El camino Shikimato – (Ruta del ácido shikímico)

Un árbol metabólico con muchas ramas

Ronald Bentley, Ph. D., D. Sc.

1. INTRODUCCIÓN
Los aminoácidos aromáticos, fenilalanina, tirosina y triptófano, están formados por una
secuencia de reacción que va desde el dos precursores de carbohidratos, D-eritrosa 4-fosfato y
fosfoenolpiruvato, a través de shikimato, a más pre-aromáticos y aromáticos compuestos.
Una ramificación de esta "vía shikimato" se produce después de la formación del corismato; de
hecho, el nombre de este compuesto (sugerido por una autoridad eclesiástica) se deriva del
griego, que significa “tenedor”. Una rama conduce al antranilato y, por tanto, al triptófano. La
otra rama conduce al prefenato, que, mediante una ramificación adicional, forma fenilalanina y
tirosina. Por consiguiente, la vía shikimato "clásica" puede representarse de la siguiente manera:

Desde el reconocimiento del corismate como intermedio en el camino, ha habido una tendencia a
considerarlo como el único punto de ramificación intermedio en la biosíntesis de compuestos
aromáticos. Así, un texto autorizado (1988) afirma que "El compuesto de ramificación para todos
estos productos diversos (es decir, los aminoácidos aromáticos, vitaminas E y K, ácido fólico,
ubiquinona y plastoquinona y ciertos quelantes de metales, tales como enteroquelina) es el
corismato”. Dado que dos de los compuestos mencionados (vitamina K y enteroquelina) se
ramifican de la vía del isocorismato, esta afirmación es engañosa; además, descuida la
importante vía de la tirosina a la ubiquinona en animales.

Ahora, es obvio que el camino shikimato no contiene uno, pero múltiples puntos de ramificación.
Como se explica en este documento, hay más ramas iniciales del isocorismato que del corismato,
y casi con certeza todos los intermedios de la vía funcionan como puntos de ramificación.
Además, una ruta alternativa a la fenilalanina y tirosina se ha descubierto a través de un erógeno.
Aún más ramificación tiene lugar cuando los aminoácidos aromáticos del “producto final” actúan
como precursores de innumerables metabolitos adicionales. De hecho, la biosíntesis de muchos
componentes aromáticos en varios organismos se logra no solo por un conjunto complejo de
rutas alternativas (es decir, ramas), sino por la organización de las actividades enzimáticas como
mono o poli funciónales polipéptidos, mediante la utilización de cofactores específicos en
reacciones de deshidrogenasa, y mediante sofisticados mecanismos reguladores, incluida la
compartimentación.

En 1979, Floss sugirió que, en vista del papel clave de

corismato (como entonces se percibía), la vía se llamaría más apropiadamente la "ruta del
corismato". Además, debido a el posterior descubrimiento del papel principal del isocorismato
y de otros puntos de ramificación, la adopción de este nombre habría sido contraproducente. Otro
posible nombre, "la ruta aromática”, es inapropiado ya que muchos compuestos aromáticos
se originan en el camino del policétido y el mevalonato; una complicación más de este nombre es
la formación de algunos compuestos (no aromáticos)
de ciclohexano por el camino.
A falta de un mejor nombre, parece mejor seguir refiriéndose a "el camino Shikimato".
El énfasis en el shikimato está en armonía con el hecho histórico de que se aisló por primera vez
hace más de un siglo de Illicium religiosum (anís japonés). Aunque el término "metabolito
secundario" no se había definido entonces, el shikimato fue por muchos años tratado como un
metabolito secundario típico que carece de función biológica. Cuando se reconoció su importante
papel, el shikimato se convirtió en uno de los pocos compuestos que cambió de metabolito
secundario oscuro, a uno de vital importancia, metabolito primario.

Dado que los humanos (y muchas otras especies) carecen de la capacidad para la biosíntesis
aromática, distinta de la aromatización del anillo de esteroides A, y desde que el funcionamiento
de la vía del shikimato en plantas y microrganismos produce nutrientes esenciales aminoácidos,
vitaminas y cofactores, esta vía asume una importancia primordial. A pesar de esta importancia
para la nutrición humana el “camino Shikimato” generalmente recibe poca atención en los textos
de bioquímica, microbiología y biología molecular.

