas en C18 y en
poliestireno-divinilbenceno), y qu eluyente, proporcionan mejores resultados para la
retencin y elucin selectiva de dichos compuestos en muestras de vinos.
248
III.4.2.2.1 Seleccin de la fase slida y eluyentes
Para el desarrollo del mtodo se emplea una mezcla de los siguientes patrones de
compuestos terpnicos: Linalol, Gamma-Terpineno, Terpineol, Geraniol, Nerol, (+)-
Limoneno, D-Citronelol, y Alfa-Terpineno. Estos patrones se disuelven en una matriz
vnica formada por una disolucin agua-EtOH (12% v/v), con 4 g/L de cido tartrico
(cido mayoritario en el vino) y con un pH = 3,20. Como patrn interno se utiliza el 2-
Octanol.
Se estudiaron dos clases de fases slidas, en forma de 6 tipos distintos de

cartuchos de EFS comerciales, 3 de ellos basados en una fase slida de octadecilslice
(C18) y los otros 3 constituidos por polmeros de estireno-divinilbenceno.
Las caractersticas de los cartuchos empleados se muestran en la siguiente tabla:
Fase Slida C-18 Estireno-Divinilbenceno

Nombre Bond Discovery Strata Chromabond LiChrolut Strata
Comercial Elut-C18 DSC-18 C-18E EASY EN SDB-L
Fabricante Varian Supelco Phenomenex Macherey-Nagel Merck Phenomenex
Cantidad de 500 500 500 500 200, 500 200, 500
fase slida (mg)
Volumen (ml) 3 3 3 6 3, 6 3, 6
Tabla 18 Caractersticas de los cartuchos de EFS empleados.
Para el desarrollo del mtodo (seleccin adsorbente y eluyente) los cartuchos se

acondicionan, antes de cada uso, con 4 ml de diclorometano, 4 ml de MeOH y 4 ml de
Agua-EtOH (12%), tal como proponen Lpez y col.35 A continuacin se prepara la
disolucin que se pasar por cada uno de stos. Para ello, se aaden 100 microlitros de
la disolucin mezcla de los 8 patrones en diclorometano (esta disolucin se prepar de
forma que cada uno de los compuestos tuviera una concentracin adecuada para
proporcionar una seal apreciable en el cromatograma, unas 15 ppm), en 50 ml de la
matriz vnica anteriormente mencionada. Con esto lo que se pretende es que la retencin
de los analitos se produzca a partir de una matriz que presenta caractersticas similares
(en cuanto a grado alcohlico, pH y contenido en azcares) a los vinos a analizar.
249
Una vez que se han pasado los 50 ml de la disolucin anterior, se aaden 10 ml de

agua para conseguir eliminar los restos de azcares que pudiese presentar el vino a
analizar, puesto que estos restos reduciran la vida til de la columna del CG. Tras el
lavado con agua, se deja que los cartuchos se sequen durante 10 minutos, bajo vaco. De
esta forma se asegura que no pase agua al interior del CG. A continuacin se eluyen los
analitos con 2 ml del eluyente estudiado (n-pentano, metanol, diclorometano o etanol), y
se vuelven a recoger los 2 ml siguientes para asegurarse de que algunos de ellos no
siguen quedando retenidos en la fase slida. Los extractos obtenidos se inyectan con un
automuestreador en el equipo de CG (con el mtodo cromatogrfico indicado en el
apartado II.3.2.4).
Las dos fracciones de 2 ml de cada eluyente se analizan por CG, las

recuperaciones medias obtenidas de los 8 compuestos analizados, con los 6 adsorbentes
estudiados, se presentan en la siguiente tabla, y se calculan a partir de dos referencias
preparadas diariamente (100 microlitos de disolucin patrn en un volumen final de 2
ml de cada eluyente).
Basada en C-18 Basada en Estireno-Divinilbenceno

Fase Slida Bond Elut Discovery Strata Chromabond LiChrolut Strata
C-18 DSC-18 C-18E EASY EN SDB-L
n-Pentano 40,4 (16,6) 29,1 (0,7) 23,7 (5,8) 22,0 (3,3) 29,4 (7,5) 56,4 (12,6)
Metanol 67,0 (3,4) 70,9 (2,4) 95,5 (5,3) 38,7 (15,5) 74,9 (11,9) 76,7 (8,3)
Diclorometano 84,5 (0,2) 91,1 (0,6) 85,4 (0,1) 72,8 (3,2) 104,0 (2,5) 101,2 (0,1)
Etanol 86,0 (0,7) 73,0 (0,8) 85,4 (0,5) 43,2 (11,4) 63,4 (13,2) 72,5 (1,4)
Tabla 19 Recuperaciones medias (n=2) totales de terpenos usando distintas fases slidas y
disolventes. Extractos 2 + 2ml (2 fraccin entre parntesis).
Si observamos las recuperaciones conseguidas en funcin de los eluyentes

empleados, puede comprobarse que es el n-pentano el que conduce a recuperaciones
ms pobres, oscilando entre el 22% y el 56,4%. Con los otros tres disolventes, en
cambio, se aprecian mayores recuperaciones, siendo, en casi todos los casos, superiores
al 60%. El EtOH y el MeOH presentan comportamientos muy similares en la elucin de
los analitos a partir de las distintas fases slidas.
El diclorometano es, con diferencia, el que consigue, en todos los casos, las
mayores recuperaciones. De hecho, salvo el caso puntual del adsorbente Chromabond
EASY (que por otro lado es la fase slida que conduce a menores recuperaciones con
todos los disolventes empleados), sus recuperaciones son superiores al 84%. Adems
250
con este disolvente se consigue eluir totalmente todos los analitos cuando se utilizan dos
adsorbentes basados en poliestireno-divinilbenceno, concretamente LiChrolut EN y
Strata SDB-L.
En cuanto a los distintos adsorbentes empleados, podemos observar que entre los
basados en C-18, el nico que proporciona recuperaciones superiores al 95% de los
compuestos ensayados, usando MeOH como disolvente extractante, es el Strata C-18E.
Tambin se obtienen buenos resultados (recuperaciones mayores del 80%), usando
diclorometano o etanol, con Strata C-18E, Bond Elut C-18 y Discovery DSC-18.
De los basados en poliestireno-divinilbenceno, el que muestra peor

comportamiento en la retencin-elucin de los analitos es el Chromabond EASY. Los
otros dos adsorbentes empleados (LiChrolut EN, Strata SDB-L) proporcionan
recuperaciones cuantitativas cuando se eluyen los compuestos con diclorometano.
Teniendo en cuenta todo lo anterior, para la EFS de los compuestos terpnicos, se

selecciona como eluyente el diclorometano, pues el que conduce a mayores
recuperaciones de todos los compuestos ensayados con todas las fases slidas utilizadas.
Como adsorbentes se emplearan el Strata SDB-L o el LiChrolut EN, puesto que

con ambos se consiguen recuperaciones cuantitativas con diclorometano (tabla 20).
Viendo estos resultados de forma individual, se observa que se consiguen
recuperaciones superiores al 95% para cada compuesto con el LiChrolut EN, por
consiguiente seleccionamos esta fase slida como el adsorbente a emplear.
Por lo tanto, en la EFS de los compuestos terpnicos, se utilizar como adsorbente

el LiChrolut EN y como eluyente el diclorometano.
Compuesto SDB-L LiChrolut EN

-terpineno (%) 92,76 98,19
(+)-limoneno (%) 89,21 92,36
-terpineno (%) 88,70 92,00
linalol (%) 101,77 101,62
terpineol (%) 102,78 102,42
D-citronelol (%) 103,76 104,17
nerol (%) 106,59 103,11
geraniol (%) 91,70 99,28
Tabla 20 Recuperaciones (n=2) obtenidas para los compuestos terpnicos estudiados
empleando cartuchos de SDB-L y LiChrolut EN, y diclorometano como disolvente
para la elucin.
251
III.4.2.2.2 Optimizacin de las variables de extraccin
Se estudiaron 5 variables de extraccin que pueden influir considerablemente en

el proceso de extraccin: volumen de agua de lavado, tiempo de secado, volumen de
disolvente extractante, nivel de vaco aplicado en el sistema de extraccin y cantidad de
fase slida en el cartucho de extraccin. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
El empleo de una etapa de lavado con agua puede resultar interesante al permitir
eliminar los compuestos ms polares, como azcares, compuestos fenlicos y
compuestos glucosilados. Sin embargo, es necesario evaluar, en primer lugar, si el
volumen de agua que se emplear para lavar los cartuchos, afectar o no a la capacidad
de la fase slida para retener los compuestos terpnicos. Para ello se realizaron ensayos
en los que los cartuchos se lavaban con 0, 5 y 10 ml de agua. Puede comprobarse que en
todos los casos las recuperaciones medias totales son cuantitativas (vase tabla 21), por
lo tanto el volumen de agua empleado no afecta a la elucin posterior de los terpenos.
Este comportamiento presenta la interesante ventaja de que, en funcin del contenido en
azcares de la muestra a analizar, se pueda lavar con distintos volmenes de agua para
asegurarse el lavado completo, sin que ello afecte a la recuperacin de los compuestos
de inters.
Volumen de Agua (ml) 0 5 10

