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Maestria en I
Ciencias
A limentarias

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
INSTITUTO DE CIENCIAS BASICAS

“ Estudio in vitro de la capacidad inhibitoria de radicales

libres del fruto de la Guanábana (Annona m urícata) ”

TESIS
Que para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIAS ALIMENTARIAS

Presenta:
Q.C. Yessica Eduviges Zamudio Cuevas

Director de Tesis:
Dr. Rafael R. Díaz Sobac

Xalapa, Veracruz Noviembre 2011

 DEDICATORIAS

Este trabajo está dedicado a mi tío Jorge y Mana, elementos fundamentales

generadores de ésta idea, por el gran apoyo durante toda mi vida,

A mi mamá, por ser una guía y estar ahí siempre, por sus buenos consejos y
ser mi más grande motivación y fortaleza.

A mi maravillosa familia, por todo su apoyo y buena vibra, a mis primos

hermanos y en especial a Pablo, Nena y Yeni por impulsarme a seguir y ser
mejor, a mis hermanos: Arturo y Marycarmen por apoyarme y soportarme, asi
como a mi Papá, que de alguna manera algo bueno hizo en mi, que es parte de
lo que ahora soy.

A mis tías favoritas Reyna y Rita, son grandiosas, lo dedico a ustedes por
impulsarme a lo largo de mi existencia a la superación, a Mamita por su
generosidad y amor y ser el pilar de la familia.

A los amigos, que han estado ahí en los buenos y malos momentos.

A Dios y Jesús por permitirme tener la fuerza para seguir cuando todo sale mal.
 AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Veracruzana por todos los apoyos y facilidades para la

realización de éste proyecto, asi como al CONACYT por el financiamiento
otorgado. Al Dr. Rafael Díaz Sobac y la Dra, Alma Vázquez Luna por creer en
mí y brindarme todo su apoyo y confianza. Al Dr. Alberto López Reyes y al Dr.
Carlos Pineda por abrirme las puertas del Instituto Nacional de Rehabilitación
para la culminación de éste trabajo, por ser una inspiración en la ardua labor de
la investigación. A la Dra. Marlid Cruz Ramos y Biol. Mónica Santamaría, por
todos sus buenos consejos y sus valiosas colaboraciones.

A la Dra. Elia Nora Aquino, Dr. Oscar García Barradas y Dra. Rosa Iseia
Guzmán Gerónimo, por sus aportes científicos y metodológicos, para mejorar ©I
trabajo. Al grupo de trabajo de ingeniería de tejidos: M en C. Carlos Landa
Solís, Biol. Carmina Ortega, Biol. Valentín Martínez y M. en C. Ricardo Gómez
por las excelentes atenciones y su disponibilidad en la realización de técnicas
analíticas y análisis estadísticos. A los chicos Tec: Daniel Rosas, José Alberto
Sosa Romo, Ricardo Pimentel, Elizabeth Villagómez y Lie en Nut. Raúl
Rodríguez por su grandioso apoyo y sincera amistad.

A los compañeros de posgrado: Esmeralda Jiménez Cruz, Suad Jácome, Laura

Acosta por sus aportes científicos y su amistad, por hacer la maestría menos
amarga, también a César Ortíz por su disponibilidad y orientación, Thania
Urrutia, Isabel Bautista, Esther Hdez y Dahiana Cessa por sus ánimos y buena
vibra, a Ricardo R. González por su aporte tecnológico y su amor incondicional.
A todos los que voluntariamente contribuyeron en este proyecto y que sin su
ayuda hubiera sido más difícil llegar al final de esto.
 ÍNDICE
Páginas

RESUMEN............................................................................................................ vi
SUMMARY.......................................................................................................... vii
1. INTRODUCCIÓN........................................................................ .................... 1
2. MARCO DE REFERENCIA..........................................................
2.1 Guanábana (Annona muricata)......................................................
2.2 Actividad biológica de guanábana.................................................... 4
2.3 Frutas y hortalizas y su actividad biológica................... ............................. 6
2.4 Radicales libres y estrés oxidante....................................................... 7
2.5 Sistema de inhibición de radicales libres....... ............................................ 9
2.6 Polifenoles y su impacto biológico ......... ......................................11
2.7 Flavonoides.............................................................
2.8 Metabolismo y biodisponibilidad de los polifenoles en la dieta................ 15
2.9 Caracterización de la actividad antioxidante.............................................. 17
2.10 Métodos de evaluación de la capacidad antioxidante in vitro.................. 17
2.11 Métodos químicos..................................................................................... 18
2.13 Modelos celulares para la investigación del cáncer................................. 21
2.14 SITUACIÓN ACTUAL............................................................................... 25
3. PLANTEAMIENTO Y DEFINICIÓN DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN26
4. OBJETIVOS E HIPÓTESIS............................................................................27
4.1 Objetivo general.......................................................................................... 27
4.2 Objetivos específicos.................................................................................. 27
5. HIPÓTESIS.................................................................................................... 27
6. MATERIAL Y MÉTODOS...............................................................................28
6.1 Materia prima....................................................................
6.2 Metodología................................................................................................ 28
6.2.1 Obtención de extractos.........................................................................28
 6.2.2 Cuantificación de fenoles totales......................................................... 29
6.2.3 Cuantificación de flavonoides.............................................................. 29
6.2.4 Identificación y cuantificación de ácido gálico y catequina por HPLC.. 30
6.2.5 Determinación de capacidad antioxidante........................................... 31
6.2.5.a Método de DPPH......................................................................... . 31
6.2.5 b.Cromatografía en capa fina “DPPH-CCF"....................................... . 32
6.2.6 Capacidad de inhibición de radicales libres en cultivo celular...... ......33
6.2.6.1 Preparación y estandarización del cultivo celular............... ......... 33
6.2.6.1 .a Modelo de estrés oxidante (Curva de viabilidad celular)............... 34
6.2.6.1.b Determinación de la viabilidad celular por incorporación del
colorante cristal violeta........................................................... 35
6.2.6.1 .c Modelo de preparación estándar de extracto de guanábana......... 35
6.2.6.1 d Ensayo de toxicidad del extracto de guanábana en cultivo celular 36
6.2.7 Evaluación de la proliferación celular en líneas de cáncer cervlcouterino
......................................................................................... 38
6.2.8 Análisis estadístico............................................................................... 39
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN..................................................................... 40
7.1 Extracción de compuestos fenólicos y flavonoides.................................... 40
7.2 Cuantificación de fenoles totales................................................................40
7.3 Cuantificación de flavonoides totales..........................................................41
7.4 Identificación y cuantificación de ácido gálico y catequina por HPLC...... 41
7.5 Determinación de la capacidad antioxidante............................................. 44
7.6 Determinación de actividad antioxídante por cromatografía en capa fina
“DPPH-CCF"..................................................................................... 47
7.7 Capacidad de inhibición de radicales libres en cultivo celular................. 48
7.8 Ensayo de toxicidad del extracto de guanábana en cultivo celular.......... 49
7.9 Caracterización de la capacidad antioxidante del extracto de guanábana en
cultivo celular................................................................................... 50
7.10 Determinación de especies reactivas de oxígeno (ERO)......................... 53
 7,11 Evaluación de actividad antiproliferativa en células tumorales HeLa....54
8. CONCLUSIONES........................................................................................... 57
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 58
10. APÉNDICE................................................................................. 71

MI
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Distribución mundial de Annona muricata........................................... 2

Fig ura 2. Guanábana (Annona muricata)........................................................... 3
Figura 3. Estados productores de guanábana............,.......................................4
Fig ura 4. Estructura de las acetogeninas................. ..........................................5
Figura 5. Clasificación de los compuestos polifenólicos...................................11
Figura 6. Estructura básica de los flavonoides.................. ,...................... .......12
Figura 7. Clasificación de los Flavonoides........................................ 13
Figura 8. Diseño de diluciones de extracto de guanábana conmedio de cultivo
DMEMF12....................................................................... ................. 36
Figura 9. Cromatograma del estándar de ácido gálico................ ................ . 42
Figura 10. Cromatograma del estándar de catequina....................................... 42
Figura 11. Cromatograma de pico enriquecido de catequina y pulpa de
guanábana............................................... 43
Figura 12. Cromatograma de pico enriquecido de ácidogálico y pulpa de
guanábana......................................................................................... 43
Figura 13. Cromatograma de pulpa de guanábana........................................... 44
Figura 14. Determinación de la capacidad antioxidante del extracto de
guanábana..........................................................................................45
Figura 15. Capacidad antioxidante del extracto de guanábana y del ácido
gálico.................................................................................................. 46
Figura 16. Capacidad antioxidante de estándar de ácido ascòrbico.................47
Figura 17. Identificación de actividad antioxidante del extractode guanábana
Annona muricata por DPPH-CCF..................................................... 48
Figura 18. Curva de viabilidad de fibroblastos................................................... 49
Figura 19. Viabilidad de fibroblastos.................................................................. 50
Figura 20. Viabilidad de fibroblastos con estrés inducido con peróxido de
hidrógeno H2C>2 y extractos de guanábana....................................... 51
IV
Figura 21. Efecto citoprotector del extracto de guanábana en la citotoxicidad
mediada por H2C>2............................................................................. 52
Figura 22. Efecto citoprotector del extracto de guanánaba por inhibición de
especies reactivas de oxígeno inducidas por H2Q2......................... 53
Figura 23. Actividad antiproliferativa a las 12 y 24 horas de células Hela con
extracto de guanábana a diferentes concentraciones................ . 55
Figura 24. Curva de calibración para cuantificación de fenoles totales.............71
Figura 25. Curva de calibración para cuantificación de flavonoídestotales..... 71
Figura 26. Cromatograma del estándar de ácido clorogénico............................72
Figura 27. Cromatograma del estándar de quercetina............................. 72

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Contenido nutrimental de Annona muricata..................................... . 3

V
 RESUMEN

El estrés oxidante, generado por los radicales libres es uno de los factores
que promueve el desarrollo de enfermedades crónico degenerativas; por lo que
el consumo de antioxidantes naturales coadyuva a minimizar sus efectos
negativos. El presente estudio evaluó la concentración de polifenoles y
flavonoides totales contenidos en la pulpa de guanábana (Annona muricata) y la
capacidad antioxidante y de inhibición de especies reactivas de oxigeno (ERO)
inducidas por peróxido de hidrógeno, en cultivo celular de fibroblastos, medíante
pruebas de viabilidad. También, se determinó la actividad antiprolif©rativa en
línea celular tumoral HeLa. Los resultados mostraron que el contenido de
fenoles totales en la pulpa de guanábana fue de 178 mgEAG/100g y de 55
mgEC/100g para flavonoides. Ácido gálico y la catequina, fueron los
compuestos mayoritarios respectivamente. La capacidad de inhibición de
radicales libres in vítro fue de 86%. Los compuestos polifenólicos mostraron
capacidad protectora al daño oxidativo en fibroblastos; sin embargo no se
observó capacidad antiproliferativa en células tumorales de cáncer
cervicouterino.

PALABRAS CLAVE: Radicales libres, antioxidantes, polifenoles,

flavonoides.
 SUMMARY

Oxidative stress generated by free radicals is one factor that promotes the
development of chronic degenerative diseases, so the consumption of natural
antioxidants helps to minimize its negative effects. This study evaluated the
concentration of total polyphenols and flavonoids contained in the pulp of
soursop (Annona muricata), and the antioxidant capacity and the ability to inhibit
reactive oxygen species (ROS) induced by the hydrogen peroxide in cell culture
from fibroblast through viability tests. Also we investigated the antiproliferative
activity in tumor cell line HeLa. The resuits showed that the total phenolic
content in soursop pulp was 178 mgEAG/IOOg and flavonoids 55 mgEG/IOOg.
Gallic acid and catechin were the major compounds respectively. The ability to
inhibit free radicals in vitro was 86%. Polyphenolic compounds showed
protective capacity to oxidative damage in fibroblasts, but there was no
antiproliferative capacity in tumor cells of cervical cancer.

KEY WORDS: Free radicals, antioxidants, polyphenols, flavonoids.

VII
 1. INTRODUCCIÓN

Las enfermedades crónico degenerativas como el cáncer, la diabetes, y las

enfermedades cardiovasculares son las principales causas de muerte en nuestro país.
El cáncer de mama y de cuello del útero provocan el 13% de las defunciones entre la
población femenina. En los hombres, el cáncer de pulmón, tráquea y bronquios y de la
próstata, son los de mayor incidencia (www.inegi.gob.mx INEGI, 2010). Diversas
investigaciones muestran que el estrés oxidante generado por un exceso de radicales
libres, se asocia al desarrollo de dichas patologías. Una forma de disminuir el daño
oxidativo celular es consumiendo antioxidantes naturales como los pollfenoles,
importantes en la prevención y desarrollo del cáncer debido a sus propiedades
biológicas. La forma de prevenir estas enfermedades es modificando estilos de vida y
consumiendo una dieta balanceada.

En México, el cultivo y la comercialización de guanábana se destina a la exportación

para su consumo en fresco, así como para la obtención de jugos, y aun cuando no es
de las frutas de mayor demanda, si es de gran interés para la industria de alimentos y
de la biomedicina; ya que se ha reportado que posee actividad antioxidante relacionada
con compuestos secundarios de importancia biológica funcional como las acetogeninas,
procianidinas, saponinas pentacíclicas; sin embargo poca atención ha recibido el
potencial efecto antioxidante e inhibidor de radicales libres que le puede proveer la
cantidad y tipo de fenoles y flavonoides presentes.

En este estudio se evaluó la capacidad inhibitoria de radicales libres de la guanábana

para proponerla como alimento funcional capaz de promover la salud.

1
 2. MARCO DE REFERENCIA

2.1 Guanábana (Annona muricata)

Annona muricata, conocida en nuestro país como “Guanábana", es un fruto

perteneciente a la familia Annonaceae. En México esta familia está integrada por 75
géneros y aproximadamente 600 especies, aunque sólo cuatro géneros son de
importancia frutícola: Annona, Uvaria, Rollinea y Asimia. Dentro del género Annona, las
especies de mayor importancia comercial son Annona muricata y Annona cherimolía;
son originarias de América del sur, ubicándose el centro de origen en Colombia o Brasil
(Aceves et al., 2008; Marcano, 2010).

Se encuentra dispersa tanto en forma silvestre como cultivada en las Antillas, (Figura
1) el sur de México, Brasil y las Islas del Pacifico; también es cultivada en el sur de
Florida, sureste de China hasta Australia y África (Aceves et al., 2008).

