REGIONAL ATLANTICO DETERMINACION DE DETERMINACION DE CODIGO:

SALMONELLA
CEDAGRO

(Técnica de adopción INVIMA)

FECHA DE EDICION:
LABORATORIO DE ALIMENTOS
VERSION:
ANALISIS MICROBIOLOGICO
PAGINAS: 6

DETERMINACIÓN DE SALMONELLA

La única vía de entrada de la salmonella en el cuerpo humano es la oral, por lo que es de

gran importancia el análisis de los alimentos para detectar su presencia. Todas las
especies deben ser consideradas como potencialmente patógenas para el hombre. La
presencia de salmonella sp en productos procesados térmicamente, indica tratamiento
inadecuado o contaminado pos proceso.

Aun no es posible recomendar un solo método para el aislamiento y la identificación de

salmonella. Que sea completamente satisfactoria para todos los alimentos. Los métodos
que se utilizan son similares en principio; comprende varia etapas sucesivas:
enriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo, siembra en placas con medios
solidos selectivos y diferenciales, caracterización bioquímica de las colonias sospechosas,
confirmación serológica y tipificación por medio de bacteriófagos.

Equipo y material

● Incubadora a 35º C + o – 2º C
● Baño de agua a 43º C + o – 0.2º C
● Refrigerador a 0-5º C
● Cajas de Petri estériles
● Pipetas de 1 ml estériles
● Gradillas
● Portaobjetos
● Microscopio
● Tubos tapa rosca estériles
● Pipeteador
● Frascos estériles con capacidad no inferior a 2.500 g sensibilidad 0.1 g
● Instrumentos para preparar la muestra
● Cuchillos, tenedores, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, morteros con sus
respectivos pistilos estériles.
● Laminas portaobjetos.

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Medios de cultivo y reactivos

● Agua destilada estéril

● Agua de peptona tamponada (medio 32)
● Agar bismuto sulfito según Wilson Blair ( medio 33)
● Agar verde brillante lactosa-sacarosa, con novobiocina (BPLS)( medio 34)
● Agar xilosa, lisina desoxicolato, XLD( medio 35)
● Caldo selenito- cistina ( medio 36)
● Caldo tetratoniato ( medio 37)
● Agar citrato de Simmons ( medio 37)
● Agar hierro triple azúcar, (TSI) (medio 39)
● Agar fenil-alanina (APP) ( medio 40)
● Agar motilidad (medio 41)
● Agar urea (medio 42)
● Caldo triptófano (medio 26)
● Caldo lisina (medio 43)
● Caldo nitrato (medio 12)
● Caldo rojo de metilo-Voges Proskauer,(MR-VP) (medio 44)
● Reactivo para oxidasa (reactivo 16)
● Polvo zinc
● Reactivo de Griess (reactivo 8)
● Rojo de metilo (reactivo 17)
● Solución acuosa de verde brillante al 0.1 % (reactivo 18)
● Solución de yodo y yoduro potásico (reactivo 19)
● Solución acuosa de hidróxido de potasio al 40% (reactivo 9)
● Solución de cloruro férrico al 10% (reactivo 20)
● Solución de alfa-naftol (reactivo 10)
● Reactivos para coloración de Gram (reactivo 12)

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Procedimiento

El análisis de salmonella incluye cuatro etapas fundamentales:

I. Enriquecimiento no selectivo.
II. Enriquecimiento selectivo.
III. Siembra en placa en Agar selectivo y diferencial
IV. Identificación

I. Enriquecimiento no selectivo

1. Pesar una bolsa para “stomacher” previamente tarada 25 g representativos de la

muestra total ) tomando tanto de la superficie como se du interior)
2. Añadir 225 ml de agua de peptona tamponada ( medio de enriquecimiento no
selectivo)
3. Cuando se analiza la leche en polvo, utilizar agua destilada adicionada de 5 ml
se solución verde brillante al 0.1 %.
4. Colocar la bolsa en el “stomacher” y hacer funcionar el aparto por 2 minutos, el
tiempo máximo de homogenización dependerá del tipo de alimento. No debe
sobrepasar los minutos.
5. Incubar a 35° C + o –, 2 por 18-24 horas
6. Realizar controles positivos y negativos con cepas conocidas.

II. Enriquecimiento selectivo

1. Transferir 1 ml de cultivo obtenido del enriquecimiento no selectivo en 10 ml de

Caldo selenito cistina.
2. Incubar en baño de agua a 43° C + o – ,0.2 por 18-24 hora

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3. Transferir 1 lm de cultivo obtenido del enriquecimiento no selectivo en 10 ml de

Caldo tatratoniato, adicionado de 0.2 ml de solución de yodo y 0.1 ml de
solución acuosa de verde brillante al 0.1 %
4. Incubar en baño de agua a 43° C + o –, 0.2 por 18-24 horas

III. Siembra en placa en Agar selectivo y diferencial

Se deben utilizar dos medios selectivos por cada caldo de enriquecimiento no selectivo y
selectivo, para aislamiento del microorganismo. El laboratorio pude utilizar el medio
diferencial de su selección. Se recomienda el Agar bismuto sulfito, el Agar verde brillante
lactosa sacarosa con novobiocina y el Agar XLD.