Recuperacin media (%) 100,9 1,5 99,0 2,3 100,1 4,1
Tabla 21 Porcentaje de recuperacin media, de todos los compuestos estudiados, con

cartuchos LiChrolut EN, empleando distintos volmenes de agua en el lavado.
Puesto que se realiza el lavado con agua, hemos de asegurarnos que no queden
restos de agua que puedan introducirse en el cromatgrafo de gases. Para ello se hace
necesaria una etapa de secado. Se realizaron ensayos en los que se dejaba secar el
cartucho, bajo un vaco fijado, durante 10, 20 y 30 minutos. A la vista de los resultados
(tabla 22), podemos observar que la duracin del tiempo de secado no afecta de manera
notable a la recuperacin de los analitos, y que con 10 minutos se asegura un secado
adecuado del adsorbente y se reduce el riesgo de introducir agua en la CG, adems de
acortar la duracin del mtodo de extraccin.
252
Tiempo de secado (min) 10 20 30

Tabla 22 Porcentajes de recuperacin media, de todos los compuestos estudiados, con
distintos tiempos de secado para eliminar restos de agua.
Para optimizar el volumen de diclorometano a emplear, se realizaron ensayos en

los que se recogan 4 fracciones de 1 ml sucesivamente, sin secado entre ellas. Tras su
anlisis por CG, puede comprobarse que ya con el primer ml se obtienen recuperaciones
superiores al 85% para todos los compuestos (tabla 23), consiguindose en la siguiente
fraccin los porcentajes restantes, de forma que con 2 ml nos aseguramos que se
recuperan cuantitativamente todos los compuestos en estudio.
Compuesto 1 fraccin 2 fraccin 3 fraccin 4 fraccin

-terpineno (%) 102,7 4,4 1,1 0,6
(+)-limoneno (%) 96,3 4,1 n.d. n.d.
-terpineno (%) 96,0 3,3 n.d. n.d.
linalol (%) 100,2 1,4 n.d. n.d.
terpineol (%) 101,6 1,4 n.d. n.d.
D-citronelol (%) 99,8 0,9 n.d. n.d.
nerol (%) 104,9 1,2 n.d. n.d.
geraniol (%) 118,9 n.d. n.d. n.d.
n.d. = no detectado.
Tabla 23 Porcentajes de recuperacin en las 4 fracciones consecutivas de 1ml de

diclorometano eludas a partir de cartuchos LiChrolut EN.
Despus de determinar el volumen de extraccin, es necesario comprobar tambin

si el vaco ejercido durante la etapa de elucin influye de forma significativa sobre las
recuperaciones de los compuestos de inters. Para ello se realizan ensayos donde se
ejerce un vaco de -0,33, -0,50, -0,67 atmsferas (tabla 24). Pudo comprobarse que las
recuperaciones de los analitos no se ven afectadas por el nivel de vaco aplicado. Puesto
que el vaco ejercido no afecta a la elucin completa de los analitos, pero si a la
duracin de la extraccin (cuanto mayor es el vaco ejercido ms se acelera el proceso),
optamos por emplear el mayor vaco permitido por el dispositivo (-0,67 atm).
253
Vaco aplicado (atm) -0,33 -0,50 -0,67

Tabla 24 Porcentajes de recuperacin media, de todos los compuestos estudiados, con
distinto nivel de vaco aplicado.
Finalmente, se estudiaron dos cantidades de fase slida en el cartucho de

extraccin: 200 y 500 mg. Las recuperaciones obtenidas para los compuestos terpnicos
individuales se muestran en la siguiente tabla:
Compuesto Recuperacin media (%) Recuperacin media (%)

LiChrolut EN 200 mg LiChrolut EN 500 mg
-terpineno 101,14 91,23
(+)-limoneno 100,67 98,52
-terpineno 94,43 102,14
linalol 107,32 86,93
terpineol 99,64 78,73
D-citronelol 105,41 80,87
nerol 109,39 79,74
geraniol 103,59 76,20
Tabla 25 Recuperaciones medias de los terpenos ensayados obtenidas con cartuchos de
LiChrolut EN de 200 y 500 mg.
A la vista de los resultados puede comprobarse que se encuentran recuperaciones

ligeramente superiores en los cartuchos de 200 mg. Probablemente para obtener los
mismos niveles usando 500 mg de relleno, sera necesario un mayor volumen de
disolvente, lo que a su vez producira una dilucin de los analitos y por ello se decide
emplear los cartuchos de 200 mg.
Teniendo en cuenta todo lo anterior, el mtodo optimizado sera el siguiente:
254
1. Acondicionamiento: 4 ml diclorometano, 4 ml MeOH, y 4 ml Agua-EtOH

(12% v/v).
2. Etapa de retencin: 50 ml de muestra en cartuchos de LiChrolut EN (200

mg).
3. Etapa de lavado y secado: 10 ml de agua, 10 minutos bajo -0,67 atm.
4. Etapa de elucin: 2 ml de diclorometano.
III.4.2.2.3 Propiedades analticas del mtodo
Las propiedades analticas del mtodo desarrollado se presentan en la siguiente

tabla:
Interv. Conc. L.D. L.C. % Repetibilidad Reproducibilidad

Compuesto (g l-1) r2 (g l-1) (g l-1) Recuperacin (d.e.r.) n=5 (d.e.r.) n=5
-terpineno 4-501,7 0,9998 1,13 3,73 99,93 4,87 7,66

(+)-limoneno 4-500,7 0,9996 2,10 7,00 97,01 5,86 5,20
-terpineno 4-499,7 0,9998 2,13 7,13 96,78 4,41 7,98
linalol 5,3-678,3 1,0000 0,43 1,40 97,87 4,92 5,58
terpineol 5,7-728,0 0,9999 0,40 1,27 96,76 6,54 6,27
D-citronelol 7,0-863,7 0,9992 3,37 11,17 100,83 2,61 5,97
nerol 6,7-846,3 0,9990 0,73 2,47 97,08 6,31 5,97
geraniol 8,0-665,7 0,9994 0,33 1,07 97,59 6,20 6,63
Tabla 26 Propiedades analticas del mtodo optimizado.
Se emple el paquete estadstico Alamin46 para determinar los lmites de

deteccin (L.D.) y de cuantificacin (L.C.). Los L.C. resultantes son menores que los
niveles de estos compuestos habitualmente encontrados en vinos jvenes. Asimismo se
puede comprobar como el mtodo optimizado presenta una buena repetibilidad y
reproducibilidad.
255
III.4.2.2.4 Aplicacin a muestras reales (vinos)
Se analizaron 12 vinos comerciales usando el mtodo desarrollado. El anlisis por

