MANUAL DE

LABORATORIO
DE
MICROBIOLOGIA
4º SEMESTRE
Docentes:
D.C. Ángel Licón Trillo Q.B.P Sandra Gpe Chavarría Hidalgo
D.C. María Alejandra Favila Pérez M.C. Guillermo Cuellar
D.C. Alva Rocío Castillo González M.C. Karla Loza
QBP Martha Gpe Flores Silva M.C América Irigoyen

TITULAR DE LA MATERIA:
________________________________________________________
SEMESTRE ENERO-JUNIO DE 2017

GRUPO:__________
NOMBRE DE ESTUDIANTES DE LA MESA_________ MATRÍCULA:
1.-______________________________________________ ________________
2.-______________________________________________ ________________
3.-______________________________________________ ________________
4.-______________________________________________ ________________
5.-______________________________________________ ________________

FECHA DE ENTREGA:___________________________

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 PRÁCTICAS DE LABORATORIO

INDICE PÁG

1. Introducción.

2. Punción venosa (anexo)

3. Practica No. 1 Tinciones microbiológicas …………...........................………………. 3

4. Practica No. 2 Reacciones febriles ............................................................................ 7

5. Practica No. 3 Anti-estreptolisina O ......................................................................... 11

6. Practica No. 4 Exudado faríngeo con antibiograma ................................................ 13

7. Practica No. 5 Urocultivo ............................................................................................ 18

8. Practica No. 6 Diagnostico de rotavirus ................................................................... 23

9. Formato de reporte de practica .................................................................................... 27

10. Rubrica para evaluar la practica de laboratorio ......................................................... 28

2
 PRACTICA No. 1.

TINCIONES MICROBIOLÓGICAS

(Tinción de Gram y tinción de Ziehl-Neelsen)

OBJETIVO

Que el estudiante realice un frotis fijo, realice la tinción de Gram con el fin de observe las
diferencias microscópicas de bacterias (forma, arreglo y afinidad por la tinción de Gram)
y que observe un frotis de micobacterias con la tinción de Ziehl-Neelsen.

INTRODUCCIÓN

En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona

importante información para la identificación de los microorganismos, para ellos es
necesario realizar alguna tinción (Decré et al., 2000).
La tinción diferencial de Gram se compone de 4 reactivos químicos que se aplican
secuencialmente en un frotis fijo (por acción del calor). El primer reactivo utilizado es el
colorante primario (cristal violeta), en este momento todas las células se tiñen de morado.
Luego se usa el yodo lugol, el cual es un mordiente que facilita la fijación del cristal violeta
a las bacterias Gram positivas. Con el fin de decolorar aquellas células que no tuvieron
la capacidad de fijar el colorante primario, es utilizado el agente decolorante (alcohol-
acetona). Finalmente, se utiliza el colorante de contraste, el cual le da a las células
decoloradas o bacterias Gram negativas un color rosa fiusha que contrasta con el del
colorante primario. El colorante de contraste (Safranina) no es absorbido por células que
no han perdido el colorante primario (Beveridge, 1990). De esta manera, las bacterias
pueden ser clasificadas en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas, siendo
esto el método de tinción diferencial más importante usado en bacteriología (López-
Jácome et l., 2013).
El principio de la tinción de Gram tiene como base la diferencia en la composición química
de la pared celular bacteriana. Como es sabido, las bacterias Gram positivas tienen una
gruesa capa de peptidoglicano (polisacárido formado por dos subunidades químicas, N-
acetilglucosamina y ácido Nacetilmurámico), mientras que esta capa es más fina en las

3
Gram negativas, además que éstas últimas están rodeadas por una capa lipídica externa
(Figura 1) (Beveridge y Graham., 1991).
Otra tinción de uso común para el diagnóstico rutinario de tuberculosis, es la inción de
Ziehl-Neelsen, la cual es una técnica rápida, fácil y de bajo costo. Esta tinción permite
observar las bacterias resistentes a la decoloración con alcohol-ácido. El género
Mycobacterium es el único miembro en la familia Mycobacteriaceae que contienen ácidos
micólicos (figura 2), los cuales pueden ser teñidos con este tipo de tinción. La pared
celular de las micobacterias es extremadamente compleja en cuanto a su composición
bioquímica; dicha característica es la que se ha aprovechado para realizar la tinción de
Ziehl-Neelsen (López-Jácome et l., 2013).
La tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación ligeramente para
solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para que permita el
paso libre del colorante, el cual es afín a los ácidos micólicos presentes en la pared. Al
enfriar con agua, los componentes de la pared vuelven a solidificar, resistiendo la acción
abrasiva del alcohol-ácido, y el azul de metileno se utiliza como contratinción (Murray
2007). Una tinción positiva es aquélla en la que se observan bacilos ácido-alcohol
resistentes, los cuales son de color rojo fucsia.

Figura 1. Esquema de las diferencias estructurales entre bacterias Gram negativas y Gram
positivas. (Tomado de López-Jácome et al., 20013)

4
 Figura 2. Representación esquemática de la composición de la pared celular de las
micobacterias (bacterias acido-alcohol resistentes, BAAR)

MATERIAL Y REACTIVOS

 Muestra (exudado faríngeo, secreción de alguna lesión, entre otras)

 Hisopo estéril
 Abatelenguas
 Portaobjetos
 Mechero
 Asa de nicromio
 Solución salina
 Reactivos de la tinción de Gram
 Microscopio

PROCEDIMIENTOS

1. Tomar la muestra con las debidas precauciones.

2. Hacer un frotis en el portaobjetos
3. Dejar secar a temperatura ambiente.
4. Fijar con la flama del mechero.
5. Realizar la tinción de Gram como lo indica la figura 3. Entre cada paso el frotis se
enjuaga con agua.

