"Incidencia de Salmonella SPP en Canales de Pollo Provenientes de Un Rasto y Distribuidoras de Aves, Dedectada Mediante Cultivo Microbiologico
"Incidencia de Salmonella SPP en Canales de Pollo Provenientes de Un Rasto y Distribuidoras de Aves, Dedectada Mediante Cultivo Microbiologico
"Incidencia de Salmonella SPP en Canales de Pollo Provenientes de Un Rasto y Distribuidoras de Aves, Dedectada Mediante Cultivo Microbiologico
AUTÓNOMA DE PUEBLA
PRESENTA:
pQFB. NANCY MAGALY NONOAL ZACAMO
DIRECTOR DE TESIS:
D.C. FABIOLA AVELINO FLORES
ASESOR INTERNO:
M.C. OSCAR PÉREZ TORIZ
DICIEMBRE 2016
AGRADECIMIENTOS
A mi asesor de tesis M.C. Oscar Pérez Toriz, mil gracias por todo su apoyo, sugerencias y sobre
todo por su disposición para sacar adelante este trabajo; gracias por haber confiado en mis
capacidades, esperando haber podido estar a la altura; así también le agradezco el haberme
brindado su tiempo para recibirme durante el desarrollo de este trabajo.
A mis sinodales D.C. Elsa Iracena Castañeda Roldan, M.C. Alejandro Ruiz Tagle y M.C. Patricia
Suarez Albores por todas sus correcciones, sugerencias y por cada una de sus valiosas
lecciones, mil gracias por todo su tiempo para la revisión de esta tesis.
A Sthephany, Gisela y Jorge, por ser mis mejores amigos y parte importante en las diferentes
etapas de mi vida, por estar para mí cada vez que los necesitaba, por apoyarme, animarme y
creer siempre en que podía dar más, por soportar mis locuras, ocurrencias y malas ideas,
simplemente gracias por nunca dejarme caer.
A Karen Báez Moreno por toda su ayuda, apoyo y tiempo brindados en este proyecto, por
acompañarme hasta el último momento, por cubrirme las espaldas siempre que fuera
necesario y ser de las pocas personas que logran entender.
Página | 2
A Clau, Katherine, Erika, Less y al resto de mis compañeros del Laboratorio de Patogenicidad,
que siempre me han dado una mano cuando ha sido necesario y con los que tan divertidos
momentos, cumpleaños y celebraciones hemos tenido.
A Edson, por estar siempre ahí, haber formado parte importante de esta historia, y haberme
acompañado y animado a siempre seguir adelante.
A los buenos amigos, José Antonio, Andrea, Laura, Irene, Renato por su compañía, su apoyo,
ayuda y a su infinita paciencia para estar en las buenas y en las malas. Hector, gracias por ser
como eres y haber de hecho de este último año uno de los más divertidos. Erica por apoyarme
en los momentos más difíciles y haberme motivado a seguir.
A todos y cada uno de mis profesores quienes dejaron plasmado en mi un poco de sus
conocimientos y lecciones de vida.
A todos aquellos compañeros con los que he compartido, me han recibido de la mejor forma
y han dejado enseñanzas valiosas en mi persona.
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Dichoso es aquél que mantiene una
profesión que coincide con su afición.
(George Bernard Shaw)
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CONTENIDO
1 RESUMEN ...................................................................................................................................... 10
2 INTRODUCCIÓN............................................................................................................................. 11
3 MARCO TEÓRICO .......................................................................................................................... 12
3.1 El pollo como alimento ......................................................................................................... 12
3.2 Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) ................................................................ 13
3.3 Inocuidad Alimentaria........................................................................................................... 13
3.4 Microorganismos indicadores de calidad ............................................................................. 14
3.4.1 Bacterias mesofílicas aerobias ...................................................................................... 14
3.4.2 Coliformes totales ......................................................................................................... 15
3.4.3 Coliformes fecales ......................................................................................................... 15
3.4.4 Staphylococcus aureus .................................................................................................. 15
3.5 Microorganismos patógenos ................................................................................................ 16
3.5.1 Género Salmonella........................................................................................................ 16
3.5.2 Características de Salmonella ....................................................................................... 16
3.5.3 Hábitat y Reservorios .................................................................................................... 17
3.5.4 Estructura antigénica y determinantes de virulencia ................................................... 17
3.5.5 Transmisión por alimentos ........................................................................................... 18
3.6 Gen inv A ............................................................................................................................... 18
3.7 PCR ........................................................................................................................................ 19
3.8 Electroforesis en gel de agarosa ........................................................................................... 20
3.8.1 Gel de agarosa .............................................................................................................. 21
3.8.2 Factores que afectan la electroforesis .......................................................................... 21
4 MARCO REFERENCIAL ................................................................................................................... 23
5 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................................ 25
6 JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................................. 26
7 OBJETIVOS..................................................................................................................................... 28
7.1 General.................................................................................................................................. 28
7.2 Particulares ........................................................................................................................... 28
8 METODOLOGÍA ............................................................................................................................. 29
8.1 Cepa control y medios de cultivos ........................................................................................ 29
8.2 Estandarización de la técnica de PCR para la amplificación del gen inv A ........................... 29