Fig ura 1. Distribución mundial de Annona muricata. Fuente: García, 2009.

La Annona muricata tiene forma ovalada que se asemeja a un corazón (Figura 2),
está cubierta por una cáscara de color verde oscuro con varias espinas pequeñas,
suaves, carnosas y que se desprenden fácilmente cuando están maduras. Su pulpa es
muy aromática, con textura similar al algodón, es blanca cremosa, jugosa y muy suave,
ésta recubre totalmente las semillas negras de 1.25 a 2 cm de largo. Cada fruto puede

2
contener hasta 200 semillas. Su sabor es ácido-subácido similar al de la pina y mango
(Rojas et al., 2004).

Figura 2. Guanábana (Annona muricela). Fuente: www.pokka.com

El contenido nutrimental porcada 100 gramos de pulpa se presenta en la la b ia l:

Tabla 1. Contenido nutrimental de Annona muricata por cada 100 g de pulpa

A p o rte C o n te n id o

C a lo r ía s 5 3 .1 - 6 1 .3

Agua 8 2 .8 g

C a r b o h id r a to s 1 4 .6 3 g

G ra s a s 0 .9 7 g

P r o te ín a s 1 -0 g

F ib ra 0 .7 9 g

C e n iz a s 0 .6 g

C a lc io 1 0 .3 m g

F ó s fo r o 2 7 .7 m g

H ie r r o 0 .6 4 m g

T ia m in a 0 .1 1 m g

R ib o fla v in a 0 .0 5 m g

N ia c in a 1 .2 8 m g

Á c id o a s c ò r b ic o 2 9 .6 m g

Fuente: www.fao.org/inph
 La producción de guanábana a nivel nacional abarca 7,900 hectáreas que producen
un estimado de 65,000 toneladas anuales según lo reportado por Aceves et al. (2008).
Es sumamente apreciada en Estados Unidos en vista de la magnitud de las
importaciones, ya que el principal proveedor de guanábana a los Estados Unidos es
México, donde la superficie plantada (Figura 3) se ubica principalmente en los estados
de Nayarit, Sinaloa, Colima, Jalisco, Michoacán, Guerrero, Gaxaca, Chiapas, Tabasco,
Campeche, Yucatán, Veracruz, Morelos y Quintana Roo (Rojas et al., 2004).

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Figura 3. Estados productores de guanábana. Fuente: Espinosa, 2005.

2.2 Actividad biológica de guanábana

Los tallos, las hojas y las semillas de la guanábana, han sido usadas en la medicina
tradicional por los pueblos indígenas para diversos tratamientos antitumorales,
antiparasitarios y antidiarreicos. Es utilizada en muchos países tropicales como
antiespasmódico, astringente, sedante, hipotensor, insecticida, vermífugo, para la tos,
fiebre, dolor, enfermedades de la piel, entre otros (Solís et al., 2010).

La Annona muricata posee más de 50 acetogenínas (Figura 4) con diferentes

actividades biológicas encontradas en fruta, corteza y hojas. Estos compuestos son
miembros de una clase de derivados policétidos que se caracterizan por poseer una
larga cadena alifática de 35 ó 37 átomos de C, con uno, dos o tres anillos
tetrahidrofurano adyacentes o no, así como sustituyentes oxigenados (hidroxilos,
cetonas y epóxido) o dobles enlaces, localizados a lo largo de la cadena, en uno de sus

4
extremos presentan un anillo de Y~Iact° na a ó p insaturado, metil sustituido, en
ocasiones saturado o rearreglado como cetolactona. También se han descrito
compuestos con dobles enlaces en cadena alifática, compuestos con anillos epoxi ó
THP (tetrahidropirano), así como lineales (Chiu et ai, 2003; Bajin ba Ndob et al., 2009).

Son compuestos provenientes de plantas, animales ó microorganismos. Se

consideran los metabolitos secundarios más potentes inhibidores del complejo I
mitocondrial, muestran un efecto antiproliferativo sobre líneas celulares de cáncer, aún
en aquellas con multi-resistencia a drogas (Liaw et al., 2003; Rojas et al., 2004; Arroyo
et al., 2005).

Figura 4. Estructura de las acetogeninas. Fuente: Nakanishi et ai, 2003.

Los mecanismos para explicar la actividad biológica son dos sitios blanco en la
célula: Complejo I (NADH (nlcotinadeníndinucleótldo); Ubiquinona oxidorreductasa)
mitocondrial y la NADH oxidasa de las membranas plasmáticas.

El complejo I mitocondrial tiene un papel importante en la síntesis de ATP

(adenosíntrifosfato) a partir de moléculas reducidas que se forman en metabolismo
central celular y se especula que debido a la rápida proliferación de las células
cancerosas, estas requieren de niveles altos de energía, por lo que pudieran ser más
sensibles a su descenso y presentar cambios morfológicos importantes como pérdida
de asimetría de la membrana plasmática, fragmentación del ADN y la condensación
nuclear, así como la transducción de señales en cascada, como las proteasas de la
familia de las caspasas, la expresión de factores antiapoptóticos y la respuesta
antioxidante con enzimas superóxido dismutasa (SOD), catalasa y glutatión peroxidasa,
así como el incremento de proteínas apoptóticas Bad y Bax (Quíspe et ai, 2006; Quispe
et al., 2007; Schlie et ai, 2009).

5
2.3 Frutas y hortalizas y su actividad biológica

La producción, comercialización y consumo de frutas y hortalizas en el mundo son

cada día mayores y representan un soporte para las economías agrícolas y el
mejoramiento de la salud de los consumidores, y de México en particular, donde el
consumo de frutas frescas es superior al de Estados Unidos, Alemania o Japón, debido
al aumento de los procesos de urbanización, del conocimiento sobre sus beneficios, del
desarrollo tecnológico y de la agroindustria, entre otros; además se ha incrementado el
uso de frutas como componentes principales de diferentes productos como jugos,
néctares, pulpas, mermeladas y dulces (Yánez, 2002; Camarena, 2008)

Las frutas juegan un papel importante en el equilibrio de la dieta humana por sus
cualidades nutritivas; así como también por los fitoqulmicos, que si bien no son
considerados nutrimentos porque no ejercen una función nutricional, debido a que no s©
trata de moléculas indispensables para el organismo, su consumo brinda una
protección adicional contra la acción nociva de sustancias provenientes de la dieta y del
entorno ambiental que afectan la salud de la población (Hemila, 1992; Sillar, 1999).

Diversos metabolitos presentes en las frutas protegen al organismo humano frente a

enfermedades relacionadas con daños neurodegenerativos, cardiovasculares,
desarrollo de cáncer, inmunodeficiencias, cataratas oculares, diabetes, artritis y
envejecimiento, entre otras. La Organización Mundial de la Salud (OMS), en los últimos
años ha validado los resultados de diversos estudios de investigación que ponen de
manifiesto los efectos anticancerígenos de frutas y hortalizas, particularmente contra el
cáncer gastrointestinal y de pulmón. En algunos estudios, uno de cada diez pacientes
afectados por algún tipo de cáncer, mantuvo una insuficiente alimentación a base de
frutas y hortalizas (Olsson et al., 2004; Beltrán y García, 2006; Murillo, 2006; Castañeda
et al., 2008; Barrera y Yahia, 2009).

Las frutas han asumido una nueva función, ya que proveen beneficios fisiológicos
adicionales, previniendo y protegiendo a través de su capacidad antioxidante. Por estas

0
razones, los investigadores resumen los beneficios de estos productos bajo el término
de "alimentos funcionales". En consecuencia, se ha incrementado en los últimos años el
interés por investigar la eficacia de compuestos naturales con propiedades
antioxidantes y sobre todo de caracterizar el potencial antioxidante de diferentes
productos biológicos con el fin de orientar el consumo a una dieta más saludable
(Pérez, 2008).

Algunos fitoquímicos aislados de la pulpa de algunas anonas son: acetogeninas,

procianidinas, flavonoides, saponinas pentaclclicas, terpenoides, ácido p-coumárico,
azúcares, alcoholes, aldehidos, ácidos orgánicos e inorgánicos, metales, sales,
minerales, vitamina B y C, GABA (ácido gamma-aminobutirico), entre otros (Adewole y
Ojewole, 2009).

2.4 Radicales libres y estrés oxidante

Las enfermedades crónico degenerativas están relacionadas con la oxidación de

blomoléculas a nivel de las membranas y tejidos, que son Inducidas por el oxígeno
activo y mediada por radicales libres.

Los radicales libres son moléculas que en su estructura atómica presentan un

electrón desapareado y que, debido a la inestabilidad de su configuración electrónica,
son generalmente muy reactivos, lo que es la base de su toxicidad, éstos actúan como
mediadores y reguladores a concentraciones fisiológicas, mientras que a
concentraciones elevadas pueden actuar como potentes oxidantes citotóxicos (Halliwell,
2007).

Los procesos biológicos normales, como el metabolismo oxidativo es capaz de

generar radicales libres oxigenados, altamente reactivos. El daño celular se produce
cuando existe un desequilibrio entre la formación de radicales libres y los sistemas
encargados de su eliminación, con un predominio de los primeros que conduce al
desarrollo del estrés oxidante (Castañeda et al., 2008).

7
 En los sistemas vivos se generan diversos tipos de radicales libres, siendo los más
conocidos los radicales del oxígeno. Se utiliza el término Especies Reactivas del
Oxígeno “ERO” (Reactive Oxygen Species, “ROS”) como nombre colectivo para
referirse a las especies derivadas del oxígeno, incluyendo tanto los derivados radicales
como los no radicales, que son agentes oxidantes y/o fácilmente convertibles en
radicales; así como especies reactivas del nitrógeno “ERN" y de metales (Castañeda et
al., 2008).

Las ERO incluyen anión superóxido (0 2'), hidroxilo (OH'), alcóxido (RQ‘) y peróxido
(ROO'). Entre los derivados no radicales se encuentran el peróxido de hidrógeno
(H20 2), ácido hipocloroso (HCIO), ozono (0 3) y oxigeno singulete (AG2) (Ugartondo,
2009).

El organismo transforma, de manera natural entre el 2 y 5% del oxigeno consumido

en ERO durante el proceso de combustión del oxigeno en las mitocondrias, El
incremento del consumo de oxígeno (estallido respiratorio) por las células del sistema
inmunológico es utilizado como un mecanismo de defensa innata para eliminar agentes
patógenos (Hail etal., 2008).

Fuentes exógenas como el humo del tabaco, contaminación atmosférica, radiación

UV, radiación electromagnética de baja longitud de onda (rayos gamma), ozono y hasta
medicamentos como el paracetamol, pueden ínteraccionar dividiendo el agua en el
organismo para generar el radical hidroxilo (OH"), este radical, débilmente reactivo, una
vez producido busca su estabilidad electrónica atacando a cualquier molécula que esté
cerca, ocasionando una secuela de reacciones en cadena de radicales libres en
propagación, cuando se genera este desequilibrio se desencadena un cuadro de
cambios fisiológicos y bioquímicos llamado estrés oxidante(Halliwell, 2007; Hail et al.,
2008).

Este estrés oxidante es el responsable del daño bíomolecular, que conduce a

fenómenos de mutagénesis y carcinogénesís, debido principalmente a modificaciones

8
en la estructura de la molécula del ADN (ácido desoxirrlbonucleico), en sus bases
nitrogenadas que producen mutaciones en la célula. La oxidación de los ácidos grasos
poliinsaturados de las membranas biológicas, genera un estado de peroxidación lipídica
que se asocia al proceso de envejecimiento. Una de las herramientas para combatir el
estrés es la suplementación con compuestos que actúen bloqueando la acción de los
radicales libres (Carhuapoma et al., 2005; Palhares y Mansour, 2006; Rivera y
Betancourt, 2006).

Cuando el organismo se ve desbordado por un exceso de especies reactivas, las

estructuras biológicas que lo integran (ADN, ARN (ácido ribonucleico), proteínas,
carbohidratos y lípidos) pueden convertirse en el blanco de acción y resultar dañadas,
originando pérdida de la función de enzimas, incremento de la permeabilidad celular,
disrupción de la señalización en la célula y en ocasiones muerte celular programada o
apoptosis celular (Olsson et al., 2004; Ramos, 2007; Hail et al., 2008; Oyagbemi et al.,
2009; Ugartondo, 2009).

2.5 Sistema de inhibición de radicales libres

Los procesos de adaptación evolutiva han permitido a la célula desarrollar

mecanismos de defensa antioxidante como medios de protección de la actual atmósfera
oxidante, por lo tanto un antioxidante es una molécula que previene o elimina el daño
oxidativo (Halliwell, 2007; Szabo et al., 2007). Diversas sustancias reductoras
intracelulares de naturaleza hidrofilica o lipofílica tienen efectos antioxidantes, ya que se
encargan de captar los radicales libres que aparecen en su entorno, protegiendo asi a
los diversos compartimentos intracelulares de los procesos oxidativos.

Entre los compuestos de carácter hidrofílico se encuentran el adenosín difosfato

(ADP), el ácido ascòrbico, el ácido úrico, la taurina y las moléculas con grupos tiol como
el glutatión. Siendo el sistema glutatión reducido/glutatión oxidado (GSH/GSSG), en el
que predomina la forma reducida (99%), uno de los sistemas de defensa antioxidante
más importante, ya que el glutatión reducido cumple una doble misión;

9
 1. Evita la oxidación de los grupos sulfhidrilo presentes en los residuos de cisteína
de diversas proteínas (enzimas, hemoglobina o proteínas de membrana).

2. Interviene en los procesos de descomposición de peróxidos (H20 2l peróxidos

lipidíeos) que se forman en las células principalmente en el eritrocito y en macrófagos
activados (Halliwell, 2007; Szabo et al., 2007).

El GSH se oxida a través de la reacción catalizada por la glutatión peroxidasa, en la

que se utilizan como sustratos los peróxidos (ROOH y H20 2), constituyendo un
importante mecanismo de detoxificación. La disminución de los niveles de glutatión
reducido en tales circunstancias supone un elevado riesgo de oxidación y, por tanto; de
alteración en la estructura-función del eritrocito (Alla et al., 2006; Sánchez, 2009).

El sistema antioxidante del organismo está constituido por compuestos de naturaleza

enzimàtica que previenen la oxidación celular: superóxido dísmutasa que convierte al
0 2‘ por dismutación en H20 2, el cual es transformado por la enzimas catalasa y glutatión
peroxidasa, en agua (H20), éstas últimas forman parte de la primera linea de defensa
antioxidante, así como la enzima glutatión transferasa y glutatión reductasa.