5
 6. Observar al microscopio. 40X, 100X (aceite de inmersión).
7. Observar la tinción de Ziehl-Neelsen previamente realizada por el docente.
8. Tomar notas de lo observado

Figura 3. Representación esquemática de los pasos para realizar la tinción de Gram.

PREGUNTA (S) DE CONSULTA

¿Qué pasaría si olvidamos aplicar el mordiente al momento de realizar la tinción de
Gram?
¿Qué pasaría si nuestra muestra ya fija se deja en contacto con el alcohol acetona por 2
minutos?

REFERENCIAS
Decré D, Barbut F, Petit JC. Role of the microbiology laboratory in the diagnosis of
nosocomial diarrhea. Pathol Biol (París). 2000; 48: 733-744.
Beveridge TJ, Graham LL. Surface layers of bacteria. Microbiol Rev. 1991; 55: 684-705.
Beveridge TJ. Mechanism of Gram variability in select bacteria. J Bacteriol. 1990; 172:
1609-1620.
Murray P. Manual of clinical microbiology. 9th ed. USA: American Society for
Microbiology; 2007.
López-Jácome LE, Hernández-Durán M, Colín-Castro CA, Ortega-peñas S, Cerón-
González G, Franco-Cendejas R. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología.
Investigación en discapacidad. 2013; 3(1): 10-18.

6
 PRACTICA No.2

REACCIONES FEBRILES

Objetivo

Que el estudiante determine de manera cualitativa la presencia de anticuerpos anti-

Samonella, Brucella y Proteus en una muestra clínica.

Introducción

La Salmonella es un bacilo gramnegativo móvil que origina en el ser humano una gran
variedad de infecciones entre ellas, la fiebre tifoidea. Se debe pensar en esta enfermedad
en cualquier proceso febril persistente con afectación del estado general, sobre todo en
aquellas personas procedentes de países en vías de desarrollo o en casos de viajeros
(Jurado-Jiménez et al., 2010).
La fiebre tifoidea es una enfermedad febril aguda de origen entérico producida por la
Salmonella typhi. En raras ocasiones Salmonella paratyphi A, paratyphi B (Salmonella
schottmuelleri) y Salmonella paratyphica C (Salmonella hirschfeltii) pueden producir un
cuadro clínico similar, aunque de menor gravedad. Estas salmonellas sólo afectan al ser
humano. La vía de transmisión es la fecal-oral, a través de aguas contaminadas no
tratadas, alimentos manipulados por portadores, ingestión de crustáceos contaminados
o vegetales regados con aguas contaminadas con heces (Jurado-Jiménez et al., 2010).
El diagnóstico de enfermedades febriles puede establecerse bien sea por el aislamiento
del microorganismo en sangre, orina o heces o por la demostración del título de
anticuerpos específicos, somáticos (O) y flagelares (H) en el suero del paciente. La
determinación de estos anticuerpos forma las bases para el ensayo de Widal que
establece que altos niveles de anticuerpos O y H superiores a 1/100 en suero, es
indicativo de infección por estos microorganismos (Kit Antígenos bacterianos
SPINREACT).

La brucelosis es una zoonosis que ocasiona enormes pérdidas a la dustria pecuaria y

representa un verdadero riesgo ocupacional para las personas que trabajan o consumen
productos crudos provenientes de animales infectados. Brucella spp., agente causal de
la brucelosis, es una bacteria cocobacilar aeróbica, gramnegativa, que no produce
7
cápsula ni esporas y tampoco posee flagelos. La bacteria es un parásito que
generalmente se localiza en los tejidos reticuloendoteliales, órganos reproductivos,
articulaciones y huesos, donde ocasiona infecciones crónicas en el ganado
caracterizadas por bacteremias recurrentes o persistentes que culminan en el aborto en
vacas, ovejas y cabras, además de infectar los órganos reproductivos del macho y
causarles lesiones de consideración (Leal-Klevezas et al., 199).

En humanos, el período de incubación puede ser de una a tres semanas y constituye una
enfermedad debilitadora caracterizada por fiebre, escalofríos, cefalea y dolor muscular o
articular. Como promedio, la recuperación ocurre en uno o tres meses, aunque la laxitud
permanece por un período más prolongado. En cursos crónicos, la fiebre puede mostrar
un patrón ondulante y de ahí el apelativo "fiebre ondulante". Cuando la enfermedad es
aguda, la toxemia extrema, la trombopenia y la endocarditis pueden llevar a la muerte del
individuo (Leal-Klevezas et al., 199).

Material y Reactivos

 Muestra suero fresco. Nota, el paciente debe de presentarse en ayuno mínimo de

8 horas. Rechazar las muestras altamente lipémicas y/o hemolizadas.
 Equipo de punción (tubos, ligadura, jeringas, etc)
 Aplicadores de madera
 Kit Antígenos bacterianos de SPINREACT.
 Placa de ensayo
 MIcropipetas para medir 5 μL, 10 μL, 20 μL y 40 μL

Procedimientos (ver inserto del Kit Antígenos bacterianos de SPINREACT)

1. Dejar atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La

sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar X μL de la muestra a ensayar en la placa de reacción (ver figura 1).

8
 Figura 1. Representación de la placa de reacción.
3. Mezclar el reactivo antes del ensayo. Añadir una gota (50 μL) de antígeno
próxima a la muestra a ensayar.
4. Mezclar con ayuda de un palillo, procurando extender la mezcla por toda la
superficie interior del círculo.
5. Mezclar suavemente con la mano la placa de ensayo durante 1 minuto.

