Rompimiento Celular

Separación y Procesos
Biotecnológicos

Caldo de Fermentación
Con Células
Proteínas
Intracelular Separación de Células

Rompimiento Celular Sin Células

•Células inmovilizadas
•Células retenidas

Separación Material Intracelular

Sobrenadante

Precipitación Ácidos Nucleicos,

Proteasas

Tratamiento de cuerpos incluidos

Concentración

Purificación Alta
Resolución

Permite
Refinamiento •Altos niveles de pureza
•Estabilidad del producto

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 ROMPIMIENTO DE CÉLULAS
( Cell Disruption)
¿Cuándo se usa?

Los procesos de bio-separación se inician con una separación de la biomasa

desde el resto del cultivo. En muchos casos los productos se encuentran en
el medio. En estos casos la biomasa se descarta y hasta se puede vender
como sub-producto.

Pero en otros casos el producto de interés se encuentra

en el interior de las células, en particular la mayoría de
las proteínas producidas por manipulación genética de
bacterias que no segregan las proteína al medio, pero que
son precipitadas en el interior de la células en forma de
cuerpos incluidos (“inclusion bodies”) .

è Se trata de proteínas intracelulares.

Procesos y Equipos

La liberación de las proteínas intracelulares involucra la ruptura o

permeabilización de la pared celular.

Los equipos involucrados en esta etapa no han sido diseñados

especialmente para el área biotecnológica sino que son prestadas de
otras áreas (área de alimentos, de pinturas y pigmentos).

Este rompimiento o permeabilización se puede llevar a cabo por dos

métodos:

•Métodos No - Mecánicos
•Métodos Mecánicos

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La selección de una u otra técnica dependerá las caracterí sticas del
producto se desea purificar,tales como:
•Resistencia a:
• Medios alcalinos
• Solventes
• Detergentes
• Enzimas
• Temperatura
• Esfuerzo de corte.

La técnica utilizada determinará el tamaño de los desechos que se

producirán.

Métodos Mecánicos

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 Métodos Mecánicos
El rompimiento se lleva a cabo por acción mecánica,
pudiendo ser:
• Fricción
• Efecto de la presión
• Colisiones.

Estos métodos incluyen las operaciones unitarias de

ultrasonido, homogenización , molinos de bolas, etc.
Estos métodos resultan ser agresivos con las proteínas de
interés, debido principalmente a la generación de calor.
Adicionalmente, el escalamiento resultan ser un problema
significativo.

Métodos Mecánicos
Técnicas Principios Stress Costos Ejemplos

Homogeni- Las células son Moderado Moderado Rompimiento de

zador de rotas en un tejidos y células
cuchillos mezclador animales.
Homogeni- Las células son forzadas a Fuerte Moderado Tratamiento a
pasar a través de un
zador alta pequeño orificio lo que gran escala de
presión produce que se rompan suspensión de
por el esfuerzo de corte células.

Ultrasonifi- Las células son Fuerte Caro Rompimiento de

cación quebradas en una suspensiones de
cavidad células a lo menos
en pequeña escala
ultrasónica
Molienda Las células son Moderado Barato
rotas por medio de
una molienda con
abrasivos
Molinos de Las células son Fuerte Barato Rompimiento a
gran escala para
bolas trituradas con suspensiones de
bodas de acero o células y células de
vidrio plantas

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 Métodos No-Mecánicos

Pueden ser de dos tipos:

•Agente químicos
•Solventes orgánicos
• Detergentes
• Alcalis
• Agua (shock osmótico)

•Enzimáticos se trata de enzimas que permeabilizan en forma

selectiva las membranas celulares, tales como lisozima,
glucanasas, mananasas, etc.

Los métodos no-mecánicos son fáciles de escalar, si uno

necesita tratar 10 veces má s materia orgánica basta con
adicionar 10 veces má s reactivo químico o enzimático.

