Práctica 3 - Hidrólisis Enzimática de Almidón

Hidrólisis de almidón: análisis enzimático de diastasa
INTRODUCCIÓN
El almidón es un homo-polisacárido de reserva producido por las plantas. A diferencia de la

celulosa, los almidones no son moléculas simples sino mezclas de dos polisacáridos
estructuralmente diferentes: amilosa y amolipectina. El almidón puede ser hidrolizado por acción
de diastasas (enzimas amilasas que hidrolizan enlaces glicosídicos) o por ácidos inorgánicos.
Las enzimas son proteínas con actividad catalítica que aceleran reacciones bioquímicas. La mayoría
de las enzimas sigue una cinética de Michaelis-Menten (figura 1). Esta curva se obtiene mediante la
determinación de las velocidades iniciales (Vo) de reacción en función de la concentración de
sustrato [S]. Se observa al principio una cinética de orden 1, donde la velocidad Vo tiene una
dependencia directamente proporcional con la concentración. A concentraciones mayores de
sustrato, la velocidad Vo tiene una dependencia de orden 0 con la concentración (región de
saturación de la enzima).
Figura 1. Cinética de Michaelis-Menten. La variación de la velocidad inicial con la

concentración describe una curva hiperbólica rectangular de 2 parámetros, Vmax y Km.
La actividad de las enzimas depende de varios factores fisicoquímicos: la temperatura, el pH, la

fuerza iónica, la presencia de inhibidores o activadores, la presencia o ausencia de cofactores
(iones y coenzimas), la concentración de sustrato, etc.
Para estudiar la actividad de una enzima en distintas condiciones se determinan las constantes
cinéticas Km y Vmax a partir de los datos cinéticos. Para ello se pueden aplicar varios métodos de
linealización de la ecuación de Michaelis-Menten. Uno de estos es el método de Lineweaver-Burk,
donde se grafica el inverso de las velocidades en función del inverso de las concentraciones (figura
2). Km es la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es ½ de la velocidad
máxima Vmax.
Figura 2. Gráfico de dobles recíprocos de Lineweaver-Burk. Al hacer la regresión lineal, la
pendiente de la recta es igual a Km/Vmax y el intercepto es igual a 1/Vmax.
En una reacción enzimática general, la enzima E se une específicamente a un sustrato S y forma un

complejo enzima-sustrato (ES). Posteriormente, el producto P se disocia de la enzima. La constante
de Michaelis Km comprende las constantes cinéticas de formación (k1) y disociación (k-1) del
complejo ES, y la constante de formación del producto (k2), figura 3. Valores pequeños de Km
implican valores grandes de k1 y pequeños de k-1, es decir, una mayor tendencia a la formación del
complejo enzima-sustrato ES. Así pues, valores pequeños de Km se interpretan como una mayor
afinidad de la enzima por el sustrato.
k −1 + k 2
Km=
k1
Figura 3. Reacción enzimática general y significado cinético de la Km.
OBJETIVO
- Determinar las constantes cinéticas Km y Vmax de la diastasa (fuente: Aspergillus oryzae,

marca Sigma-Aldich) mediante un estudio cinético de hidrolisis de almidón.
- Identificar los productos de hidrólisis mediante el método de Nelson – Somogyi.
PREGUNTAS PRE-LABORATORIO
- ¿Qué es el almidón?
El almidón, o fécula, es una macromolécula compuesta de dos polisacáridos, la amilosa
(en proporción del 25 %) y la amilopectina (75 %).2 Es el glúcido de reserva de la mayoría
de los vegetales.3 Gran parte de las propiedades de la harina y de los productos de
panadería y repostería pueden explicarse conociendo las características del almidón.
- ¿Qué son las enzimas amilasas? ¿Cuál es su código EC?
amilasa, es una enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de
hidrólisis de los enlaces 1-4 del componente α-amilasa al digerir el glucógeno y el
almidón para formar azúcares simples. Se produce principalmente en las glándulas
salivales (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene actividad
enzimática a un pH de 7. Cuando una de estas glándulas se inflama, como en la
pancreatitis, aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre
(amilasemia). El pH óptimo de la amilasa salival es de 6.9.
Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien en
un principio la bautizó con el nombre de "diastasa".
- ¿Cuáles son los productos de hidrólisis del almidón?