Pregunta (s) de consulta

Una elevada proporción de individuos normales da resultados positivos con los antígenos
de Proteus, ¿por qué no es de utilidad realizar la prueba para Proteus en placa?
En el método cualitativo para Brucella, por qué no se consideran los títulos de 1:40 y 1:80
como anticuerpos de memoria.

Referencia

 Jurado-Jiménes R, Arenas-Muñoz C, Doblas-Delgado A, Rivero A, Torre-Cisneros

J. Fiebre tifoidea y otras infecciones por salmonellas. Medicine. 2010;10(52):3497-
501
 Kit Antígenos Bacterianos. SPINREACT.
http://www.spinreact.com/files/Inserts/Serologia/SGIS06_-
9
 _Ref._1205011_Antigenos_bacterianos_03-2013.pdf Fecha de consulta 07 de
Septiembre del 2016.
 Leal-Klevezas D, Barbosa-Pliego A, Flores-Trujillo M, López-Merino A, Martínez-
Soriano JP. Biotecnología aplicada. 1999; 16(3):149-153.

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 PRACTICA No.3

ANTI-ESTREPTOLISINAS-O

OBJETIVO

Que el estudiante determine de manera cualitativa la presencia de anti-estreptolisina O

(ASO), usando una técnica de aglutinación ASO-látex

INTRODUCCIÓN

La infección por estreptococo β-hemolítico del grupo A, C y G difiere de otras infecciones

del aparato respiratorio, ya que puede ocasionar una enfermedad postestreptocócica no
supurativa (EPENS), como fiebre reumática y glomerulonefritis postestreptocócica.
Cuando aparece la EPENS, no siempre se obtiene el antecedente de infección por
estreptococo o cultivo faríngeo positivo; por lo tanto, el médico debe solicitar la
determinación de anticuerpos antiestreptolisina O para establecer la posible causa de la
enfermedad postestreptocócica no supurativa, en conjunto con reactantes de fase aguda
como la velocidad de sedimentación globular y proteína C reactiva para señalar un
proceso inflamatorio (Nava et al., 2007).

Las dos hemolisinas producidas por el estreptococo del grupo A comprende la

estreptolisina S y O; ésta última es antigénica. La estreptolisina O es una toxina citolítica,
cuyas propiedades biológicas producen lisis de los hematíes. En el humano, el anticuerpo
producido por el huésped contra dicha toxina se conoce como antiestreptolisina O (AELO
o ASO), el cual se utiliza como marcador estándar para detectar el anticuerpo contra
estreptococo β-hemolítico del grupo A. Este anticuerpo no tiene función protectora para
el huésped. En los pacientes con infección estreptocócica del grupo A, la respuesta del
anticuerpo antiestreptolisina O se comprueba después de una semana de su inicio y
alcanza su concentración máxima de tres a seis semanas (Nava et al., 2007).

11
MATERIAL Y REACTIVOS

 Muestra suero fresco. Nota, el paciente debe de presentarse en ayuno mínimo de

8 horas.
 Equipo de punción (tubos, ligadura, jeringas, etc)
 Aplicadores de madera
 Kit ASO-Latex

PROCEDIMIENTOs (ver inserto del Kit ASO-latex de SPINREACT)

1. Los reactivos y las muestras deben estar a temperatura ambiente. La sensibilidad del
ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar 50 μL de la muestra y una gota de cada uno de los controles Positivo y
Negativo, sobre círculos distintos de una placa.
3. Homogeneizar suavemente el reactivo de ASO- látex antes de usar. Depositar una
gota (50 μl) junto a cada una de las gotas anteriores.
4. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie
interior del círculo. Emplear palillos distintos para cada muestra.
5. Agitar durante 2 a 3 minutos la placa con las manos. El exceso de tiempo puede originar
la aparición de falsos positivos.
6. Reportar resultados.

PREGUNTA (S) DE CONSULTA

¿Qué pasa si se utiliza una muestra lipémica para la determinación de anti-estreptolisina

O?
¿Por qué la artritis reumatoide nos puede dar un resultado falso positivo?

REFERENCIA
Nava A, Roble G, Mendoza-Aguilar C, Martínez-Ríos MA, Riebeling C, Navarrete S,
Reyer PA. Correación entre concentraciones séricas de anti-estreptolisina O y proteína
C reactiva. 2007. Revista alergia México 2007; 54(6):201-204.

12
 PRACTICA NO. 4

CULTIVO Y FROTIS DE EXUDADO FARÍNGEO CON ANTIBIOGRAMA

OBJETIVO
El alumno conocerá la utilidad del exudado faríngeo para aislar e identificar
microorganismos que puedan causar una infección en tracto respiratorio superior. Así
como la importancia del estudio de susceptibilidad a los antibióticos.

INTRODUCCIÓN
El sistema respiratorio se divide en vías altas o superiores, que comprenden las áreas
anteriores a la laringe, incluyendo la nasofaringe, orofaringe, laringe, epiglotis, oído
externo y medio, y los senos paranasales, y vías bajas o inferiores que incluyen todas las
estructuras posteriores a la laringe.

En la faringe podemos encontrar distintos microorganismos entre los que destacan los
siguientes grupos y especies: estreptococos, estafilococos, micrococos, neisserias,
Moraxella catarrhalis, corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyromonas, Prevotella,
Fusobacterium, Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, que constituyen parte de
la microbiota normal. Sin embargo, cuando encontramos una patología en la faringe, el
agente etiológico más frecuentemente aislado es el Streptococcus pyogenes, pero
también, otros microorganismos patógenos pueden ser diagnosticados en el laboratorio
como: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus alfa-hemolítico grupo viridans, etc.