CG se realiz tal como se indica en el apartado II.3.2.4. Los cromatogramas obtenidos
son similares al presentado en la figura 66.
Como puede comprobarse se identificaron adems otros compuestos presentes en

el extracto, concretamente algunos esteres y alcoholes.
g 2
e
a c i
d
1
f h
b k
34 j
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
tiempo (min)
Figura 66 Cromatograma tpico de un vino Moscatel: (1) linalol, (2) terpineol, (3) citronelol, (4) nerol.
(a) acetato de hexilo, (b) acetato de isoamilo, (c) isoamlico, (d) lactato de etilo, (e) 1-hexanol,
(f) trans-hexen-1-ol, (g) octanoato de etilo, (h) isovaleriato de etilo, (i) succinato de dietilo, (j) alcohol
benclico.
Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 27. Se utiliz el tiempo de

retencin y la deteccin por espectrometra de masas para identificar los compuestos
terpnicos en las muestras. Se recogieron dos fracciones de 2 mL de diclorometano de
cada una de las muestras, y en ninguna de las segundas fracciones se detectaron
compuestos terpnicos.
256
Adems, se realizaron reextracciones de los 50 ml de muestra eluda para

determinar si la fase slida era capaz de retener todos los terpenos de las muestras. No
se detectaron ninguno de estos compuestos en los reextractos.
Los mayores niveles de compuestos terpnicos se encontraron en vinos elaborados

a partir de la variedad de uva Moscatel (en color azul), principalmente debido a los
elevados niveles de terpineol que, en algunos vinos, representa ms del 50% de los
terpenos totales. El linalol y el terpineol son los compuestos presentes en todos los vinos
analizados, mientras que el nerol est presente en 11 muestras.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Castillo n.d. n.d. n.d. 21,4 15,5 n.d. 30,4 n.d. 67,3 23
Irachea
Original n.d. n.d. n.d. 15,6 107,0 28,47 n.d. n.d. 151,0 70,8
Muscatb
Marques de 13,6 n.d. n.d. 4,9 6 n.d. 29,2 n.d. 53,7 11,2
Riscalc
Via n.d. n.d. n.d. 102,9 146,1 22,8 25,8 n.d. 297,7 49,1
Esmeraldab
Gran n.d. n.d. n.d. 26,8 102,2 22,5 31,9 77,11 260,5 39,2
Feudob
Via n.d. n.d. n.d. 14,7 60,3 20,1 16,7 38,05 149,9 40,2
Mireiab
Cresta 8,8 n.d. n.d. 6,6 9,0 19,1 27,8 n.d. 71,3 12,6
Reald
Moscatel n.d. n.d. n.d. 59,5 115,4 22,2 15,8 n.d. 212,8 54,2
Doradob
Tokaji tr n.d. n.d. 15,5 16,6 18,4 34,1 n.d. 93,3 17,8
Furminte
Castillo 8,9 n.d. n.d. 9,0 13,7 17,1 23,0 64,15 135,9 10,1
Aguarnf
Castillo de n.d. n.d. n.d. 87,1 75,0 27,4 18,5 n.d. 208,1 36
Liriab
Ribera del 4,5 n.d. n.d. 5,6 7,0 18,0 85,1 n.d. 120,1 5,8
Puertog
Variedades de uva: a: Chardonnay, b: Moscatel, c: Sauvignon Blanc, d: Verdejo, e: Furmint, f: Garnacha,

g
: Palomino-Macabeo.
n.d.: no detectado. tr: trazas, por debajo del L.C.
Tabla 27 Concentraciones (g/L) de compuestos terpnicos en vinos: 1: -terpineno, 2:

Limoneno, 3: -terpineno, 4: Linalol, 5: Terpineol, 6: Citronelol, 7: Nerol, 8: Geraniol, 9: Total, 10:
% de terpineol.
257
Compuesto 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Isobutanol + + + + + + + + + + + +
Acetato + + + + + + + - + + - +
isoamilo
3-Metil-1- + + + + + + + + + + + +
butanol
Hexanoato de + + + + + + + + + + + +
etilo
Lactato de etilo + + + + + + + + + + + +
1-hexanol + + + + + + + + + + + +
3-hexenol + + + + - + - - + - + +
Octanoato de + + + + + + + + + + + +
etilo
Succinato de + + + + + + + + + + + +
dietilo
cido - + + + - + + - - + - +
hexanoico
Alcohol + + + + + + + + + + + +
fenetlico
Malato de + + + + + + + + + + + -
dietilo
cido + + + + + + + - + + - +
octanoico
cido + + + + - + + - + + - -
decanoico
Succinato de + + + + + + + - + + + +
etilo
Tyrosol + + + + + + + - + + - +
Hexanal - - - - - - - - - - + -
Acetato de - - + - - - - - - - - -
hexilo
Decanoato de - - + - - - + - - - - -
etilo
5-hidroximetil - - - - + - - + - - - -
furfural
+: presente, -: no presente
Tabla 28 Compuestos no terpnicos identificados en los vinos analizados. 1: Castillo de Irache,

2: Original Muscat, 3: Marques de Riscal, 4: Via Esmeralda, 5: Gran Feudo, 6: Via Mireia,
7: Cresta Real, 8: Moscatel Dorado, 9: Tokaji Furmint, 10: Castillo Aguaron, 11: Castillo de Liria,
12: Ribera del Puerto.
258
En la tabla 28 se muestran algunos compuestos voltiles, no terpnicos,

identificados en esas mismas muestras de vino.
Se realiz asimismo el anlisis de componentes principales sobre los resultados

encontrados para los vinos comerciales analizados, encontrndose que los terpenos que
mayor peso ejercen en las componentes principales representadas son el terpineol y el
linalol en la CP1, y el geraniol en la CP2 (figura 67).
ACP Vinos Comerciales variable terpenos

geraniol
CP2
citronelol terpineol
a-terpineno CP1
nerol
linalol
Figura 67 Representacin del ACP de la variable terpenos en los vinos comerciales analizados.
En funcin de esas componentes principales, se obtiene la clasificacin de los

vinos analizados mostrada en la figura 68.
En esta figura podemos comprobar que los vinos analizados se clasifican en dos
grupos bien diferenciados, uno formado por los vinos elaborados, total o parcialmente,
con la variedad Moscatel; y los que no se elaboran a partir de esa variedad.
Destaca adems el hecho de que el nico vino tinto analizado (Castillo de

Aguarn), se encuentra separado del resto de vinos sin Moscatel.
Adems, entre los vinos elaborados con la variedad Moscatel, se aprecia una
cierta diferenciacin en funcin de su composicin, segn sean monovarietales de
Moscatel, sean un coupage con otras variedades (Via Esmeralda, Via Mireia, etc..), o
incluso de los elaborados con otras variedades de Moscatel distintas de la tradicional
(Moscatel de Alejandra), como el Gran Feudo elaborado con 100% de Moscatel de
Frontignan (Moscatel de grano menudo).
259
ACP Vinos Comerciales (clasificacin terpenos)
CP2
Gran Feudo
Castillo de Aguarn
Via Mireia
Original Muscat
Marqus Cresta Real CP1
Tokaji Furmint Moscatel Dorado
de Riscal
Ribera del Castillo de
Irache Via Esmeralda
Puerto Castillo de Liria
Figura 68 Clasificacin de los vinos comerciales analizados en funcin de la variable terpenos
III.4.2.3 Aplicacin del mtodo desarrollado a la determinacin de la fraccin

voltil de vinos jvenes monovarietales.
Siguiendo con los anlisis realizados para determinar la utilidad del mtodo
desarrollado de EFS/CG, este se aplic en la determinacin de la composicin terpnica
y otros componentes del aroma de 23 vinos monovarietales correspondientes a 13
variedades de uva cultivadas en Jerez y elaboradas en diferentes condiciones de
vinificacin.
De esta manera se han determinado compuestos de tipo terpnico, steres, cidos

y alcoholes que permiten, en primer lugar, la caracterizacin de las variedades
estudiadas, y en segundo lugar la evaluacin de los efectos que distintas condiciones de
vinificacin tienen sobre algunos de estos compuestos.
En la tabla 29 se indican cuales son los vinos analizados, y cuales son los distintos
procesos de vinificacin que los diferencian. Adems en algunas variedades se realizan
ensayos de riego.
260
Variedad de uva Cdigo asignado

Tipo de muestra
Chardonnay Chard
Secano (v.c.)
Cabernet Cabsauv
Sauvignon Secano (v.c.)
Garrido Garrido
Secano (v.c.)
Graciano Graciano
Secano (v.c.)
Moscatel Moscmal Moscmalr
Alejandra Secano (v.c.) Riego (v.c.)
Palomino Pno Pnor Pnoenz Pnomac
Secano (v.c.)* Riego (v.c.) Enz. glucosidasas Maceracin en fro
Palomino negro Pnoneg Pnonegbt Pnonegmc
Secano (v.c.)* Fermentado a baja temperatura Maceracin carbnica
Syrah Syrah
Secano (v.c.)
Tempranillo Temprani
Secano (v.c.)
Gewrtztraminer Trami Tramimac
(Traminer) Secano (v.c.)* Maceracin en fro
Tintilla de Rota Tinrota Tinrotar
Secano (v.c.) Riego (v.c.)
Vijiriega Vijirieg
Secano (v.c.)
Viura Viura Viuramac Viuraenz
Secano (v.c.)* Maceracin en fro Enzimas glucosidasas
v.c.: vinificacin clsica *: testigos frente a los cuales se comparan los otros tipos de ensayos.
Tabla 29 Muestras analizadas, clasificadas en funcin de la variedad de uva y tipo vinificacin
Los extractos obtenidos se analizaron por CG (apartado II.3.2.4) y los resultados

medios (n=2) se presentan en las tablas 30 (compuestos terpnicos) y 31 (esteres y
alcoholes).
261
Muestra g-terpineno linalol terpineol citronelol nerol geraniol