- Almidón Amilasa Dextrinas amilasa Maltosa maltasa Glucosa
- Las dextrinas son polisacáridos de glucosa de tamaño intermedio. Su brillo y rigidez se
debe a la presencia de las dextrinas que se forman cuando se plancha. También se
emplean como adhesivos en estampillas, sobres y etiquetas
- La Amilosa y la Amilopectina son las Cadenas lineales y ramificadas de Alfa Glucosa que
forman el Almidón(Polisacárido).
-
- Cuando el Almidón se Hhidroliza(se descompone en unidades más simples) por medio de
las Amilasas(Salival, Pancreática y la intestinal), este queda convertido en
Maltosa(Disacárido formado por la unión de 2 monómeros de Alfa Glucosa) y luego por
medio de la Maltasa la Maltosa queda convertida en Glucosa.
-
- Entonces, de la Hidrólisis del Almidón se obtienen 2 productos orgánicos, la
Maltosa(Disacárido) y la Glucosa(Monosacárido).
-
- ¿En qué consiste el método de Nelson – Somogyi?
La determinación de azúcares reductores mediante el método de Somogyi-Nelson se basa en la
capacidad de estos azúcares para reducir agentes oxidantes suaves como el Cu2+.. El Cu2+ se
reduce a Cu+, y en presencia de arsenomolibdato amónico forma un complejo de color azul, a
partir del cual podemos conocer mediante espectrofotometría la cantidad de cobre reducido, y
por lo tanto, de azúcar reductor.
PROCEDIMIENTO
Preparación de las soluciones de almidón
1. Prepare 50 mL de una solución 0,2% p/v de almidón en agua destilada caliente. Para ello,
disuelva 0,1 gramos de almidón en 40 mL de agua destilada previamente calentada en un
vaso de precipitados de 100 mL. Para favorecer la solubilidad del almidón, caliente el vaso
de precipitados y agite con el agitador de vidrio. Una vez haya disuelto el almidón, retire el
vaso del montaje de calentamiento, deje enfriar el vaso con la solución y transfiera
cuantitativamente al balón aforado de 50 mL y lleve a la línea de afore con agua destilada.
Homogenizar la solución por inversión del balón aforado.
2. Prepare 50 mL de una solución 1,5% p/v de almidón en agua destilada. Para ello, disuelva
0,75 gramos de almidón en 40 mL de agua destilada previamente calentada en un vaso de
precipitados de 100 mL. Para favorecer la solubilidad del almidón, caliente el vaso de
precipitados y agite con el agitador de vidrio. Una vez haya disuelto el almidón, retire el
vaso del montaje de calentamiento, deje enfriar el vaso con la solución y transfiera
cuantitativamente al balón aforado de 50 mL y lleve a la línea de afore con agua destilada.
Homogenizar la solución por inversión del balón aforado.
Preparación de la solución de diastasa
3. Prepare 20 mL de una solución de diastasa en NaCl 0.1% a un porcentaje de 0.1% p/v en el

balón aforado de 20 mL (ver apéndice 2).
Estudio de la actividad enzimática en función de la concentración
4. Aliste un montaje de baño de maría con el trípode, la malla de cerámica, el mechero y un

vaso de precipitados de 500 mL con agua del grifo.
5. En tubos de ensayo limpios, secos y rotulados, agregue los volúmenes consignados en la

tabla 1. Agregue primero el agua, luego el almidón y por último la enzima. Una vez que
haya agregado la enzima, inicia la reacción de hidrólisis del almidón. La reacción
transcurrirá a temperatura ambiente durante el tiempo que le indique el docente a cada
grupo (5 ó 15 min). Homogenizar el contenido de cada tubo cada 2 minutos por inversión.
*Para el tubo Ben (blanco de enzima), adicione la solución azul y la solución amarilla
antes de adicionar la enzima.
Tabla 1. Volúmenes de sustrato (almidón), enzima (diastasa) y agua destilada para el estudio
cinético.
6. Una vez haya transcurrido el tiempo indicado, introduzca los tubos de ensayo en el baño
de maría durante 5 minutos para detener la reacción (el calor desnaturaliza la enzima y la
inactiva). Mueva los tubos para evitar que salten por sobrecalentamiento.
7. Adicione 1 mL de solución de tartrato de cobre alcalino (Solución azul). Deje los tubos en
agua en ebullición por 5 minutos más. Mueva los tubos para evitar que salten por
sobrecalentamiento. Debe observarse la aparición de un color amarillento.
8. Deje enfriar los tubos y adicione 1 mL de solución de arsenomolibdato (Solución amarilla).

Debe observarse una transición a color azul. Homogeneizar los tubos de ensayo por
inversión. Realice este procedimiento con cuidado ya que el sistema se encuentra sobre-
presurizado. NOTA: Si el color azul de los tubos es muy intenso y oscuro, haga una dilución
2 a 6 en los tubos de centrífuga. Tenga en cuenta este factor de dilución para los cálculos
posteriores.
9. Centrifugar durante 5 minutos a 5000 rpm. Posicione y equilibre correctamente los tubos
en la centrífuga. Pida indicaciones del docente en este paso.
10. Agregue en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada, 1 mL de solución azul y 1 mL de

solución amarilla. Homogenizar y rotular como tubo B.
11. Medir la absorbancia a 620 nm (ajuste el cero del espectrofotómetro con la solución del
tubo B). Diligencie los datos en la tabla 2.
Tabla 2. Registro de datos.