En una muestra de exudado faríngeo, es común observar células epiteliales, filamento

de moco, algunos leucocitos y distintas bacterias, como bacilos cortos, largos,
cocobacilos, cocos aislados o agrupados ya sea en cadena, cúmulos o racimos, en
tétradas y su afinidad tintorial también es variada. Pueden incluso observarse algunas
levaduras que usualmente son positivas al Gram. Tanto las células epiteliales como los
leucocitos, no retendrán el colorante primario, ya que en su pared no hay moléculas afines
al cristal violeta, por lo que se observarán de color rojo, pero para estas estructuras no
se utiliza el término gramnegativo, ya que éstas no son bacterias para clasificarlas.

Para poder identificar el agente microbiano de la muestra problema, se procederá a la

siembra del mismo en diferentes medios de cultivo, y así observar si hay o no crecimiento
en cada uno de ellos. Además se procederá a realizar diferentes pruebas bioquímicas
para la identificación del agente causal.

Una vez aislados los microorganismos e identificados como posibles agentes causales
de la patología que se sospecha, se procede a realizar un ANTIBIOGRAMA, que consiste
básicamente en poner en contacto a la cepa bacteriana con antimicrobianos para
investigar cuál de ellos es el que puede inhibir su crecimiento y a cuáles puede ser
resistente. Consiste en inocular el microorganismo que nos interesa en un medio sólido
que favorezca la difusión de los antimicrobianos. Sobre la superficie inoculada se colocan
discos de antimicrobianos de determinadas concentraciones estandarizadas y se incuba.
El comportamiento del antimicrobiano ante la cepa se observará como zonas nítidas de
13
inhibición del crecimiento alrededor del disco con antimicrobiano al cual la bacteria
estudiada es susceptible. Si la bacteria crece alrededor de un determinado antibiótico,
éste no le causó ningún efecto letal. Es importante recordar que el antibiograma sólo
refleja del comportamiento "in vitro" del microorganismo ante el antimicrobiano.

MATERIAL Y REACTIVOS
1. Medios de cultivo preparados en placa de agar sangre, y agar sal manitol
2. Medios para bioquímicas preparados en tubo.
3. Asas Bacteriológicas
4. Mechero
5. Estufa de Cultivo
6. Portaobjetos
7. Solución Salina isotónica
8. Colorantes de Gram
9. Microscopio
10. Aceite de Inmersión
11. Aplicadores de madera
12. Peróxido de Hidrógeno
13. Plasma con Anticoagulante EDTA
14. Tubos de ensayo
15. Hisopos estériles
16. Multidiscos de Antibióticos

PROCEDIMIENTO:

a) OBTENCION DE UNA MUESTRA DE EXUDADO FARÍNGEO

1) Pedirle al paciente que abra la boca ampliamente, para exponer faringe.
2) Colocar un abatelengua e introducir un hisopo, frotar firmemente las paredes de la
faringe y ambas amígdalas y en cualquier área de inflamación, ulceración y
exudación, se debe evitar tocar la lengua o los labios para no diluir o contaminar
la muestra.
3) Colocar muestra en cada medio de cultivo.

b) FROTIS DIRECTO
1) Colocar la muestra suavemente en un portaobjetos con movimientos circulares
2) Dejar secar al aire y fijar con el mechero, procurando no quemar la muestra.
3) Realizar una tinción de Gram.

4) Observar a través del microscopio.

14
 c) PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO Y LA IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS.

1) SIEMBRA PARA CULTIVO

Sembrar las placas Petri que contienen los diferentes agares, esterilizando el asa y
dejándola enfriar cada vez que se va inocular. Incubar a 37°C por 24hrs.

2) LECTURA DE CRECIMIENTOS
Después de 24hrs anotar las características que presenta la colonia bacteriana,
morfología colonial (ver anexo).

3) IDENTIFICACIÓN MICROSCÓPICA
Preparar un frotis, tocar con asa estéril y fría una de las colonias separadas de uno de
los medios de cultivo y extenderla sobre una laminilla a la que ya se le colocó una gota
de solución salina isotónica. Dejar secar, fijar y teñir con la técnica de Gram para observar
al microscopio. Observar y anotar la morfología y afinidad tintorial de la cepa bacteriana
aislada.

4) PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Prueba de Catalasa: Se utiliza un aplicador de madera para transferir un poco de colonia
bacteriana (no utilizar colonias aisladas en Agar Sangre, pues da resultados Falsos
Positivos) al centro de un portaobjetos en la que se añadieron unas gotas de peróxido de
hidrógeno. La formación de burbujas significa una prueba Positiva.

Prueba de Coagulasa: Colocar en un tubo de ensayo 0.5 ml de plasma humano tomado

con anticoagulante de EDTA y suspender en él 2 o 3 colonias del microorganismo.
Colocar en incubación a 37°C por 18 a 24hrs. Observar en busca de la formación de un
coágulo o de un precipitado granular. No exceder las 24 horas, pues si se trata de una
cepa de Staphylococcus aureus, éste contiene también otra enzima (fibrinolisina) capaz
de deshacer el coágulo formado, y reportaríamos un resultado Falso Negativo.

d) ANTIBIOGRAMA
1.-Seleccionar la colonia bacteriana utilizada para la identificación bioquímica de la placa
de agar original con asa bacteriológica estéril.