Chard 113,76 n.d. n.d. n.d. 30,42 n.d.
Cabsauv 101,61 16,35 n.d. n.d. n.d. n.d.
Garrido 108,59 7,09 n.d. n.d. 19,55 n.d.
Graciano 18,20 15,59 n.d. n.d. 90,79 n.d.
Moscmal 137,43 76,35 123,78 18,22 22,50 13,01
Moscmalr 132,85 86,89 89,17 18,70 37,91 12,65
Pno 133,99 9,72 5,26 n.d. 32,81 n.d.
Pnor 155,89 n.d. 3,86 n.d. 37,40 n.d.
Pnoenz 261,38 9,63 5,32 n.d. 35,76 n.d.
Pnomac 246,24 5,16 3,55 n.d. 21,84 n.d.
Pnoneg 69,09 6,35 4,15 n.d. 67,83 n.d.
Pnonegbt 84,81 n.d. 3,82 n.d. 61,85 n.d.
Pnonegmc 95,38 n.d. 4,37 n.d. 47,38 n.d.
Syrah 70,25 15,81 3,90 n.d. 96,78 n.d.
Temprani 21,07 14,49 n.d. n.d. 100,33 n.d.
Trami 147,65 13,32 15,91 n.d. 18,91 n.d.
Tramimac 127,68 49,63 47,31 31,44 47,95 n.d.
Tinrota 55,64 8,99 3,89 n.d. 52,47 n.d.
Tinrotar 63,18 13,18 5,25 n.d. 72,48 n.d.
Vijirieg 110,95 n.d. n.d. n.d. 16,62 n.d.
Viura 122,13 8,90 n.d. n.d. 29,47 n.d.
Viuramac 140,11 10,87 n.d. n.d. 45,67 n.d.
Viuraenz 84,08 9,95 4,25 n.d. 28,08 n.d.
n.d.: no detectado
Tabla 30 Concentraciones de compuestos terpnicos (g/L) en los vinos ensayados.

El significado de las claves identificativas de las muestras viene indicado en la tabla 29.
262
Acet. Hexan. Isoval. Decan. Succin. Alcohol Lact. de 1-

Muestra de hexilo de etilo de etilo de etilo de dietilo fenetlico etilo hexenol
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)
Chard 3802,71 625,76 n.d. 749,83 1609,95 19836,91 6683,07 1554,25
Cabsauv 8413,56 n.d. 71,60 517,75 8869,60 142180,14 6851,06 3246,48
Garrido 4957,09 809,44 n.d. 934,18 3376,98 30692,43 2759,36 725,63
Graciano 11852,74 270,90 64,66 536,53 7249,23 89780,62 6129,16 1902,19
Moscmal 4569,87 181,74 n.d. n.d. 3540,18 640347,49 1543,56 1148,78
Moscmalr 7235,39 227,57 n.d. 734,42 4903,32 74758,86 1716,09 1414,54
Pno 3101,10 184,67 42,52 636,11 3670,12 60036,30 1546,39 967,46
Pnor 3845,81 933,20 n.d. 686,01 506,39 27075,32 1536,13 584,25
Pnoenz 3248,63 n.d. n.d. 618,46 2550,83 42902,18 5915,64 1469,58
Pnomac 1995,47 n.d. 31,34 459,01 1464,19 21314,65 3913,86 588,82
Pnoneg 9009,18 766,71 60,11 559,27 5700,90 58825,22 11029,67 2589,78
Pnonegbt 8693,56 688,12 93,41 530,26 4205,79 47176,33 12404,56 2853,44
Pnonegmc 6029,73 672,24 108,98 612,76 6680,80 39742,41 11753,26 689,72
Syrah 11428,61 691,99 72,74 532,53 5195,39 67844,04 8876,04 1968,87
Temprani 11333,78 240,13 76,38 569,75 9733,79 127133,60 8383,83 2484,65
Trami 3470,72 n.d. n.d. 845,20 986,22 15348,14 2648,54 1118,66
Tramimac 6646,08 820,62 52,50 604,28 3562,64 23374,41 15216,11 2277,38
Tinrota 5256,09 509,41 44,75 386,81 3477,56 38920,62 4548,58 1070,22
Tinrotar 9366,48 779,25 67,55 511,57 6759,96 61095,50 10156,49 1788,34
Vijirieg 4128,10 n.d. 40,27 687,96 3831,27 43983,00 1839,51 999,82
Viura 5968,06 201,33 n.d. 684,75 1704,35 35831,32 7231,25 1446,78
Viuramac 6364,85 184,92 48,85 636,97 4076,93 34748,33 2057,12 915,60
Viuraenz 5510,98 n.d. n.d. 529,65 1954,62 36041,16 6860,85 1581,52
n.d.: no detectado
Tabla 31 Concentraciones de esteres y alcoholes (g/L) en los vinos ensayados.
Los datos obtenidos son analizados para determinar tanto su variabilidad entre las
distintas variedades de uva, como la posible influencia en las mismas de las condiciones
de vinificacin y cultivo que se han ensayado.
Al realizar un anlisis de agrupaciones de todas las muestras analizadas,

empleando como variables los compuestos de tipo terpnico, se obtuvo el dendograma
de la figura 69. En esta representacin puede verse como los terpenos permiten una
agrupacin caracterstica de las variedades analizadas.
263
En primer lugar se puede distinguir un grupo bastante homogneo formado por la

gran mayora de las variedades blancas. A continuacin se encuentra otro grupo ms
heterogneo, en el que se puede distinguir un subgrupo constituido por las variedades
tintas autctonas (Tintilla de Rota, Palomino negro) bastante diferenciado del subgrupo
formado por las otras variedades tintas no autctonas (Graciano, Tempranillo, Syrah).
Tambin se distinguen otros subgrupos formados por la variedad tinta Cabernet
Sauvignon, otro correspondiente a la variedad Palomino, y un ltimo grupo donde se
integran las variedades ms aromticas: Moscatel (secano y riego) y Traminer
maceracin, estando este grupo completamente separado del resto de vinos analizados.
Diagrama de rbol para los 23 casos variable terpenos
CHARD
GARRIDO
VIJIRIEG
VIURAMAC
PNOR
VIURAENZ
PNO
VIURA
TRAMI
CABSAUV
PNOENZ
PNOMAC
GRACIANO
TEMPRANI
SYRAH
PNONEG
TINROTAR
TINROTA
PNONEGBT
PNONEGMC
MOSCMAL
MOSCMALR
TRAMIMAC
0 1 2 3 4 5 6 7 8
distancia de unin
Figura 69 Dendograma representando la agrupacin existente, en funcin de terpenos, de las

variedades analizadas.
Son tambin muy interesantes los efectos de los procesos de maceracin pelicular
y el empleo de enzimas glucosidasas en la vinificacin. En cuanto a la maceracin en
fro, hay que recordar que tiene como objetivo fundamental el incremento de los
fenmenos de extraccin desde las partes slidas, particularmente de los terpenos y
otros compuestos aromticos presentes en las uvas.
264
Los resultados muestran que los efectos de este proceso, en cuanto a terpenos, son
totalmente dependientes de la variedad empleada. As, mientras las modificaciones son
mnimas en la variedad Viura (lneas en rojo), para la variedad Palomino (lneas en
naranja) y Traminer (lneas en verde) si que son notables.
Algo similar ocurre con el empleo de enzimas con actividad glucosidasa. As,
mientras en la variedad Palomino hay un claro efecto (lneas en naranja), para la
variedad Viura nuevamente los efectos son menores (lneas en rojo).
Influencia de la maceracin y el tratamiento con enzimas

glucosidasas en los compuestos terpnicos de los vinos
elaborados con las variedades Viura, Palomino y Traminer
60,00
testigo
40,00
maceracin
mcg/L
enzimas
20,00
0,00
promedio promedio promedio
terpenos terpenos terpenos
Viura Palomino Traminer
Figura 70 Influencia de los distintos tratamientos sobre la composicin terpnica de las

variedades Palomino, Gewrtztraminer (Traminer) y Viura.
En general, en la figura 70 se observa que la maceracin conduce a un