Además, ha habido relativamente pocas revisiones orientadas de la vía shikimato general en los
últimos años. El texto clásico de Haslam, The Shikimte Pathway, publicado por primera vez en
1974, sigue siendo un libro de consulta muy útil. Se publicó otro libro, “The Biosynthesis of
Aromatic Compounds” (la biosíntesis de los componentes aromáticos) en 1980, pero cubre la
literatura sólo hasta aproximadamente 1973. Incluye gran parte del mismo material que el texto
de Haslam, y también describe las otras vías para la biosíntesis aromática. Documentos
presentado en un simposio de 1985 de The Phytochemical Society (la sociedad fotoquímica)
de América del Norte, y en particular capítulo interesante de Weiss recuerda los primeros
trabajos sobre el camino shikimato . Una revista de orientación química, Natural Product
Reports, (reportes de productos naturales) revisa la biosíntesis de los metabolitos de shikimato; la
revisión más reciente cubre material publicado hasta el final de 1987.

A la luz de las múltiples ramas del isocorismato, Los componentes del "tronco" básico del árbol
de la vía se amplían aquí para incluir este compuesto. Por lo tanto, una abreviatura forma del
tronco de la vía shikimate común, como en la actualidad entendido, es el siguiente (las flechas
verticales indican rama de posibilidades, generalmente múltiples):
El tronco del árbol está firmemente arraigado en el catabolismo de los carbohidratos, y hay dos
ramas principales, una para prefenar y el otro al isocorismato (véase también la Figura 1). Se le
da un significado cualitativo al isocorismato y al prefenato ya que, por un lado, el prefenato da
lugar a dos aminoácidos esenciales, y por otro, el isocorismato da lugar a factores esenciales
como la vitamina K y muchos importantes “sideróforos” quelantes del hierro.

Figura 1: El tronco principal de la vía SHK. Para mayor comodidad en la visualización de

relaciones entre átomos de carbono, DAHP se dibuja aquí como una cadena de cetona , aunque
reacciona como una disposición de piranosa. La frase, “El tronco común de shikimato", se utilizó
anteriormente

Cuando es posible, esta revisión ofrece una descripción detallada de

las enzimas y los mecanismos de reacción involucrados en el tronco del camino shikimato, y
enfatiza los artículos publicados después 1980. En otra sección se examinan los productos de la
rama derivados de los componentes del trunco. Mientras que, para los metabolitos del tronco
principal, el énfasis actual está en la estructura de los genes, nucleótidos y secuencias de
proteínas, sobreexpresión y purificación de enzimas y mecanismos de reacción, las reacciones de
ramificación son probremente caracterizadas, excepto en unos pocos casos (por ejemplo, los
aminoácidos aromáticos). Si bien los productos derivados de los "productos finales clásicos"
(fenilalanina, tirosina, triptófano) se consideran lógicamente como metabolitos de shikimato, una
descripción de todos estos materiales haría esta revisión excesivamente larga. Por ejemplo, se
estima que ahora hay alrededor de l000 cumarinas que se producen naturalmente, que se derivan,
al menos en parte, de la vía shikimato. Además, los diversos sistemas para transportar
aminoácidos aromáticos a las células de los microorganismos son no considerados, este tema ha
sido revisado.

La numeración "química" se utiliza para el shikimato y sus derivados, localizando así el doble
enlace del ciclohexeno entre átomos de carbono 1 y 2. En la literatura bioquímica anterior, este
enlace se numeró entre los carbonos 1 y 6. Dado que la numeración química es utilizada por el
Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica para nombrar la vía enzimas,
es lamentable que el sistema más antiguo todavía se utilice.
Los aminoácidos serán referidos por el estándar de tres letras
abreviaturas; a menos que se indique lo contrario, la configuración L
se pretende. Las siguientes abreviaturas se utilizan para el principal
tronco de la vía del shikimato: fosfoenolpiruvato, PEP;
D-eritrosa 4-fosfato, E4P; 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato, DAHF 3-
deshidroquinato, DHQ; 3-deshidroeshikimato, DHS; shikimato, SHK, shikimato 3-fosfato, S3P;
5-enolpymvil shikimate 3-fosfato, EPSP; corismato CHA;
isocorismato, ICHA; y prefenato, PPA. Este uso es ciertamente inconsistente en el sentido de que
shikimato es SHK, mientras que enderivados es S; evita, sin embargo, la longitud de EPSHKP
para 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato. Otros de uso general las abreviaturas son arogenato,
AGN; fenilpiruvato, PPY; 4- hidroxifenilpiruvato, HPP; quinate, QA (nuevamente inconsistente
ya que Q se usa en DHQ); y PP, pirofosfato. Otras abreviaturas utilizadas de forma limitada se
definen en secciones apropiadas.

Dado que la distinción entre sintetasa y sintasa ha sido abandonada, todas estas enzimas se
denominan sintasas.
Los siguientes organismos comunes siempre se mencionan en formas abreviadas: Aspergillus
nidulans, A. nidulans; Bacilo subtilis, B. subtilis; Escherichia coli. E. coli; Klebsiella moniae, K.
pneumoniae (en la literatura anterior, Aerobacter aerogenes); