0069049
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Proyecto de Grado
Directora:
Rosa Acevedo Barrios. Ph.D(c)
I
II
I. TABLA DE CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS .............................................................................................. I
I. TABLA DE CONTENIDO ............................................................................. III
II. ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................. VI
III. ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................... VII
IV. RESUMEN.................................................................................................... IX
V. ABSTRACT ................................................................................................... X
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 3
2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................ 5
2.1. BACTERIAS HALÓFILAS ............................................................................ 5
2.2. GENERALIDADES DEL PERCLORATO .................................................. 5
2.2.1. Vías de Exposición .............................................................................. 6
2.3. ORIGEN DEL PERCLORATO ................................................................... 7
2.3.1. Origen Natural ..................................................................................... 7
2.3.2. Origen Antropogénico .......................................................................... 8
2.4. EFECTOS DEL PERCLORATO EN EL MEDIO AMBIENTE .................... 9
2.4.1. Efecto en la Biota................................................................................. 9
2.4.2. Efectos en los Humanos .................................................................... 10
2.5. TECNOLOGÍAS DE TRATAMIENTO DE PERCLORATO ...................... 11
2.5.1. Métodos Físico-Químicos. ................................................................. 11
2.5.2. Tratamientos biológicos de perclorato ............................................... 12
2.6. BIOSORCIÓN CON BACTERIAS REDUCTORAS DE PERCLORATO . 13
2.6.1. Metabolismo Bacteriano en la Degradación del Perclorato ............... 17
2.6.2. Requerimientos Ambientales de las Bacterias Degradadoras ........... 18
2.6.3. Hábitat de Bacterias Reductoras de Perclorato ................................. 19
2.7. BACTERIAS HALÓFILAS Y SU RELACIÓN CON EL PERCLORATO
19
III
2.8. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS BACTERIANOS ................................... 20
2.8.1. Identificación Microscópica de Bacterias ........................................... 20
2.8.2. Identificación Bioquímica de Bacterias .............................................. 21
2.8.4. Ensayos de Susceptibilidad ............................................................... 22
3. ESTADO DEL ARTE Y ANTECEDENTES ................................................. 23
3. OBJETIVOS ................................................................................................ 25
4.1. OBJETIVO GENERAL ............................................................................. 25
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 25
5. METODOLOGÍA ......................................................................................... 26
5.1. AISLAMIENTO DE BACTERIAS HALÓFILAS ....................................... 26
5.1.1. Recolección de muestras .................................................................. 26
5.1.2. Aislamiento de cepas bacterianas ..................................................... 30
5.2. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN MICROSCÓPICA Y
BIOQUÍMICA DE LAS BACTERIAS .................................................................... 30
5.2.1. Identificación Microscópica ................................................................ 30
5.2.2. Identificación Bioquímica. .................................................................. 31
5.3. ENSAYOS DE SUSCEPTIBILIDAD ........................................................ 31
5.3.1. Ensayos de susceptibilidad al NaCl ................................................... 31
5.3.2. Ensayo de susceptibilidad al perclorato ............................................. 31
6. RESULTADOS ............................................................................................ 32
6.1. PRIMER MUESTREO: GALERAZAMBA (BOLÍVAR) ............................ 32
6.1.1. Identificación bioquímica de las bacterias aisladas. .......................... 36
6.1.2. Pruebas de susceptibilidad al NaCl ................................................... 38
6.1.3. Pruebas de susceptibilidad al KClO4 ................................................. 40
6.2. SEGUNDO MUESTREO: MINAS DE SAL DE MANAURE (GUAJIRA) . 41
6.2.1. Identificación bioquímica de las bacterias aisladas ........................... 45
6.2.2. Pruebas de susceptibilidad al NaCl ................................................... 47
6.2.3. Pruebas de susceptibilidad al KClO4 ................................................. 48
6.3. TERCER MUESTREO: VÍA PARQUE ISLA DE SALAMANCA
(MAGDALENA) ..................................................................................................... 49
IV
6.3.1. Identificación bioquímica de las bacterias aisladas ........................... 52
6.3.2. Pruebas de susceptibilidad al NaCl ................................................... 54
6.3.3. Pruebas de susceptibilidad al KClO4 ................................................. 55
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................................. 56
8. CONCLUSIONES........................................................................................ 59
9. TRABAJOS FUTUROS .............................................................................. 60
10. BIBLIOGRAFÍA........................................................................................... 61
11. ANEXOS ..................................................................................................... 77
11.1. MUESTREO GALERAZAMBA ................................................................ 77
11.2. MUESTREO MANAURE.......................................................................... 78
11.3. MUESTREO VÍA PARQUE ISLA DE SALAMANCA............................... 79
V
II. ÍNDICE DE FIGURAS
VI
III. ÍNDICE DE TABLAS
VIII
IV. RESUMEN
IX
V. ABSTRACT
In this study, native bacteria were characterized from hypersaline soils of the
Colombian Caribbean (Galerazamba, Manaure and Salamanca Island Road Park)
with potential perchlorate degrading capacity, identified microscopically by Gram
staining and biochemically by the BBL™ Crystal™ Kit ID System for Gram
negative and Gram positive bacteria and through oxidase and catalase tests,
allowing to characterize three bacteria genera: Vibrio sp., Bacillus sp., and
Escherichia coli. Also, sodium chloride and potassium perchlorate susceptibility
tests were performed, which proved that the bacteria isolated are halophiles and
tolerate concentrations up to 1500 ppm of potassium perchlorate, with exception of
the Escherichia Coli, which was susceptible to testing. Based on these results, it
was concluded that the genera Vibrio sp. and Bacillus sp. are potential perchlorate
reductors, being halophiles bacteria and tolerating high perchlorate concentrations.
X
1. INTRODUCCIÓN
3
Los tratamientos químicos basados fundamentalmente en el intercambio iónico,
utilizados en la actualidad para su degradación son poco eficientes, no selectivos,
y son incompletos, generando resinas o salmueras contaminadas que deben ser
tratadas posteriormente, llegando a ser en algunos casos más tóxicas que el
compuesto original (Wang et al., 2014), lo cual conlleva a la necesidad de
proponer tratamientos biológicos alternativos para depurar ambientes
contaminados con perclorato; encontrándose en la biorremediación una solución
prometedora, efectiva, económica y viable para eliminar el perclorato de los
ecosistemas, debido a que son muy eficientes, económicos, reproducibles, y sus
cultivos son de fácil manipulación (Bardiya & Bae, 2005; Xiao et al., 2010; London
et al., 2011)
En el Caribe colombiano existen suelos hipersalinos como las minas de sal de
Galerazamba y Manaure y la Vía Parque Isla de Salamanca, donde es factible
aislar y caracterizar bacterias con capacidad de degradar el perclorato. La razón
de seleccionar este tipo de ambientes se debe a que se ha demostrado que existe
formación natural de este contaminante en cantidades significativas en ambientes
hipersalinos (Cang et al., 2004; Park & Marchand, 2006; Lehman et al., 2008; Van
Ginkel et al., 2008; Ryu et al., 2012; Murray & Bolger, 2014), lo que posibilita la
presencia de bacterias con potencial capacidad de degradar el perclorato, debido
a que la habilidad de reducir este contaminante se incrementa en bacterias
tolerantes a la sal (Cang et al., 2004; Park & Marchand, 2006; Lehman et al., 2008;
Van Ginkel et al., 2008; Srinivasan & Viraraghavan, 2009; Ryu et al., 2012).