Métodos No-mecánicos
Técnicas Principios Stress Costos Ejemplos

Permeabili- Permeabilización de Suave Caro Tratamiento de

la pared celular, lo
zación M. lysodeikticus
cual produce el
Enzimático rompimiento de la con lisozima.
célula

Shock Ruptura Osm ótica Suave Barato Ruptura de

de la membrana Células de
Osmótico
Glóbulos Rojos.
Solubiliza- Disolución de la Suave Moderada- Rompimiento
ción membrana celular mente Caro de bacterias con
con detergentes SDS.

Disolución Solventes orgánicos Modera Barato Rompimiento

que disuelve la pared
de Lípidos celular y también la do de levaduras
desestabilizan con tolueno.

Tratamien- Solubilización de la Fuerte Barato

membrana por
to con saponificación de los
álcalis lípidos

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 Rompimiento Celular
Métodos Mecánicos

Separación y Procesos
Biotecnológicos

MÉTODOS MECÁNICOS

Los métodos mec ánicos se pueden dividir en dos tipos :

Métodos a pequeña escala son :

•Ultrasonificación
•Molina con abrasivos
•Homogenizadores

Métodos a gran escala

•Homogenizadores a alta presión
•Molinos de bolas

Ambos son operaciones unitarias típicas de la Ingeniería de

Procesos y de la industria de alimentos.

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 MÉTODOS MECÁNICOS

Pequeña Escala

Desintegración completa de una célula

Para determinar el contenido de proteínas total de una célula se debe

realizar la desintegración total de ellas, para ello se utiliza la siguiente
metodología:
1. Se adicionan 1 volumen de bolas de vidrio
en un ependorf.
2. Se adiciona 1 volumen de las células a
desintegrar (en forma de pasta, previamente
separadas del caldo)

3. Se adiciona 0.5 volumen de buffer, se

puede adicionar algún detergente (SDS,
Triton X-100)

4. Se agitan fuertemente en un vortex, entre 2

y 5 minutos (controlando que no se caliente)
5. Se repite el punto 4 hasta asegurarse que no
se rompen más las células.
6. Se separan los desechos de la solución y se
analiza la concentración de proteínas.
100% Rompimiento

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 Ultrasonificación

Se utilizan frecuencias de 20 Khz esto produce vibraciones que provocan el

fenómeno de cavitación.
• Se producen zonas de baja presión en el líquido
• El líquido se transforma en gas formándose pequeñas burbujas
• Las burbujas colapsan debido a los cambios de presión.
• Se producen fuertes esfuerzos de corte en el líquido que rompen las
células.

Ultrasonicador

Molina con abrasivos

Procedimiento:
1. Se utilizan un recipiente donde se agrega algún agente abrasivo, como
bolas de vidrio.
2. El sistema se hace vibrar lo que produce:
• Colisiones de las bolas con la biomasa
• Fuertes esfuerzos de cortes
• Se produce la ruptura de las células.
3. Posteriormente, se separan las bolitas y desechos celulares y se
recupera el sobrenadate.

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 Homogenizadores

La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la ruptura de

las células. Los altos esfuerzos de corte se pueden obtener por:
1. Embolos
2. Cuchillas
3. Pistones

Émbolos Cuchillas Pistones

MÉTODOS MECÁNICOS

Gran Escala

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 Homogenizadores a alta presión
Son los equipos más ampliamente usado en el rompimiento
celular.
Resulta ser un método no selectivo
Se componen de:
• Pistón a alta presión
•Laboratorio 1-2
•Industria
•Válvulas
La suspensión que se procesa se hace pasar varias veces hasta
lograr el nivel de liberación deseado.

Descripción

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 Mecanismo

Las células se rompen cuando la suspensión pasa a alta presión

por la válvula de descarga. Las células son sometidas a :

• Turbulencia
• Cavitación
• Fuertes esfuerzos
de corte

Parámetros de Diseño

1. Presión de operación
2. Diseño de la válvula
3. Localización del Producto
4. Temperatura de operación
5. Número de Pasadas

1.- Presión de operación

Condiciones:
-A mayor presión mayor
liberación de proteínas.

