Test de

Anticuerpos IgM
antiglobulina
Anticuerpos que tienen
la capacidad de realizar
una aglutinación directa
de los hematíes, esto por sus características Hasta el año 1945 no existía una forma a
de valencia, lo que le da la posibilidad de través del laboratorio, en que se pudiera
interaccionar con varios eritrocitos a la vez evidenciar la presencia de anticuerpos de
pudiendo generar un aglutinado visible que tipo IgG, esto dificultaba la posibilidad de
se da, ya sea mediante una centrifugación o estudiar incompatibilidad, la EHRN, se
también en aglutinación en lámina desconocía una gran cantidad de GS que
desarrollan Ac de tipo IgG, la
inmunohematología estaba muy limitada
producto de la imposibilidad de revelar estos
anticuerpos.
El año 1945, Robert Coombs describe un
test que permite detectar los anticuerpos de
tipo IgG.

Anticuerpos IgG
Se denominan también incompletos o
sensibilizantes, esto debido a que tienen la
posibilidad de unirse a los antígenos
eritrocitarios, fijarse a ellos, pero no son
capaces de aglutinar directamente. Entonces
recubren los hematíes, sensibilizándolos,
pero no son capaces de aglutinarlos como
son capaces los Ac de tipo IgM.

Método convencional para producción de

antiglobulina humana policlonal, para ello se
puede utilizar fracciones de complemento o IgG e
inyectarlas a un conejo, posteriormente ese conejo
producirá anticuerpos policlonales anti-IgG o anti-
fracciones del complemento y eventualmente
reactivos monoespecíficos para IgG o complemento
o bien, lo que se encuentra más comúnmente a
disposición en el comercio, reactivos
poliespecíficos policlonales de antiglobulina desarrollo de reactivos mucho más específicos de
humana. manera más fácil.

Esto ha cambiado con el tiempo con el fin Tipos de reactivo

de desarrollar mejores técnicas de Existen distintos tipos de reactivos
producción de anticuerpos. antiglobulina humana.
 Anti-globulina humana poliespecíficos:
mezcla de anticuerpos anti-IgG y anti-
C3b, anti-C3d (fracciones de
complemento).
 Reactivos monoespecíficos: Anti-IgG
sola o anti-C3b, anti-C3d sola.

Test de Coombs directo

Como su nombre lo indica, es un test que se
realiza directamente. No requiere incubación
previa y lo que busca es detectar la
sensibilización de GR in vivo (mientras
están circulando en la sangre del paciente).
Hoy en día lo que se emplea es la producción de
antiglobulina humana monoclonal, utilizando la Lo que se hace en este test es tomar GR del
tecnología del hibridoma. Se hace lo mismo, pero paciente, generalmente con anticoagulante
esta vez se inyecta complemento e IgG, se espera la EDTA, se lavan los eritrocitos y se
producción de estos anticuerpos monoclonales y
posteriormente van a ser fusionados en una célula
suspenden al 5%, se toma una gota y se
tumoral con la cual se tendrá la producción de un enfrenta al reactivo antiglobulina humana.
solo clon de anticuerpos. Esta antiglobulina humana va a reconocer
los Ac IgG o también fracciones de
complemento que estén unidas in vivo al
eritrocito y lo van a aglutinar.

Acá está representado donde se inmuniza a un ratón,

luego sus células B se fusionan con células de
mieloma formando un hibridoma y posteriormente
se hace una selección y a continuación el hibridoma
son separadas para la producción de los clones de
Ac monoclonales. Lo que ha favorecido el
 Hemólisis autoinmune
 Anemia hemolítica autoinmune por
anticuerpos calientes:
o Idiopática
o Secundaria a lupus eritematoso
sistémico
o Síndrome de Evans (Anticuerpos
antiplaquetarios y hemolíticos).
El test de antiglobulina directa (DAT)  Anemia hemolítica autoinmune por
detecta células rojas sensibilizadas in vivo anticuerpos fríos:
con IgG y/o con componentes del o Idiopática, síndrome de aglutininas
complemento C3b y C3d. frías
El recubrimiento in vivo de glóbulos rojos o Mononucleosis infecciosa
con IgG y/o complemento puede ocurrir en o Hemoglobinuria paroxística por frío
cualquier mecanismo inmune que esté Test de Coombs indirecto
atacando a los propios eritrocitos del Este test nos permite realizar una serie de
paciente. Por lo tanto, van a haber diversas determinaciones muy importantes en el
patologías que cursen con un DAT +. ámbito de la inmunohematología. Estas son,
por ejemplo, detectar anticuerpos IgG en el
suero o plasma de un paciente antes de
Estos mecanismos pueden ser: efectuar una transfusión. Por otro lado, nos
 Autoinmunes: LES, artritis reumatoide, permite, empleando anticuerpos conocidos
por ejemplo. IgG, fenotipar antígenos en los GR, es decir,
 Aloinmunes: por ejemplo, reacción detectar un antígeno que nos interese
hemolítica por transfusiones. demostrar que está presente empleando un
Ac de tipo IgG.
 Mecanismo inducido por drogas.
Hemólisis aloinmune A este se le denomina indirecto, ya que se le
 Reacción hemolítica transfusional incluye un paso adicional de incubación. Se
debe dejar que los anticuerpos que se están
 Enfermedad hemolítica del recién
buscando en el suero problema reaccionen a
nacido:
una temperatura adecuada en un medio
o Rhesus D EHRN
adecuado, que favorezca la reacción Ag-Ac
o ABO EHRN (el test de Coombs
y luego de ese tiempo de incubación se
puede ser solo débilmente positivo).
prueban con el reactivo de antiglobulina
o Anti-Kell EHRN
humana para ver si están presentes o no en
o Rhesus c EHRN la muestra en estudio.
o Incompatibilidad por otros grupos
sanguíneos (RhC, Rhe, Kidd, Duffy,
MN, P y otros).
  Determinación del fenotipo de los GR K,
Lea, Fya Fyb, Jka, Jkb, y subgrupo de Rh
usando un suero conocido.