Dentro de los antioxidantes endógenos de naturaleza no enzimàtica están la

ceruloplasmina, transferrina, lactoferrina, haptoglobina y albúmina que se encuentran
en el plasma sanguíneo, éstos secuestran los iones metálicos capaces de catalizar las
reacciones desencadenantes de los procesos peroxidativos "reacción de Fenton"
(Sánchez, 2009; Ugartondo, 2009).

Los antioxidantes exógenos; son aquellos que ingerimos a través de la dieta incluyen
a la sustancias fitoquímícas como la vitamina E, beta-caroteno, vitamina C, compuestos
polifenólicos como los flavonoides y metales de transición como Se, Cu, Zn (Hassimotto
et al., 2009).

10
2.6 Polifenoles y su impacto biológico

Los polifenoles son un grupo de sustancias químicas producto del metabolismo

secundario de las plantas y se encuentran en las ralees, tallos, troncos, hojas y frutos,
donde desarrollan funciones que abarcan desde la protección frente a influencias
externas hasta los mecanismos de polinización, el olor, el color y la tolerancia al frío,
entre otros (Zavala et al., 2002; Castañeda et al., 2008).

Se caracterizan por contener un anillo aromático unido a uno o más grupos hidroxilo
(grupo fenol). Su estructura varia de moléculas simples, como los ácidos fenólicos, a
estructuras complejas, como los taninos condensados. Se clasifican en cuatro familias
en función del número de anillos fenólicos y de los elementos estructurales unidos a
esos anillos: flavonoides, ácidos fenólicos, estilbenos y lignarios (Figura 5) (Kluth et al.,
2007).

oci

Flavonoides Ácido fenólicos Estilbenos Lignanos

Figura 5. Clasificación de los compuestos polifenólicos. Fuente: Kluth et al., 2007.

La actividad antioxidante de los compuestos polifenólicos radica en su capacidad

para secuestrar los radicales libres y la quelación de los metales. Su estructura química
es ideal para reaccionar con estas estructuras químicamente inestables y formar un
radical intermedio más estable y menos reactivo, ya que la presencia de los anillos
aromáticos y los grupos hidroxilo permite que se deslocalícen los electrones (Kurata et
al., 2007; Castañeda et al., 2008).

11
 Además poseen actividades biológicas: antimicrobianas, antimutagénicas, antiVIH,
antioxidante de lipoproteinas de baja densidad (LDL) relacionadas con enfermedades
coronarias y la agregación plaquetaria, presentan efectos antiinflamatorios, entre otros
(Zavala et al., 2002; Cos et al., 2007),

Estudios relacionados a la evaluación de la capacidad antioxidante de frutas y

bebidas de frutas, indican que la guanábana, posee gran captación de radicales libres y
que las frutas con más compuestos polifenólicos tienen mayor actividad antioxidante,
concluyendo que estos últimos son los principales responsables de la actividad
antioxidante “in vitro” (MuríWo, 2006).

2.7 Flavonoides

Es la familia de compuestos fenólicos más abundante, son de bajo peso molecular

formados por la combinación de derivados de la fenilalanina y el ácido acético,
Comparten una estructura común caracterizada por tener un esqueleto dlfenllpropano
(CeC^Ce) basado en el núcleo flavonoide, formado por tres anillos conocidos como A, B
y C (Figura 6). El anillo aromático A está condensado con un anillo de seis carbonos
(C), un heterociclo oxigenado, que en posición dos tiene un anillo bencénico como
sustituyente (B) (Merken y Beecher, 2000).

Figura 6. Estructura básica de los flavonoides. Fuente: Merken y Beecher, 2000.

Presentan más de 5000 estructuras diferentes y están presentes en las frutas y las
hortalizas, asi como en alimentos y bebidas obtenidas a partir de plantas como el aceite

12
de oliva, el té y vino tinto. Las diferencias entre los diversos grupos de flavonoides se
establecen por el grado de aromaticidad (dobles enlaces conjugados), el patrón de
hidroxilación (orden y número), el tipo de sustituciones (glicosilación, metilación,
sulfatación, etc.) y el grado de polimerización de sus estructuras.

Las moléculas de flavonoide no unidas a un grupo glucósido se conocen como

agliconas, mientras que las formas glicosiladas se llaman glicósidos de flavonoides. Las
variaciones estructurales en los anillos permiten subdividir a los flavonoides en seis
subclases (Figura 7): flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanonoles, flavanoles (flavan-
3-oles y flavan-3,4-d¡oles), antocianinas (antocianidínas), ¡soflavonas y chalconas
(Ramos et a/., 2007; García, 2009).

Figura 7. Clasificación de los Flavonoides. Fuente: Ramos et al., 2007.

Los flavonoides han sido utilizados para tratar desórdenes cardiovasculares y

prevenir algunos tipos de cáncer, debido a que la carcínogénesis es un proceso de

13
varios pasos (iniciación, promoción y progresión); el estrés inducido por los radicales
libres causa daños al ADN, que conduce a la mutación de bases y a la rotura de las
dobles cadenas, al entrecruzamiento y el reordenamiento de los cromosomas que
puede inducir al cáncer (Sudjaroen, 2009).

Los flavonoides neutralizan las especies reactivas de oxígeno, ayudan a atraparlas o

evitan que se propague la reacción química que genera más radicales libres, actúan
regulando ciertas actividades enzimáticas celulares relacionadas con la capacidad de
alterar la estructura de la membrana celular, influyendo en la señalización y ciclo
celular, el metabolismo de ácido araquidónico y la proliferación celular, asi como en la
apoptosis (Sakakibara et al., 2003; Katsube et al., 2003; Lako et al., 2007; Hall et al.,
2008).

Estudios de investigación se han centrado en los usos de los flavonoides como

potenciales captadores de radicales libres e inhibidores de la peroxidación lipldlca, para
prevenir el daño oxidativo; por lo que diversos flavonoides han sido evaluados como
agentes protectores de estrés oxidante en modelos celulares expuestos a distintos
estímulos oxidativos.

Alía et al. (2006) demostraron que las células de hepatoma humano HepG2 tratadas
con quercetina están mejor preparadas para hacer frente a un ataque oxidativo. Crespo
et al. (2008) concluyeron que el kaempferol previene la producción de peróxidos, anión
superóxido y óxido nítrico inducidos por citoquina en cultivo celular de hígado.

Martín et al. (2008) concluyeron que el extracto polifenólico de cocoa, utiliza como
mecanismo para atenuar las lesiones inducidas por terbutílhídroperóxído en células de
hepatoma humano, la inducción de las actividades de GPx (glutatíón peroxídasa) y GR
(glutatión reductasa), a través de las señales extracelulares reguladas por cinasas
(ERK).

14
 Recientemente la atención se ha centrado en la influencia de los flavonoides en las
vías de señalización y su interacción indirecta con el sistema de defensa antioxidante
endógeno. Se ha demostrado que la hesperidina regula la expresión de enzimas
antioxidantes como la hemoxigenasa 1 (HO-1) mediante la activación del factor nuclear
eritroide (Nrf2) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) involucradas
en los mecanismos de protección de daño en células como hepatocitos (Chen et al,,
2010 ).

Otras investigaciones han evaluado fracciones fenólicas de algunas frutas y

vegetales para la inhibición de la proliferación celular de cáncer y se ha concluido que el
mecanismo que utilizan los polifenoles es la apoptosis o muerte celular programada
(Katsube et al., 2003; Watanabe et al., 2003; Bawadi et al., 2005; Kurata et ai, 2007;
Peng et al., 2008; González et al., 2010).

2.8 Metabolismo y biodisponibilidad de los polifenoles en la dieta

Un amplio porcentaje de flavonoides son consumidos en la dieta, aunque la cantidad

y el tipo son dictados por los hábitos alimenticios y culturales. Las mejores fuentes de
polifenoles en la dieta humana son las frutas y sus jugos, ya que contienen una gran
cantidad de este tipo de metabolitos, y su ingesta es bastante abundante (100-200 g de
fruta/ración) (Sánchez, 2009).

La biodisponibilidad de los polifenoles es un determinante importante en la

comprensión de sus actividades biológicas. Los flavonoides ingeridos a través de la
dieta se encuentran abundantemente en forma 3-O-glícosilada y en estado
polimerizado. La biodisponibilidad es muy variable entre los diferentes polifenoles y en
función de las propiedades químicas, desconjugación/reconjugación en el intestino, la
absorción intestinal, y las enzimas para el metabolismo (Veeríah, 2007; Ugartondo,
2009).

15
 A pesar de la gran capacidad antioxidante de los flavonoides in vitro, su eficacia in
vivo está limitada por varios factores. Uno de ellos, y tal vez el más importante, es la
baja absorción de los flavonoides en humanos, en contraste con otros antioxidantes de
la dieta como las vitaminas C y E. La máxima concentración de flavonoides en el
plasma humano, que se alcanza normalmente entre 1 y 3 horas después del consumo
de los alimentos ricos en estos polifenoles, está entre 0,06 y 7,6 pM para flavonoles,
flavanoles y flavanonas, y menos de 0.15 pM para antocianidinas.

Además la vida media de los flavonoides en el plasma humano es corta,

normalmente de unas pocas horas. Estos factores limitan mucho la capacidad de los
flavonoides de la dieta para actuar como antioxidantes in vivo en el plasma (Lotito y
Frei, 2006).

Los polifenoles se absorben por difusión pasiva, la mayoría resisten la hidrólisis ácida
del estómago y llegan intactos al intestino; donde las enzimas intestinales (glicosldasas
y otras hidrolasas) o las procedentes de la microflora hidrolizan estos compuestos hasta
la forma de aglicón, convirtiéndolos en metabolitos más asimilables, algunos glucósidos
intactos son absorbidos por transportadores de glucosa en el Intestino delgado, en éste
sufrirán conjugaciones, con posteriores modificaciones (metílaciones, sulfataciones y/o
transformaciones con ácido glucurónico) en el hígado. Por lo tanto, las formas
procedentes de la dieta son totalmente diferentes de aquellas que ejercen su acción en
los tejidos (Sánchez, 2009).

En el torrente sanguíneo, los flavonoides circulan unidos a proteínas, en particular a

albúmina. La afinidad que muestran por esta proteína varía en función de su estructura
química. Su grado de unión con la albúmina puede afectar tanto a su tasa de
eliminación, como a su grado de incorporación en células y tejidos, de forma que la
captación celular de estos metabolitos es proporcional a su concentración en la forma
flavonoide libre.

16
 La biotransformación que sufren por parte del intestino y del hígado, afecta
enormemente a sus propiedades físicas, haciéndolos más solubles en agua, lo que
facilita su eliminación vía biliar o a través de la orina, afectando incluso a su capacidad
antioxidante (Veeriah, 2007).

Algunos flavonoides transformados mantienen la actividad antioxidante de sus

formas nativas, pero en general suelen perder poder antioxidante debido a las
modificaciones en sus grupos catecol y fenol. Se han realizado escasos estudios sobre
la captación de flavonoides por los tejidos, sin embargo en los pocos estudios
existentes se ha puesto de manifiesto que no existe correlación entre las
concentraciones de estos metabolitos en plasma y la captación de flavonoides por parte
de los tejidos (Barrera y Yahia, 2009).

2.9 Caracterización de la actividad antioxidante

La acción antioxidante que ejerce un compuesto se considera directa cuando

secuestra o inhibe la generación de ERO, o indirecta cuando estimula los mecanismos
de defensa antioxidantes endógenos (enzimáticos). Por lo anterior es importante
identificar el tipo de biomolécula que protege el antioxidante, así como la cantidad que
se requiere para ejercer su acción en un sistema biológico y evaluar el posible efecto
pro-oxidante que pudieran tener una vez que se haya reparado el daño (Halliwell,
2007).

2.10 Métodos de evaluación de la capacidad antioxidante in vitro

El estudio de nuevos compuestos con potencial efecto antioxidante cada vez

adquiere más relevancia en los campos de la biología, nutrición, la industria alimentaria
y la medicina, lo que hace necesaria la existencia de métodos in vitro, simples, rápidos
y confiables, para la determinación de la capacidad antioxidante de compuestos ya sea
en su forma pura (moléculas aisladas) o complejas (alimentos y muestras biológicas).

17
 Los métodos de evaluación de la capacidad antioxidante pueden clasificarse en
función de la especie oxidante: ERO, ERN; de radicales específicos o radicales
estables no biológicos, del mecanismo de acción del antioxidante (capacidad
secuestradora de radicales, capacidad de inhibición de la peroxidación lipídica, de
reducir metales o del sustrato oxidado, químico o biológico) (Ugartondo, 2009). Los
métodos in vitro más utilizados para evaluar la capacidad antioxidante de una sustancia
se muestran a continuación:

2.11 Métodos químicos

a. Ensayos de capacidad secuestradora contra ERO's, ERN's específicas:

a.1.Ensayos de capacidad secuestradora de radicales peroxilo (ROO')

Estos métodos miden la habilidad de un antioxidante para secuestrar radicales

peroxilo por transferencia de un átomo de hidrógeno. Los generadores de radicales
peroxilo más utilizados son los compuestos azo termolábiles 2,2'-azo bis (2-
amidinopropano) dihidrocloruro (AAPH) soluble en agua y el 2,2 azobis (2,4
dimetilvaleronitrito) (AMVN), liposoluble. Entre estos ensayos destacan:

-Ensayo TRAP (Total radical- trappíng parameter): se desarrolló para medir el estado
antioxidante del plasma humano. Los radicales peroxilo oxidan antioxidantes del plasma
y la oxidación y su inhibición se miden por absorción de oxígeno. Como antioxidante de
referencia se usa el Trolox (derivado sintético de la vitamina E) (Ciz el al., 2010).

-Ensayo TOSC (Total oxyradical scavenging capacity): se basa en la oxidación del

ácido a-keto-y-metilolbutírico a etileno por radicales generados por el AAPH. La
formación de etileno es inhibido por los antioxidantes y puede determinarse por
cromatografía de gases.

-Ensayo ORAC (Oxygen radical absorbance capacity): mide la "capacidad de

absorción de radicales oxígeno”, se basa en la capacidad de neutralizar radicales libres

18
(transferencia de un átomo de hidrógeno) por la degradación oxidativa de una molécula
fluorescente como la fluoresceina sometida a flujo constante de radicales peroxilo
generados por AAPH. La protección generada por los antioxidantes se cuantifica a
través de la fluorescencia (Alvarez et al., 2006).