-Siempre se trabaja P >30

Mpa
-La presión más usada es
55 MPa

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 2.- Tipo de Válvula

Las válvulas en forma de Cuchillas provocan mayor

turbulencia, lo que implica mayor Rompimiento

3.- Localización del Producto

Dependiendo donde se encuentre localizado el producto se

deberán aplicar diferentes condiciones para romper la célula,
por ejemplo:
• Si el producto se encuentra en la membrana, se
debe aplicar un menor esfuerzo.
• Si se encuentra dentro de un organelo, debe ser
mayor esfuerzo.

4.- Temperatura

La temperatura tiene un doble efecto, dado que ha mayor

temperatura:
• Se reduce la viscosidad, lo cual es positivo para el proceso
• Pero se puede denaturar el producto

SE DEBE BUSCAR UNA TEMPERATURA OPTIMA

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 5.- Número de Pasadas

A medida que aumenta el número de pasadas aumenta la proteína

liberada.

DISEÑ O DE UN HOMOGENIZADOR A ALTA PRESION

La cinética de desintegración de las células es de 1ª orden

respecto al número de pasos

dR
= k ( RM − R )
dN

R: Producto liberado luego de N pasos.

RM: Producto máximo que se podría liberar.
N: Número de pasos
k: Constante cinética f(T,P, tipo de válvula)
Generalmente
k = k* P a a= 2.9 Levaduras
a= 2.2 E.coli

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Integrando N =0 R=0
N=N R=R

RM
ln =k⋅N
RM − R

La ecuación de Diseño queda de la forma:

RM
ln = k* ⋅ P a ⋅ N
RM − R

SE DETERMINA EL NUMERO DE PASADAS PARA UN

NIVEL DE ROMPIMIENTO DADO

EJEMPLO 1
En la recuperación de β -galactosidasa de E.coli, se hace pasar
por un homogenizador de alta presión. La suspensión contiene
47,6 g/l en peso seco. La presión de operación utilizada fue
de 60 MPa.

La cantidad de proteína liberada después de cada paso se

presenta en la siguiente tabla

Paso % Recuperación

1 63.0
2 79.0
5 96.0
10 99.9

1. Estime el valor de la constante cinética de rompimiento.

2. Estime el número de pasos para liberar el 93% de la enzima.

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 ESCALAMIENTO

El escalamiento se hace en base al factor “Θ ” que se

define como:

Porcentaje de Proteína liberada

Θ=
Potencia Consumida

La Potencia consumida se determina como:

Potencia = F ⋅ P = N ⋅V ⋅ P
F: Caudal a tratar
V: Volumen a tratar por pasada
P: Presión

El porcentaje de proteína liberada se calcula como:

*100 = (1 − e − k⋅ P ⋅N ) *100
R
Porcentaje de Proteína Liberada =
a

RM

Luego

Θ=
(1 − e − k ⋅Pa ⋅ N
)*100
F ⋅P

Se puede encontrar la presión de operación óptima que

maximiza Q, para un número de pasadas dada:

dΘ d 2Θ
=0 <0
dP dP 2

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EJEMPLO 2
Células de Micrococcus son rotas, a 5º C, en un
homogenizador Manton-Gaulin que opera a presiones entre 200
y 550 kgf/cm2. Se han realizado experimentos en el equipo
obteniendo los diversos porcentajes de liberación de proteínas
en función del número de pasadas.

Tabla Nº2: Porcentaje de Rompimiento de Células

Nº Pasadas Presión
200 300 550
1 5 13.5 42
3 14 33.5 83
5 22 47.5 94.5

Si se necesita liberar el 80% de las células indique :

¿Que condiciones de Operación son más convenientes: trabajar

a una presión de 230 ó 430 (kgf/cm2)? .

Calentamiento

Como se señalo el proceso de rompimiento celular se produce

por una entrega de energía al sistema, esto provoca un
aumento de la temperatura el cual se puede determinar
mediante la siguiente relación:

Potencia = F ⋅ ρ ⋅C p ⋅ ∆T
Donde
ρ : Densidad
Cp: calor específico
DΤΤ : Aumento de temperatura

Ejemplo 3
Determine el aumento de temperatura si la presión en
el homogenizado es de 700 bar, la densidad 1100
kg/m3 y el calor específico 4000 J/kg K

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