Página | 5
8.3 Selección de distribuidoras muestreadas ............................................................................. 29
8.4 Toma de muestra .................................................................................................................. 32
8.5 Extracción de ADN bacteriano de la muestra ....................................................................... 32
8.5.1 Obtención del botón directo de la muestra ................................................................. 32
8.5.2 Extracción de ADN con el kit ......................................................................................... 33
8.5.3 Electroforesis en gel de agarosa y visualización de ADN extraído con el kit ................ 34
8.5.4 PCR punto final: amplificación del gen inv A ................................................................ 35
8.5.5 Visualización de los amplicones .................................................................................... 36
8.6 Procesamiento microbiológico ............................................................................................. 36
8.6.1 Determinación de microorganismos indicadores en pollo por método microbiológico
36
8.6.2 Detección de Salmonella mediante el kit “Salmonella detection” (Mississippi State
University) ..................................................................................................................................... 38
8.6.3 Determinación de Salmonella spp en pollo por método microbiológico ..................... 39
8.6.4 Identificación bioquímica.............................................................................................. 39
8.6.5 PCR de colonia (prueba confirmatoria) ........................................................................ 39
9 RESULTADOS ................................................................................................................................. 40
9.1 Estandarización de la técnica de PCR para la amplificación del gen inv A ........................... 40
9.2 Extracción de ADN bacteriano de la muestra ....................................................................... 40
9.2.1 Obtención del botón directo de la muestra ................................................................. 40
9.2.2 Extracción de ADN con el kit ......................................................................................... 40
9.2.3 PCR punto final: amplificación del gen inv A ................................................................ 41
9.3 Análisis microbiológico ......................................................................................................... 43
9.3.1 Determinación de microorganismos indicadores en pollo por método microbiológico
43
9.3.2 Detección de Salmonella mediante el kit “Salmonella detection” (Mississippi State
University) ..................................................................................................................................... 49
9.3.3 Determinación de Salmonella spp en pollo por método microbiológico ..................... 49
9.3.4 Comparación de los indicadores de calidad entre las muestras de pollo obtenidas del
rastro y de las distribuidoras ........................................................................................................ 50
10 DISCUSIÓN DE RESULTADOS ..................................................................................................... 52
11 CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 55
12 BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................................ 56
Página | 6
ÍNDICE DE FIGURAS
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FIGURA 15. Gráfica de los promedios y desviaciones estándar de las muestras obtenidas del rastro
para BMA. ...................................................................................................................................... 43
FIGURA 16. Gráfica de los promedios y desviaciones estándar de las muestras de pollo obtenidas
de las distribuidoras de la ciudad de Puebla de la cuantificación de BMA. .................................. 44
FIGURA 17. Resultados de la determinación de coliformes totales y fecales en el rastro de Zacatlán
de todas las muestras analizadas en los tres muestreos. .............................................................. 45
FIGURA 18. Resultados de la determinación de coliformes totales y fecales en las distribuidoras
de la ciudad de Puebla de todas las muestras analizadas. ............................................................ 45
FIGURA 19. a) Crecimiento de colonias características de S. aureus en agar Baird Parker, después
de 48 horas de incubación a 35°C. b) Confirmación de S. aureus coagulasa (+). .......................... 46
FIGURA 20. Gráfica de los promedios de las muestras obtenidas del rastro para S. aureus. ....... 47
FIGURA 21. Gráfica de los promedios de las muestras obtenidas de las distribuidoras de la ciudad
de Puebla para S. aureus................................................................................................................ 47
FIGURA 22. Gráfica las distribuidoras muestreadas que cumplieron con los tres parámetros
establecidos por las normas. ......................................................................................................... 48
FIGURA 23. a) Tubos del kit “Salmonella detection” que presentan resultado negativo. b) Tubos
del Kit “Salmonella detection” que presentan fondo amarillo: resultado positivo. .................... 49
FIGURA 24. Visualización de los amplicones obtenidos por reacción de PCR de colonia para el gen
inv A a partir de ADN obtenido de las colonias presuntivas de Salmonella por el método
microbiológico. L1) Marcador, 2) Control positivo, L3-L9) 1VB. 1SB. 2SB. 3VB. 3SB. 4SB. 6SB, L10)
Control negativo. ........................................................................................................................... 50
FIGURA 25. Comparación de los porcentajes de las muestras dentro y fuera de norma entre el
rastro y las distribuidoras. ............................................................................................................. 51
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ÍNDICE DE TABLAS
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1 RESUMEN
La gastroenteritis causada por Salmonella se denomina salmonelosis. La salmonelosis
es una enfermedad infecciosa zoonótica causada por bacterias del género Salmonella que
tiene como principal reservorio aparato gastrointestinal de las aves. El alto consumo de carne
de pollo en el estado de Puebla representa un importante vehículo de transmisión de la
salmonelosis, que debe ser monitoreado de forma rápida y eficaz, características ofrecidas
por la PCR, por ello, el objetivo general de este trabajo fue determinar la incidencia de
Salmonella spp en canales de pollo provenientes de un rastro y distribuidoras de aves,
mediante cultivo microbiológico y PCR de punto final.