-Ensayos basados en la química del luminol: los radicales peroxilo oxidan el luminol
generado radicales que emiten luz detectable. Los antioxidantes inhiben esta
quimioluminiscencia por un tiempo directamente proporcional al potencial antioxidante
de la muestra. Utiliza trolox como compuesto de referencia.

-Ensayos de oxidación del LDL (low-densitv lipoproteins); las LDL aisladas de

muestra de sangre se oxidan por los radicales generados por el AAPH o por metales de
transición como el Cu generándose dienos conjugados, que se determinan por
espectrometría a 234 nm (Rodrigo et al., 2006).

a. 2 Ensayos de capacidad secuestradora de radicales específicos generados en el

medio (por radiólisis, fotolisis, reacción de Fenton, etc.)

-Ensayos de capacidad secuestradora del:

Anión superóxido (0 2")
Peróxido de hidrógeno (H20 2)
Radical hidroxilo (OH-)
Oxígeno síngulete (0 2‘)
Radical óxido nítrico (N0‘)
Peroxinitrito (ONOO')

b. Ensayos de capacidad secuestradora contra radicales estables, no biológicos y

evaluación de la capacidad reductora total. Estos métodos utilizan radicales libres
estables por lo que no es necesario generarlos en el medio:

19
 -Método TEAC (trolox equivalente antioxidante capacitv): mide la capacidad de un
compuesto de reducir el radical catiónico ABTS+ (2,2-azinobis) (3-etibenzotiazolina-6-
sulfonato) evaluando la disminución de la absorbancia a 734 nm (Thaipong et al., 2006;
Lee et al., 2009)

-Método del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidraciP: se basa en la reducción del

radical por captación de un átomo de hidrógeno al añadir el antioxidante. Se emplea
sobre todo para determinar la eficacia antirradicalaria de compuestos fenólicos.

-Método del radical HNTTM (tris(2,4,6-tricloro-3,5-dinitrofenil): dado que este radical

es inerte a la capacidad donadora de electrones de los antioxidantes al radical (Vasco
et al., 2008).

-Ensayo FRAP (ferric-reducing antioxidante Power); mide la capacidad de una

muestra de reducir el complejo incoloro tripiritriazina férrica (Fe^'-TFTZ) al complejo
azulado tripiriditriazina ferrosa (Fe2+-TPTZ) que representa absorbencia a 595 nm, es
también conocido como método de reducción del hierro/ poder anlioxidanle (Rodrigo-
García et al., 2006).

-Ensayo FC (Folin- Ciocalteau) de capacidad reductora: el ensayo se basa en la

transferencia de electrones del compuesto antioxidante al molibdeno que contiene el
reactivo FC, formándose un complejo azulado que presenta absorbancia a 750-765 nm.

Los ensayos para evaluar la actividad antioxidante con éstos reactivos químicos
tienen ventajas en cuanto a la detección de la actividad antioxidante de los alimentos,
son fáciles de ejecutar, tienen una alta reproducibilidad, se pueden utilizar con una gran
cantidad de antioxidantes y son de bajo costo (Lee et al., 2009).

20
2.12 Métodos biológicos:

Los métodos químicos, aunque ampliamente utilizados y aceptados para determinar

la actividad antioxidante de gran variedad de compuestos, tienen el inconveniente de
que no reflejan las condiciones fisiológicas celulares y que no tienen en cuenta factores
como la biodisponibilidad o el metabolismo. Por otro lado, los estudios con modelos
animales y ensayos clínicos con humanos son caros, implican cuestiones éticas y
resultan poco adecuados para realizar los ensayos preliminares de actividad
antioxidante. Un sistema eficaz para el cribado inicial de sustancias antioxidantes es el
uso de modelos in vitro con células ya que representa lo que ocurre a nivel celular
(Castañeda et al., 2008).

Los sistemas de cultivo son especialmente útiles para estudiar los efectos del estrés
oxidante en términos de toxicidad, respuestas adaptativas celulares y comprobar los
efectos reguladores que los potenciales antioxidantes pueden ejercer en alteraciones
como citotoxicidad, genotoxicidad y reacciones oxidativas. Además, el uso de estos
modelos evita los problemas éticos derivados de los estudios realizados con animales y
humanos, y permite controlar fácilmente las condiciones experimentales, El modelo de
cultivo celular resulta una herramienta útil y muy valiosa en la ciencia biomédica y
farmacéutica. Los modelos incluyen el uso de líneas celulares transformadas, así como
el uso de cultivos celulares primarios.

2.13 Modelos celulares para la investigación del cáncer

Los ensayos para determinar las propiedades quimíopreventivas o anticancerígenas

de los compuestos antioxidantes, se realizan con células tumorales y no tumorales para
comparar las respuestas obtenidas, evaluar la selectividad de los compuestos y
determinar la sensibilidad en términos de inhibición del crecimiento e inducción de
apoptosis (Ugartondo, 2009).

21
 El ensayo con fibroblastos 3T3 se utiliza como modelo general de citotoxicidad para
determinar el potencial tóxico de nuevos compuestos; además, ha resultado dar buenas
correlaciones con resultados obtenidos in vivo, lo que permite utilizarlo como un sistema
predictivo de toxicidad aguda y de estimación de dosis iniciales antes de un ensayo in
vivo. La línea celular NIH/3T3 es no tumoral, de tipo fibroblastoide, y es obtenida a partir
de embriones de ratón de la cepa NIH, con ritmo de cultivos cada 3 dias, transfiriendo 3
millones de células.

Las células NIH/3T3 en muchos aspectos se comportan en forma similar a cultivos

primarios. Son células que están implicadas en la angiogénesis y la respuesta a una
lesión, tienen un papel importante en la progresión, crecimiento y propagación del
cáncer, debido a que sus contribuciones estructurales y funcionales surgen con la
producción de factores de crecimiento, quimiocinas y matriz extracelular que facilitan la
contracción angiogénica de las células endoteliales, siendo un factor importante en la
progresión del cáncer (Werth et ai., 2008).

El peróxido de hidrógeno (H2O2) se utiliza como sustancia modelo para generar

estrés oxidante, debido a que los macrófagos y neutrófilos producen especies reactivas
del oxígeno durante el estallido oxidativo, por lo que es común emplearlo para generar
el estrés oxidante en terapias del cáncer (Werth et al., 2008).

Los ensayos más comunes realizados con células en cultivo son:

Ensayos para determinar viabilidad o toxicidad. La toxicidad ejercida por los

diferentes compuestos puede ser basal, relacionada con funciones celulares básicas y
estructuras comunes entre tejidos o, específica, dirigida a funciones y estructuras
propias. Entre los diferentes criterios utilizados para valorar el efecto cítotóxico
encontramos cambios de morfología, viabilidad, metabolismo, integridad de la
membrana celular, proliferación, adhesión y captación e incorporación de precursores
radiactivos.

22
 Los ensayos más utilizados de citotoxicidad son:

El ensayo de captación del colorante rojo neutro (NRU, Neutral Red Uptake Assay):
se basa en la captación y acumulación del colorante vital rojo neutro en los lisosomas
de las células viables, es decir, las células cuyas membranas no han sido dañadas por
el compuesto a evaluar.

El ensayo de liberación del colorante rojo neutro (NRR, Neutral Red Release Assay):
evalúa los efectos de la toxicidad como daño a la membrana plasmática y pérdida de la
integridad lisosomal causada por exposiciones breves a altas dosis de compuestos; se
determina por la cantidad de colorante liberado por las células que previamente lo han
captado.

Ensayo del MTT: se basa en la reducción metabòlica del bromuro de 3-(4,5-

dimetiltiazol-2-ilo)-2,5 difeniltetrazol (MTT) (una sal insoluble de color amarillo) realizada
por la enzima mitocondrial succinato deshidrogenase en un compuesto coloreado de
color azul (formazan), permitiendo determinar la funcionabilidad mitocondrial de las
células tratadas. Este método ha sido muy utilizado para medir supervivencia y
proliferación celular. La cantidad de células vivas es proporcional a la cantidad de
formazán producido (Castro, 2006).

Actividad lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio de cultivo: la LDH es una enzima

citoplasmàtica que se libera al medio de cultivo cuando se producen daños sobre la
membrana de las células, es un buen marcador de la integridad de la membrana.

Determinación de apoptosis: se realiza por microscopía óptica y electrónica para

observar cambios morfológicos como la condensación de la cromatina y la deformación
de la membrana; también se emplean técnicas de tinción y el análisis por citometría de
flujo, que mide las características físicas y químicas de las células o sus componentes
celulares.
 Análisis por microscopía electrónica: mediante observación microscópica se evalúan
los cambios en la morfología celular a nivel de tamaño y forma, número, tamaño y forma
del núcleo, inclusiones intracelulares, etc.

Ensayos de captación o incorporación de precursores radiactivos: consisten en

añadir al medio de cultivo un precursor radiactivo que se incorporará a la molécula que
queremos determinar a medida que ésta vaya siendo sintetizada (aminoácidos,
proteínas, ADN, ARN, etc).

Ensayos relacionados con el proceso de carcinogénesis:

Evaluación de la proliferación, diferenciación y ciclo celular: mide el Incremento del

número de células, del número de colonias por área o del contenido total de ADN, ARN
y proteínas. Los estudios de ciclo celular se realizan por citomeíría de flujo mediante
sistema FACS (Fluorescente Actlvated Cell Sorting).

Ensayos de daño oxidativo del ADN y genotoxicidad: la técnica más utilizada para
determinar la extensión del daño oxidativo en el ADN y el posible efecto protector de los
compuestos estudiados es el ensayo cometa. El nivel de ADN dañado se determina
mediante clasificación visual del tamaño de la rotura del ADN que aparece al migrar las
células en electroforesis.

Estudio de vías de transducción de señales y de modulación de actividades

enzimáticas: mediante técnicas de Western blotting se evalúa la expresión de
proteínas relacionadas con procesos inflamatorios y de carcinogénesis como la COX-2
y proteín-cinasas de la familia MAPKs.

Determinación de peroxídación lipídíca: se realiza mediante el uso de sondas

fluorescentes (como la cPnA) o cuantíficando la formación de TBARs en el medio de
cultivo.

24
 Determinación del estado oxidante/antioxidante de la célula: para determinar el
status redox celular se realizan medidas del glutatión y del nivel de ERO intracelulares,
así como ensayos de actividades enzimáticas (superóxido dismutasa, catalasa,
glutatión peroxidasa, etc).

Determinación de citoquinas inflamatorias: los principales mecanismos usados por

las células epidérmicas para participar en reacciones inmunitarias e inflamatorias de la
piel son la producción de citoquinas y respuestas a citoquinas (Ugartondo, 2009).

2.14 SITUACIÓN ACTUAL

En la actualidad el estrés oxidante, se asocia al desarrollo de diferentes estados

patológicos como el cáncer, diabetes, enfermedades pulmonares, cardiovasculares,
neurológicas, oculares, entre otras. La forma de prevenir estas enfermedades puede
ser favorecida con una dieta basada en frutas y verduras debido a que los polifenoles
previenen la oxidación celular.

La guanábana es un frutal en expansión por el creciente interés en la producción de

fruta para el consumo en forma de jugos y más allá de sus propiedades nutricionales se
ha-encontrado que posee una gran actividad antioxidante.

Debido a la importancia de los polifenoles en la prevención y desarrollo del cáncer

por la capacidad de inhibir radicales libres, se necesitan más estudios sobre la actividad
y mecanismos de acción para profundizar y entender mejor su interacción con las
diversas células y, en general sus funciones biológicas. Por lo que la obtención de
nuevos compuestos bioactivos a partir de diferentes fuentes naturales de origen vegetal
ricas en polifenoles es una línea de investigación cada vez más extendida.

Al ser éstos cultivares ricos en acetogeninas, así como en compuestos fenólícos y

flavonoides; presentan un potencial para considerarlos frutos funcionales o de los
cuales se puede elaborar algún alimento funcional o nutracéutíco.

25
 3. PLANTEAMIENTO Y DEFINICIÓN DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

Los estudios de aplicación biofuncional de la guanábana se han realizado en partes

no comestibles de ésta ya que las investigaciones atribuyen la actividad antiproliferativa
a las acetogeninas de hojas y semillas de la guanábana.

Las propiedades funcionales de los polifenoles presentes en la pulpa de esta especie

de Annonaceae han sido poco estudiadas, por lo que la escasa información funcional
de la pulpa limita su consumo y comercialización.

Se propuso extraer los compuestos polifenólicos, a partir de la pulpa, para evaluar la

cantidad de éstos y relacionarlo a su capacidad antioxidante, medir la actividad
inhibitoria de radicales libres en cultivos celulares sometidos a daño oxidante; para
comprobar si los polifenoles presentes en éste fruto tienen efecto citoprotector y
regenerador celular, así como en cultivos de cáncer cervicouterino para observar si
disminuye su porcentaje de crecimiento y evaluar su actividad anticancerigena.

De ésta manera promover su consumo como fruto potencialmente funcional capaz de

prevenir el estrés oxidante generado por el incremento de radicales libres, asociado al
desarrollo de enfermedades crónico degenerativas.

26
 4. OBJETIVOS E HIPÓTESIS

4.1 Objetivo general

• Evaluar la capacidad inhibitoria de radicales libres de la guanábana para

proponer su aplicación funcional en la prevención de daños causados por radicales
libres.

4.2 Objetivos específicos

• Identificar y cuantificar fenoles y flavonoides totales en el extracto de pulpa de

guanábana para su potencial aplicación antioxidante en cultivos celulares.

• Determinar el potencial de captación de radicales libres del extracto de pulpa de

guanábana “in vitro" para su aplicación antioxídante en cultivos celulares.

• Determinar la capacidad inhibitoria de radicales libres del extracto en cultivos

celulares para la reducción de daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno.

• Determinar actividad antiproliferativa de los extractos en líneas celulares de

cáncer cervicouterino para su tratamiento.

5. HIPÓTESIS

“Los compuestos polifenólicos presentes en la pulpa de guanábana tienen capacidad

de inhibición de radicales libres en cultivos celulares"

27
 6. MATERIAL Y METODOS

6.1 Materia prima

Los experimentos se llevaron a cabo con frutos obtenidos de la región productora de

Actopan, Veracruz, durante los meses de abril y mayo del 2010. La selección de los
frutos se llevó a cabo por muestreo aleatorio simple de cada lote. Las frutas
previamente lavadas y desinfectadas, se secaron, para posteriormente obtener los
extractos.