incremento del promedio de los compuestos terpnicos analizados en las tres
variedades, especialmente de Palomino y Traminer. En cuanto al empleo de enzimas
glucosidasas, se comprueba que es efectiva en el caso de la variedad Palomino, pero no
en la variedad Viura.
265
Si adems se evala la variacin de los terpenos entre los 23 tipos de vinos

analizados (figura 71), puede observarse que se registran tres tipos de comportamiento.
Tanto el gamma-terpineno, como el nerol, presentan poca similitud, tanto entre ellos,
como con el resto de los terpenos, que, a su vez, si tienen un comportamiento muy
similar entre todas las variedades analizadas. Esto nos lleva a concluir que deben ser
estos dos primeros compuestos los que reflejen las diferencias entre los vinos
analizados.
Diagrama de rbol para las 6 variables terpenos
G_TERP
LINALOL
TERPINEO
GERANIOL
CITRONEL
NEROL
1 2 3 4 5 6 7
distancia de unin
Figura 71 Dendograma representando la agrupacin de las compuestos terpnicos en los 23

casos evaluados.
Para corroborar los resultados obtenidos con los dendogramas y comprobar cuales
son los terpenos que permiten la diferenciacin de las variedades ensayadas, se realiza
un anlisis de componentes principales (ACP) en los 23 vinos analizados. Los
resultados obtenidos se presentan en la grfica 72.
266
ACP Vinos Monovarietales variable terpenos
CP2
terpineol
linalol
citronelol
nerol geraniol CP1
g-terpineno
Figura 72 Representacin del anlisis de componentes principales, variable terpenos, de los

23 vinos analizados.
Con este ACP se puede establecer una clasificacin de las muestras analizadas
tal como se muestra en la figura 73.
APC Vinos Monovarietales (clasificacin terpenos)

CP2
Mosc
Mosc-riego
Tram-mac
T.R-riego Gar
Gra T.R. Viu-enz C.S. CP1
Temp Syr Viu-test Tram
P.N. P-test
P.N P.N. P-riego
Vij Viu-mac P-enz
b.t. m.c. Char P-mac
Figura 73 Clasificacin de los vinos analizados en funcin de las CP 1 y 2 para la variable

terpenos. Gra: Graciano, Temp: Tempranillo, Syr: Syrah, T.R.:Tintilla de Rota, P.N.: Palomino
Negro, Gar: Garrido, C.S: Cabernet Sauvignon, Viu: Viura, Vij: Vijiriega, Char: Chardonnay,
P: Palomino, Mosc: Moscatel. Con mac se indica maceracin, con b.t: baja temperatura y con
m.c.: maceracin carbnica
267
Se puede comprobar como con las componentes principales obtenidas en el ACP,

se aprecia una separacin entre los vinos considerados ms aromticos (Traminer y
Moscatel) y el resto de variedades analizadas.
La diferenciacin entre variedades aromticas y no aromticas se refleja en la

CP2, que como se puede ver en la figura 72, es donde terpineol y linalol presentan una
mayor contribucin, siendo prcticamente nula la contribucin de los otros terpenos.
Sern por tanto terpineol y linalol los terpenos ms directamente responsables de las
caractersticas diferenciadoras de las variedades aromticas. En el caso de la CP1 el
compuesto que presenta mayor contribucin es el gamma-terpineno.
En cuanto a otros compuestos voltiles (tabla 31), entre los 23 vinos analizados se
han encontrado dos grupos de compuestos de carcter diferenciado. El primero de ellos
formado principalmente por steres etlicos de cidos grasos y el segundo por otros
compuestos relacionados con el proceso de maceracin, tal como se aprecia en la figura
74.
Diagrama de rbol para las 8 variables voltiles no terpnicos
ACET_HEX
HEXENOL
SUCCIN_D
FENETL
HEXAN_ET
ISOVA_ET
LACT_ET
DECAN_ET
1 2 3 4 5 6 7 8
distancia de unin
Figura 74 Dendograma representando la agrupacin de las compuestos no

terpnicos en los 23 casos evaluados.
268
Asimismo puede comprobarse que estos compuestos se ven afectados por las
condiciones de vinificacin orientadas a la obtencin de mayores aromas varietales, de
forma que tanto la maceracin prefermentativa, como el empleo de enzimas con
actividad glucosidasa, puede influir en los niveles de los mismos, en este ltimo caso
como consecuencia de la actividad esterasa que suele registrarse junto a la actividad
glucosidasa.47
Influencia del tratamiento con enzimas glucosidasas en los compuestos voltiles

no terpnicos de los vinos elaborados con las variedades Viura y Palomino
5000,00
4000,00
testigo
3000,00
mcg/L
enzimas
2000,00
1000,00
0,00
promedio promedio promedio promedio
esteres alcoholes esteres alcoholes
Viura Palomino
Figura 75 Influencia del tratamiento con enzimas glucosidasas en los compuestos voltiles no
terpnicos de los vinos elaborados con las variedades Viura y Palomino.
A la vista de esta figura 75 puede comprobarse que en los vinos analizados no se

observa una influencia clara de la actividad esterasa de las enzimas glucosidasas, puesto
que mientras que en el caso de la variedad Viura se aprecia una ligera disminucin en el
contenido de los esteres, en el caso de la variedad Palomino, se aprecia un incremento.
Se trata por tanto de enzimas con una actividad esterasa dbil o nula.
En el caso de la maceracin tampoco parece existir un efecto claro de la influencia

que la maceracin en fro prefermentativa tiene en las variedades ensayadas, como
cabra esperar (vase figura 76). Adems este comportamiento es distinto entre ambas
variedades. As, en el caso de la variedad Viura, se aprecia el aumento de algunos
compuestos (acetato de hexilo, isovaleriato de etilo y succinato de dietilo), una
disminucin ligera (con mayor o menor intensidad) para los compuestos hexanoato de
etilo, decanoato de etilo, alcohol fenetlico y 1-hexenol, mientras que el lactato de etilo
disminuye de forma considerable en los vinos obtenidos a partir de mostos con
maceracin.
269
Sobre la variedad Traminer se aprecia una mayor influencia, de forma que son
ms acusados los incrementos de todos los compuestos, con dos excepciones: la del
isovaleriato de etilo que no vara, y del decanoato de etilo, en el que se produce una
ligera disminucin.
Influencia de la maceracin en los compuestos voltiles no

terpnicos de los vinos elaborados con las variedades Viura y
Traminer
5000
4000
testigo
3000
mcg/L
maceracin
2000
1000
0
promedio promedio promedio promedio
esteres alcoholes esteres alcoholes
Viura Traminer
Figura 76 Influencia de la maceracin en fro en los compuestos voltiles no terpnicos de los

vinos elaborados con las variedades Viura y Gewrtztraminer.
De esta forma, si se evalan las agrupaciones que se forman en funcin de estos

compuestos voltiles no terpnicos, entre los 23 vinos estudiados, puede apreciarse una
diferenciacin en funcin de que se trate de vinos blancos y tintos, y del grado de
maceracin (figura 77).
Los grupos formados pueden justificarse al evaluar la influencia que el tipo de

vinificacin (en blanco o tinta) y la maceracin, tiene en la composicin promedio de
estos compuestos voltiles (figura 78).
270
Diagrama de rbol para los 23 casos de las variables voltiles no terpnicos
CHARD
PNOENZ
VIURAMAC
VIURA
PNO
VIJIRIEG
VIURAENZ
TINROTA
TRAMI
PNOMAC
GARRIDO
PNOR
MOSCMALR
MOSCMAL
CABSAUV
TEMPRANI
GRACIANO
PNONEG
SYRAH
TINROTAR
PNONEGBT
TRAMIMAC
PNONEGMC
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

distancia de unin
Figura 77 Dendograma que representa la agrupacin existente, en funcin de los compuestos

voltiles no terpnicos, de los vinos ensayados.
Promedio de la composicin voltil no terpnica

variedades blancas vs. tintas
8000,00
6000,00 blancas
mcg/L
tintas
4000,00
2000,00
0,00
1 2 3 4 5 6/10 7 8
compuesto
Figura 78 Influencia del tipo de vinificacin en los compuestos voltiles no terpnicos de los
variedades ensayadas.
271
Este agrupamiento observado en el dendograma anterior se repite al representar