La necesidad de identificar y caracterizar las bacterias nativas de este tipo de
ambientes nace de la escasez de conocimiento sobre la diversidad microbiana de
ambientes naturales con potencialidades biotecnológicas para degradar
contaminantes ambientales; por lo tanto, la investigación marcará bases en
biorremediación y en la búsqueda y desarrollo de modelos biológicos eficientes
para la región que permitan la degradación del perclorato.
Por otro lado, dado que no existen muchos reportes de bacterias reductoras de
perclorato aplicables de manera universal, ni existe garantía de cuán eficientes
sean las especies reportadas en otras partes del mundo en ambientes tropicales
como los del Caribe colombiano, y es probable que al implementar especies no
nativas en biosistemas se pueda perturbar el equilibrio y la calidad ambiental de
los suelos (Cruz et al. (2004). Los resultados de esta investigación se establecen
como una fuente científica, aportando nuevos conocimientos en la identificación y
caracterización de bacterias nativas.
4
2. MARCO TEÓRICO
Aunque las sales se requieren para todas las formas de vida, las bacterias
halófilas se distinguen o clasifican por el requerimiento de condiciones hipersalinas
para su crecimiento. Estos microorganismos requieren cierta concentración de
NaCl para su desarrollo (González-Hernández & Peña, 2002; Oren, 2002; Ramírez
et al., 2006) y pueden ser clasificados en función de la cantidad de sal que
requieren: los halófilos ligeros muestran crecimiento óptimo dentro de una
concentración de NaCl que oscila entre 2 y 5%, los halófilos moderados entre 5 y
20 % de NaCl, y los halófilos extremos crecen de 20 a 30% de NaCl. En contraste,
los organismos no halófilos sólo pueden crecer por debajo de 2% de NaCl
(DasSarma & Arora, 2001; González-Hernández & Peña, 2002; Soria, 2004).
5
acuáticos se disocia fácilmente en anión perclorato y en sus cationes asociados
(Urbansky, 1998). Por otro lado, el perclorato que se encuentra en el suelo, puede
lixiviar a los cuerpos de agua, ser absorbido por plantas y acumularse en sus
tejidos vegetales, llegando a los humanos a través de la cadena alimenticia
(Sanchez et al., 2006; Voogt & Jackson, 2010; Lee et al., 2012)
6
los lactantes y niños menores de 7 años presentan la mayor exposición esperada,
con afectaciones en el sistema esquelético y sistema nervioso central (USFDA,
2008; Wang et al., 2008; Ye et al., 2012).
7
en Chile se ha reportado la presencia de rocas compuestas por carbonato de
calcio (Schumacher, 1960; Ericksen, 1983; Kounaves et al., 2010), yeso, sodio y
sales (nitrato de sodio, nitrato potasio y perclorato como contaminante). Este tipo
de rocas con perclorato también se han encontrado en el Valle de la Muerte en los
EE.UU en concentraciones de 1700 µg/kg (Rajagopalan et al., 2006; Rao et al.,
2007; Jackson et al., 2010). De acuerdo a este panorama, se informa que el
perclorato también se puede formar de manera natural en algunos fertilizantes,
dado que gran parte del nitrato utilizado en estos abonos proviene del desierto de
Atacama (Urbansky et al. (2001). Estas rocas compuestas con nitrato de sodio,
nitrato potasio y perclorato han sido extraídas y exportadas a todo el mundo
durante casi 200 años, por lo que la formación natural de perclorato en este
desierto ha tenido mayor interés (Murray & Bolger, 2014).
Gran parte del perclorato que se encuentra distribuido en las diferentes matrices
ambientales es el resultado de actividades antropogénicas. De acuerdo con el
informe “Perchlorate: A system to track sampling and cleanup results is needed”
del gobierno de los Estados Unidos (2005), el 65% de la contaminación por
perclorato se encuentra en aguas subterráneas y superficiales asociadas con
actividades militares, aeroespaciales, explosivas entre otras (Government
Accountability Office, 2005; Dasgupta et al., 2006; Parker, 2009; Attanasio et al.,
2011; Murray & Bolger, 2014).
Por otro lado, los fuegos artificiales también son una de las principales fuentes de
contaminación de perclorato en el ambiente, porque contienen químicos como
nitrato de potasio, cloruro de potasio, perclorato de potasio o perclorato de
amonio, carbón, azufre, manganeso, oxalato de sodio, aluminio y hierro en polvo,
nitrato de estroncio, y nitrato de batio (McLain, 1980; Thompson & Potter, 2000;
8
Motzer, 2001; Zoeller & Rovet, 2004; SERADP, 2005; Wang et al., 2007; Wu et al.,
2011).
Varios estudios han encontrado que el perclorato puede ser fácilmente acumulado
por las plantas (Yu et al., 2004; Jackson et al., 2005; Voogt & Jackson, 2010). Se
demostró que la planta de arroz (Oryza sativa L) es fácilmente contaminada por el
perclorato, sugiriendo que puede inhibir el crecimiento en plantas (Xie et al., 2009;
He et al., 2013; Xie et al., 2014). En otra investigación se comprobó que el
perclorato afecta el contenido de clorofila y las raíces de A. calamus, C. indica, T.
dealbata y E. crassipes, sin embargo, no está claro cómo el perclorato daña el
sistema fotosintético, por lo que es necesario investigar los mecanismos de acción
del perclorato en las plantas (Xie et al., 2014).
9
que el perclorato tiene efectos androgénicos (Bernhardt et al., 2006). Otros efectos
en los peces incluyen el desarrollo anormal de la placa lateral, disminución del
rendimiento de nado, tasas de crecimiento más lentas y reducción de la
pigmentación (Bernhardt et al., 2006; Bernhardt & von Hippel, 2008; Bernhardt et
al., 2011).
Por otra parte, se ha demostrado que produce cáncer de tiroides, afecta el sistema
nervioso, reproductivo, e inmunológico produciendo teratogénesis en mujeres
embarazadas (Thrash et al., 2007), y ha sido documentado en muestras humanas
de sangre, saliva, leche materna y orina (Kirk et al., 2005; Blount et al., 2006;
Blount et al., 2007; Pearce et al., 2007; Kannan et al., 2009; Oldi & Kannan, 2009;
Zhang et al., 2010). La exposición aguda a perclorato puede producir irritación en
ojos, piel y vías respiratorias, tos, náuseas, vómitos y diarrea. Así por ejemplo, el
ácido perclórico es corrosivo para los ojos, la piel y el tracto respiratorio y la
exposición a corto plazo a dosis elevadas puede causar dolor de garganta, tos,
dificultad respiratoria, quemaduras, pérdida de la visión, dolor abdominal, vómitos
y diarrea (EPA, 1999 ; Dozier et al., 2005).
10
2.5. TECNOLOGÍAS DE TRATAMIENTO DE PERCLORATO
2.5.1.3. Precipitación
11
2.5.1.4. Reducción Química
12
nidulans, Rhizopus rhizopodiformi, Rhizopus oryzae y Rhizopus pusillus),
comprobando que la biosorción fue similar para todos los hongos y la acumulación
del compuesto aumentó con el incremento de las concentraciones de perclorato.
También se ha encontrado que las algas marinas son potenciales biosorbentes
(Leusch et al., 1997).
13
en muestras de suelo y lacustres de la antártica, por lo que estos dos grupos
bacterianos son los más dominantes (Coates et al., 1999b; Achenbach et al.,
2001; Coates, 2005).
Género y % De
Especies De Degra- Referencia Observaciones
Bacterias dación
Degradación de perclorato bajo
Oceanicola sp 7 - 11 (Ahn et al., 2009)
condiciones de alta salinidad (3%)
Degradación de perclorato bajo
Nitratireductor sp 7 - 11 (Ahn et al., 2009)
condiciones de alta salinidad (3%)
(Coates et al.,
Dechlorospirillum 1999b; Bardiya & Degradación en condiciones aerobias;
70
sp Bae, 2008; Vigliotta temperatura 37°C
et al., 2010)
Dechlorospirillum
(Coates et al.,
anomalous strain ND Degradación en condiciones aerobias
1999b)
WD
Degradación en condiciones
Azospirillum sp 100 (Waller et al., 2004)
anaeróbicas; temperatura 22°C
Rhodobacter Temperatura 30°C; degradación en
80 (Bruce et al., 1999)
capsulatus condiciones facultativas
Rhodobacter Temperatura 30°C; degradación en
80 (Bruce et al., 1999)
sphaeroides condiciones facultativas
Magnetospirillum Temperatura 37°C; degradación en
70 (Xu & Logan, 2003)
magnetotacticum condiciones aerobias
Rhodocyclus Reducción óptima con salinidad del 1%;
60 (Bruce et al., 1999)
tenuis temperatura de 35°C, pH 7.5
Degradación en condiciones aerobias,
Burkholderia sp ND (Ghosh et al., 2011)
temperatura 30°C, pH 7
La enzima clorato reductasa mostró
(Bruce et al., 1999; aproximadamente 200 veces mayor
Ideonella
90 Lindqvist et al., reducción en células inducidas
Dechloratans
2012) anaeróbicamente. Condiciones
anaerobias; temperatura 30°C
(Vijaya Nadaraja et
Serratia Degradación en condiciones extremas de
100 al., 2013; Sankar et
Marcescens salinidad (más del 15%); pH de 4.0 a 9.0
al., 2014)
Dechlorobacter (Thrash et al., Crecimiento óptimo a 37°C con 0% de
100
hydrogenophilus 2007) salinidad; pH 6.5
14
Propionivibrio Crecimiento óptimo a 30°C con 0% de
100 (Gu & Brown, 2006)
militaris salinidad; pH 6.8
(Rikken et al., 1996;
Coates et al.,
1999b; Michaelidou Degradación tanto de perclorato como de
Dechloromonas 100 et al., 2000; clorato en condiciones facultativas
Achenbach et al., anaerobias
2001; Coates &
Achenbach, 2004)
Requiere CO2 como fuente de carbono.
Dechloromonas
100 (Zhang et al., 2002) Pueden degradar perclorato en presencia
sp. HZ
de Hidrógeno
Dechloromonas Degradación en presencia de Hidrógeno;
92 (Shrout et al., 2005)
sp. JDS5 Temperatura 30°C; pH 7.0
(Bruce et al., 1999;
Chaudhuri et al.,
Dechloromonas 2002; Nozawa-
100 Degradación en condiciones aerobias
agitata Inoue et al., 2005;
Sun et al., 2009;
Vigliotta et al., 2010)
Puede crecer autótrofamente con
Dechloromonas (Nerenberg et al.,
ND Hidrógeno como donador de electrones,
PC1 2006)
o heterótrofamente con acetato
(Rikken et al., 1996;
Coates et al.,
1999b; Michaelidou
et al., 2000;
Temperaturas de 20 °C a 37 °C; pH de
Achenbach et al.,
Dechlorosoma 6.0 a 8.0; Degradación en condiciones
20 2001; Tan &
sp (Azospira) aerobias. Acumulación máxima de clorato
Reinhold-Hurek,
de 41 a 279 mg/L. Agitación a 200 rpm
2003; Coates &
Achenbach, 2004;
Waller et al., 2004;
Guan et al., 2014)
Dechlorosoma Resulta efectivo para la degradación de
20 (Dudley et al., 2008)
sp. HCAP-C altas concentraciones de perclorato
Dechlorosoma Degradación de perclorato, clorato y
100 Zhang et al, 2005
sp. strain KJ nitrato en reactores
Se encuentran en condiciones
Dechlorosoma (Chaudhuri et al., ambientales de 30 °C. La respiración
(Azospira) 30 2002; Sun et al., microbiana de perclorato se ve afectada
suillum 2009) significativamente por variación en la
temperatura.
la remoción de perclorato oscilo entre
Halomonas sp. 7 - 11 (Ahn et al., 2009)
0.014 y 0.020 g/m2 por dia
15
(Logan et al.,
2001a; Okeke et al.,
Halomonas Reduce perclorato en concentraciones
ND 2002;
halodenitrificans de sal por encima de las del mar
Martinez‐Espinosa
et al., 2007)
Dechloromarinus (Bardiya & Bae, Condiciones ambientales de: 37-42 °C,
ND
cepa NSS 2011) pH 7.5, y 1.5-2.5 % NaCl
(Ahn et al., 2009;
Reductora de perclorato tolerante a la
Marinobacter sp. 7 - 11 Stepanov et al.,
sal, 5.6% NaCl soluciones NaCl
2014).
Aerobia capaz de crecer en salinidades
Alcanivorax sp. 7 - 11 (Ahn et al., 2009)
de of 0.46–20.3% NaCl
En concentraciones de 1, 5, 25, 50, 75,
Vibrio
20 (Wang et al., 2008) 100, 125, 150, 175, 200 mg/L. Donador
dechloraticans
de aceptadores
Se encuentra en condiciones ambientales
(Rikken et al., 1996; de temperatura 30 °C y pH 7. Reductora
Citrobacter sp. 32
Okeke et al., 2002) de perclorato, tolerante a la sal, 0-5
soluciones NaCl.
16
Hipertermofílica, el mecanismo de
(Liebensteiner et al., reducción de perclorato no involucra la
Archaeoglobus
ND 2013; Liebensteiner enzima clorito dismutasa, por lo que la
fulgidus
et al., 2014) reducción de perclorato no es llevada de
clorito a cloruro y oxígeno.
Para reducción de perclorato no involucra
Hyperthermophili (Liebensteiner et al., la enzima clorito dismutasa, por lo que la
ND
c archaea 2013) reducción de perclorato no es llevada de
clorito a cloruro y oxígeno.
Temperatura 37 °C, Se requiere
(Nozawa-Inoue et
enriquecimiento de Hidrogeno,
Clostridium sp. 80 al., 2005; Chung et
Degradación en conducciones
al., 2009)
facultativas.