6.2 Metodología

6.2.1 Obtención de extractos

Los diferentes análisis, determinaciones y cuantificaciones del presente trabajo se

llevaron a cabo en el Laboratorio de Biología y Química Molecular de frutas del Instituto
de Ciencias Básicas de la Universidad Veracruzana.

Se utilizaron diez gramos de pulpa de cada fruto; el sistema de extracción fue

metanol-agua (100 mL) grado HPLC J.T. Baker al 80% (v/v) acidificado a pH 2.5 con
HCI, se sometió a agitación magnética por 2 horas protegido de la luz, según Kim et al.
(2003). Posteriormente se decantó en tubos de 15 mL tipo Falcon, se centrifugó a 5000
rpm durante 10 minutos en una Microcentrifuga SIGMA 3-16 y se separó el
sobrenadante por filtración en papel Whatman No. 5.

El extracto filtrado se colocó en frascos ámbar para análisis posteriores, se almacenó

a -20 °C en un congelador Sanyo Mod. MDF-U5411. Se realizó un barrido de los
extractos metanólicos obtenidos usando un espectrofotómetro ultravioleta visible con
arreglo de diodos Agilent Mod. 8453, de 200 a 700 nm para determinar las longitudes
de onda a las cuales se observaban los picos de máxima absorción.

28
6.2.2 Cuantificación de fenoles totales

Se realizó una curva de calibración para la cuantificación de fenoles totales,

empleando el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau y ácido gálico como
estándar. El reactivo de Folin-Ciocalteau tiene una coloración amarilla que en presencia
de un fenol se torna azul. La intensidad del color azul se midió
espectrofotométricamente a 765 nm.

Para la preparación de la curva patrón se disolvieron 100 mg de ácido gálico (Sigma-

Aldrich) en 50 mL de mezcla metanol-agua 50:50 (v/v). Alícuotas de 10, 20, 30, 40 y 50
pL de ésta solución se colocaron en tubos de ensaye de 12x75 protegidos de la luz, a
los que se les adicionaron 1.5 mL de agua destilada y 100 pL de reactivo de Folin-
Ciocalteau (Fluka), se mezcló en un vórtex Fisher Mod. Genie 2 durante 5 minutos.
Posteriormente se le agregaron 300 pL de carbonato de sodio NajCOa (Reactivos y
Productos Químicos Finos S.A de C.V) al 10% (p/v), hasta completar un volumen de 3
mL con agua destilada, se dejaron reposar durante 2 horas a 20 “C y se midieron las
absorbancias para obtener la curva patrón a 765 nm.

Se determinaron las absorbancias de las muestras y la concentración de fenoles se

obtuvo interpolando los valores en la curva patrón (Apéndice 1). La cuantificación se
obtuvo a partir 20 pL, se realizaron por triplicado y el total de fenoles en los extractos se
reportó como mg equivalentes de ácido gálico/100 g de pulpa fresca (mgEAG/100 g).

6.2.3 Cuantificación de flavonoides

Para la cuantificación de flavonoides se utilizó el método colorimétrico de Shizen et

al. (1999), basado en la cuantificación de catequina. Para la preparación de la curva
patrón se disolvieron 100 mg de catequina en 100 mL de metanol, se tomaron 50, 100,
150, 200 y 250 pL de ésta solución en tubos de ensaye protegidos de la luz, a los que
se adicionaron 1250 pL de agua destilada y 75 pL de una solución de nitrito de sodio

29
NaN02 al 5%, se agitaron por 5 minutos y posteriormente se les agregaron 150 pL de
AICI3 al 10%, se incubaron por otros 5 minutos y se adicionaron 500 pL de hidróxido de
sodio NaOH 1 M, se llevó cada tubo a un volumen de 3 mL con agua destilada y se les
determinó la absorbancia a 510 nm.

Se cuantificaron los flavonoides de los extractos metanólicos tomando 250 pL de

cada uno, se determinaron las absorbancias de las muestras y la concentración de
flavonoides se obtuvo interpolando los valores en la curva patrón (Apéndice 1), La
concentración de flavonoides totales se estimó como mg equivalentes de catequina por
cada 100 gramos de pulpa fresca (mgEC/100 g).

6.2.4 Identificación y cuantificación de ácido gálico y catequina por HPLC

Se realizó siguiendo la metodología modificada de Merken y Beecher, (2000), por la

técnica de enriquecimiento de pico. Se utilizaron estándares de ácido gálico y catequina
(Sigma-Aldrich) para la identificación de éstos compuestos en el extracto, Se pesaron 5
mg y 3mg de cada estándar respectivamente y se disolvieron en 50 m i de matanol, se
almacenaron en frascos ámbar para reducir la exposición a la luz. Para la separación
de los compuestos se utilizó una columna de fase reversa C18 Agilent de 150 mm de
longitud y 4.6 mm de diámetro interno, con tamaño de partícula de 5 pm.

Se emplearon como fases móviles: fase A; agua acidificada al 2% (v/v) con ácido
acético y para la fase B; metano! acidificado al 2% con ácido acético; se filtraron
utilizando una bomba de vacío (Welch Mod. 2522B-01) a través de membrana estéril de
acetato de celulosa (Supelco) con poro de 0.45 pm y diámetro de 45 mm, se
desgasificaron durante 20 minutos en un baño de ultrasonido Cole-Parmer Mod. 8890.

Se utilizó un cromatógrafo de líquidos Varían ProStar Modelo 210 con bomba de

gradiente binario Mod. 9012, con inyector manual y detector UV-Vis programable Mod.
9050 a 280 nm. El volumen de inyección fue de 20 pL usando una jeringa Hamilton
modelo 80565. De los estándares se inyectaron 0.002 mgEAG, 0.0012 mgEC, también

30
se utilizó ácido clorogénico (0.006 mgEAC) y quercetina (0.002 mgEQ), del extracto
0.002 g. El gradiente de polaridad fue el siguiente: 95:5% B (0 min), 80:20% B (5 min),
65:35% B (25 min), 50:50% B (35 min) y 55:45% B (40 min). La velocidad de flujo fue
de 1.5 mL/min, con un tiempo de corrida fue de 40 min.

6.2.5 Determinación de capacidad antioxidante

6.2.5.a Método de DPPH

La evaluación de la actividad antioxidante se basó en la capacidad de captación de

radicales libres utilizando el reactivo DPPH (2,2-difenil-1 -picrilhidracilo de Sigma-
Aldrich), el cual en presencia de un compuesto antioxidante cambia de color d© azul
violeta a amarillo, (Brand-Williams et ai., 1995).

Se preparó una solución estándar disolviendo 12 mg de DPPH con 50 mL de

metanol. La solución de trabajo se obtuvo mezclando 39 mL de la solución anterior con
184 mL de metanol para obtener una absorbanda de 1.000 a 517 nm. Se tomaron 0.75
mL de los extractos metanólicos (lOmg/mL) y se hicieron reaccionar con 1.25 mL de la
disolución de DPPH por 60 minutos al abrigo de la luz. Al término de este tiempo, se
realizaron lecturas a una longitud de onda de 517 nm durante los primeros 5 minutos,
cada minuto, y posteriormente a los 10, 30 y 60 minutos para obtener una cinética de
reacción; como blanco de calibración se utilizó metanol. El blanco de la muestra se
preparó con 0.75 mL de los extractos y 1.25 mL de metanol. El patrón de referencia con
0.75 mL de agua y 1.25 mL de DPPH en tres ensayos independientes. Con los valores
de las absorbancias obtenidas, se determinó el porcentaje de captación de radicales
libres mediante la siguiente fórmula:

% Captación de radical libre= 1 - (A2-A3) * 100

A1

31
 Donde:
A1= Absorbancia del patrón de referencia
A2= Absorbancia de la muestra
A3= Absorbancia del blanco de muestra

Debido a la demostrada capacidad antioxidante del ácido ascòrbico, se utilizó como

patrón de referencia con respecto a los extractos metanólicos de guanábana para
determinar por medio de su capacidad antioxidante a cuantos equivalentes de vitamina
C corresponde. También se utilizó el ácido ácido gálico para comparar la actividad
antioxidante de los mgEAG que contienen los extractos metanólicos de guanábana con
la actividad del estándar puro.

6.2.5 b. Cromatografía en capa fina “DPPH-CCF"

Se utilizó además otro método para la identificación de la actividad antioxidante del

extracto de pulpa de guanábana. La cromatografía en capa fina, en la que se
identificaron más rápido los compuestos de acuerdo a su polaridad utilizando metanol-
agua al 50:50 (v/v). La identificación de la actividad antioxidante fue a través de la
captación de radicales libres utilizando el reactivo DPPH. Esta variación colorimétrica
fué fácilmente detectada sobre la placa de cromatografía por el método de Rashld et al.
( 2010 ).

El ácido gálico y el ácido clorogénico se utilizaron como estándares de compuestos

fenólicos y la catequina y quercetina de flavonoides. El extracto para la cromatografía
se empleó a una concentración de 1 g/mL. Una gota de cada estándar y de la muestra
se cargó en una placa de sílíca gel (5x10 cm MERCK), la fase móvil fue metanol-agua
50:50 (v/v) acidificado al 2% con ácido acético glacial. Después de 20 minutos de
corrida, la placa se secó al aíre y se roció con solución de DPPH al 0.04% observando
la capacidad inhibidora después de 30 minutos. Todos los ensayos se realizaron por
triplicado.

32
6.2.6 Capacidad de inhibición de radicales libres en cultivo celular

La capacidad inhibitoria de radicales libres en cultivo celular se evaluó por medio del
análisis de la viabilidad celular utilizando la línea celular de fibroblastos embrionarios de
ratón, certificada por la American Tissue Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD),
NIH/ 3T3 catálogo CRL-1658.

6.2.6.1 Preparación y estandarización del cultivo celular

Las células se cultivaron incubándolas a 37 °C en una atmósfera aire:C02, 95:5, con

medio de cultivo DMEMF12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB)
desactivado a 56 °C por 60 minutos y 1% de antibiótico-antimicótico (GIBCO); para la
realización de los ensayos, los cultivos se desarrollaron hasta un 70% de saturación de
caja de cultivo T25 (CORNING), posteriormente se retiró el medio de cultivo con puntas
estériles a través de una bomba de vacio (Gomco Mod.3040), se lavaron las células con
buffer de fosfatos (GIBCO) pH 7.3 y se disgregó con tripsina TrypLE Express (GIBCO)
por 7 minutos a 37 °C y atmósfera aire:C02l 95:5, para inactivar la tripsina, se utilizó
medio de cultivo fresco, toda la suspensión se centrifugó (centrífuga refrigerada 5702 R)
en tubo Falcon de 15 mL a 3500 rpm a 4 °C durante 5 minutos. El sobrenadante se
desechó y el precipitado celular se resuspendió en medio de cultivo fresco, para
calcular la cantidad de células a sembrar se utilizó el recuento celular por medio de la
Cámara de Neubauer y tinción con azul tripano (Sigma-Aldrich), se tomaron 20 pL de la
suspensión celular y 20 pL de azul tripano (1:1).

El azul tripano es un colorante selectivo que permite diferenciar las células viables
(no teñidas) de las no viables (teñidas) ya que penetra en las células que tienen la
membrana dañada, pero no en las células que se encuentran en perfectas condiciones,
por lo que éstas se mantienen incoloras mientras que las células muertas se tiñen de
azul (Zapata et al., 2007). Para obtener el número total de células se cuantificó a través
de la siguiente fórmula:

33
 ________No. de células contadas________x 10000 x 2 x mL de medio
No. de cuadrantes de la cámara de Neubauer

Dónde:

El factor de dilución de la cámara corresponde a 10,000

El factor de la dilución de la suspensión celular y azul tripano es 2
Los mL de medio es la cantidad empleada para resuspender las células

6.2.6.1.a Modelo de estrés oxidante (Curva de viabilidad celular)

Las pruebas de actividad inhibitoria de radicales libres en cultivos celulares, se

realizaron en fibroblastos (NIH/3T3), debido a que éstos son un buen modelo para el
estudio de estrés oxidante, ya que éstas células se encuentran expuestas de manera
constante al estrés ocasionado por diversos factores como altas concentraciones de
oxígeno y radiaciones ultravioleta, siendo susceptibles al ataque de radicales libres
(Nichols y Katiyar, 2010). El modelo de estrés oxidante se realizó con peróxido de
hidrógeno, debido a que es de los más utilizados, por generarse constantemente a nivel
celular durante la respiración y en el estallido respiratorio (Dash et al., 2008).

'Se colocaron 20,000 células por pozo en una caja de cultivo de 96 pozos CORNING,
USA, con DMEMF12 al 10% de suero fetal bovino y 1% de antibiótico-antimicótico
(GIBCO). Se cultivaron por 24 horas y se les retiró el medio de cultivo, posteriormente
se adicionaron diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno (Sigma-Aldrich) al
30% (v/v) durante 30 minutos para determinar que concentración (200 pM, 100 pM, 50
pM y 25pM) afectaba más el número de células presentes en cada pozo, se utilizó un
grupo control, células sin peróxido de hidrógeno (0 pM) para comparar las viabilidades.
Se realizó una curva de viabilidad celular por triplicado.

34
6.2.6.1.b Determinación de la viabilidad celular por incorporación del colorante
cristal violeta

Se realizó la técnica utilizada por Flick y Gifford, (1984) modificada por Ortega et al.
(2009). Se retiró el medio de cultivo de las células y se lavaron con 100 pL de buffer de
fosfatos por cada pozo, para realizar la fijación se utilizaron 100 pL de glutaraldehldo
(Sigma-Aldrich) al 25% por pozo durante 10 minutos, posteriormente se retiró y se lavó
de nuevo con agua destilada; se dejó secar muy bien al aire.

La tinción se realizó con 100 pL de cristal violeta (HYCEL) al 0.1 %, durante 10

minutos en un agitador rotatorio Clay Adams Mod. 1213, se retiró el exceso de
colorante mediante lavados con agua destilada y se dejó secar al aire. Para solublllzar
el colorante se emplearon 100 pL de ácido acético (J.T. Baker) al 10% por pozo, con
una agitación de 20 minutos en agitador rotatorio y se midieron las absorbencias a 595
nm en un lector de microplacas iMarker Blorad. Las absorbencias del lector, se
convirtieron en % de células. Los ensayos se realizaron por triplicado.