Colum Columna Columna Columna 4
na 1 2 3
ANÁLISIS DE DATOS EXPERIMENTALES
Tubo % Absorban (A) –
Almidón cia 620 BE
- Determine la velocidad de hidrólisis nm (A) n
de almidón (mg de glucosa/mL/min) BEn -
interpolando el dato de la columna 4 1 0.01
2 0.02
de la tabla 2 para cada uno de los
3 0.03
tubos (1 a 13) en la curva de
4 0.05
calibración de glucosa (una curva para 5 0.10
todo el grupo, ver apéndice 1 al final), 6 0.15
y dividiendo dicho dato de 7 0.23
concentración por el tiempo de 8 0.30
reacción. Tenga en cuenta el factor de
dilución para los tubos en los que 9 0.38
hubo que diluir. 10 0.68
11 0.98
- Grafique dichas velocidades en 12 1.28
función de la concentración 13 1.35
porcentual de almidón (columna 2) en cada tubo para obtener la curva de Michaelis-
Menten.
- Construya la gráfica de Lineweaver-Burk, graficando el inverso de la velocidad 1/V (eje Y)
contra el inverso de la concentración (1/S).
- Determine la constante de Michaelis (Km, %p/v almidón) y la velocidad máxima (Vmax, mg

de glucosa/mL/min). Convierta la Km a concentración milimolar (mM) de almidón soluble
de maíz (MW: 692.661 g/mol) y compárela con la Km para diastasa de otros organismos
(consulte en https://www.brenda-enzymes.org/).
- Explique la función de los reactivos tartrato de cobre y arsenomolibdato, utilizados en el

experimento (buscar método de Nelson – Somogyi).
Apéndice 1
Por curso, debe elaborarse una curva de calibración de glucosa.
1. Preparar una solución 0,24 mg/mL de glucosa en agua destilada.

2. Aliste 6 tubos de ensayo y agregue las respectivas cantidades de la solución de glucosa o
agua:
3. Desarrolle la reacción de Nelson-Somogyi para cada tubo y mida la absorbancia.

4. Grafique la Absorbancia a 620 nm (Y) vs. la concentración de glucosa (X, mg/mL). Haga la
regresión lineal para obtener la línea de tendencia y la fórmula de la ecuación de la recta
(Y=mX+b) con r2 (debe ser >0.9). En principio, se puede hacer una curva de calibración para
todo el semestre.
Apéndice 2
Cada equipo de laboratorio debe preparar 20 mL de una solución de diastasa al 0.1% p/v en NaCl
0.1%. Para ello, debe tomar una alícuota de 5 mL de la solución stock de diastasa al 0.4% que
preparó el profesor, y completar a 20 mL en balón aforado con NaCl al 0.1%.
>Al docente
Para preparar 100 mL de la solución stock al 0.4%: disuelva 0.4 g de diastasa (frasco Sigma Aldrich)
en 50 mL de NaCl al 0.1% en un beaker. Esta se disuelve fácilmente con un poco de agitación.
Posteriormente, transfiera a un balón aforado de 100 mL y complete a volumen con NaCl al 0.1%.
Homogeneizar y rotular.

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Hidrólisis de almidón: análisis enzimático de diastasa

El almidón es un homo-polisacárido de reserva producido por las plantas. A diferencia de la

Figura 1. Cinética de Michaelis-Menten. La variación de la velocidad inicial con la

La actividad de las enzimas depende de varios factores fisicoquímicos: la temperatura, el pH, la

En una reacción enzimática general, la enzima E se une específicamente a un sustrato S y forma un

Figura 3. Reacción enzimática general y significado cinético de la Km.

- Determinar las constantes cinéticas Km y Vmax de la diastasa (fuente: Aspergillus oryzae,

- ¿Cuáles son los productos de hidrólisis del almidón?

Preparación de las soluciones de almidón

Preparación de la solución de diastasa

3. Prepare 20 mL de una solución de diastasa en NaCl 0.1% a un porcentaje de 0.1% p/v en el

Estudio de la actividad enzimática en función de la concentración

4. Aliste un montaje de baño de maría con el trípode, la malla de cerámica, el mechero y un

5. En tubos de ensayo limpios, secos y rotulados, agregue los volúmenes consignados en la

8. Deje enfriar los tubos y adicione 1 mL de solución de arsenomolibdato (Solución amarilla).

10. Agregue en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada, 1 mL de solución azul y 1 mL de

Tabla 2. Registro de datos.

- Determine la constante de Michaelis (Km, %p/v almidón) y la velocidad máxima (Vmax, mg

- Explique la función de los reactivos tartrato de cobre y arsenomolibdato, utilizados en el

Por curso, debe elaborarse una curva de calibración de glucosa.

1. Preparar una solución 0,24 mg/mL de glucosa en agua destilada.

3. Desarrolle la reacción de Nelson-Somogyi para cada tubo y mida la absorbancia.

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