Reducción en condiciones aerobias,
(Hackenthal et al., pueden tolerar altas concentraciones de
Bacillus sp. ND 1964; Rainey, 2012; perclorato y son capaces de reducirlo a
Oren et al., 2014) una tasa de 71.04 mg/día por gramo de
biomasa
-ND: No determinado
17
como un aceptor de electrones para su metabolismo (Coates et al., 2000). La
enzima reductasa es la encargada de reducir el perclorato a clorato y de clorato a
clorito, mientras que la enzima clorito superóxido transforma el clorito a cloruro y
oxígeno molecular, por lo que la vía de reducción metabólica ampliamente
aceptada por los investigadores es la siguiente (Logan et al., 2001a; Xu & Logan,
2003; Nozawa-Inoue et al., 2005; Nerenberg et al., 2006):
18
en condiciones anaerobias o facultativas (Chaudhuri et al., 2002; Shrout et al.,
2005).
Por otro lado, se ha reportado que la reducción de perclorato se produce en un
rango de temperatura de 10 a 40°C, no obstante, la reducción óptima se produce
entre los 28 y 37°C (Bruce et al., 1999; Giblin & Frankenberger, 2001; Chaudhuri
et al., 2002). Así mismo, esta se limita generalmente a condiciones de bajo
contenido de sal (<2% de NaCl), aunque también se reporta reducción en altas
concentraciones de sal (Logan et al., 2001a; Okeke et al., 2002; Cang et al., 2004;
Park & Marchand, 2006; Balk et al., 2008; Lehman et al., 2008; Van Ginkel et al.,
2008; Chung et al., 2010).
19
grandes que los que se encuentran en regiones de mayor precipitación (Srinivasan
& Viraraghavan, 2009). Por lo anterior en los ambientes hipersalinos se han
reportado concentraciones significativas de perclorato que van desde 25 a 2700
mg/kg (Cang et al., 2004; Park & Marchand, 2006; Lehman et al., 2008; Van
Ginkel et al., 2008; Ryu et al., 2012), lo que posibilita la presencia de bacterias
halófilas con potencial capacidad de degradar el perclorato, debido a que la
habilidad de reducir este contaminante se incrementa en bacterias tolerantes a la
sal (Cang et al., 2004; Park & Marchand, 2006; Lehman et al., 2008; Van Ginkel et
al., 2008; Srinivasan & Viraraghavan, 2009; Ryu et al., 2012).
20
peptidoglicán en su pared celular, por lo que se tiñen con el cristal violeta y no se
decoloran, y como Gram negativas aquellas que han sido decoloradas y se tiñen
con el colorante de contraste (Pérez & Peris, 1997; Cavallini, 2005). Algunas
bacterias se caracterizan como Gram variables, pues simultáneamente presentan
tinción Gram positiva y negativa, aún bajo condiciones óptimas de cultivo
(Cavallini, 2005).
21
formación de agua y juega un papel importante en la vía metabólica del nitrato en
ciertas bacterias (Koneman & Allen, 2008; Forbes, 2009).
El Kit está compuesto de las tapas del panel BBL Crystal E/NF, las bases BBL
Crystal y los tubos de fluido (IF). La tapa contiene 30 sustratos deshidratados en
las puntas de los dientes, la base tiene 30 pocillos de reacción y el inóculo del
análisis está preparado con el fluido del inóculo y se utiliza para llenar los 30
pocillos de la base. Cuando se alinea la tapa con la base y se cierra en su lugar, el
inóculo del análisis rehidrata los sustratos secos e inicia las reacciones del
análisis. Luego del proceso de incubación, se examinan los pocillos para observar
cambios de color, producto de las actividades metabólicas de los
microorganismos, obteniendo un patrón resultante de las 30 reacciones que se
utiliza como base para la identificación (Guia BD BBL Crystal ID).
22
3. ESTADO DEL ARTE Y ANTECEDENTES
23
Ilustración 1: Número de artículos sobre bacterias degradadoras de perclorato en el medio ambiente por años
Articulos ScienceDirect
200
180
Nùmero de publicaciones
160
140
120
100
80
60
40
20
0
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
Año de publicación
Fuente: Registro de ScienceDirect (Búsqueda realizada el 22 de Septiembre del 2015).
Ilustración 2: Número de artículos sobre bacterias degradadoras de perclorato en el medio ambiente por años.
Articulos SpringerLink
70
60
Nùmero de publicaciones
50
40
30
20
10
0
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
Año de publicación
24
3. OBJETIVOS
25
5. METODOLOGÍA
Fuente: Autores.
26
5.1.1.1.1. Primer muestreo: Galerazamba, Bolívar (26 de Noviembre de 2014).
Fuente: Autores.
Fuente: Autores.
27
5.1.1.1.2. Segundo muestreo: Manaure, Guajira (15 de Mayo de 2015).
Ilustración 6: Mapa de las salinas de Manaure.
Fuente: Autores.
Fuente: Autores.
28
Tabla 3: Coordenadas de los puntos de muestreo en Manaure.
Fuente: Autores.
29
Tabla 4: Coordenadas de los puntos de muestreo en Vía Parque Isla de Salamanca.
30
las características morfológicas y bioquímicas de cada grupo bacteriano
identificado.
31
6. RESULTADOS
Coordenadas Método de
Código Muestra Género†
Geográficas Aislamiento
Sedimentos 10°47'41.3"N LB-caldo
G001 Vibrio sp
marinos 75°15'37.7"W agua de mar
Sedimentos 10°47'42.4"N LB-caldo
G002 Vibrio sp
marinos 75°15'37.3"W agua de mar
Sedimentos 10°47'42.4"N LB-caldo
G003 Vibrio sp
marinos 75°15'37.3"W agua de mar
Sedimentos 10°47'44.8"N LB-caldo
G004 Vibrio sp
marinos 75°15'33.2"W agua de mar
Sedimentos 10°47'45.7"N LB-caldo
G005 Vibrio sp
marinos 75°15'31.8"W agua de mar
Sedimentos 10°47'45.5"N LB-caldo
G007 Bacillus sp
marinos 75°15'30.2"W agua de mar
Sedimentos 10°47'45.5"N LB-caldo
G008 Bacillus sp
marinos 75°15'30.2"W agua de mar
Sedimentos 10°47'44.7"N LB-caldo
G009 Bacillus sp
marinos 75°15'30.3"W agua de mar
Sedimentos 10°47'44.7"N LB-caldo
G010 Bacillus sp
marinos 75°15'30.3"W agua de mar
Sedimentos 10°47'42.7"N LB-caldo
G011 Vibrio sp
marinos 75°15'28.4"W agua de mar
Sedimentos 10°47'42.7"N LB-caldo
G012 Vibrio sp
marinos 75°15'28.4"W agua de mar
Sedimentos 10°47'42.7"N LB-caldo
G013 Vibrio sp
marinos 75°15'28.4"W agua de mar
† La identificación de los caracteres morfológicos y taxonómicos basados en el Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology (2005) y Atlas Microbiológico de Koneman (2008).