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2 INTRODUCCIÓN
La falta de conocimiento sobre las Buenas Prácticas Higiénicas, así como la escasa
disponibilidad de información sobre las ETA repercute negativamente en la manipulación y
preparación de los alimentos, tanto a nivel familiar como comercial. Esta carencia de
conocimientos técnicos básicos sobre la inocuidad por parte de quienes preparan alimentos,
se puede considerar como uno de los factores que más contribuyen a la contaminación
alimentaria, donde de manera indirecta se ven mayormente afectados los grupos más
vulnerables a enfermarse como los niños, ancianos y personas inmunodeprimidas (Kopper et
al., 2009).
Algunos de los síntomas de esta enfermedad son náuseas, vómitos, cólicos abdominales,
diarrea, fiebre y cefalea. Los síntomas de la enfermedad comienzan a manifestarse entre seis
y 72 horas (generalmente 12 a 36 horas) después de la ingesta de Salmonella, y la enfermedad
dura entre dos y siete días (OMS, 2013). Los alimentos relacionados son carnes crudas, pollo,
huevos, leche, derivados lácteos, pescados, salsas, cacao y chocolate (Muñoz, 2014).
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3 MARCO TEÓRICO
La carne de pollo forma parte de la alimentación humana al contar con los nutrientes
necesarios para el crecimiento, desarrollo y funcionamiento óptimo de nuestro organismo.
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3.2 ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS (ETA)
A nivel mundial Campylobacter spp y Salmonella spp son las causas más comunes de
enfermedades de transmisión alimentaria bacteriana en varios países, y los productos
avícolas son los principales vehículos de transmisión a los seres humanos (Ellingson et al.
2004).
Ciertas ETA son capaces de generar enfermedades crónicas a largo plazo tales como
daños renales, artritis, meningitis, aborto y, en casos extremos, la muerte; se pueden
manifestar de diversas formas y se debe distinguir entre infección alimentaria e intoxicación
(Kooper et al., 2009).
Por todo lo expuesto anteriormente se requiere que los alimentos cubran las
expectativas de inocuidad alimentaria para no constituir un riesgo para la salud.
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Como es imposible hacer la determinación de todos los microorganismos presentes en
los alimentos, se busca una estrategia para poder hacer un análisis microbiológico
representativo de la carga microbiana presente en el alimento, por lo que se recurre a las
determinaciones de los grupos de microorganismos indicadores.
La frescura de un producto.
La presencia de patógenos o sus toxinas.
La idoneidad de una materia prima.
La vida de anaquel de un producto.
Una contaminación humana.
La eficiencia de procesos antimicrobianos.
Violaciones a prácticas sanitarias de operación o distribución.
Los grupos microbianos indicadores de mayor aplicación en los alimentos son las bacterias
mesofílicas aerobias, los organismos coliformes totales y fecales, E. coli, hongos y levaduras,
bacterias psicrótrofas, termodúricos, termófilos, proteolíticos y lipolíticos, osmotolerantes y
acidúricos (Fernández, 2000).
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microrganismos que pueden ser o no patógenos, con temperaturas de crecimiento entre 35
± 2°C 48 ± 2 h en presencia de oxígeno (Fernández, 2000).
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no implica el mismo tipo de riesgo que con los microorganismos patógenos. (Fernández,
2000).
Salmonella enterica se subdivide, a su vez, en seis subespecies: Enterica (I), Salamae (II),
Arizonae (IIIa), Diarizonae (IIIb), Houenae (IV), e Indica (VI). Estas subespecies son
diferenciables bioquímicamente. En la actualidad se conocen más de 2500 serovares (Levin
R. et al. 2009; Figueroa et al. 2005).
Al hablar de Salmonella como posible riesgo de infección por el consumo de productos
de origen animal, se debe hacer referencia a S. enterica Typhimurium y S. enterica Enteritidis,
los cuales causan la mayoría de los brotes que afectan a las personas, y constituyen uno de
los principales problemas en muchos países (Jarquin et al. 2009).
Las subespecies de S. enterica son consideradas de importancia clínica y en esta
subespecie se incluye a los patógenos asociados con la fiebre tifoidea: S. enterica serovar
Typhi, siendo la única que tiene como reservorio especifico al hombre.
S. bongori se asocia generalmente con el medio ambiente o los reptiles y no se
consideran clínicamente importante.
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x 1,0 a 6,0 µm. Son bacterias móviles debido a la presencia de flagelos perítricos, a excepción
de S. enterica Gallinarum y S. entérica Pullorum (Linder, 1995) con una diversa composición
antigénica que se emplea como base para la identificación de sus miembros en serotipos, más
recientemente designados como serovares (Fernández, 2000).