Por ejemplo, si quisiéramos detectar en el

suero de un paciente un anticuerpo dirigido
contra algún antígeno de los eritrocitos, lo
primero que tenemos que hacer es incubar el
suero con GR que porten el antígeno (se
usan GR comerciales que expresan serie de
Ag conocidos), luego de la incubación de
realizan lavados para remover anticuerpos
que no se unieron (rojos y amarillos) y luego
se adiciona el reactivo antiglobulina humana
IAT: tubo con muestra de suero o plasma con Ac, 2
que reconocerá las IgG unidas a eritrocitos
gotas son incubadas con GR screening a t° que
que no son capaces de aglutinar favorezca la reacción (37°C). Si hay Ac dirigidos
(sensibilizantes). contra algún Ag presente en las células screening en
el plasma o suero del individuo esos Ac se unan
durante la incubación, esto será revelado mediante
el reactivo de antiglobulina humana. Es necesario
lavar los Ac no unido (3 veces). Por último, se
agrega el reactivo, se centrifuga y se lee.
Fuentes de error en los test de AGH
Resultados falsos negativos: DAT general
e IAT
1. No lavar adecuadamente los GR, ya que
las globulinas no unidas a los GR
Indicaciones neutralizarán el reactivo AGH.
El test de antiglobulina humana indirecto 2. El proceso de lavado y la adición de
(IAT) se realiza para determinar la presencia reactivo AGH deben realizarse lo más
de sensibilización de GR con IgG y/o rápido posible para minimizar la
complemento in vitro en las siguientes pérdida de anticuerpos unidos por
condiciones elución (la reacción Ag-Ac es
 Test de compatibilidad (al efectuar una reversible, pueden despegarse).
transfusión). 3. El almacenamiento inadecuado, la
 Screening y detección de Ac inesperados contaminación bacteriana y la
en suero contaminación con suero humano
afectarán la actividad del reactivo AGH.
 4. No agregar el reactivo AGH. Jka, anti-Jkb). Existen anticuerpos que son
5. Centrifugación inadecuada. capaces de fijar complemento, en ese
6. Número de células presentes en la caso se prefiere el uso de suero.
prueba:  La temperatura y el tiempo de incubación
 Demasiadas células dan reacciones afectan la unión el anticuerpo o
débiles. complemento a las células.
 Muy pocas células afectarán la  Se debe lograr una proporción óptima de
lectura de la aglutinación. suero a las células: generalmente 2-3
Razón antígeno-anticuerpo
gotas de suero a una gota de suspensión
La proporción óptima es 80 partes de celular al 5% (en tubo).
anticuerpo por 1 parte de antígeno. Hay Resultados falso positivo
términos específicos para variaciones en esta DAT e IAT
relación.  En muestras que contienen potentes Ac
Prozona: exceso de anticuerpos, Ac que reactivos al frío, puede ocurrir
saturan todos los sitios de antígeno, no hay aglutinación antes de agregar el reactivo
anticuerpos que formen enlaces cruzados AGH.
entre células, sin aglutinación.  Tubos sucios pueden causar
aglomeración de células.
Zona de equivalencia: Ac y Ag presentes
 Sobre centrifugación.
en proporción óptima, aglutinación formada.
Zona de exceso de antígeno: postzona,
demasiados antígenos, cualquier
aglutinación está oculta por masas de DAT
antígenos no aglutinados.  Una DAR positiva de una muestra
Resultados falsos negativos coagulada debe repetirse en una muestra
DAT de EDTA.
Todas las muestras negativas en la fase  Las muestras recogidas de las líneas de
AGH deben incubarse a temperatura infusión pueden tener complemento
ambiente durante 5 minutos para lograr la presente en las células.
máxima sensibilidad necesaria para la IAT
detección del complemento (tiempo de Las células con un DAT positivo darán un
incubación y leer). resultado positivo en cualquier
IAT procedimiento de antiglobulina indirecta.
 El suero y/o GR pierden reactividad si se Células Coombs o células control Coombs
almacenan incorrectamente. Para mostrar que las células de prueba se
 El plasma utilizado en lugar del suero lavaron adecuadamente y que no se ha
puede conducir a la falla en la detección producido neutralización o deterioro de los
de anticuerpos dependiendo de la reactivos. Las células recubiertas con
presencia de complemento activo (anti- anticuerpos se usan como un indicador
positivo. Las células control Coombs se
deben utilizar entonces en pruebas que
resulten ser negativas.
En una prueba de antiglobulina negativa, la
globulina antihumana debe permanecer
activa y esto se puede demostrar mediante la
adición de células sensibilizadas con IgG.
La aglutinación de las células sensibilizadas
con IgG después de mezclar y centrifugar
confirma que se añadió la globulina
antihumana a la prueba, que las células de
prueba se lavaron adecuadamente y se
eliminaron todas las moléculas de globulina
libre y que la globulina antihumana estaba
activa.
La falta de aglutinación de las células
sensibilizadas con IgG indica que el
resultado negativo original de la prueba de
antiglobulina no es válido y la prueba debe
repetirse.

Se tiene GR que no presentan AC IgG unidos a su

superficie, al adicionar a la prueba GR con Ag
fijados (células control Coombs) reaccionarán si el
reactivo AGH está en buenas condiciones y arrojará
un resultado positivo. Esto permite comprobar que
el resultado negativo es válido.