32
Tabla 6: Caracterización Microscópica y Bioquímica de las bacterias halófilas aisladas de Galerazamba (Bolívar), Caribe colombiano. .
Catalasa
Oxidasa
Gram
Código Nombre Evidencia Descripción
Hábitat Observaciones
cepa científico Fotográfica Microscópica
Halófilo.Puede
Forma:
Vibrio sp crecer en medios Bacilo pequeño, móvil, no presenta
G002 Bacilos - - -
ligeramente cápsula ni espora.
curvados
básicos.
Forma:
Vibrio sp Bacilo pequeño, móvil, no presenta
G003 Bacilos - - - Halófilo
cápsula ni espora.
curvados
33
Forma: Bacilos rectos o curvos, no esporulados, 2
G006 Vibrio sp Bacilos - + - Halófilo y 3 µm de largo, móviles, facultativos,
curvados dotados de un único flagelo polar.
34
Bacilos gruesos, de 0.9 µm, gram
variables, aerobios, crecenentre 17 y 37°C
Forma:
y pH de 4,5, hidrolizan urea,
Bacilos,
betagalactosidasa, caseína, almidon, con
G010 Bacillus sp Colonias + - + Suelos salinos
citrato +, producen ácido a partir de D-
opacas y
Glucosa, D-Manitol, glicerol, fructosa,
suaves
galactosa, rabonosa, sacarosa, trehalosa,
negativo a esculina, fenilalanina.
Forma:
Bacilos
curvados. Bacilos monótricos de 0.5-0.6 µm, no
Colonias Suelos esporulados, gram variables, facultativos
G011 Vibrio sp cremosas, + + - hipersalinos y móviles, crecimiento entre los 20 y 50°C
opacas, salmueras (optimo a 37°C) y pH entre 5.5 y 8.5, indol
circulares, negativo.
convexas,
lisas
35
6.1.1. Identificación bioquímica de las bacterias aisladas.
CEPAS
SUSTRATOS
01 02 03 04 05 06 011 012 013
Fermentación de Lactosa + - - - - - - - -
Lisina - - - - - - - - -
Arginina - - - - - - - - -
Cloruro de trifeniltetrazolio + + - + + + - - -
Ácido malónico - + - - - - - - -
Citrato - - - - - - - - -
Glicina - - - - + + - - -
Urea - - - - - - - - -
p-nitro-DL-fenilalanina - - + - - - - - -
Esculina + - - - + + - - -
γ-L-glutamil p-nitroanilida - + - - + + - - -
p-n-p-N-acetil glucosamidina - - - + - - - - -
p-n-p-ß-glucurónido - - - - + + - - +
p-n-p-fosforilcolina - + - - - - - - -
p-n-p-a-arabinósido - + - - - - - - -
p-n-p-xilósido - - - - + + + - +
p-n-p bis-fosfato + + - + + + - - -
Prolinanitroanilida + + - + + + - - -
p-n-p-ß-galactósido + - - - - - - + +
p-n-p a-ß-glucósido + + - + - - - - +
p-n-p-fosfato + - - + + + - + -
Inositol + - + - - - - - +
Galactosa + + + - - - + + +
Adonitol + - + - - - - - -
Manitol + - + + + + - - -
Sorbitol + - + - - - - - -
Ramnosa + - + - - - + - +
Melibiosa + - + - - - - - -
Sacarosa + + + + + + - - -
Manosa + + + + + + - - -
Arabinosa + - + + - - - - +
Catalasa - - - + + + + + +
Oxidasa + - - - - - + + +
001. Vibrio sp. 002. Vibrio sp. 003. Vibrio sp. 004. Vibrio sp. 005. Vibrio sp. 011. Vibrio sp .012. Vibrio sp 013.
Vibrio sp.
36
Tabla 8: Actividad bioquímica de bacterias Gram positivas aisladas en Galerazamba
CEPAS
SUSTRATOS
07 08 09 010
Fermentación de Lactosa + - - -
Lisina - - - -
Arginina - - - -
Cloruro de trifeniltetrazolio + + - -
Ácido malónico - + - -
Citrato - - - -
Glicina - - - -
Urea - - - -
p-nitro-DL-fenilalanina - - + -
Esculina + - - -
γ-L-glutamil p-nitroanilida - + - -
p-n-p-N-acetil glucosamidina - - - -
p-n-p-ß-glucurónido - - - -
p-n-p-fosforilcolina - + - -
p-n-p-a-arabinósido - + - -
p-n-p-xilósido - - - +
p-n-p bis-fosfato + + - -
Prolinanitroanilida + + - -
p-n-p-ß-galactósido + - - -
p-n-p a-ß-glucósido + + - -
p-n-p-fosfato + - - -
Inositol + - + -
Galactosa + + + +
Adonitol + - + -
Manitol + - + -
Sorbitol + - + -
Ramnosa + - + +
Melibiosa + - + -
Sacarosa + + + -
Manosa + + + -
Arabinosa + - + -
Catalasa + + + -
Oxidasa + + + +
007. Bacillus sp. 008. Bacillus sp. 009. Bacillus sp 010. Bacillus sp.
37
6.1.2. Pruebas de susceptibilidad al NaCl
Concentraciones (ppm)
Código
Observaciones
bacteria 300000 150000 75000 50000 35000
Crecimiento
001 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal*
Crecimiento
002 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal
Crecimiento
003 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal
Crecimiento
004 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal
Crecimiento
005 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal
Crecimiento
006 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal
Crecimiento
007 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
008 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal
Crecimiento
009 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal
Crecimiento
010 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
011 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal
Crecimiento
012 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
normal*
Crecimiento
013 R/R/R* R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
- * : formación de biopelículas en la parte superior del medio
- S: sensible (no se observa crecimiento)
- R: resistente (se observa crecimiento)
38
Tabla 10: Cálculos para experimento de susceptibilidad de bacterias al NaCl.
LB Final
Volumen
LB (mL) 600000 NaCl
final (mL)
ppm (mL) (ppm)
0 5 5 300.000
2.5 2.5 5 150.000
1.25 3.75 5 75.000
0.83 4.17 5 50.000
0.58 4.42 5 35.000
Ilustración 9: Presencia de biopelículas en los cultivos de Géneros bacterianos resistentes a NaCl aislados de
sedimentos marinos de Galerazamba (Bolívar).
39
6.1.3. Pruebas de susceptibilidad al KClO4
Tabla 11: Prueba susceptibilidad a diferentes concentraciones de KClO4 de bacterias aisladas de
Galerazamba (Bolívar).