los resultados del anlisis de componentes principales, clasificndose de esa forma los
vinos analizados en variedades blancas y tintas, con la nica excepcin de la variedad
Tintilla de Rota que aparece en el grupo de las variedades blancas, tal como se aprecia
en la figura 79.
APC Vinos Monovarietales (clasificacin voltiles)
CP2
Tram-mac
P.N-b.t.
P.N-m.c. P.N.
T.R-riego
Syr
Viu-test
Viu-mac Temp
Char Gra CP1
P-enz
P-mac Gar
Tram T.R. C.S.
Viu-enz
Mosc-riego
P-riego Vij Mosc
P-test
Figura 79 Clasificacin de los vinos analizados en funcin del ACP de la variable compuestos
voltiles no terpnicos. Gra: Graciano, Temp: Tempranillo, Syr: Syrah, T.R.:Tintilla de Rota,
P.N.: Palomino Negro, Gar: Garrido, C.S: Cabernet Sauvignon, Viu: Viura, Vij: Vijiriega,
Char: Chardonnay, P: Palomino, Mosc: Moscatel. Con mac se indica maceracin, con b.t: baja
temperatura y con m.c.: maceracin carbnica.
Asimismo puede comprobarse que la diferenciacin entre vinificacin con y sin

maceracin se debe fundamentalmente a los compuestos alcohol fenetlico, acetato de
hexilo, succinato de dietilo y lactato de etilo, que son los que mayor peso tienen en las
componentes principales, y que adems se corresponden con el agrupamiento que se
aprecia en la figura 80.
Esta diferenciacin se debe a que los procesos de maceracin hacen que se

incremente, por ejemplo, tanto el hexenol, como alguno de sus esteres derivados
(acetato de hexilo) en los vinos elaborados mediante maceracin con las partes slidas.
272
APC Vinos Monovarietales (voltiles)
CP2
lactato etilo
acetato hexilo
succinato dietilo
hexen-1-ol CP1
hexanoato etilo
isovaleriato etilo fenetlico
decanoato etilo
Figura 80 Representacin del anlisis de componentes principales, variable voltiles no

terpnicos, de los 23 vinos analizados.
Finalmente se realiza el anlisis de agrupaciones correspondiente a todas las

variables (compuestos terpnicos y no terpnicos) en las 23 muestras de vino
estudiadas:
Diagrama de rbol para las 14 variables (terpenos y voltiles no terpnicos)
G_TERP
LINALOL
TERPINEO
GERANIOL
CITRONEL
NEROL
ACET_HEX
ISOVA_ET
LACT_ET
HEXENOL
SUCCIN_D
FENETL
HEXAN_ET
DECAN_ET
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
distancia de unin
Figura 81 Dendograma representando la agrupacin de todas las variables estudiadas (terpenos

y compuestos no terpnicos) en los 23 casos evaluados.
273
En general, se aprecian dos grupos: un primer grupo formado por todos los
compuestos terpnicos, salvo el nerol, que presenta un comportamiento ms similar al
del segundo grupo, constituido por los compuestos no terpnicos.
Podemos concluir indicando que los compuestos terpnicos parecen mostrar el

mismo tipo de variacin entre las distintas muestras, sin que se aprecie una clara
influencia de la maceracin o de otros tratamientos en su composicin, aunque si en
funcin de la variedad de uva empleada.
274
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277
IV. CONCLUSIONES
Conclusiones
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el trabajo presentado en esta

memoria, se pueden enumerar las siguientes conclusiones:
a) En relacin a la extraccin con fluidos presurizados:
1) Se ha determinado la estabilidad y la extractabilidad de distintos compuestos

fenlicos (pertenecientes a varias familias) en condiciones de extraccin a alta presin y
temperatura, y se ha comprobado que las recuperaciones medias en metanol para todos
los compuestos extrados estn en torno al 90%, con las excepciones de la catequina,
epicatequina a 150C.
2) Se ha puesto a punto un mtodo de extraccin con fluidos presurizados para la

extraccin de compuestos polifenlicos. La aplicacin del mtodo a muestras reales de
orujo (hollejos y pepitas) ha permitido la determinacin de compuestos fenlicos
mayoritarios presentes en ellas (cido caftrico, cido glico, catequina, epicatequina).
Esta informacin se considera interesante tanto desde un punto de vista analtico

como para su uso en el desarrollo de procesos de recuperacin de estos compuestos a
partir de residuos de vinificacin.
b) En relacin al desarrollo de mtodos rpidos para el anlisis de polifenoles:
3) Se ha puesto a punto un mtodo de extraccin con fluidos presurizados para la

extraccin de catequinas en distintos tipos de muestras, rpido (en torno a los 10
minutos) y reproducible, y se ha optimizado el mtodo cromatogrfico para su
determinacin mediante la deteccin fluorimtrica
281
Conclusiones
Al comparar este mtodo con la extraccin asistida por ultrasonidos o con

agitacin magntica, se ha comprobado que la extraccin con fluidos presurizados es la
tcnica que proporciona los mejores resultados.
4) Se han evaluado los niveles de catequinas que pueden ser potencialmente

extrables durante la vinificacin. Se ha encontrado un comportamiento homogneo
para la evolucin de catequina y epicatequina en las variedades de uva analizadas
durante su maduracin.
5) Asimismo, se ha comprobado que la extractabilidad de estos compuestos no se

ve afectada cuando las muestras se someten a una liofilizacin previa para eliminar el
agua de las mismas, y que, de hecho, sta se ve favorecida. De forma que la liofilizacin
adems de permitir conservar las muestras, permite incrementar las recuperaciones de
los compuestos de inters al facilitar la accesibilidad del disolvente hacia los mismos.
c) En relacin al aumento de la selectividad mediante acoplamiento de tcnicas:
6) Se ha comprobado que el acoplamiento directo entre la EFP y EFS permite la

separacin de los compuestos fenlicos del resto de otros compuestos presentes en la
uva, especialmente azcares. El mtodo completo se desarrolla bajo atmsfera inerte, y
el acoplamiento de ambas tcnicas permite reducir el manejo de las muestras y, por
tanto, la posibilidad de degradacin de los compuestos extrados.
7) La aplicacin del mtodo de EFP-EFS sobre muestras de uvas liofilizadas

permite: la determinacin de compuestos fenlicos en uvas, de inters por sus
implicaciones tecnolgicas en la vinificacin (relacionados con la sensibilidad al
pardeamiento) en el caso de los steres caftrico, cis-cutrico, trans-cutrico, catequina,
o epicatequina, o por sus implicaciones biolgicas en cuanto a su actividad fisiolgica
en el organismo en el caso del trans-resveratrol.
282
Conclusiones
d) En relacin a la determinacin de glucsidos en uvas a lo largo de la maduracin:
8) Se ha aplicado el mtodo habitual por primera vez sobre muestras de uva

liofilizadas. De esta forma se ha estudiado la evolucin de estos compuestos
(precursores aromticos) a lo largo de la maduracin en distintas variedades de uvas
(autctonas, nacionales y universales) cultivadas en la zona de Jerez, durante dos aos
consecutivos.
9) Se ha comprobado que para las muestras analizadas no es posible la estimacin

de los valores de la cantidad total de compuestos glicosilados en funcin de los
parmetros analizados de forma rutinaria.
10) Adems se ha puesto de manifiesto la influencia determinante que las

condiciones climticas tienen en el desarrollo de la uva y de los compuestos presentes
en ellas que determinarn la calidad del producto a obtener.
e) En relacin a la determinacin de terpenos y otros voltiles:
11) Se ha desarrollado un mtodo rpido de anlisis cuantitativo de terpenos en

vinos mediante la extraccin en fase slida. Tras evaluar distintos disolventes y fases
slidas, se ha seleccionado el diclorometano y la fase slida basada en estireno-
divinilbenceno como la mejor combinacin. Se ha realizado la optimizacin de las
variables de extraccin y se ha desarrollado un mtodo que ha permitido la
determinacin de terpenos en vinos comerciales y vinos jvenes monovarietales
(algunos de ellos elaborados con distintas variantes tecnolgicas).
12) Adems se han identificado y cuantificado otros compuestos voltiles (esteres,

alcoholes) presentes en estas muestras, y se ha evaluado la influencia que las distintas
prcticas enolgicas llevadas a cabo durante la vinificacin tienen en la componente
aromtica de estos vinos.
283
Conclusiones
Finalmente conviene destacar que los mtodos desarrollados aplicando las

tcnicas de extraccin mencionadas, adems de ayudar a obtener mayor informacin de
compuestos de inters enolgico, pueden abrir un camino hacia la utilizacin de algunas
de estas tcnicas de extraccin para la diversificacin industrial enolgica, como la
recuperacin de componentes de inters diverso a partir de residuos de la vinificacin.
284
ANEXOS
Anexo I
Representacin whisker & plot de las recuperaciones de los distintos patrones