15
2.-Inocular en solución salina las colonias hasta llegar al 0.5 Mc Farland (comparación
con tubo Mc Farland de referencia)
3.- Sumergir un hisopo estéril en la suspensión bacteriana y antes de retirarlo eliminar el
exceso de líquido haciendo rotar el hisopo presionando contra la pared interna del tubo.
4.-Inocular con este hisopo la superficie de la placa de agar. Cubrir uniformemente toda
la placa esparciendo con el hisopo en 3 direcciones: Vertical, horizontal y diagonal
(90,180 y 45º de inclinación)
5-Dejar reposar unos minutos el inóculo y utilizando una pinza estéril colocar sobre la
superficie del agar los discos de antibiótico con las letras hacia abajo. Incubar a 37ºC
durante 18 a 24hr.
6.- Medir cuidadosamente los diámetros de inhibición alrededor de los discos de
antimicrobianos en milímetros. Anotar los resultados para interpretar la susceptibilidad de
la cepa ante cada antimicrobiano (ver anexo).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Dibuje lo observado describiendo lo siguiente:

1) La presencia y cantidad de leucocitos (pocos no es clínicamente significativo; sólo si

son abundantes y se acompañan del predominio de un tipo bacteriano en especial)

2)
Características macroscópicas AGAR AGAR

SANGRE SAL-MANITOL

Forma

Tamaño

Borde

Elevación

Luz Transmitida

Color

Reacción con algún sustrato

Características Microscópicas

Morfología microbiana

Distribución observada

Afinidad tintorial

16
Antibiograma:
Antibiótico Diámetro de halo

(Nombre completo y abreviación) de inhibición en mm

3) Nombre del agente patógeno aislado:___________________________________

Anexar en el reporte datos extras de resultados y fotografías.

PREGUNTA (S) DE CONSULTA

¿Cuáles son las indicaciones que debe recibir el paciente antes de la prueba para la
correcta toma de la muestra?
¿Cuál es la microbiota normal de vías respiratorias altas y bajas?

REFERENCIAS
1. H.K. Hamilton, M.B. Rose "Diagnóstico Clínico" 1ª Edición, Editorial Interamericana.
2. Jawetz, Melnick, Adelberg "Microbiologia Medica" 12º Edicion, Editorial Manual
Moderno.
3. Koneman, Allen, Dowell, Sommers "Diagnostico Microbiológico" Texto Atlas Color,
Editorial Panamericana.
4. Normas Oficiales Mexicanas del Diario Oficial de la Federación.

17
 PRACTICA NO. 5
UROCULTIVO

OBJETIVO:
El estudiante conocerá la utilidad de una muestra de orina para aislar e identificar
microorganismos que puedan causar una infección en tracto urinario. Así como la
susceptibilidad o resistencia que los microorganismos aislados presenten a los
antibióticos.

INTRODUCCIÓN:
El urocultivo es el cultivo de orina para diagnosticar infección sintomática del tracto
urinario o infección asintomática (bacteriuria asintomática) en pacientes con riesgo de
infección.

La piuria, junto con la bacteriuria, es un dato muy importante para el diagnóstico de

infección del tracto urinario, ya que prácticamente está presente en todas las infecciones
urinarias.

Etiológicamente, Escherichia coli causa el 80% de las infecciones del tracto urinario (ITU)
no complicadas. Proteus mirabilis, Klebsiella spp. y Staphylococcus saprophyticus son
responsables de la gran mayoría de las restantes. En los niños varones es
particularmente frecuente la infección por Proteus mirabilis. Los Streptococcus del grupo
B (SGB) suelen causar ITU en embarazadas y en recién nacidos. Si el paciente presenta
algún problema urológico, se ha sometido a instrumentación uretral o sufre cambios de
la flora colónica (por ejemplo, como consecuencia de la administración de antibióticos)
aumenta la frecuencia de infección por bacilos gramnegativos diferentes de E. coli y por
cepas de este germen resistentes a los antibióticos habituales. Enterococcus faecalis es,
a menudo, responsable de las infecciones en ancianos con hipertrofia prostática y en
pacientes postoperados que han recibido profilaxis con cefalosporinas. S. aureus y S.
epidermidis producen infección en pacientes con sonda uretral permanente. S. aureus
puede alcanzar el riñón por vía hematógena procedente de un foco distante; si se
identifica en un urocultivo, es conveniente descartar la presencia de un absceso renal o
prostático. Otros microorganismos productores de ITU son poco frecuentes como
Corynebacterium urealyticum, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealyticum, y en
algunas ocasiones están asociadas con agentes causantes de enfermedades sistémicas
como Salmonella spp. O Cryptococcus neoformans. El urocultivo no está indicado de
forma rutinaria, sólo se admite como cribaje en la 12-16 semana de gestación o antes de
la cirugía urológica

La correcta recogida y conservación de la orina para urocultivos es fundamental para que

puedan obtenerse resultados fiables:

1) Se recolecta la primera orina de la mañana. La muestra se recoge después de

limpiar los genitales con agua y jabón. Se descarta la primera porción de orina y se recoge
5-15mL del volumen restante.
2) La orina debe ser llevada al laboratorio en el lapso de 1-2 horas tras su recolección,
manteniéndola refrigerada, aproximadamente a 4˚C, mientras y durante su transporte.
18
 Nota: en los niños pequeños se toma con bolsa colectora, o mediante sonda vesical
permanente o evacuante, o punción supra púbica.

Los criterios de Kass son los aceptados para definir presencia excesiva de bacterias en
la orina obtenida por emisión uretral: 100 mil unidades formadoras de colonias (UFC) por
ml de orina indica infección urinaria en individuos sin uropatía. Los criterios de Kass se
refieren a la orina obtenida por micción media directa en un frasco estéril, tras la limpieza
cuidadosa con agua y jabón de los genitales externos.