Volumen
ppm KClO4 (g) final
(mL)
100 0.05 5
250 0.125 5
500 0.25 5
750 0.375 5
1000 0.5 5
1250 0.625 5
1500 0.75 5
40
6.2. SEGUNDO MUESTREO: MINAS DE SAL DE MANAURE (GUAJIRA)
Coordenadas Método de
Código Muestra Género†
Geográficas Aislamiento
LB-
11°46'10.9524"N
M001 Sedimentos marinos caldoagua Vibrio sp
72°28'24.3804"W
de mar
11°46'20.568"N LB-caldo
M002 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°28'25.7916"W agua de mar
11°46'17,4396"N LB-caldo
M003 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°28'24,6578"W agua de mar
11°46'04.5124"N LB-caldo
M004 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°28'20.7103"W agua de mar
11°46'05.5915"N LB-caldo
M005 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°28'08.3525"W agua de mar
11°46'05.5915"N LB-caldo
M006 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°28'08.3525"W agua de mar
11°46'22.1808"N LB-caldo
M007 Sedimentos marinos Bacillus sp
72°28'27.0192"W agua de mar
11°46'22.1736"N LB-caldo
M008 Sedimentos marinos Bacillus sp
72°28'26.7312"W agua de mar
11°46'24.2688"N LB-caldo
M009 Sedimentos marinos Bacillus sp
72°28'20.928"W agua de mar
11°46'14.1558"N LB-caldo
M010 Sedimentos marinos Bacillus sp
72°28'09.6572"W agua de mar
11°6'25.3596"N LB-caldo
M011 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°28'18.4908"W agua de mar
11°46'26.3470"N LB-caldo
M012 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°28'03.8296"W agua de mar
11°46'23.8025"N LB-caldo
M013 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°27'52.0477"W agua de mar
11°46'12.3845"N LB-caldo
M014 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°27'47.0806"W agua de mar
11°46'12.3845"N LB-caldo
M015 Sedimentos marinos Vibrio sp
72°27'47.0806"W agua de mar
† La identificación de los caracteres morfológicos y taxonómicos basados en el Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology (2005) y Atlas Microbiológico de Koneman (2008).
41
Tabla 14: Caracterización Microscópica y Bioquímica de las bacterias halófilas aisladas de Manaure (Guajira), Caribe colombiano..
Catalasa
Oxidasa
Gram
Código Nombre Evidencia Descripción
Hábitat Observaciones
cepa científico Fotográfica Microscópica
Forma:
Suelos Bacilos móviles, no presenta cápsula ni
M003 Vibrio sp Bacilos - - -
hipersalinos espora.
curvados
La cepa oxida hidratos de carbono,
Forma:
Suelos nucleósidos, aminoácidos y ácidos
M004 Vibrio sp. Bacilos - + -
hipersalinos orgánicos, y enzimas lipolíticas y
curvados
proteolíticas constitutivas.
Forma: Bacilos rectos o curvos, no esporulados,
Suelos
M005 Vibrio sp Bacilos - + - 2 y 3 µm de largo, facultativos, móviles,
hipersalinos
curvados dotados de un único flagelo polar.
42
Bacilos grandes, móviles, aerobios,
Forma: crece entre los 5 y 50 °C, reductoras de
Bacilos nitrato, hidrolizan caseína y almidón,
Bacillus Colonias Suelos producen acido a partir de L-Arabinosa,
M007 + + +
sp opacas hipersalinos celobiosa, fructosa, galactosa, D-
suaves y glucosa, maltosa, D-Manitol, D-manosa,
circulares ramnosa, ribosa, sorbitol y sacarosa,
trehalosa, salicina y D-xilosa
Bacilos grandes, móviles, aerobios,
crece entre los 5 y 50 °C, reductoras de
nitrato, hidrolizan caseína y almidón,
Forma: Suelos producen acido a partir de L-Arabinosa,
M008 Bacillus + + +
Bacilos hipersalinos celobiosa, fructosa, galactosa, D-
sp
glucosa, maltosa, D-Manitol, D-manosa,
ramnosa, ribosa, sorbitol y sacarosa,
trehalosa, salicina y D-xilosa
Bacilos pequeños (de 0.6 a 0.7µm),
Forma: flagelación perítrica, móviles, crecen
Bacilos entre 10 y 47 °C, y pH de 9 a 10,
Bacillus
M009 Colonias color + + + Suelos salinos tolerantes a las sal, reductoras de nitrato,
sp
blanco hidrolizan la caseína, almidón y la beta
cremoso galactosidasa.No desaminan fenilalanina
ni hidrolizan úrea.
Bacilos gruesos, de 0.9 µm, gram
variables, aerobios, crecenentre 17 y
Forma:
37°C y pH de 4,5, hidrolizan urea,
Bacilos
betagalactosidasa, caseína, almidon, con
Bacillus Colonias
M010 + - + Suelos salinos citrato +, producen ácido a partir de D-
sp opacas y
Glucosa, D-Manitol, glicerol, fructosa,
suaves
galactosa, rabonosa, sacarosa,
trehalosa, negativo a esculina,
fenilalanina.
43
Forma:
Bacilos
curvados. Bacilos monótricos de 0.5-0.6 µm, no
Colonias Suelos esporulados, gram variables, facultativos
M011 Vibrio sp cremosas, + + - hipersalinos y móviles, crecimiento entre los 20 y 50°C
opacas, salmueras (optimo a 37°C) y pH entre 5.5 y 8.5,
circulares, indol negativo.
convexas,
lisas
Bacilos monótricos de 0.5-0.6 µm, no
Forma: Suelos esporulados, gram variables, facultativos
M012 Vibrio sp Bacilos + + - hipersalinos y móviles, crecimiento entre los 20 y 50°C
curvados. salmueras (optimo a 37°C) y pH entre 5.5 y 8.5,
indol negativo.
44
6.2.1. Identificación bioquímica de las bacterias aisladas
CEPAS
SUSTRATOS
01 02 03 04 05 06 011 012 013 014 015
Fermentación de Lactosa + - - - - - - - - - -
Lisina - - - - - - - - - - -
Arginina - - - - + + - - - - -
Cloruro de trifeniltetrazolio + + - + + + - - - - -
Ácido malónico - + - - - - - - - - -
Citrato - - - - - - - - - - -
Glicina - - - - + + - - - - -
Urea - - - - - - - - - - -
p-nitro-DL-fenilalanina - - + - - - - - - - -
Esculina + - - - + + - - - - -
γ-L-glutamil p-nitroanilida - + - - + + - - - - -
p-n-p-N-acetil glucosamidina - - - + - - - - - - -
p-n-p-ß-glucurónido - - - - + + + + + + +
p-n-p-fosforilcolina - + - - - - - - - - -
p-n-p-a-arabinósido - + - - - - - - - - -
p-n-p-xilósido - - - - + + + + + + +
p-n-p bis-fosfato + + - + + + - - - - -
Prolinanitroanilida + + - + + + - - - - -
p-n-p-ß-galactósido + - - - - - + + + + +
p-n-p a-ß-glucósido + + - + - - + + + + +
p-n-p-fosfato + - - + + + - - - - -
Inositol + - + - - - + + + + +
Galactosa + + + - - - + + + + +
Adonitol + - + - - - - - - - -
Manitol + - + + + + - - - - -
Sorbitol + - + - - - - - - - -
Ramnosa + - + - - - + + + + +
Melibiosa + - + - - - - - - - -
Sacarosa + + + + + + - - - - -
Manosa + + + + + + - - - - -
Arabinosa + - + + - - + + + + +
Catalasa - - - + + + + + + + +
Oxidasa + - - - - - + + + + +
001. Vibrio sp. 002. Vibrio sp. 003. Vibrio sp. 004. Vibrio sp..005. Vibrio sp. 006. Vibrio sp 011. Vibrio sp .012.
Vibrio sp 013. Vibrio sp 014. Vibrio sp 015. Vibrio sp.