Capaces de producir ácido sulfhídrico (H2S). Emplean glucosa por poseer una enzima
especializada (fermentadoras de glucosa), pero no lactosa, no producen ureasa, son también
catalasa positivo y oxidasa negativo. Crecen bien a temperatura ambiente, si bien su
temperatura óptima de crecimiento es de aproximadamente 37°C, su intervalo de pH de
crecimiento se haya comprendido entre los valores 4.1 y 9.0 multiplicándose, por lo tanto, en
alimentos de baja acidez (Frazier, 1993).
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3.5.5 Transmisión por alimentos
Salmonella puede llegar al alimento por contaminación fecal de manipuladores de
alimentos o por contaminación cruzada por medio de superficies contaminadas. Los animales
para producción de alimentos como pollos, cerdos y vacas, pueden contener Salmonella y
transmitir la bacteria a alimentos frescos como huevo, carne y productos lácteos.
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de Salmonella spp en muestras de alimentos, debido principalmente a la estabilidad que
presenta desde el punto de vista genético (Chacón et al., 2010).
3.7 PCR
La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica
millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que
la secuencia blanco es copiada fielmente (Tamay de Dios et al., 2013).
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2. Régimen de ciclaje: Tres son los pasos necesarios a seguir y repetir por cada ciclo de
la PCR. Comúnmente se les refiere como desnaturalización, alineamiento y extensión.
Regularmente se agrega una etapa previa de desnaturalización (generalmente a 94°C)
para relajar las posibles estructuras secundarias y de otros tipos.
3. ADN polimerasa: Las ADN polimerasa utilizadas en PCR incluyen un grupo de enzimas
termoestables aisladas de microorganismos termófilos, de calidad suficiente que
evitan pérdidas en especificidad, eficiencia, fidelidad y rendimiento, que de esta
forma generara copias complementarias a la secuencia de interés utilizando como
materia prima los cuatro nucleótidos que constituyen el ADN (Bolivar et al., 2014)
(figura 2).
Figura 2. Componentes implicados en una PCR. Tomado de: García, C., 2014.
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de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional (Morales et. al.,
2006).
Por electroforesis se pueden separar fragmentos de ADN y ARN en función a su tamaño
y visualizarlos mediante tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos
de una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de integridad.
» Concentración de agarosa
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» Conformación del ADN. Las distintas conformaciones de las moléculas de ADN circular
del mismo peso molecular migran a distinta velocidad.
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4 MARCO REFERENCIAL
Los métodos microbiológicos convencionales para la detección de Salmonella son
métodos tardados y tienen ciertas desventajas, debido que su recuperación se dificulta
porque no es detectable en alimentos que tienen un bajo número de células, y por otra parte,
los métodos tradicionales para la recuperación del microorganismo, aislamiento en medios
selectivos, posterior identificación bioquímica y caracterización serológica tienen baja
especificidad, sensibilidad y consumen mucho tiempo, por lo que la implementación de
técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha facilitado el diagnóstico de
estos patógenos en alimentos (Acosta et al., 2013).
En 2012 Alves et al., desarrollaron un ensayo de PCR múltiple para la detección rápida
de Campylobacter spp y Salmonella spp en carne de pollo cruda. La especificidad del ensayo
fue de 100% y determinaron que era capaz de detectar 102 UFC/mL de Campylobacter spp
después del enriquecimiento selectivo y 1 UFC/mL de Salmonella spp después del pre-
enriquecimiento. Se analizaron cincuenta muestras de carne de pollo cruda; 4% estaban
contaminados con Salmonella spp y el 56% con resultados positivos a Campylobacter spp Los
resultados obtenidos mediante PCR coincidieron con los métodos de cultivo convencionales
(Alves et al., 2012).
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molecular por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para detectar Salmonella spp en
expendios de la ciudad de Santa Marta (Colombia), a partir de 65 muestras de alimento, entre
ellas pollo: 7(10.8 %), con una PCR previamente estandarizada para la amplificación de una
banda de 284 pb correspondientes al gen inv A, reportaron que por inmunoensayo enzimático
hallaron un 3.1 % (2/7) de muestras positivas pero al confirmar con la PCR el porcentaje se
elevó a 6.2 % (4/7) de positividad, demostrando la sensibilidad de la PCR contra otro tipo de
métodos (Acosta et al., 2013).
Por otra parte Saeki et al., llevaron a cabo una PCR múltiple para la detección de
Salmonella spp y la diferenciación entre serovares Typhimurium y Enteritidis en carne de
pollo. Su objetivo fue desarrollar una nueva PCR múltiple (mPCR) para la detección simultánea
y diferenciación de Salmonella spp, S. Enteritidis y S. Typhimurium en carne de pollo. Los
ensayos mPCR mostraron una alta especificidad con la identificación de S. Typhimurium
diferenciada de 22 serotipos de Salmonella probados, incluyendo S. Kentucky. Ellos
detectaron la amplificación del gen STM4492, el cual exhibió una alta especificidad para
detectar S. enterica Typhimurium después de 24 horas de enriquecimiento (Saeki et al.,
2013).