Recuentos inferiores a 10 000 UFC/ ml se consideran contaminación fisiológica, es decir

negativos, y los recuentos intermedios más de 10 000 y menor de 100 000 son
considerados como sospechosos de infección y obliga a nuevas determinaciones,
teniendo en cuenta que la infección urinaria es mono bacteriana por lo que cultivos con
dos o más gérmenes no deben de ser considerados significativos aunque el recuento sea
superior a 100 000 UFC/ml.

Los criterios de Kass son válidos para Enterobacterias, sin embargo en aquellas
infecciones urinarias producidas por gram positivos como Staphylococcus saprophytus,
Enterococcus spp., etc. recuentos superiores a 10,000UFC pueden ser significativos de
infección.

MATERIAL Y REACTIVOS
Medios de cultivo preparados en placa (Sangre, MacConkey y EMB).
Medios para bioquímicas preparados en tubo.
Asa bacteriológica 0.001 ml
Asa bacteriológica en punta
Mechero
Incubadora
Portaobjetos
Solución salina isotónica
Colorantes de gram
Microscopio
Aceite de inmersión
Aplicadores de madera
Peróxido de hidrógeno
Plasma con anticoagulante EDTA
Tubos de ensayo
Multidisco de antibióticos

19
PROCEDIMIENTOS:
a) OBSERVACIÓN DIRECTA:
1) Centrifugar, en un tubo estéril, 10ml de orina a 1500 rpm durante 10 minutos.
2) Decantar el líquido cuidando de no tirar el sedimento.
3) Colocar una gota del sedimento en un portaobjeto y sellarlo con el cubreobjetos.
4) Observar al microscopio a través del objetivo 40x.

c) SIEMBRA PARA CULTIVO

1) Sembrar la orina en los agares correspondientes. Se toma la muestra directamente
de la orina, no utilizar el sedimento.
2) Etiquetar las placas con datos del equipo.
3) Incubar a 37°C por 24hrs.

d) LECTURA DE CRECIMIENTOS
Después de 24hrs anotar las características que presentan las colonias bacterianas
(morfología colonial) y conteo para cuenta de Kass.

e) IDENTIFICACIÓN MICROSCÓPICA
Preparar un frotis, tocar con asa estéril y fría una de las colonias separadas de los medios
de cultivo y extenderla sobre una laminilla a la que ya se le colocó una gota de solución
salina isotónica. Dejar secar, fijar y teñir con la técnica de Gram; observar y anotar la
morfología y afinidad tintorial de la cepa bacteriana aislada.

f) PRUEBAS BIOQUÍMICAS
1) Con el cultivo de 24 horas de la bacteria problema, proceder a inocular un tubo con
solución salina estéril hasta obtener una suspensión de bacterias ligeramente turbia.
2) A partir de la suspensión anterior proceder a inocular los medios de cultivo en el orden
que se indica a continuación:
- Por estría recta el tubo que contiene citrato de Simmons.
- Por picadura los tubos que contienen MIO y SIM.
- En superficie el tubo que contiene el medio LIA.
- Por picadura y en superficie el tubo que contiene el medio TSI.

20
g) ANTIBIOGRAMA
1.- Proceder a inocular con la cepa aislada un tubo con solución salina estéril hasta
obtener una suspensión de bacterias ligeramente turbia
2.- Sumergir un hisopo estéril en la suspensión bacteriana y antes de retirarlo eliminar el
exceso de líquido haciendo rotar el hisopo presionando contra la pared interna del tubo.
3.-Inocular con este hisopo la superficie de la placa de agar. Cubrir uniformemente toda
la placa esparciendo con el hisopo en 3 direcciones: Vertical, horizontal y diagonal
(90,180 y 45º de inclinación)
4-Dejar reposar unos minutos el inóculo y utilizando una pinza estéril colocar sobre la
superficie del agar los discos de antibiótico con las letras hacia abajo. Incubar a 37ºC 18
a 24hr.
5.- Medir cuidadosamente los diámetros de inhibición alrededor de los discos de
antimicrobianos en milímetros. Anotar los resultados para interpretar la susceptibilidad de
la cepa ante cada antimicrobiano.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1) Cuenta el número de colonias desarrolladas en el agar y multiplícalas por 1000, ya
que la asada de platino contiene 0.001 ml. de orina.
Resultado:

No hubo desarrollo microbiano

Menos de 10,000 UFC

Entre 10,000 UFC y 100,000 UFC

> 100,000 UFC

2) Describa:
CARACTERÍSTICAS AGAR AGAR
MACROSCÓPICAS
_______________ ________________

Forma

Tamaño

Borde

Elevación

Luz Transmitida

Color

Reacción con algún sustrato

21
 CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS TINCIÓN DE GRAM

Morfología microbiana

Tipo de distribución

Afinidad tintorial

ANTIBIÓTICO DIÁMETRO DE HALO

(Nombre completo y abreviación) DE INHIBICIÓN (en mm)

3) Nombre del agente patógeno aislado:

REFERENCIAS
Miragliotta G, Di Pierro MN, Miragliotta M, Mosca A. Antimicrobial resistance among
uropathogens responsible for community-acquired urinary tract infections in an Italian
community. J Chemother. 2008; 20(6):721-7.