45
Tabla 16: Actividad bioquímica de bacterias Gram positivas aisladas en Manaure.
CEPAS
SUSTRATOS
07 08 09 010
Fermentación de Lactosa + - - -
Lisina - - - -
Arginina - - - -
Cloruro de trifeniltetrazolio + + - -
Ácido malónico - + - -
Citrato - - - -
Glicina - - - -
Urea - - - -
p-nitro-DL-fenilalanina - - + -
Esculina + - - -
γ-L-glutamil p-nitroanilida - + - -
p-n-p-N-acetil glucosamidina - - - -
p-n-p-ß-glucurónido - - - -
p-n-p-fosforilcolina - + - -
p-n-p-a-arabinósido - + - -
p-n-p-xilósido - - - +
p-n-p bis-fosfato + + - -
Prolinanitroanilida + + - -
p-n-p-ß-galactósido + - - -
p-n-p a-ß-glucósido + + - -
p-n-p-fosfato + - - -
Inositol + - + -
Galactosa + + + +
Adonitol + - + -
Manitol + - + -
Sorbitol + - + -
Ramnosa + - + +
Melibiosa + - + -
Sacarosa + + + -
Manosa + + + -
Arabinosa + - + -
Catalasa + + + -
Oxidasa + + + +
007. Bacillus sp. 008. Bacillus sp. 009. Bacillus sp 010. Bacillus sp.
46
6.2.2. Pruebas de susceptibilidad al NaCl
Tabla 17: Prueba susceptibilidad a diferentes concentraciones de NaCl de bacterias aisladas de Manaure
(Guajira).
47
6.2.3. Pruebas de susceptibilidad al KClO4
Tabla 18: Prueba susceptibilidad a diferentes concentraciones de KClO4 de bacterias aisladas de Manaure
(Guajira).
Código Concentración (ppm)
Observaciones
bacteria 100 250 500 750 1000 1250 1500
Crecimiento
001 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
002 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
003 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
004 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
005 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
006 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
007 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
008 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
009 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
010 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
011 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
012 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
013 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
014 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
Crecimiento
015 R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R R/R/R
masivo
- R : resistente (se observa crecimiento)
Volumen
ppm KClO4 (g) final
(mL)
100 0.05 5
250 0.125 5
500 0.25 5
750 0.375 5
1000 0.5 5
1250 0.625 5
1500 0.75 5
48
6.3. TERCER MUESTREO: VÍA PARQUE ISLA DE SALAMANCA
(MAGDALENA)
Tabla 20: Aislamiento de bacterias Halófilas en suelos salinos del Vía Parque Isla de Salamanca. .
Coordenadas Método de
Código Muestra Género†
Geográficas Aislamiento
Sedimentos 10°59'19.4''N LB-caldo
S001 Vibrio sp
marinos 74°17'45.5''W agua de mar
Sedimentos 10°59'03.3"N LB-caldo
S002 Vibrio sp
marinos 74°18'22.9"W agua de mar
Sedimentos 10°58'52.4"N LB-caldo
S003 Vibrio sp
marinos 74°19'11.3"W agua de mar
Sedimentos 10°58'42.7"N LB-caldo
S004 Vibrio sp
marinos 74°20'07.4"W agua de mar
Sedimentos 10°59'19.4''N LB-caldo
S005 Eschericha coli
marinos 74°17'45.5''W agua de mar
Sedimentos 10°58'34.8"N LB-caldo
S006 Vibrio sp
marinos 74°21'01.8"W agua de mar
Sedimentos 10°58'29.0"N LB-caldo
S007 Bacillus sp
marinos 74°25'38.0"W agua de mar
Sedimentos 11°00'40.0"N LB-caldo
S008 Bacillus sp
marinos 74°36'29.6"W agua de mar
Sedimentos 10°47'44.7"N LB-caldo
S009 Bacillus sp
marinos 75°15'30.3"W agua de mar
Sedimentos 10°59'19.4''N LB-caldo
S010 Eschericha coli
marinos 74°17'45.5''W agua de mar
† La identificación de los caracteres morfológicos y taxonómicos basados en el Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology (2005) y Atlas Microbiológico de Koneman (2008).
49
Tabla 21: Caracterización Microscópica y Bioquímica de las bacterias halófilas aisladas de Vía Parque Isla de Salamanca (Magdalena), Caribe colombiano.
Catalasa
Oxidasa
Gram
Código Nombre Evidencia Descripción
Hábitat Observaciones
cepa científico Fotográfica Microscópica
Forma:
Bacilo pequeño, móvil, no presenta cápsula
S003 Vibrio sp Bacilos - - - Halófilo
ni espora.
curvados
Forma: Hábitat
Eschericha Bacilos rectos o curvos, no esporulados,
S005 Bacilos - + - contaminados con
coli facultativos
curvados materia fecal
50
Bacilos grandes, móviles, aerobio, crece
Forma: entre los 5 y 50 °C, reducen nitrato,
Bacilos. hidrolizan caseína y almidón, producen
Colonias acido a partir de L-Arabinosa, celobiosa,
S007 Bacillus sp + + + Suelos salinos
opacas, fructosa, galactosa, D-glucosa, maltosa, D-
suaves y Manitol, D-manosa, ramnosa, ribosa,
circulares sorbitol y sacarosa, trehalosa, salicina y D-
xilosa.
Bacilos pequeños (de 0.6 a 0.7µm),
Forma:
flagelación perítrica, móviles, crecen entre
Bacilos,
10 y 47 °C, y pH de 9 a 10, tolerantes a las
S008 Bacillus sp Colonias + + + Suelos salinos
sal, reductoras de nitrato, hidrolizan la
blanco
caseína, almidón y la beta galactosidasa.No
cremoso
desaminan fenilalanina ni hidrolizan úrea.
Bacilos pequeños (de 0.6 a 0.7µm),
Forma:
flagelación perítrica, móviles, crecen entre
Bacilos,
Bacillus sp 10 y 47 °C, y pH de 9 a 10, tolerantes a las
S009 Colonias + + + Suelos salinos
sal, reductoras de nitrato, hidrolizan la
blanco
caseína, almidón y la beta galactosidasa.No
cremoso
desaminan fenilalanina ni hidrolizan úrea.