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5 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las enfermedades diarreicas causan más de la mitad de la carga mundial de las
enfermedades de transmisión alimentaria, con 550 millones de personas que enferman y
230.000 que mueren cada año. Los niños corren un riesgo especial de padecer enfermedades
diarreicas transmitidas por los alimentos: 220 millones enferman y 96.000 mueren cada año.
La diarrea suele deberse a la ingestión de carne y huevos crudos o mal cocidos, verduras y
frutas mal lavadas, y productos lácteos, contaminados por norovirus, Campylobacter,
Salmonella no tifoídica y Escherichia coli patógena (OMS, 2015).
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6 JUSTIFICACIÓN
En México aproximadamente: 57’730,590 toneladas de pollo son procesadas en los
rastros de pollo, de los cuales 52’247,420 toneladas (90.50%) de la producción se procesa en
rastros Tipo Inspección Federal (TIF) (Castañeda et al., 2013). Pero también es importante
destacar que la mayoría de este producto es de exportación y sólo un bajo porcentaje se
queda para cubrir la demanda Nacional. Aproximadamente el 10% de la matanza de pollo se
lleva a cabo en rastros estatales y privados y éste producto es el que cubre el mercado
Nacional.
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La importancia de estos datos, es reconocer el impacto del manejo del pollo en la
incidencia de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA), ya que durante el proceso de
matanza de las aves, se puede producir contaminación cruzada por contacto con material no-
procesado, con aves, o utensilios de proceso, aun teniendo las medidas de manipulación e
higiene adecuadas, por lo que es de gran importancia la detección de esta bacteria antes de
que sea adquirida por el consumidor (Castañeda et al., 2013), sin embargo, los métodos
microbiológicos para la identificación de las diferentes especies patógenas toman demasiado
tiempo en ofrecer una respuesta, lo que hace que los productores no puedan valerse de ellos
para sacar a la venta un producto con garantía microbiológica, al tratarse de un alimento
perecedero. De ahí la importancia de la implementación de nuevas técnicas para la detección
de patógenos, por lo que el método de PCR para el diagnóstico molecular rápido y preciso de
Salmonella spp en carne de pollo es de gran valor, no sólo para los productores y
distribuidores, sino también para los consumidores.
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7 OBJETIVOS
7.1 GENERAL
Determinar la incidencia de Salmonella spp en canales de pollo provenientes de un
rastro y distribuidoras de aves, mediante cultivo microbiológico y PCR de punto final.
7.2 PARTICULARES
Determinar la calidad microbiológica de pollos, provenientes de un rastro y
distribuidoras de aves.
Aislar mediante cultivo microbiológico a Salmonella de canales de pollo muestreados.
Estandarizar y aplicar la técnica de PCR para la detección de Salmonella spp en carne
de pollo.
Detectar Salmonella mediante el kit “Salmonella detection” (Mississippi State University)
para corroborar su utilidad.
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8 METODOLOGÍA
8.1 CEPA CONTROL Y MEDIOS DE CULTIVOS
La cepa control empleada, S. enterica Typhimurium ATCC-14028 fue donada por el
Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas de la BUAP.
Los medios empleados en el desarrollo del trabajo fueron LB para las pruebas
relacionadas a PCR y los específicos para cada una de las determinaciones de los diferentes
indicadores sanitarios.
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Figura 3. Mapa de la ciudad de Puebla, donde se muestra y se señala la ubicación de las
distribuidoras muestreadas, observándose una mayor concentración en la Central de
Abastos. Tomado de: Google Maps, 2016.
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Rastro Distribuidoras
Toma de muestra
NOM-109-SSA1-1994
Procesamiento
Extracción de ADN
microbiológico
SAGARPA, 2013 kit Quick-gDNA MiniPrep
Bacterias
Staphylococcus
Salmonella Coliformes Totales Coliformes Fecales Mesofilicas PCR punto final
aureus
Aerobias
NOM-114-SSA1-1994. NOM-115-SSA1-1994 NOM-112-SSA1-1994 NOM-112-SSA1-1994 NOM-092-SSA1-1994 Amplificación gen invA
Pruebas
Bioquímicas
(+)
PCR
De colonia
Análisis de Resultados
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8.4 TOMA DE MUESTRA
La toma de muestra fue realizada conforme a la Norma Oficial Mexicana NOM-109-
SSA1-1994, PROCEDIMIENTOS PARA LA TOMA, MANEJO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS DE
ALIMENTOS PARA SU ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO, en un rastro y distribuidoras de aves en
Puebla, durante un día de proceso normal, y transportadas al Laboratorio de Patogenicidad
Microbiana del Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas ICUAP, BUAP; en
cadena de frio para evitar así, lo más posible, la variación de la carga microbiana, en donde
eran procesadas.
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a)
b)
c)
Figura 6. a) Toma de trozos de carne y piel de las canales para la suspensión (25g de muestra
de pollo en 225 mL de caldo BHI). b) Alícuota de 50 mL en tubo cónico, después de la
incubación durante 3 horas a 37°C. c) Residuo de grasa de la alícuota después de la
centrifugación. Fotografías propias, 2016.