Royano M, Correas M, Clavo J, Roiz MP, Sangrador A, Casado S. Infecciones del tracto
urinario. Boletín de uso racional del medicamento. Servicios de Farmacia de Atención
Primaria. Servicio Cántabro de Salud. 2007 n.o 4.

www.Facmed.unam.mx/urocultivo coprocultivo indicaciones Medicine2010p.d.f

22
 PRACTICA NO.6
DIAGNÓSTICO DE ROTAVIRUS

OBJETIVO
El estudiante realizará una técnica serológica para detectar rotavirus en una muestra de
heces, conociendo el fundamento de este proceso.

INTRODUCCION
Los Rotavirus son un grupo de virus productores de gastroenteritis en mamíferos
y aves. Desde 1973 se conocen como agentes comunes causantes de diarrea
infantil. Pertenecen a la familia de los reovirus y son icosaédricos, de 65-75 nm de
diámetro. Presentan una cápside de doble capa, un genoma ARN bicatenario y
segmentado que es inactivo como ARNm. En la primera etapa de replicación,
ocurre la transcripción de la cadena menos, como matriz para fabricar el ARNm. Los
Rotavirus se dividen en:

Grupos. Se basan en la antigenicidad de la proteína VP6 y en la movilidad electroforética

de los segmentos del genoma.

Subgrupos. Son definidos por la fijación del complemento y dependen de la proteína de

la cápside interna VP6.

Serotipos. Se determinan por reacciones de neutralización y dependen de la proteína

VP7.

Este virus se transmite por contacto feco-oral. Los principales síntomas de esta
gastroenteritis vírica son diarrea acuosa y vómitos. También puede presentarse con
dolores de cabeza, fiebre y dolor de estómago. Por lo general los síntomas comienzan 1
ó 2 días después de infectarse y pueden durar 3 días.

Entre las técnicas de diagnóstico se incluyen la detección directa del antígeno, el

aislamiento en cultivos celulares y el diagnóstico serológico. La detección directa
del antígeno viral en heces representa el método diagnóstico de elección. La
disponibilidad de anticuerpos específicos ha permitido el empleo del
enzimoinmunoensayo y la aglutinación con látex. Se prefieren estos métodos por
rápidos y sencillos, relativamente baratos y de efectividad.

La técnica que se utilizará en la práctica es un inmunoensayo cromatográfico. Durante

la prueba, la muestra reacciona con los conjugados coloreados (anticuerpos
monoclonales de ratón anti-rotavirus-microesferas rojas) previamente secados en el
test. Este complejo avanza por capilaridad a través de la membrana del test. Para
dar el resultado como positivo, una línea de color ROJO aparecerá en la zona de
resultados de la membrana. La ausencia de esta línea sugiere un resultado
negativo. Independientemente de que haya presencia o no de Rotavirus, la mezcla
de conjugado va avanzando por la membrana hasta la región de control donde se
han inmovilizado anticuerpos y siempre aparecerá una línea de color VERDE (línea de
control).
23
La aparición de esta línea se utiliza: 1) para verificar que se ha añadido el volumen
de muestra suficiente y 2) que el flujo ha sido el apropiado; y 3) como control
interno de los reactivos.

Para llevar a cabo el inmunoensayo se requiere tomar suficiente cantidad de muestra de

heces (1-2 g o ml para muestras líquidas). Las muestras de heces deberían ser
almacenadas en un recipiente limpio y seco (sin conservantes o medios de transporte).
Las muestras se pueden conservar, hasta el momento de utilizarlas, 1 ó 2 días a
2-4ºC. Para conservar las muestras durante un tiempo prolongado, como máximo 1
año, deben mantenerse congeladas a 20ºC. La muestra debe descongelarse
totalmente y alcanzar la temperatura ambiente para poder utilizarla en la prueba.

MATERIAL Y REACTIVOS
Placas en un sobre sellado incluyendo desecante.
Tubos para la toma de muestra, cada tubo contiene el tampón de extracción
Contenedores para la toma de muestra
Cronómetro
Guantes desechables.

PROCEDIMIENTOS
1) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Con ayuda del palito se toma una muestra de las heces recogidas. Para ello se pasa el
palito por la muestra recogiendo una pequeña cantidad de heces. Se introduce el palito
en el tampón de extracción, para dilución de la muestra, cerrando el tubo. Agitar para
facilitar la dispersión de la muestra. Para muestras líquidas, utilice una pipeta y añada
100μL en el vial para muestra con diluyente.

2) PROCEDIMIENTO
1. Atemperar (15-30ºC) la muestra y los otros materiales necesarios para el test,
incluidos los dispositivos, antes realizar el ensayo.
2. Para cada muestra o control se debe usar un tubo de dilución de la muestra y un
dispositivo diferente. Identificar cada uno con los datos de la muestra.
3. Agitar el tubo de dilución de la muestra para asegurar una buena dispersión.
4. Romper el extremo superior del tubo.
5. Extraer el dispositivo de reacción de su envase para utilizarlo inmediatamente.
6. Depositar 5 gotas o 150μL del líquido de extracción en la ventana circular del
dispositivo marcada con una flecha o una S, evitando añadir partículas sólidas con el
líquido.
Si se da el caso de que el test no funciona debido a la presencia de partículas sólidas
en la ventana circular, retirarlas y añadir una gota de tampón hasta que se vea avanzar
al líquido (zona de reacción y de control).
7. Leer el resultado del test a los 10 minutos tras la adición de la muestra.

24
 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
- NEGATIVO: Una sola línea de color VERDE aparece en la ventana central del
dispositivo de reacción, en la zona marcada con la letra C (línea de control).

- POSITIVO: Además de la línea de control VERDE, también aparece una línea

ROJA (línea de resultado) en la zona marcada con la letra T (zona de resultado).