6.2.6.1.C Modelo de preparación estándar de extracto de guanábana

Los extractos metanólicos de guanábana se liofilizaron (Liofilizador Labconco Mod.

070875216), en condiciones de esterilidad y protegidos de la luz, durante 72 horas,
para su almacenamiento se resguardaron a -80 °C hasta su utilización. Se generó una
solución concentrada, para la cual se pesaron 10 mg de los extractos liofilizados, se
solubilizaron con 200 pL de DMSO (dimetilsulfóxido Sigma-Aldrich) y se llevaron a un
volumen de 10 mL con medio de cultivo DMEMF12 fresco sin suero y sin antibiótico (1
mg/mL). En la preparación de las diluciones se tomaron 1000 pL de la concentración de
1 mg/mL y se pasaron a otro tubo que contenía 9 mL de DMEMF12 (Figura 8).

35
 Stock
1 m l

[%

10 m i 9 m l 9 n il 9 m l

1 m g/ m L 0.1 m g f m t O . Q im g m il O .O O im gm iL

Figura 8. Diseño de diluciones de extracto de guanábana con medio de cultivo

DMEMF12.

6.2.6.1 d Ensayo de toxicidad del extracto de guanábana en cultivo celular

Para determinar si el extracto presentaba algún efecto de toxicidad sobre las células
fibroblásticas y si existían diferencias en la respuesta de las células con los compuestos
presentes en el extracto, se colocaron 20,000 células por pozo en una caja de cultivo de
96 pozos con DMEMF12 al 10% de suero fetal bovino y 1% de antibiótico-antimicótico,
se cultivaron por 24 horas, se les retiró el medio de cultivo y se adicionaron las
diferentes concentraciones del extracto de guanábana (0.001 - 1 mg/mL) durante 24
horas para determinar la densidad celular, así como del medio con DMSO al 2% y al
0.2%, se utilizó un grupo control (células sin extracto y sin DMSO) para comparar las
viabilidades y de ésta manera evaluar el efecto del extracto y DMSO sobre el potencial
proliferativo de las células, a través de la técnica de cristal violeta para las densidades
celulares.

36
6.2.6.2 Caracterización de la capacidad antioxidante del extracto de guanábana en
cultivo celular

Se realizaron otros ensayos para evaluar si el extracto de pulpa de guanábana tenía

la capacidad antioxidante en modelo biológico reparando el daño que las ERO
producen en el cultivo celular o a través de la inhibición de ERO o previniendo su
formación, mediante la determinación de las viabilidades celulares por incorporación de
colorante cristal violeta (apartado 6.2.6.1 .b) por triplicado de acuerdo a la metodología
modificada de Panich et al., 2007.

En el primer ensayo se empleó un cultivo celular bajo las condiciones de cultivo

mencionadas en el apartado 6.2.6.1.a; al que se agregó peróxido de hidrógeno (100
pM) por 30 minutos; y posteriormente se le colocaron las distintas concentraciones del
extracto de guanábana (0,0.001, 0.01, 0.1 y 1 mg/mL) durante 2 horas y se realizó la
determinación de la viabilidad celular. Como control se utilizó un cultivo al que no se la
aplicó peróxido de hidrógeno ni extracto.

Para determinar si los extractos tenían un efecto citoprotector del daño ocasionado
por el estrés oxidante, previniendo la formación de ERO, se realizó un cultivo similar al
anterior y se aplicaron las distintas concentraciones de los extractos de guanábana (0 -
1 mg/mL) durante 2 horas, posteriormente se les agregó H2O2 (100 pM) durante 30
minutos y se evaluó la viabilidad del cultivo, también se dejó un cultivo como control al
que no se le suministró ninguna concentración de extracto ni peróxido de hidrógeno.

6.2.6.3 Determinación de la generación de ERO's po r DCFH-DA

La producción de ERO ¡ntracelulares se midió fluorimétricamente usando diacetato

2',7'-diclorof!uoresceína (DCFH-DA) (Invitrogen) por el método modificado por Bass et
al. (1983). En el que la detección ¡ntracelular de DCFH-DA se llevó a cabo cuando éste
es oxidado a DCF por compuestos oxidantes como peróxido de hidrógeno emitiendo
una fluorescencia, detectada a longitudes de onda de excitación y emisión de 488 y 530

37
nm, respectivamente en un lector de fluorescencia BD Beckman Coulter, ésta prueba se
realizó para determinar la cantidad de especies reactivas de oxígeno que se generan al
exponer a las células al peróxido de hidrógeno y evaluar si los extractos protegían a las
células de la generación de ERO.

El cultivo celular fue realizado bajo las mismas condiciones del ensayo de evaluación
del efecto citoprotector del extracto; durante el experimento las células fueron
suplementadas con medio de cultivo sin suero y sin antibiótico durante 2 horas, antes
de la exposición a las distintas concentraciones de extracto de guanábana, el cual se
dejó actuar también por 2 horas antes de añadir el peróxido de hidrógeno por 30
minutos. Se dejó un cultivo al cual no se le colocó extracto y otro al que no se le colocó
extracto ni peróxido de hidrógeno, para tomar en cuenta la fluorescencia basal celular.
El medio con peróxido de hidrógeno se retiró y se lavó el cultivo con buffer de fosfatos
suplementado con Ca/Mg, finalmente fueron incubadas con 5 pM de DCFH-DA durante
30 minutos a 37 °C y 5% C 02 protegidas de la luz. Los ensayos fueron realizados por
triplicado en el Laboratorio de Sinovioanálisis Molecular y en el Laboratorio de
Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa del Instituto Nacional de Rehabilitación.

6.2.7 Evaluación de la proliferación celular en líneas de cáncer cervicouterino

Las células HeLa, denominadas así en honor a su donadora Henríetta Lacks, son
células transformadas que se obtuvieron del cérvix humano (una pequeña porción de la
parte baja del útero) en 1951 y que actualmente se cultivan in vitro como modelo de
estudio para la investigación del comportamiento del cáncer. A pesar de que existen
otras líneas celulares, las células HeLa fueron nuestro modelo en este estudio; debido a
que el cáncer de cérvix en México es una de las principales causas de muerte en
mujeres (Dosne, 2006).

La evaluación de la actividad antiproliferativa se midió por medio de la técnica de

incorporación del colorante cristal violeta (apartado 6,2.6.1.b); con células de la ATCC,
cat. CCL-2 donadas por el Laboratorio de Proteómica del Instituto Nacional de Nutrición

33
Salvador Zubirán (INNSZ) y por la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).
Las células se cultivaron por 24 horas y se les retiró el medio de cultivo adicionando
100 pL del extracto de guanábana a diferentes concentraciones (0.001 mg/mL-1
mg/mL), por pozo, incubándolas a 37 °C por 24 horas en atmosfera de aire: C 02, 95:5.
Se dejaron pozos para el grupo control, a los cuales no se les aplicó tratamiento de
acuerdo a la metodología de Olsson et al. (2004) modificada; se realizó un monitoreo a
las 12 y 24 horas. Se realizaron tres ensayos independientes.

6.2.8 Análisis estadístico

Los resultados de las pruebas de capacidad de inhibición de radicales libres en

cultivo celular, determinación de ERO y actividad antiproliferativa, se analizaron con el
programa estadístico Minitab Release 10. (Minitab Inc.). Se realizó un análisis de
varianza de una vía para la prueba de viabilidad celular con peróxido de hidrógeno para
la viabilidad celular de los cultivos con los distintos tratamientos del extracto; en al
ensayo de toxicidad, así como en la determinación de ERO. Se utilizó ANOVA de dos
vías para la viabilidad celular con respecto al orden en que se aplicaron los extractos
(antes o después del peróxido de hidrógeno) así como la viabilidad de células tumorales
a las 12 y 24 horas con los distintos tratamientos del extracto. También se realizaron
Pruebas de Tukey para determinar diferencias significativas entre las medias. Para
valores de P ^ 0.002.

39
 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1 Extracción de compuestos fenólicos y flavonoides

En los barridos del extracto metanólico de la pulpa de guanábana, se obtuvieron

picos máximos de absorción de longitudes de onda en 246 y 270 nm, y absorbencias
menores a 260 y 280 nm. Algunos flavonoides absorben en un rango de longitud de
onda de 260 a 290 nm como catequinas, flavanonas, isoflavonas, flavonas, flavonoles y
flavonolglucósidos (Merken y Beecher, 2000). Al obtener los espectros de absorción de
los estándares de ácido gálico, catequina, ácido clorogénico y quercetina, mostraron
picos de absorción descritos para compuestos fenólicos.

Comparando las longitudes de onda de máxima absorción del extracto, con lo

reportado por Merken y Beecher, 2000; se estimó la presencia de polifenoles en el
extracto de guanábana, ya que la mayoría de ellos absorben a 280 nm (Agostíni et al.
2004), además que las bandas mostradas en espectrofotometria, son características de
los sistemas conjugados de los anillos aromáticos. La banda I, de mayor longitud de
onda en el rango 300-390 nm está asociada con la funcionalidad clnamollo, y la banda
II, entre 250-280 nm es debida al anillo aromático del benzoílo (Martínez, 2005).

7.2 Cuantificación de fenoles totales

El contenido de fenoles totales en pulpa de guanábana fue de 178 mg EAG/100 g

pulpa (DE ± 5.43). El valor del extracto estudiado fue mayor que lo reportado en otros
estudios y con otras variedades de anonas (Lako et al., 2007; Julián, 2009).

Comparando los resultados obtenidos para la guanábana estudiada, tuvo una

concentración de polifenoles más alta que lo publicado por Lako et al. (2007) para la
misma especie: 42 mg EAG/100 g, también fue mayor que el contenido de polifenoles
de la Annona díversifolia variedad blanca: 170 ± 4.44; Annona díversifolía variedad rosa:
129 ± 1.32 y variedad rosa mexicano: 171 ± 2.19 (Julián, 2009); aunque su

40
concentración fue menor que lo reportado por Murillo, (2006) para la misma especie
anonácea: 368 ± 42 e Isabelle et al. (2010): 236 ± 0.02. La diferencia en el contenido de
polifenoles entre la misma especie de anona, es debido a que el contenido de fenoles
depende del estado de madurez de los frutos, de las condiciones de cultivo,
climatológicas, entre otras (Flores, 2009). La guanábana mostró mayor contenido de
polifenoles que otros frutos como la lima, la uva verde, la naranja y la pifia (Murillo,
2006; Vijaya et al., 2010).

7.3 Cuantificación de flavonoides totales

La concentración de flavonoides totales fue de 55 mg EC/1Q0 g de pulpa (DE ±

1.13). El contenido de flavonoides fue menor comparado con las concentraciones de las
variedades de Annona diversifolia blanca: 152 ± 5.39, rosa: 107 ± 5.15 y la rosa
mexicano: 142.56 ± 2.55, (Julián, 2009). Se cuenta con escasa información de la
concentración de flavonoides totales en la pulpa de guanábana.

7.4 Identificación y cuantificación de ácido gálico y catequina por HPLC

Los cromatogramas obtenidos de los estándares de referencia ácido gálico y

catequina se muestran en las Figuras 9 y 10. Las señales obtenidas a los tiempos de
retención de 1.6 y 6.6 minutos, confirmaron que las condiciones cromatográficas
establecidas fueron apropiadas para la identificación de compuestos de tipo fenólico
según la metodología modificada de Merken y Beecher, (2000).

41
 s
E
CD

150—

125—

100—
£
75 —

50 —

»- i

0 4U t
i r T T ~
5 »0 !S »
t.iìm lU iE
H XIT T"
Í5

Figura 9. Cromatograma del estándar de ácido gálico

T20 '

Figura 10. Cromatograma del estándar de catequina

Se presentan los cromatogramas obtenidos para los extractos de pulpa del fruto de
guanábana. Ambos cromatogramas exhiben un patrón de señales que corresponden al
estándar de catequina (Figura 11) y de ácido gálico (Figura 12), respectivamente, éstas
dos señales principales se identificaron antes de los 5 minutos por enriquecimiento de

42
pico y corresponden a 1.95 mgEC (DE ± 0.06) y 0.027 mgEAG (DE ± 0.02), por 100
gramos de pulpa, respectivamente.

o 100
£

fi
0
T '
5 16 H 30

Figura 11. Cromatograma de pico enriquecido de catequina y pulpa de guanábana

( P
70
f.iin u i

Figura 12. Cromatograma de pico enriquecido de ácido gálico y pulpa de guanábana

43
 La muestra sin enriquecimiento de pico, presentó picos con tiempos de retención
similares a los encontrados en los estándares anteriores y las concentraciones
obtenidas finalmente fueron de 0.05 mgEAG/100 g (DE ± 0.02) y 1.95 mgEC/100 g (DE
± 0.03), respectivamente (Figura 13).
175 —

150 —

l>5 —

IDO

.c

S 75 _

75 _ . í

i-l!..ui a¡

Figura 13. Cromatograma de pulpa de guanábana

En el extracto se evidenció la ausencia de ácido clorogónlco y de qusrcetina a 320

nm (Apéndice 2) concordando con Lako et al. (2007), que al evaluar la capacidad
antioxidante y la calidad nutricional de Annona muricata, no identificaron quercetina
entre los componentes del extracto.

7.5 Determinación de la capacidad antioxidante

La medida de la capacidad de inhibición de radicales libres de DPPH a los 60

minutos, es evidente en la Figura 14, donde se observó que dependiendo del tiempo de
reacción del extracto con el radical libre, el extracto redujo la cantidad de DPPH, ya que
aumentó la captación de este radical hasta estabilizarse a los 60 minutos. El análisis de
los datos obtenidos en éste estudio pone de manifiesto la importancia de considerar el
tiempo de reacción y la capacidad antioxidante necesaria para la saturación de los
radicales libres.

44
 100-
co
CD

CD ________ ____— 5
mCO so
o

■a a 60

s'r= O

X
c
aD
i
|3
—Ü 40
> cCoJ,
/
X 3
CO
"O
o
CO 20 -
CL
CO
o — E>4raoto cte guanábana»

10 20 30 40 60 60 70

Tiempo (minutos)

Figura 14. Determinación de la capacidad antioxidante del extracto de guanábana.

Los datos son las medias ± DE de tres experimentos independientes.

La capacidad antioxidante del extracto de pulpa de guanábana fue de 86% ± 0.02, se

observó que la actividad antioxidante fue directamente proporcional al tiempo de
reacción; a los 10 minutos la capacidad fue de 61%, a los 30 minutos aumentó a 78%
hasta llegar a 86% a los 60 minutos; conforme incrementó el tiempo aumentó el poder
de-captación.