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Se llevó a cabo por medio de una lisis al botón obtenido con anterioridad para permitir
que los ácidos nucleicos se liberasen con la solución “Genomic Lysis Buffer”. Posteriormente
mediante centrifugaciones en una columna de extracción se separó el material genético y
este quedó atrapado en la columna, se realizaron los lavados correspondientes para que al
final todo el ADN extraído fuera nuevamente resuspendido en agua estéril (figura 7).
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8.5.4 PCR punto final: amplificación del gen inv A
Para la identificación de Salmonella por PCR se amplificó el gen inv A que es
característico de género, los oligonucleótidos que se usaron se muestran en la tabla 1, las
reacciones de PCR fueron de 25 µL y se realizaron empleando la mezcla de reacción
comercial GoTaq®Green Master Mix 2X, de PROMEGA (tabla 2). La mezcla de reacción final
se sometió a un proceso de amplificación en un termociclador (Mastercycler Personal,
EPPENDORF). El programa de amplificación consistió en una desnaturalización inicial a 94˚C
por dos minutos, seguido de una desnaturalización a 94˚C por 1 minuto, alineación de 58˚C
por 30 segundos, extensión a 72˚C durante 30 segundos, este ciclo fue repetido 30 veces y
finalizado con una etapa de extensión final a 72˚C por 15 minutos.
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8.5.5 Visualización de los amplicones
La visualización de los amplicones obtenidos en la reacción de PCR para el gen inv A a
partir del ADN obtenido de la muestra directa, se realizó de igual forma a lo ya explicado en
el punto 7.5.3, empleando como control positivo ADN bacteriano de S. enterica
Typhimurium ATCC-14028.
La prueba fue realizada a partir de las dos diluciones decimales realizadas a partir de
la dilución primaria (1:100 y 1:1000), se sembraron dos placas por cada una de las diluciones
con 100 µL. Se realizó la incubación a 35°C ± 2 por 48 ± 2 h. Pasado el tiempo de incubación,
se procedió al conteo de las placas, en caso de que el resultado de las placas fuera
incontable, se realizaba nuevamente la prueba, realizando nuevas diluciones decimales (10-
4, 10-5, 10-6, etc.) según el resultado de las placas.
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8.6.1.2 Coliformes totales y fecales
La detección de bacterias coliformes totales y fecales se llevó a cabo en base a la
Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, DETERMINACIÓN DE BACTERIAS
COLIFORMES. TÉCNICA DEL NUMERO MÁS PROBABLE.
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8.6.1.3 Staphylococcus aureus
La detección de S. aureus fue llevada a cabo en base a la Norma Oficial Mexicana
NOM-115-SSA1-1994, MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN
ALIMENTOS.
Figura 9. Kit “Salmonella detection”, tubos pre-llenados con medio MB2 (10 mL).
Fotografía propia, 2016.
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Para la preparación del medio MB2 que se utilizó en el kit, se agregó 19 g de medio MB2
por cada litro de agua destilada, se mezcló hasta disolver completamente y se llevó a
esterilización a 121 °C por 15 min, una vez que este se enfrió, se agregó a los tubos
preparados para este.
Se hizo un cultivo de las colonias en medio LB con la finalidad de aislarlas y así garantizar
su pureza para posteriormente realizar la PCR de colonia. De las placas de cultivo crecidas,
se seleccionó 1 colonia aislada y con una punta de micropipeta estéril se tomó
cuidadosamente y se homogeneizó en la reacción de PCR previamente mezclada.
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9 RESULTADOS
1 2 3 4 5 6 7 8
280 pb inv A
Figura 10. Se observan los amplicones de 280-300 pb del gen inv A, L1) Marcador de ADN de
100 pb, L2) S. enterica Enteritidis, L3) S. enterica Typhimuirium 129, L4) S. enterica Typhi, L5)
S. enterica Typhimurium ATTC-14028, L6) S. enterica Montevideo, L7) S. enterica serovar
Typhimurium, L8) S. enterica Anatum. Fotografía Laboratorio de Patogenicidad Microbiana del
Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas ICUAP, BUAP, 2015.
Página | 40
9.2.2.1 Electroforesis en gel de agarosa y visualización de ADN extraído con el kit
Los productos de extracción fueron analizados para confirmar la existencia de ADN en
la muestra. Obteniendo ADN en todas las muestras (figura 11).
Figura 11. Verificación de la obtención de ADN de las muestras obtenidas por medio
del kit Quick-gDNA MiniPrep. Fotografía propia, 2016.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
280pb
Figura 12. Visualización de los amplicones obtenidos por reacción de PRC para el gen inv A a
partir de ADN obtenido de la muestra directa. L1) Marcador, L2) Control positivo, L3-L8)
Muestras 1 – 6, L9) Control negativo. Fotografía propia, 2016.