durante el estudio de la estabilidad de los mismos a altas temperaturas, se representa la
recuperacin media, la recuperacin media desviacin estndar y la recuperacin
media 1,96 x desviacin estndar.
gentsico
120
115
110
105
recuperacin
100
95
90
85
80
referencia 40C 50C 100C 150C 65C
extractos
cafeico
112
106
100
recuperacin
94
88
82
76
extractos
I
Whisker & Plot
protocatequialdehdo
108
104
100
recuperacin
96
92
88
84
extractos
siringialdehdo
112
108
104
recuperacin
100
96
92
88
extractos
II
Anexo I
catequina
115
105
95
recuperacin
85
75
65
55
45
extractos
p-cumrico
135
125
115
recuperacin
105
95
85
75
extractos
III
Whisker & Plot
vertrico
118
112
106
recuperacin
100
94
88
82
extractos
epicatequina
110
100
90
recuperacin
80
70
60
50
extractos
IV
Anexo I
vainillina
112
108
104
100
recuperacin
96
92
88
84
80
extractos
glico
108
104
100
96
recuperacin
92
88
84
80
76
extractos
V
Whisker & Plot
p-OHbenzoico
122
116
110
recuperacin
104
98
92
86
extractos
esculetina
114
110
106
102
recuperacin
98
94
90
86
82
extractos
VI
Anexo I
ferlico
120
115
110
105
recuperacin
100
95
90
85
80
extractos
escopoletina
135
125
115
recuperacin
105
95
85
75
extractos
VII
Whisker & Plot
sinpico
125
115
105
recuperacin
95
85
75
extractos
veratraldehdo
120
110
100
recuperacin
90
80
70
extractos
VIII
Anexo II
Parmetros clsicos de control durante la maduracin de las distintas variedades de uva

estudiadas en el ao 2002 (aportados por el CIFA Rancho de La Merced de Jerez de la
Frontera):
GARRIDO
Da de B A.T. (g/L) pH cido peso Residuo ndice
muestreo tartrico medio seco (%) maduracin
19/07/02 6,0 22,59 2,79 12,29 2,19 10,79 3,72
26/07/02 6,8 14,79 2,9 10,53 2,27 12,43 6,76
02/08/02 7,5 13,14 3,03 11,13 2,39 13,96 8,83
09/08/02 7,8 10,26 3,1 11,03 2,55 14,43 11,89
16/08/02 8,4 8,72 3,09 9,65 2,87 13,07 15,48
23/08/02 8,7 7,39 3,15 8,97 2,92 16,19 19,21
30/08/02 9,2 6,74 3,18 8,38 3,22 15,27 22,55
Garrido Moscatel de Alejandra
MOSCATEL DE ALEJANDRA (MALAGA GRANO GRUESO)

19/07/02 6,3 17,25 2,87 11,37 2,28 12,47 5,22
26/07/02 7,9 11,99 3,12 10,05 2,02 15,60 10,34
02/08/02 8,5 8,97 3,18 9,15 2,86 16,39 15,38
09/08/02 9,4 7,78 3,23 9,39 3,07 17,21 20,05
23/08/02 10,8 7,28 3,27 9,03 3,35 18,26 26,65
29/08/02 10,7 6,18 3,32 8,05 2,83 18,31 29,77
IX
Parmetros clsicos de maduracin
PALOMINO FINO
26/07/02 8,8 8,40 3,17 8,93 1,91 17,92 17,02
02/08/02 10,3 6,31 3,25 8,22 1,95 18,07 27,73
09/08/02 10,4 5,45 3,34 7,44 2,10 19,79 32,66
16/08/02 11,8 5,32 3,38 7,84 2,21 21,29 38,91
23/08/02 12,6 5,34 3,51 7,88 2,18 21,07 42,32
Palomino Fino Palomino Fino riego
PALOMINO FINO RIEGO

26/07/02 7,6 10,65 3,22 6,81 2,51 13,08 11,17
02/08/02 8,1 7,01 3,44 5,98 2,67 15,66 18,54
09/08/02 9,0 5,42 3,48 5,99 2,77 16,49 27,31
16/08/02 10,2 4,78 3,55 6,08 2,67 16,06 36,40
23/08/02 10,5 4,33 3,70 6,05 2,82 17,44 41,57
X
Anexo II
VIJIRIEGA
26/07/02 6,9 16,94 2,92 9,07 2,23 11,91 6,08
02/08/02 7,5 12,91 3,07 8,03 2,66 13,98 8,99
09/08/02 7,7 10,62 3,13 7,16 2,58 13,69 11,30
23/08/02 9,4 8,34 3,18 7,57 2,83 16,89 18,71
30/08/02 9,4 7,73 3,13 8,52 2,88 17,48 20,18
04/09/02 10,4 7,02 3,25 7,25 2,72 19,28 25,32
Vijiriega Viura
VIURA
26/07/02 5,9 17,25 2,85 11,16 1,31 13,35 4,81
02/08/02 7,2 13,12 3,04 10,80 1,11 14,01 8,46
09/08/02 8,2 8,60 3,07 8,50 1,50 15,81 15,23
16/08/02 9,2 7,70 3,12 9,15 1,65 15,26 19,74
23/08/02 10,2 6,30 3,16 8,20 1,90 18,10 27,62
30/08/02 10,6 5,63 3,19 7,75 2,01 18,46 32,50
XI
CHARDONNAY
12/07/02 8,8 18,70 2,95 10,06 1,23 15,24 7,65
19/07/02 10,5 13,37 3,17 10,19 1,21 17,06 13,46
26/07/02 11,6 10,25 3,25 8,80 1,29 19,38 19,90
02/08/02 12,8 8,34 3,40 9,13 1,32 21,61 27,34
06/08/02 12,8 7,72 3,46 8,92 1,32 21,95 29,53
Chardonnay Sauvignon Blanc
SAUVIGNON BLANC
12/07/02 7,1 24,84 2,84 12,25 1,03 12,47 4,35
19/07/02 9,0 17,28 2,96 11,30 1,29 16,33 8,56
26/07/02 9,9 11,35 3,08 9,38 1,50 16,79 14,71
2/08/02 10,4 9,55 3,27 8,75 1,54 19,11 18,64
9/08/02 11,2 7,00 3,42 8,14 1,62 20,80 27,86
13/08/02 11,7 6,65 3,37 7,47 1,80 19,26 30,83
XII
Anexo II
GEWRTZTRAMINER (TRAMINER)
12/07/02 8,0 15,53 3,16 10,83 1,26 15,52 8,18
19/07/02 10,3 11,56 3,25 10,30 1,44 17,09 15,14
26/07/02 10,6 8,27 3,36 9,26 1,41 17,06 22,13
1/08/02 11,5 6,69 3,52 8,50 1,55 20,40 30,19
Gewrztraminer Graciano
GRACIANO
2/08/02 8,8 15,77 2,91 13,47 1,24 18,10 9,06
9/08/02 10,4 11,94 2,99 11,15 1,28 20,00 14,91
16/08/02 11,1 10,07 3,08 11,79 1,35 21,46 19,27
30/08/02 12,5 7,86 3,24 10,47 1,34 24,82 28,37
5/09/02 13,2 6,29 3,26 9,02 1,47 25,98 38,00
XIII
PALOMINO NEGRO
12/07/02 9,2 14,55 2,90 6,75 1,45 15,18 10,45
19/07/02 10,5 10,38 3,20 6,45 1,71 16,67 17,34
26/07/02 11,5 7,79 3,26 5,83 1,78 20,31 25,93
02/08/02 12,1 6,11 3,50 5,96 1,92 22,89 35,18
Palomino Negro Tempranillo
TEMPRANILLO
19/07/02 7,0 17,37 2,92 8,58 1,61 15,31 6,10
26/07/02 8,2 11,87 3,06 8,23 1,71 19,11 11,04
02/08/02 8,8 8,10 3,21 6,98 1,75 19,76 17,65
09/08/02 9,2 7,44 3,25 7,42 1,86 20,47 20,43
16/08/02 11,0 6,10 3,28 7,15 2,02 22,16 31,31
30/08/02 11,7 4,74 3,40 6,03 2,26 22,80 43,25
XIV
Anexo II
TINTILLA DE ROTA
2/08/02 10,0 17,55 2,97 17,55 1,43 18,75 9,69
9/08/02 10,4 13,59 3,05 13,59 1,49 19,46 13,10
16/08/02 12,0 10,66 3,13 10,66 1,48 19,21 19,89
30/08/02 12,5 7,90 3,29 7,90 1,58 22,93 28,23
Tintilla de Rota Cabernet Sauvignon
CABERNET SAUVIGNON
26/07/02 8,9 16,89 2,95 11,30 0,80 18,09 8,64
2/08/02 9,2 12,41 3,07 10,00 0,79 19,56 12,25
9/08/02 10,8 9,95 3,19 9,60 0,92 20,09 18,69
16/08/02 11,5 9,16 3,26 10,46 0,90 22,68 22,05
30/08/02 12,9 6,77 3,38 8,83 1,01 23,31 34,12
XV
SYRAH
19/07/02 8,4 17,12 3,02 10,30 1,17 14,87 7,88
26/07/02 9,0 12,89 3,05 9,61 1,50 15,95 11,48
02/08/02 9,6 10,25 3,22 9,61 1,51 18,22 15,8
09/08/02 10,6 8,37 3,38 9,19 1,55 18,99 21,86
16/08/02 12,0 8,02 3,44 9,75 1,54 21,03 26,43
Syrah
Parmetros clsicos de control durante la maduracin de las distintas variedades de uva