En estudios previos sobre el impacto de los compuestos fenólicos en la capacidad

antioxidante de la pulpa de guanábana, Márquez (2009), afirmó que su capacidad
antioxidante podría estar relacionada en mayor proporción por la acción de los
flavonoides; por lo que, la forma en que el extracto metanólico de guanábana redujo los
radicales libres fue medíante la donación de protones para estabilizarlos, ya que los
compuestos polifenólicos se caracterizan por donar un electrón de su estructura y de
ésta forma estabilizar al radical.

45
 Se comparó la actividad antioxidante del ácido gálico con el extracto de guanábana
para comparar la captación del estándar puro y del equivalente que contiene el extracto.
Los equivalentes de ácido gálico en la guanábana por 100 gramos de pulpa (1.8
mgEAG) mostraron un comportamiento ligeramente menor en cuanto a la actividad
antirradical del ácido gálico en estado puro (Figura 15), esto es debido a que en el
extracto se encuentran presentes otro tipo de compuestos fenólicos además del ácido
gálico (Veeriah, 2007).

Tiempo (minutos)

Figura 15. Capacidad antioxidante del extracto de guanábana y del ácido gálico. Los
datos son las medias ± DE de tres experimentos independientes.

La capacidad antioxidante del ácido ascórbico se obtuvo por medio de la ecuación de

regresión lineal, observando relación entre la reducción de la absorción del DPPH y la
dosis de vitamina C utilizada, el total de la capacidad antioxidante del extracto de
guanábana se interpoló en la Figura 16, observando que el 86% obtenido equivale a la
concentración 0.045 mg del ácido ascórbico/mL.

46
 Figura 16. Capacidad antioxidante de estándar de ácido ascòrbico.

7.6 Determinación de actividad antioxidante por cromatografía en capa fina

“DPPH-CCF”

El análisis por DPPH-CCF evidenció la actividad antioxidante del extracto metanólico,

a través de la reacción que forma un complejo de color amarillo sobre la placa
cromatogràfica. La intensidad del color fue similar a la desarrollada por la catequlna y el
ácido gálico utilizados como referencia y presentes en el extracto de guanábana, de
acuerdo a la información obtenida en el análisis por HPLC, que descartó la presencia
de ácido clorogénico y quercetina (Figura 17).

47
 Figura 17. Identificación de actividad antioxidante del extracto de guanábana Annona
muricata por DPPH-CCF.

7.7 Capacidad de inhibición de radicales libres en cultivo celular

Los resultados de la viabilidad celular de NIH/3T3 con diforontes concentraciones do

peróxido de hidrógeno (0 a 200 pM), mostraron que hubo diferencias notables en la
cuantificación de células expuestas a las distintas concentraciones de peróxido de
hidrógeno, comparadas con el cultivo al que no se le provocó estrés oxidante. La
concentración adecuada a utilizar en los ensayos de caracterización de la actividad
antioxidante en cultivo celular y determinación de ERO fue 100 pM (Figura 18). Con
ésta concentración se cortó la pendiente que se formaba entre 50 y 75 pM y empleando
200 pM, se perdió casi el 50% de la viabilidad en el cultivo, interfiriendo con la medición
intracelular de ERO.

48
 120

40 •

20 -

Q ' i' • ---- T -------- — '-'1--------- ¡ ------— ~

OpM 50py 75pM lOOpM 200pM

Concentraciones H20 2

Figura 18. Curva de viabilidad de fibroblastos. Los valores representan la media ±

DE de tres ensayos independientes.

En el análisis estadístico las concentraciones de peróxido Influyeron

significativamente en la viabilidad celular (P < 0.002) y no hay diferencias entre el
empleo de las concentraciones de 50 y 75 pM. Coincidiendo con lo publicado por Werth
et al. (2008) que reportaron que a concentraciones de 0.25 y 1.0 mM de H2O2 se reduce
significativamente la viabilidad de los fibroblastos (Apéndice 3),

7.8 Ensayo de toxicidad del extracto de guanábana en cultivo celular

Los resultados muestran que las células fibroblásticas no son afectadas con ninguna
de las concentraciones de extracto de guanábana ni de DMSO utilizadas, se observó
que ninguna de las concentraciones indujo un decremento en la densidad celular, con
las concentraciones de 0.001, 0.01 y 0.1 mg/ mL se detectó un incremento en las
viabilidades, empleando 1 mg/mL y DMSO al 2% y 0.02% tampoco resultaron tóxicas al
cultivo, por lo que es válido emplearlas para las pruebas de caracterización de la
capacidad antioxidante en cultivo celular.

49
 O mg/mL O.OOtmgiriLOfllmg/tnL 0-trng.ÍTil ¡mg.¡nL í % CM50 0.2% GMSO

Concentraciones

Figura 19. Viabilidad de fibroblastos. Los valores representan la media ± DE de tres

ensayos independientes.

Estadísticamente hubo diferencias significativas entre el cultivo al que no se le aplicó

ninguna concentración de extracto (0 mg/mL) y los cultivos con 0.001, 0.01 y 0.1 mg/mL
de extracto; ya que la viabilidad se incrementó, con las demás concentraciones
utilizadas no hubo diferencias significativas (P < 0.002) (Apéndice 4).

7.9 Caracterización de la capacidad antioxidante del extracto de guanábana en

cultivo celular

Los resultados de la evaluación de la capacidad antíoxidante del extracto como

atenuante del daño oxidativo inducido por el peróxido de hidrógeno (Figura 20)
mostraron que el extracto no aumentó la viabilidad celular; independientemente de las
dosis utilizadas, comparadas con el cultivo que no recibió tratamiento (control). La
intensidad del daño provocado por el peróxido de hidrógeno fue el mismo en todos los
cultivos, no se observó un efecto dosis respuesta entre las distintas concentraciones.

50
 Figura 20. Viabilidad de fibroblastos con estrés inducido con H2G2 y extractos de
guanábana, se muestran las medias ± DE de tres ensayos independientes.

El análisis estadístico mostró que no hubo diferencias estadísticas significativas (P á

0.002) entre las concentraciones de extracto empleadas; por lo que el extracto, no tuvo
un efecto regenerador ni atenuante del daño celular, esto concuerda con Alia et al.
(2006) que señalaron que algunos flavonoides tienen actividad preventiva pero no
reparadora del daño celular provocado por peróxido de hidrógeno. El efecto de
inhibición de daño oxidativo del extracto, contra el peróxido de hidrógeno se observa en
la Figura 21. La aplicación del extracto, antes de la generación del estrés oxidante,
mantuvo aumentada la viabilidad de los fibroblastos ante el estrés; esto le brindó al
extracto un carácter citoprotector.

No se observó un efecto dosis respuesta, ya que independientemente de la

concentración utilizada, el efecto protector fue similar. Las células a las que no se les
aplicó extracto (0 mg/mL) evidenciaron más muerte celular por la cantidad de células
que se cuantificaron respecto al grupo control.

51
 Conrol 0 mgAnl O.OOlmgint ODImgMil O.lm gjnl. Img/ml,

Concentraciones

Figura 21. Efecto citoprotector del extracto de guanábana en la citotoxicidad

mediada por H2O2. Medias ± DE de tres ensayos independientes.

La guanábana tuvo un efecto positivo en la viabilidad celular en términos y

condiciones experimentales, en el análisis estadístico, se observó diferencia
estadísticamente significativa (P < 0.002) entre la concentración de 0.01 mg/mL
comparada con el cultivo que no recibió extracto (0 mg/mL) y se sometió al estrés
(Apéndice 6). El análisis estadístico con ANOVA de dos vías, donde se analizó el orden
en que se colocan los extractos (antes o después de la adición de H2O2 en el cultivo)
mostró diferencias significativas entre el orden de aplicación de los extractos (P á
0.002), por lo que el extracto de guanábana tiene efectividad antes de la generación del
estrés oxidante (Apéndice 7).

Actualmente existe un considerable interés por los efectos citoprotectores de los

antioxidantes naturales contra el estrés oxidante, Spencer et a!. (2010) demostraron
que la epicatequina y 3-O-metil-epicatequina, tuvieron la capacidad de inhibir la muerte
celular inducida por peróxido de hidrógeno en fibroblastos a dosis entre 5-30 pM,
comparando con los flavonoides presentes en el extracto de guanábana, se puede

52
sugerir que éste presenta características positivas para ser utilizado como inhibidor de
estrés oxidante.

7.10 Determinación de especies reactivas de oxígeno (ERO)

En la Figura 22 se presentan los resultados de la determinación de ERO con DCFH-

DA, el análisis de la fluorescencia detectada en las células de acuerdo a las
condiciones utilizadas, determinaron que el peróxido de hidrógeno indujo un aumento
significativo (P < 0.002) en la producción de ERO. Las distintas concentraciones del
extracto de guanábana redujeron significativamente la producción de las ERO (P <
0.002) comparadas con las células expuestas al H2O2 sin extracto (0 mg/mL). La
cantidad de ERO detectada en los cultivos tratados con distintas concentraciones de los
extractos es similar a las del grupo control, no hubo diferencias entra las
concentraciones utilizadas y generación de ERO; por lo que independientemente de la
concentración del extracto, el efecto de citoprotección es el mismo (Apéndice 8).

Figura 22. Efecto citoprotector del extracto de guanánaba por inhibición de especies
reactivas de oxígeno inducidas por H2O2, medias ± DE.
 El extracto de guanábana impidió el aumento de ERO provocado por el peróxido de
hidrógeno, explicando el mecanismo por el cual se ejerce el efecto citoprotector
evidenciado en los resultados anteriores de viabilidad. La inhibición de la producción de
ERO y el efecto citoprotector de los flavonoides en la prevención del estrés oxidante, ha
sido confirmado por otros autores en distintos modelos celulares como Rao et al.
(2002), que identificaron flavonoides como la catequina; capaz de inhibir actos nocivos
del estrés oxidante producido por el óxido nitroso (NO) en cultivos como fibroblastos y
células HT22, también Königsberg (2007), Crespo et al. (2008) y Chen et al. (2010)
confirmaron la capacidad de ciertos flavonoides de inhibir ERO en células de hígado;
además Yao et al. (2008) demostraron que compuestos como el eplgalocatequlngalato
protegió contra el estrés oxidante en células epiteliales de intestino.

Sin embargo, se recomienda realizar estudios de captación de los compuestos

fenólicos del extracto, en las membranas celulares, asi como ensayos enzimáticos para
determinar si el extracto induce la activación de enzimas de naturaleza antioxidante que
disminuyan las concentraciones de peróxido de hidrógeno observadas para esclarecer
el mecanismo de regulación por el que protegen a las células del estrés oxidante.

7.11 Evaluación de actividad antiproliferativa en células tumorales HeLa

■En la Figura 23 se observan diferencias entre las viabilidades celulares con las
distintas concentraciones del extracto como tratamiento antiproliferativo y las células sin
extracto, se puede observar que la viabilidad de éstas aumentó tanto a las 12 como a
las 24 horas, con respecto a los controles (0 mg/mL), en las concentraciones de 0.001
mg/mL y 0.01 mg/mL se observa un comportamiento dosis respuesta a las 12 y 24
horas, al aumentar la concentración, aumentó la viabilidad; mientras que cuando se
utilizaron 0.1 y 1 mg/mL la viabilidad ya no siguió incrementándose con respecto a las
anteriores, pero más aumentadas que los controles.

54
 300

Concentraciones
Figura 23. Actividad antiproiiferativa a las 12 y 24 horas de células HeLa con
extracto de guanábana a diferentes concentraciones. Medias ± DE de tres ensayos
independientes.

Las diferencias son estadísticamente significativas entre las concentraciones del

extracto utilizadas como tratamiento y las células sin extracto (P < 0.002). El análisis
ANOVA de dos vías, mostró que independientemente del tiempo de tratamiento, la
viabilidad celular tumoral se incrementó (P < 0.002) (Apéndices 9, 10 y 11). Se necesita
probar con alguna otra línea tumoral para asegurar que el extracto de guanábana como
antiproliferativo tenga un efecto nulo, ya que las células tumorales tienen alterados sus
ciclos reproductivos y de muerte celular, por eso crecen a un ritmo acelerado en
comparación con células normales; éstas ya tienen daños a nivel molecular que
difícilmente los polifenoles presentes en la guanábana pueden detener, coincidiendo

55
con ios resultados obtenidos en ios ensayos de capacidad reparadora o inhibidora del
daño celular causado por estrés oxidante.

No hay suficiente evidencia para recomendar el extracto de guanábana como

anticancerígeno, ya que los resultados en este tipo de célula no fueron favorecedores ni
alentadores para la cura de ésta enfermedad, esto coincide con lo publicado por Morón
(2010), que resalta el hecho de que la demostración ¡n vitro de la actividad
farmacológica de ciertos compuestos considerados como anticancerígenos en la
guanábana, es insuficiente para validar cualquier efecto terapéutico, y más en el caso
de enfermedades complejas y graves, se requiere disponer de estudios preclínicos que
permitan hacer ensayos clínicos que demuestren la eficacia y efectividad en humanos,
antes que recomendar su uso.

56
 8. CONCLUSIONES

La presencia de ácido gálico y catequina en los extractos de pulpa de guanábana le

atribuyen excelente actividad antioxidante mediante la inhibición de radicales libres.

La concentración de 100 pM de peróxido de hidrógeno, fue la más adecuada para

simular el estado de estrés oxidante en fibroblastos de ratón.

El extracto no afecta el potencial proliferativo de los fibroblastos con las distintas

concentraciones estudiadas.

Es conveniente emplear el extracto como citoprotector o preventivo contra el daño

ocasionado por oxidantes celulares por su buena capacidad antioxidante in vitro
mediante la inhibición de la generación de ERO en modelos biológicos.

El que diversas frutas y vegetales muestren buena actividad antioxldante no indica

que son antiproliferativos o que tienen actividad anticancerigena; el extracto da
guanábana puede prevenir, pero no reparar el daño oxidativo celular.

Es importante seguir realizando estudios adicionales por medio de otros métodos y

técnicas de aislamiento e identificación estructural de los principios activos presentes en
la pulpa de guanábana; así como evaluar su actividad antíoxidante en otros modelos in
vitro e in vivo que permitan identificar la actividad biológica funcional de éstos
compuestos y los mecanismos para proteger o inhibir el desarrollo del cáncer.