1. A partir de cada uno de los cultivos obtenidos del enriquecimiento no selectivo y

selectivo, sembrar en superficie con asa por agotamiento placas con Agar verde
brillante lactosa-sacarosa, Agar bimuto sulfito o Agar XLD.
2. Incubar las placas a 35° C + o –, 2 durante 18-24 horas.
3. Escoger 3 colonias típicas sospechosas de salmonella (lactosa negativa)
4. Aislarlas en Agar selectivo para garantizar su pureza.
5. Proceder a su identificación.

IV. Identificación de salmonella

Identificación de cultivos sospechosos de pertenecer al género salmonella sp incluye dos

etapas seguidas:
Comprobación de las colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas
determinativas.
Identificación serológica de las cepas sospechosas mediante el uso de antisueros.

Identificación de salmonella mediante pruebas bioquímicas

Coloración de Gram:

Hacer frotis de cada una de las colonias seleccionadas y colorearlas por el método de
Gram.

Salmonella: bacilo Gram negativo, no esporulado

Prueba de la oxidasa:

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En una caja de Petri, colocar papel de filtro e impregnarlo con el reactivo para oxidasa.

Hacer un extendido, con asa de vidrio o palillo de madera, de una colonia sospechosa,
sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo, siguiendo una línea de 3 a 6 mm de
longitud.

Si se produce un cambio de color azul o violeta indica una prueba positiva.

Fermentación de carbohidratos:

Inocular con asa los tubos que contienen cada uno de los carbohidratos glucosa, lactosa,
sacarosa.
Incubar a 35°C + o – 2 por 24-48 horas.
Si se produce un cambio de color, según el indicador de pH utilizado, la reacción es
positiva.

Prueba de la lisina decarboxilasa:

Inocular con asa el tubo con el aminoácido L-lisina, colocar una capa de aceite mineral
estéril incubar a 35°C + o – 2°C por 24-48 horas.
El cambio de color a purpura indica una prueba positiva.

Movilidad:

Inocular con asa recta por punción central, a una profundidad de ¼ a ½ pulgadas, tubos
con agar movilidad incubar a 35°C + o - 2°C por 24- 48 horas.
El crecimiento es positivo si el microorganismo migra de la línea de siembra se difunde a
través del medio. Cuando es inmóvil solo crece en la línea de siembra.

Reducción de nitrato:

Inocular con asa recta tubos de caldo nitrato. Incubar a 35°C + o - 2°C por 24- 48 horas.
Revelar la prueba de nitrato añadiendo unos miligramos del reactivo de Griess y observar
el color que presenta. La aparición de un color rojo, indica presencia de nitritos
(positividad) en el caso de que no ocurra cambio de color añadir unos miligramos de polvo
de zinc para determinar la presencia de nitrato residual. La aparición de un color rojo
indica presencia de nitrato residual en el medio y por lo tanto una reacción negativa.

Reacción en Agar hierro triple azúcar:

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Inocular cada uno de los tubos de Agar TSI, sembrando por estría la parte inclinada y por
picadura la colonia del medio incubar a 35°C + o - 2°C por 24- 48 horas.
Los cultivos de salmonella producirán una reacción K/A con producción de gas, y
producción de H2S.

Reacción en Agar citrato de Simmons:

Inocular cada uno de los tubos de Agar citrato de Simmons, sembrando por picadura la
columna del medio. Incubar a 35°C + o - 2°C por 24- 48 horas.
Una reacción positiva estará dada por un viraje de color verde a azul intenso.

Reacción en Agar LIA:

Inocular cada uno de los tubos de Agar LIA, sembrando por doble picadura la columna del
medio y por estría la superficie. Incubar a 35°C + o - 2°C por 24- 48 horas.
Los cultivos de salmonella producirán una reacción K/K

Reacción en Agar Urea

Incubar cada uno de los tubos Agar Urea sembrando por estría la parte inclinada. Incubar
a 35°C + o - 2°C por 24- 48 horas.
Se observa una reacción positiva cuando el color del medio vira de color rosado a violeta.

Desaminación de la Fenilalanina (APP)

Inocular cada uno de los tubos de Agar Fenilalanina, sembrando por estría la parte
inclinada. Incubar a 35°C + o - 2°C por 24- 48 horas.
Revelar añadiendo 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10% sobre la estría de crecimiento. Un
color verde indica positividad de la reacción.

Producción de Indol

Inocular cada uno de los tubos de caldo Triptófano. Incubar a 35°C + o - 2°C por 24- 48
horas.
Revelar añadiendo 3 a 5 gotas de reactivo de Kovac’s. Un anillo olor cereza en la
superficie del medio indica una reacción positiva.

Rojo de metilo- Voges Proskauer (MR-VP)

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Inocular dos de los tubos con caldo MR-VP. Incubar a 35°C + o - 2°C por 24- 48 horas.
Revelar el Rojo de Metilo (MR) agregando a uno de los tubos de 4 a 6 gotas de Rojo de
Metilo.
Un color rojo indica positividad de la reacción.
Revelar el Voges Proskauer (VP), añadiendo en el otro tubo, 0,6 ml de Alfa naftol al 5 % y
0,2 ml de la solución acuosa de hidróxido de potasio al 40%. Agitar el tubo suavemente y
dejar en reposo por 10 minutos. Un color rojo indica positividad en la reacción.