Página | 41
Así también, fueron analizadas 36 canales de pollo, provenientes de 12 distribuidoras
de la Central de Abastos y ciudad de Puebla, de las cuales en el 8 % (1/12) se detectó a
Salmonella (figura 13) por la amplificación del gen inv A en dos muestras (figura 14).
Detección de
Salmonella
8%
No detección
92%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
280 pb INV A
Figura 14. Amplificación del gen inv A directamente del ADN extraído de las muestras de pollo.
L1) Marcador de ADN de 100 pb, L2) Amplicón de S. enterica Typhimurium ATCC-14028, L3-L9)
amplicones de muestras provenientes de las distribuidoras, L10) control negativo. Fotografía
propia, 2016.
Página | 42
9.3 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
9.3.1 Determinación de microorganismos indicadores en pollo por método
microbiológico
9.3.1.1 Bacterias Mesofílicas Aerobias
Una vez llevada a cabo la determinación de BMA, se tomó como límite máximo 10 000 000
UFC/g de acuerdo al Proyecto de Norma Oficial, NOM-087-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.
AVES FRESCAS REFRIGERADAS Y CONGELADAS ENTERAS Y TROCEADAS ENVASADAS.
ESPECIFICACIONES SANITARIAS.
El promedio de los resultados obtenidos en los tres muestreos del rastro, indican que
ninguna de las muestras de pollo estuvo fuera de norma, para la determinación de BMA
(figura 15); por otro lado se observa claramente que dos de las 12 distribuidoras
muestreadas se encontraron fuera de norma como se observa en la figura 16 (16.7%).
BMA
10,000,000
9,000,000
8,000,000
7,000,000
6,000,000
UFC/g
5,000,000
4,000,000
3,000,000
2,000,000
1,000,000
-
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3
Rastro
Figura 15. Gráfica de los promedios y desviaciones estándar de las muestras obtenidas del
rastro para BMA.
Página | 43
BMA
20,000,000
18,000,000
16,000,000
14,000,000
12,000,000
UFC/g
10,000,000
8,000,000
6,000,000
4,000,000
2,000,000
-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Distribuidoras
Figura 16. Gráfica de los promedios y desviaciones estándar de las muestras de pollo obtenidas de las
distribuidoras de la ciudad de Puebla de la cuantificación de BMA.
Página | 44
Coliformes totales y fecales
1000
800
UFC/g 600
400
200
0
1 2 3
Rastro
800
600
400
200
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Distribuidoras
Página | 45
9.3.1.3 Staphylococcus aureus
Una vez realizada la extensión en superficie con varilla de vidrio en placas con agar Baird
Parker y pasado el tiempo de incubación, se procedió a realizar el conteo de las colonias
típicas de S. aureus, donde solamente eran tomadas en cuenta las colonias con las siguientes
características: negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y que
mostraban una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia (figura 17a).
Posteriormente, se les realizó la prueba de confirmación en base a los criterios de la Norma
Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994, realizando la prueba de coagulasa (figura 19b).
a) b)
El promedio de los resultados de los tres muestreos del rastro indica que ninguna de las
muestras de pollo estuvo por arriba de la norma para la determinación de S. aureus (figura
20) a diferencia de lo observado en las distribuidoras, donde las muestras de pollo obtenidas
de las distribuidoras 3,4 y 9 (25%) no cumplieron la normatividad (figura 21).
Página | 46
Staphylococcus aureus
1,000
900
800
700
600
UFC/g
500
400
300
200
100
-
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3
Rastro
Figura 20. Gráfica de los promedios de las muestras obtenidas del rastro para S. aureus.
Staphylococcus aureus
8,000
7,000
6,000
5,000
4,000
UFC/g
3,000
2,000
1,000
-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
-1,000
Distribuidoras
Figura 21. Gráfica de los promedios de las muestras obtenidas de las distribuidoras de la ciudad de
Puebla para S. aureus.
Página | 47
Con los resultados obtenidos de los Indicadores, se analizó el número de distribuidoras
que cumplían o no con la normatividad, de acuerdo a los parámetros analizados: bacterias
mesofílicas aerobias (NOM-087-SSA1-1994), S. aureus (NOM-034-SSA-1993) y Salmonella
(NOM-087-SSA1-1994) concluyendo que el 58% (7/12) de las distribuidoras cumplieron con
los requerimientos establecidos por las normas (figura 22).
Fuera de Norma
42%
Dentro de
Norma
58%
Figura 22. Gráfica las distribuidoras muestreadas que cumplieron con los tres parámetros
establecidos por las normas.
Página | 48
9.3.2 Detección de Salmonella mediante el kit “Salmonella detection” (Mississippi
State University)
El kit fue utilizado en 17 de 36 muestras de las distribuidoras, a partir del muestreo
número 4. De acuerdo a las indicaciones del kit, se obtuvieron 6 resultados positivos y 11
negativos (figura 23a y 23b).
a) b)
Figura 23. a) Tubos del kit “Salmonella detection” que presentan resultado negativo. b) Tubos del
Kit “Salmonella detection” que presentan fondo amarillo: resultado positivo. Fotografías propias,
2016.