57
 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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70
 10. APÉNDICE

Apéndice 1

y= i 15.9ix- 0.0449
R£=0.9819
tí»
C5

CO
-e
o
«

1 -

♦ Absorbanoias Ácido Gálico

---- Ragrasión Lint al

0.00 0.02 0.04 0.00 0,08 0.10 0.12

Concentraciones ácido gálico (mg/mL)

Figura 24. Curva de calibración para cuantificación de fenoles totales,

Concentraciones catequina (rrg/rnL)

Figura 25. Curva de calibración para cuantificación de flavonoides totales.

71
 Apéndice 2
175

150 -'

125 ■

,100 ,
> !
75 _

T
10 20 30
Mirtulùa

Figura 26. Cromatograma del estándar de ácido clorogènico

175:

150 _

125 _

100
mVdlts

75

50

25

0 1
■ 13 T
20 30
M in uios

Fig ura 27. Cromatograma del estándar de quercetina

72
 Apéndice 3
One-way Analysis of Variance

Analysis of Variance Curva viabilidad NIH3T3 con H202

Source DF SS MS F P

conce 4 0.42167 0.10542 31.65 0.000

Error 35 0.11659 0.00333

Total 39 0.53826

Individual 95 % CIs For Mean

Based on Pooled StDev

Level N Mean StDev ------ + ------ -----+ -------- --- + ------------

1 8 0.65284 0.03152 (-*-— )

2 8 0.57538 0.06866 (--

3 8 0.58445 0.09319 (- •-*--)

4 8 0.50125 0.04517

5 8 0.35163 0.01496

------ + ------

Pooled StDev = 0.05772 0.36 0.48 0.60 0.

Tukey's pairwise comparisons

Family error rate - 0.0500

Individual error rate - 0.00678

Critical value = 4.07

Intervals for (column level mean) - (row level. mean)

1 2 3 4

2 -0.00559

0.16051

3 -0.01466 -0.09213

0.15144 0.07398

4 0.06854 -0.00893 .

0.23464 0.15718 0.16625

5 0.21816 0.14070 0.14977 0.06657

0.38426 0.30680 0.31588 0.23268

73
 Apéndice 4
One-way Analysis of Variance
Analysis of Variance Toxicidad del extracto y PMSO

Source DF SS MS F P

trat 6 0.0006091 0.0001015 16.65 0.000

Error 14 0.0000854 0.0000061

Total 20 0.0006945

Individual 95 CIs For Mean

Based on Pooled St D e v

Level N Mean StDev-+ ----------------- +---------------------------- +---------------------------- +_

1 3 0.09033 0.00058 ( —*----- )

2 3 0.09967 0.00058 (----- *------)
3 3 0.10633 0.00635 (----- *------)
4 3 0.09833 0.00058 ( --------*-------- )
5 3 0.09100 0.00100 --- * ----)
6 3 0.09467 0.00058 ( --------*---------)
7 3 0.09170 0.00010 (----- * ------)
- + -----------------------+ ------------------------------------- ^ ----------------------------------------- 1 -

Pooled StDev 0.00247 0.0900 0.0960 0.1020 0.1080

Tukey's pairwise comparisons

Family error rate = 0.0500 Individual error rate 0.00418

Critical value = 4.83Intervals for (column level mean) - (r o w level mean

1 2 3 4 5 6

2 -0.016219

-0.002448

3 -0.022885 -0.013552

-0.009115 0.000219

4 -0.014885 -0.005552 0.001115

-0.001115 0.008219 0.014885

5 -0.007552 0.001781 0.008448 0.000448

0.006219 0.015552 0.022219 0.014219

6 -0.011219 -0.001885 0.004781 ■ V •/ '■ -0.010552

0.002552 0.011885 0.018552 0.010552 0.003219

07
NJ
N>
1

0.001081 0.007748 -0.007585 -0.003919

o
o
o
o

7 -0.008252

0.005519 G . 014852 G.021519 0.013519 0.006185 0.009852

74
 Apéndice 5
One-way Analysis of Variance

Analysis of Variance peróxido de hidrógeno y extractos de guanábana

Source DF SS MS F P

coneros 4 0.0027207 0.0006802 29.71 0.000

Error 55 0.0012590 0.0000229

Total 59 0.0039797

Individual 95 CIs For Mean

Based on Pooled StDev

Level N Mean StDev

1 12 0.11533 0.00697

2 12 0.10375 0.00299

3 12 0.09725 0.00710

4 12 0.09658 0.00193

5 12 0.10342 0.00168

Pooled StDev = 0.00478 0.0980 0.1050 0.1120 0.

Tukey's pairwise comparisons

Family error rate » 0.0500

Individual error rate « 0.00664

Critical value = 3.99

Intervals for (column level mean) - (row level mean)

1 2 3 4

2 0.006073

0.017094

3 0.012573 0.000989

0.023594 0.012011

4 0.013239 0.001656 -0.004844

0.024261 0.012677 0.006177

5 0.006406 -0.005177 -0.011677 -0.012344

0.017427 0.005844 -0.000656 -0.001323

75
 Apéndice 6
One-way Analysis of Variance

Analysis of Variance for extractos de guanábana y peróxido de hidrógeno

Source DF SS MS F p

coneros 4 0.01863 0.00466 0.74 0.570

Error 55 0.34678 0.00631

Total 59 0.36540

Individual 95 CIs For Mean

Based on Pooled StDev

Level N Mean StDev

1 12 0.47257 0.08253 ( ------------------ — * -------------- )

2 12 0.49170 0.09627 ( --------- -------- * ............. )
3 12 0.52467 0.06845 (............ * -----

4 12 0.49333 0.08738 ( ------- -------- * .............. )

5 12 0.50955 0.05591 ( - - .......... * ........— ---- )

•r*
.£»

Pooled StDev = 0.07940 0.480 0.520 0.560

o

Tukey's pairwise comparisons

Family error rate 0.0500

Individual error rate 0.00664

Critical value = 3.99

Intervals for (column level mean) - (row level mean)

1 2 3 4

2 -0.11059

0.07233

3 -0.14356 -0.12443

0.03936 0.05849

4 -0.11222 -0.09309 -0.06012

0.07070 0.08982 0.12280

5 -0.12844 -0.10931 -0.07634 -0.10768

0.05448 0.07361 0.10658 0.07524

76
 Apéndice 7

Two-way Analysis of Variance

Analysis of Variance for Orden en el que se agregaron (antes o

después del H202)

Source DF SS MS F P

juntas p 1 5.70909 5.70909 1853.77 0.000

grupos 5 0.01908 0.00382 1.24 0.294

Interaction 5 0.01769 0.00354 1.15 0.338

Error 132 0.40652 0.00308

Total 14 3 6.15238

Ind ividual 95' CI

juntas p Mean --- + --

1 0.1061 (*)

2 0.5043 (*)

0.1200 0.2400 0.3600 0.4800

Individual 95 Cl

grupos Mean ------ + --------- 4------------ (------------- 1--------

1 0.294 __ ;

2 0.327 (-------------* -------------- >

3 0.298 K --------j
4 0.311 (------------ * -------------- )

5 0.295 \ “ j

6 0.306 \ -- ----- ----------- j

0.280 0.300 0.320 0.340

77
 Apéndice 8
One-way Analysis of Variance
Analysis of Variance for ERO
Source DF SS MS F P

coneros 4 2 . 635E+11 6.587E+10 31.93 0.000

Error 55 1.134E+11 2.063E+09

Total 59 3.769E+11

Individual 95* CIs For Mea n

Based on Pooled StDev

Level N Mean StDev -------- + ------------+ ------------+ ------------

1 12 233399 34581

2 12 93783 72354 (--*— )

3 12 73138 35985

4 12 67546 45777 <— *--)

5 12 50841 22173
---------+ ------------+ ------------ 1------------

Pooled StDev = 45416 70000 140000 210000

Tukey's pairwise compar isons

Family error rate = 0.0500

Individual error rate = 0.00664

Critical value = 3.99

Intervals for (column level mean) - (row level mean)

1 2 3 4

2 87305

191927

3 107951 -31666

212572 72956

4 113542 -26074 -46719

218164 78548 57902

5 130247 -9369 -30014 -35606

234869 95253 74607 69016

78
 Apéndice 9
One-way Analysis of Variance
Analysis of Variance for Viabilidad HeLa 12 horas
Source DF SS MS F P

concentr 4 0.041876 0.010469 12.86 0.000

Error 15 0.012214 0.000814

Total 19 0.054090

Individual 95 CIs For Mean

Based on Pooled StDev

Level N

1 4 0.14179 0.01862 (------ * ------ )

2 4 0.22073 0.01567 (------ * ...... )

3 4 0.26420 0.02531 (------ * ......

4 4 0.26230 0.04120 (...... * ........

5 4 0.25029 0.03378 (...... * ...... )

Pooled StDev = 0.02854 0.150 0.200 0.250

Tukey's pairwise comparisons

Family error rate ■ 0.0500

Individual error rate - 0.00747

Critical value = 4.37

Intervals for {column level mean) - (row level mean)

1 2 3 4

2 -0.14129

-0.01659

3 -0.18476 -0.10582

-0.06006 0.01888

4 -0.18287 -0.10393 -0.06046

-0.05816 0.02078 0.06425

5 -0.17085 -0.09191 -0.04844 -0.05034

-0.04615 0.03279 0.07626 0.07437

79
 Apéndice 10
One-way Analysis of Variance
Analysis of Variance for Viabilidad 24 horas
Source DF SS MS F P

concentr 4 0.02981 0.00745 7.04 0.002

Error 15 0.01587 0.00106

Total 19 0.04568

Individual 95 i CIs For Mean

Based on Pooled StDev

Level

11 4 0.22366 0.01926 (------- * --------)

2 4 0.25845 0.03659 (------- * ........)

3 4 0.31972 0.03354 (....... *........)
4 4 0.32664 0.02874 (....... * ........)
5 4 0.29193 0.04036 (....... * ........)

Pooled StDev = 0.03253 0.200 0.250 0.300 0.350

Tukey's pairwise comparisons

Family error rate - 0.0500

Individual error rate 0.00747

Critical value = 4.37

Intervals for (column level mean) - (row level mean)

1 2 3 4

2 -0.10586

0.03628

3 -0.16713 -0.13234

-0.02499 0.00980

4 -0.17406 -0.13927 -0.07800

-0.03192 0.00287 0.06415

5 -0.13934 -0.10455 -0.04328 -0.03635

0.00280 0.03759 0.09886 0.10879

80
 Apéndice 11
Two-way Analysis of Variance
Analysis of Variance 12 y 24 horas

Source DF SS MS F P

tiempo 1 0.031603 0.031603 33.76 0.000

cone 4 0.069124 0.017281 18.46 0.000

Interaction 4 0.002558 0.000640 0.68 0.609

Error 30 0.028084 0.000936

Total 39 0.131369

Individual 95 Cl

tiempo

1 0.2279 (---- * ------ )

2 0.2841 (------ * ----- )

0.2250 0.2500 0. 2 7 5 0 0.3000

Individual 95 Cl

cone Mean ------ - — — *---

1 0.183 (------ * ----- )

2 0.240 (------ *- — )

3 0.292 (------ * — ■-)

4 0.294 (------ * ----- )

5 0.271 (------ * ----- )

0.200 0.240 0.280 0.320

81
 Apéndice 12
Composición del medio de cultivo DMEMF12

Sales inorgánicas (g/litro)

CaCI2 (anhidro) 0.11665
CuS04 (anhidro).................. 0.0000008
Fe(N03)3-9H20 ................... 0.00005
FeS04-7H20 ....................... 0.000417
MgS04 (anhidro)................. 0.08495
KCI...................................... 0.3118
NaHC03.............................. 1.20000
NaCI.................................... 7.00000
Na2HP0 4 (anhidro)............. 0.00445
L-Arginina HCI.................... 0.14750
L-Asparagina H20 ............... 0.00750
L-Ácido Aspártico............... 0.00666
L-Cisteina HCI H20 ............. 0.01756
L-Cisteina-2HCI.................. 0.03129
L-Ácido Glutámico.............. 0.00735
L-Glutamina........................ 0.36510
Glicina................................. 0.01875
L-HistidinaHCIH20 ............ 0.03148
L-lsoleucina 0.05437
L-Leucina........................... 0.05895
L-Lisina-HCI 0.09135
L-Metionina......................... 0.01724
L-Fenilalanina.................... 0.03548
L-Prolina 0.01725
L-Serina.............................. 0.02625
L-Treonina.......................... 0.05355
L-Triptofano........................ 0.00902

82
L-Tiros!na-2Na-2H20 0.05582
L-Valina 0.05285

Vitaminas (g/litro)
D-Biotina....................... ....0.00000365
Cioruro de colina.......... .... 0.00898
Acido fólico................... .... 0.00265
Mioinositol.................... .... 0.01261
Niacinamida................. .... 0.00202
Ácido D-pantoténico..... ... 0.00224
Piridoxina-HCI............... 0.00203
Riboflavina.................... ... 0.00022
Tiamina-HCI................. .....0.00217
Vitamina B-12.............. .....0.00068

Otros (g/litros)
D-Glucosa.........
HEPES........................ .......3.57480
Hipoxantina.................. ..... 0.00239
Ácido Linoleico............. ..... 0.000044
Rojo fenol, sal de sodio ..... 0.00810
Putrescina-2HCI.......... ..... 0.00008
Acido pirúvico-Na......... ..... 0.05500
DL-Acido Tioctico......... 0.000105
Timidina 0.000365
 Apéndice 13
Colorante Cristal Violeta al 0.1%

La solución de cristral violeta se preparó al 0.1% en una solución amortiguadora de

ácido fórmico 200 Mm pH 6, la cual consistió en agregar 3.96 g de NaOH y 4.28 mL de
ácido fórmico aforados a 500 mL con agua bidestilada. Una vez preparada la solución
se filtró para su uso.

Desactivación del suero

El suero fetal bovino se colocó en el baño de agua a temperatura ambiente para ser
descongelado y posteriormente se colocó 57°C durante 60 minutos. Se realizaron
alícuotas de 50 mL para su mejor uso y manipulación.

Acido acético al 10%

Se midieron 10 mL de ácido acético glacial y se aforó a 100 mL en un matraz

volumétrico.

Glutaraldehído al 25%

Se utilizó glutaraldehído al 25% por lo que se midieron 5 mL de este y se aforó a 50 mL

en matraz volumétrico con agua de alta pureza (sistema Millipore).

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