- INVÁLIDO: Cuando la línea de control (VERDE) no aparece independientemente

de que aparezca o no la línea de resultado (ROJA). Las causas más comunes
por las que puede aparecer un resultado inválido son: una cantidad insuficiente
de muestra, una forma de proceder incorrecta o un deterioro de los reactivos.
Si ocurriera esto, debe revisarse el procedimiento y repetir la prueba con un
nuevo dispositivo de reacción. Si persistiese el problema, debe contactar con su
proveedor y dejar de utilizar la prueba.

NOTA: La intensidad de la línea roja en la zona de resultado puede variar

dependiendo de la concentración de antígenos presentes en la muestra. Sin embargo,
esta prueba es cualitativa por lo que, ni la cantidad ni la tasa de aumento de
antígenos puede ser determinada por la misma. Cualquier otro resultado obtenido,
distinto de los descritos, deberá considerarse como INVALIDO.

CONTROL DE CALIDAD
Control de calidad interno, el test contiene un control de calidad interno, la línea Verde
que aparece en la zona de control. La presencia de esta línea indica que se ha usado un
volumen correcto de muestra y el procedimiento seguido ha sido el adecuado. La claridad
del fondo de la ventana es también un control interno. Si el test funciona correctamente,
este fondo estará claro y no interferirá con la lectura del resultado.

Control de calidad externo, se recomiendan controles externos, positivos y negativos,

para controlar el desarrollo del ensayo

VALORES PREVISTOS
Se esperan resultados negativos en niños y jóvenes sanos, así como en adultos libres de
infección.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

Sensibilidad: La detección de Rotavirus presenta un 100% de concordancia en
sensibilidad.

Especificidad: La detección de Rotavirus presenta un 98% de concordancia en

especificidad.

25
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Interprete el resultado en base a los datos de la literatura y concluya.

PREGUNTA (S) DE CONSULTA

1.- ¿En qué momento se debe tomar una muestra de heces para hacer diagnóstico de
Rotavirus?
2.- ¿Medidas de prevención que se deben tener al estar en contacto con personas que
tienen Rotavirus?

REFERENCIAS
H.K. Hamilton, M.B. Rose "Diagnóstico Clínico" 1ª Edición, Editorial Interamericana.
Koneman, Allen, Dowell, Sommers "Diagnostico Microbiológico" Texto Atlas Color,
Editorial Panamericana.

ESTES, M. K. and COHEN, J.; “Rotavirus Gene Structure and Function”, Microbiological
Reviews, Vol. 53 No 4, Dec. 1989, pp. 410-449.

PAI C. H., SHAHRABADI M. S., and INCE B., “Rapid Diagnosis of Rotavirus
Gastroenteritis by a Commercial Latex Agglutination Test”, Journal of Clinical
Microbiology, Vol. 22 No 5, Nov. 1985, pp. 846-850.

CUKOR, G., PERRON, D.M., and BLACKLOW, N. R.: “Detection of Rotavirus in Human
Stools by Using Monoclonal Antibody”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 19, 888-892.

26
 FORMATO DE REPORTE DE PRÁCTICA

1. PORTADA: Número de la práctica y nombre, grupo, nombre de los integrantes del

equipo, fecha de entrega.

2. INTRODUCCIÓN: Investigación sobre las preguntas de consulta. (artículo)

3. MATERIALES: Los utilizados en la práctica.

4. PROCEDIMIENTO: El utilizado en la práctica.

5. RESULTADOS:

Fotografías con explicación

Dibujos con explicación
Tablas
Cálculos, etc.

6. CONCLUSIÓN: Anotar una conclusión por integrante del equipo.

7. DISCUSIÓN: Discutir o confrontar sus resultados con la introducción y bibliografía

investigada.

8. BIBLIOGRAFÍA: Debe incluir la bibliografía del libro de texto y al menos un artículo

relacionado que utilizó para su reporte.

27
 RUBRICA PARA EVALUAR LA PRÁCTICA DE LABORATORIO
DOCENTE

GRUPO FECHA

PRÁCTICA EQUIPO CALIFICACIÓN

INTEGRANTES:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

CRITERIOS E INDICADORES EXCELENTE BUENO REGULAR DEFICIENTE TOTAL

INTRODUCCIÓN
Contesta de forma adecuada la pregunta de
consulta. Aborda claramente los conceptos y
2 1.5 1.0 0
fundamentos para la introducción.
RESULTADOS
Indica de forma clara y ordenada los
resultados, basándose en el formato de
1 --- 0.5 0
reporte.
DISCUSIÓN
Compara sus resultados con lo reportado por
autores y discute sobre sus similitudes y
2 1.5 1.0 0
diferencias.
CONCLUSIÓN
Basado en la introducción (antecedentes) y a
la discusión, formula una conclusión clara de
2 1.5 1.0 0
su trabajo en el laboratorio.
DESEMPEÑO DE LA PRÁCTICA
Trabaja en forma ordenada y segura
atendiendo a las indicaciones dadas por el
docente.
Participa activamente en el cuestionario 2 1.5 1.0 0
hecho por el docente durante la práctica.
BIBLIOGRAFÍA
Da crédito a los autores de la información
generada anteriormente que usa en su
reporte.
Indica las referencias en cada párrafo de la
introducción y en la discusión.
Usa fuentes de información de buena calidad
(artículos científicos, libros de texto, páginas 1 --- 0.5 0
de universidades, entre otros). De reciente
publicación (2010 a la fecha). Usa de forma
correcta y homogénea alguna de las formas
existentes para citar bibliografía.
TOTAL

28