Página | 49
como presuntivas a Salmonella no se confirmaron por PCR ya que no se amplificó del gen
inv A (figura 24).
Figura 24. Visualización de los amplicones obtenidos por reacción de PCR de colonia para el gen inv A a
partir de ADN obtenido de las colonias presuntivas de Salmonella por el método microbiológico. L1)
Marcador, 2) Control positivo, L3-L9) 1VB. 1SB. 2SB. 3VB. 3SB. 4SB. 6SB, L10) Control negativo.
Fotografía propia, 2016.
Página | 50
Muestras: Rastro vs Distribuidoras
100%
90%
80%
70% 53%
60% 80%
50%
40%
30%
20% 47%
10% 20%
0%
Rastro Distribuidoras
Figura 25. Comparación de los porcentajes de las muestras dentro y fuera de norma entre
el rastro y las distribuidoras.
Página | 51
10 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Debido a la estabilidad del gen inv A, que le confiere la capacidad de invasión al epitelio
intestinal, y que se encuentra presente en el género, fue seleccionado como blanco para su
detección en este estudio, lográndose la estandarización de las condiciones del programa de
amplificación con un producto de 280 pb que ya secuenciado presentó un 99% de homología,
demostrando que la técnica de PCR punto final obtenida es específica, sensible y sobre todo
rápida, para la detección de esta bacteria sin complicaciones en cuanto a su reproducción en
el laboratorio, a diferencia de lo obtenido por Chacón et al., y Espinal et al., quienes
realizaron una PCR amplificando fragmentos de 389 y 378 pb, respectivamente, con métodos
más tardados y complejos aunque igualmente exitosos para la detección de Salmonella en
las muestras (Chacón et al., 2010 y Espinal et al., 2006).
Página | 52
(COVENIN), la cual tiene como límite máximo, los mismos valores tomados que en la
normatividad mexicana, mientras que en el estudio realizado en 5 mataderos del Estado
Zulia (Venezuela) por Molero, G., se obtuvo un recuento de BMA, por encima de los valores
permitidos, en el 40% de las canales; por lo que todo esto confirma la idea de que durante
el transporte de las canales del rastro a las distribuidoras, así como la manipulación y
almacenamiento en estas, existen puntos deficientes que influyen de manera importante en
el incremento de la contaminación microbiana del producto. En el estudio de Molina et al.,
también analizaron los recuentos de S. aureus, tomando como referencia la normatividad de
otros países como Argentina, Nicaragua y Perú, debido a que no cuentan con criterios
definidos para este indicador, sus resultados para pollos no industriales fueron consideradas
como rechazados al comparar los recuentos con las normativas de esos países, en nuestro
caso, los resultados del rastro indican que se encontraron en norma a diferencia de las
distribuidoras, donde el 25% de las muestras no cumplieron la normatividad mexicana
coincidiendo de manera parcial con su estudio.(Molero, 2012 y Molina et al., 2010).
Para el caso de coliformes totales y fecales, estos superaron totalmente los valores
contables para la prueba del NMP, debido a que en nuestro país aún no se encuentran
definidos los valores para el conteo de coliformes en carne de pollo, se tomaron como
referencia los valores emitidos en la Norma Técnica Nicaragüense 03 023-06, donde se
establece como recuento máximo permitido valores de 1x103 NMP/g, y debido a que esta
prueba fue usada como indicador de buenas prácticas higiénicas, se determinó que en todos
los establecimientos existen prácticas deficientes. Lo anterior hace la diferencia en cuanto a
los hallazgos por parte de Molina et al., ya que describieron que una parte de las muestras
no industriales se encontraban dentro de la normatividad de los países antes señalados.
Como punto extra, en todas las muestras de pollo industrial se presentaron valores para
bacterias mesofílicas aerobias, coliformes totales, E. coli y S. aureus aceptables,
independientemente de la norma con la cual se compararon, lo que efectivamente hace
confirmar la deficiencia de buenas prácticas higiénicas tanto en el rastro como en las
distribuidoras. (NTON 03 023-06, 2010 y Molina et al., 2010).
Página | 53
En la detección de muestras positivas a Salmonella mediante el kit “Salmonella
detection” (Mississippi State University), se determinó que reflejaban falsos positivos, ya que
al ratificar la existencia de Salmonella por la PCR directa de las muestras, estos resultaron
ser negativos.
Por otra parte, se corroboró por medio de la PCR de colonia, que las cepas presuntivas
a Salmonella obtenidas por medio del método microbiológico fueron negativas a la presencia
del gen, determinándose que no se aislaron cepas de Salmonella, totalmente contrario a lo
reportado por Acosta et al., que por inmunoensayo enzimático hallaron un 3.1 % de
muestras positivas pero al confirmar con la PCR el porcentaje se elevó a 6.2 % de positividad,
todo lo anterior concluye que la PCR es capaz de detectar células viables presentes en la
muestra, así como células no cultivables por medio del ADN bacteriano (Acosta et al., 2013).
Página | 54
11 CONCLUSIONES
Página | 55
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