Forma: Hábitat
Eschericha Bacilos rectos o curvos, no esporulados,
S010 Bacilos + + - contaminados con
coli facultativos
curvados. materia fecal
51
6.3.1. Identificación bioquímica de las bacterias aisladas
Tabla 22: Actividad bioquímica de bacterias Gram negativas aisladas en Vía Isla de Parque de Salamanca
CEPAS
SUSTRATOS
01 02 03 04 05 06 010
Fermentación de Lactosa + - - - - - -
Lisina - - - - - - -
Arginina - - - - + + +
Cloruro de trifeniltetrazolio + + - + + + +
Ácido malónico - + - - - - -
Citrato - - - - - - -
Glicina - - - - + + +
Urea - - - - - - -
p-nitro-DL-fenilalanina - - + - - - -
Esculina + - - - + + +
γ-L-glutamil p-nitroanilida - + - - + + +
p-n-p-N-acetil glucosamidina - - - + - - -
p-n-p-ß-glucurónido - - - - + + +
p-n-p-fosforilcolina - + - - - - -
p-n-p-a-arabinósido - + - - - - -
p-n-p-xilósido - - - - + + +
p-n-p bis-fosfato + + - + + + +
Prolinanitroanilida + + - + + + +
p-n-p-ß-galactósido + - - - - - -
p-n-p a-ß-glucósido + + - + - - -
p-n-p-fosfato + - - + + + +
Inositol + - + - - - -
Galactosa + + + - - - -
Adonitol + - + - - - -
Manitol + - + + + + +
Sorbitol + - + - - - -
Ramnosa + - + - - - -
Melibiosa + - + - - - -
Sacarosa + + + + + + +
Manosa + + + + + + +
Arabinosa + - + + - - -
Catalasa - - - + + + +
Oxidasa + - - - - - +
001. Vibrio sp. 002. Vibrio sp. 003. Vibrio sp. 004. Vibrio sp..005. Eschericha coli. 006. Vibrio . 010. Eschericha
coli
52
Tabla 23: Actividad bioquímica de bacterias Gram positivas aisladas en Vía Parque de Salamanca
CEPAS
SUSTRATOS
07 08 09
Fermentación de Lactosa + - -
Lisina - - -
Arginina - - -
Cloruro de trifeniltetrazolio + + -
Ácido malónico - + -
Citrato - - -
Glicina - - -
Urea - - -
p-nitro-DL-fenilalanina - - +
Esculina + - -
γ-L-glutamil p-nitroanilida - + -
p-n-p-N-acetil glucosamidina - - -
p-n-p-ß-glucurónido - - -
p-n-p-fosforilcolina - + -
p-n-p-a-arabinósido - + -
p-n-p-xilósido - - -
p-n-p bis-fosfato + + -
Prolinanitroanilida + + -
p-n-p-ß-galactósido + - -
p-n-p a-ß-glucósido + + -
p-n-p-fosfato + - -
Inositol + - +
Galactosa + + +
Adonitol + - +
Manitol + - +
Sorbitol + - +
Ramnosa + - +
Melibiosa + - +
Sacarosa + + +
Manosa + + +
Arabinosa + - +
Catalasa + + +
Oxidasa + + +
007. Bacillus sp. 008. Bacillus sp. 009. Bacillus sp
53
6.3.2. Pruebas de susceptibilidad al NaCl
Tabla 24: Prueba susceptibilidad a diferentes concentraciones de NaCl de bacterias aisladas de Vía Parque
Isla Salamanca (Magdalena).
54
6.3.3. Pruebas de susceptibilidad al KClO4
Tabla 25: Prueba susceptibilidad a diferentes concentraciones de KClO4 de bacterias aisladas de Vía Parque
Isla Salamanca (Magdalena).
Volumen
ppm KClO4 (g) final
(mL)
100 0.05 5
250 0.125 5
500 0.25 5
750 0.375 5
1000 0.5 5
1250 0.625 5
1500 0.75 5
55
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Por otro lado, los resultados de las pruebas de susceptibilidad confirmaron que la
mayoría de bacterias aisladas son halófilas, pues sobrevivieron a concentraciones
de NaCl mayores a las del agua de mar (35000 ppm NaCl). Estas condiciones
resultan favorables para las bacterias de los géneros Vibrio sp y Bacillus sp
aisladas y caracterizadas, dado que la salinidad es un factor determinante para
estas, pues las Vibrio necesitan iones de sodio para mantener la integridad de su
pared celular y membrana, mientras que algunas especies de Bacillus crecen a
grandes concentraciones de sal (70000 ppm – 75000 ppm NaCl, y en algunos
casos hasta 100000 ppm) (Granum et al., 2014), por lo que no resulta inusual la
presencia de estas bacterias en ambientes hipersalinos.
Sin embargo, las cepas de E. coli aisladas de Vía Parque Isla de Salamanca
resultaron susceptibles a las condiciones de alta salinidad, por lo que su presencia
56
es atribuida al aporte de las actividades antrópicas de la zona, y fueron
susceptibles a todas las concentraciones de perclorato a las que fueron expuestas
(desde 100 ppm hasta 1500 ppm).
En definitiva, es factible que los géneros Vibrio sp y Bacillus sp. sean potenciales
reductores de perclorato, dado que existen reportes de especies degradadoras de
este contaminante, y además, por ser aisladas de ambientes hipersalinos, su
57
potencial de degradación aumenta, dado que en estos lugares existe formación
natural de perclorato, presentando así los mecanismos metabólicos necesarios
para resistir y sobrevivir bajo estas condiciones (Coates & Achenbach, 2006).
58
8. CONCLUSIONES
59
9. TRABAJOS FUTUROS
Por otra parte, se sugiere realizar pruebas pilotos en suelos con estas bacterias,
mediante la aplicación de modelos biológicos, con el fin de determinar su
capacidad de degradación al perclorato y los mecanismos metabólicos que las
hacen resistentes a este contaminante. Incluso, es indispensable establecer
estudios que permitan observar el comportamiento in vivo de estas cepas, con
otras comunidades microbianas, para determinar si estas afectan o contribuyen
con el proceso de reducción. Además, se debe determinar si las bacterias aisladas
pueden degradar otros contaminantes como el nitrato, el cual suele ser degradado
por ciertas bacterias reductoras de perclorato y si esto implicaría una disminución
en la eficiencia de reducción a este contaminante.
Sumado a ello, se debe estudiar más a fondo la relación entre la salinidad del
medio donde crecen las bacterias y su resistencia al perclorato, debido al vínculo
entre estos factores encontrado en el presente estudio. Adicionalmente, se
requiere determinar la concentración de sal, perclorato, temperatura, pH y
cantidad de donadores de electrones ideal para el crecimiento de los géneros,
puesto que es importante establecer las condiciones requeridas para modelar la
degradación del perclorato frente estas variables y diseñar sistemas de ingeniería
que permitan remediar la contaminación por perclorato a escala en laboratorio,
como biorreactores de película fija, lecho fluidizado y membranas.
Por último, es preciso investigar si las cepas aisladas pueden ser utilizadas en
sistemas integrados, combinando tratamientos físico-químicos con el uso de
bacterias degradadoras de perclorato, puesto podría resolver la problemática del
manejo de residuos y resinas generadas durante el proceso.
60
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11. ANEXOS
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Ilustración 12: Evidencia de Suelos Salinos, Indicador Biológico, especie de planta Batis maritima.
Fuente: Autores.
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Ilustración 14: Cristales de sal de Manaure, Guajira.
Fuente: Autores.
Fuente: Autores.
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Ilustración 16: Muestras de Vía Parque Isla de Salamanca, tomadas en tubos Falcón.
Fuente: Autores.
Ilustración 17: Evidencia de Suelos Salinos, Indicador Biológico, especie de planta Batis maritima
Fuente: Autores.
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