estudiadas en el ao 2003 (aportados por el CIFA Rancho de La Merced de Jerez de la
Frontera):
MOSCATEL DE ALEJANDRA (MLAGA O GRANO GRUESO)

22/07/03 6,8 16,61 2,92 10,05 2,47 13,39 6,02
29/07/03 8,1 12,12 3,09 9,58 2,39 13,46 10,73
05/08/03 10,3 11,79 3,20 11,57 2,44 18,00 14,80
12/08/03 12,2 7,93 3,50 9,84 2,66 22,19 27,24
19/08/03 13,5 7,37 3,55 9,42 2,39 22,35 33,11
XVI
Anexo II
PALOMINO FINO
22/07/03 9,2 9,22 3,10 9,54 2,25 15,62 16,49
29/07/03 10,8 7,47 3,27 9,60 2,23 18,72 24,89
05/08/03 12,6 6,95 3,39 10,44 2,26 19,88 32,51
12/08/03 13,5 5,60 3,52 8,84 1,93 22,62 47,84
PALOMINO FINO RIEGO

22/07/03 8,4 10,56 3,10 8,35 2,23 12,85 12,78
29/07/03 9,7 7,18 3,31 8,18 2,34 17,16 22,70
05/08/03 10,1 5,40 3,46 7,29 2,09 17,93 31,85
12/08/03 11,2 4,94 3,54 7,66 2,18 20,69 39,47
VIJIRIEGA
22/07/03 5,7 22,89 2,74 9,81 2,03 11,05 3,49
29/07/03 6,9 17,44 2,90 10,00 2,03 13,06 5,81
5/08/03 8,6 11,39 3,07 9,48 2,60 14,90 12,29
12/08/03 10,0 9,29 3,33 9,25 2,56 16,33 18,30
19/08/03 10,5 7,26 3,35 8,31 2,52 18,51 24,79
CHARDONNAY
22/07/03 10,5 14,23 3,17 9,09 1,10 18,87 12,65
29/07/03 13,0 8,82 3,41 9,35 1,29 20,63 26,53
XVII
SAUVIGNON BLANC
22/07/03 9,8 17,80 2,98 10,49 1,47 18,00 9,21
29/07/03 10,9 13,62 3,16 9,45 1,57 21,34 13,80
05/08/03 13,0 10,60 3,31 10,67 1,44 25,93 22,08
GEWRTZTRAMINER (TRAMINER)
22/07/03 10,6 9,92 3,30 8,59 1,30 17,28 18,45
29/07/03 11,5 7,26 3,56 7,21 1,45 21,08 27,82
GRACIANO
29/07/03 9,5 17,73 2,90 14,77 1,00 18,87 8,88
05/08/03 13,0 12,17 3,03 13,67 0,93 22,75 19,22
12/08/03 14,30 8,38 3,27 9,82 0,96 26,45 31,38
19/08/03 14,7 7,68 3,30 9,20 0,87 28,64 35,42
PALOMINO NEGRO
22/07/03 11,2 9,65 3,30 6,00 1,74 20,19 20,21
29/07/03 11,9 7,73 3,42 6,45 1,72 20,66 27,17
XVIII
Anexo II
TEMPRANILLO
22/07/03 8,7 12,49 3,06 7,35 2,07 17,75 11,37
29/07/03 9,8 8,69 3,25 6,47 2,27 19,77 18,87
05/08/03 11,3 6,66 3,44 6,18 2,16 19,80 29,73
12/08/03 11,7 5,05 3,74 6,38 2,06 22,73 40,79
TINTILLA DE ROTA
29/07/03 9,8 20,34 2,92 14,15 1,31 23,99 8,06
05/08/03 12,5 13,23 3,16 11,95 1,26 20,89 16,85
12/08/03 15,0 9,46 3,27 10,44 0,99 25,85 29,49
19/08/03 15,3 7,40 3,45 8,71 1,05 28,06 38,78
CABERNET SAUVIGNON
22/07/03 8,4 18,31 2,86 13,05 0,96 17,01 7,37
29/07/03 10,6 12,68 3,08 10,35 1,09 22,05 14,40
05/08/03 12,7 9,52 3,14 7,65 0,89 25,13 23,84
12/08/03 13,4 9,53 3,27 10,22 0,70 23,68 26,22
19/08/03 14,7 7,30 3,35 8,20 0,59 35,14 37,26
SYRAH
22/07/03 8,4 18,57 2,92 11,00 1,27 17,01 7,27
29/07/03 9,5 13,65 3,10 10,26 1,60 20,73 11,64
05/08/03 12,0 9,46 3,30 9,30 1,34 23,51 22,41
12/08/03 13,4 6,86 3,44 7,66 1,08 23,61 35,27
XIX
XX

Tesis Compuestos Aromatios Vino, Terpenos, Etc

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______________________________________________

MEMORIA PRESENTADA POR LA LICENCIADA

Fdo. Zulema Pieiro Mndez

Que el presente trabajo de investigacin titulado Desarrollo de nuevos mtodos

Y para que conste, expiden y firman la presente certificacin

Que el presente trabajo de investigacin titulado Desarrollo de nuevos mtodos

Y para que conste, expido y firmo la presente certificacin

Fdo.: Dr. D. Jose Luis Hidalgo Hidalgo de Cisneros

A Patricia, por saber compartir todos los interminables das en el laboratorio..,

A Angie, por todos sus nimos, por su conversacin,... se te echa de menos!!. A

A Gerardo, por ser mi compaero en el CAIV, cuando no estaba ni Cristina,

A Skike, por compartir las confidencias y gustos cinematogrficos, por animar el

A Manolo Padilla, por dejarme muchas veces el turno en el cromatgrafo, por

A Ana, por ayudarme pacientemente a pelar mis uvas, por su alegra, y

A Ramn, por su inters constante, por su activa participacin en los debates,

A Reme, por estar siempre dispuesta a resolverme dudas, por recordarme

Y ya le toca el turno a los jefes:

A Carmelo, por convencerme para hacer el doctorado mientras estudiaba

Y a todos los dems que no he nombrado y que me han ayudado de alguna

Por ltimo, tambin quisiera agradecer su apoyo a:

La Junta de Andaluca, por haberme concedido la beca que me ha permitido

Y al CIFA Rancho de la Merced por proporcionarme todas las muestras de

I.1 JUSTIFICACION Y OBJETIVOS .......................................................................................... 1

I.2 COMPUESTOS FENLICOS ................................................................................................ 5

I.3 DETERMINACION DE COMPUESTOS FENLICOS........................................................ 26

I.4 COMPUESTOS RELACIONADOS CON EL AROMA PRESENTES

II PARTE EXPERIMENTAL .................................................................................................................. 131

II.1 Reactivos, disolventes y sustancias patrones.......................................................................... 131

II.2 Aparatos e instrumentos ......................................................................................................... 135

II.3 Tcnicas experimentales......................................................................................................... 141

II.4 Muestreo................................................................................................................................. 149

II.5 Preparacin de las muestras y cmaras de extraccin............................................................. 155

III RESULTADOS Y DISCUSION ......................................................................................................... 159

III.2 Muestras slidas: EFP y EAU............................................................................................... 171

III.4 Aplicacin de la EFS en uvas y vinos ................................................................................... 231

Bibliografa Experimental ............................................................................................................. 275

IV. CONCLUSIONES ............................................................................................................................. 281

I.1 Justificacin y objetivos

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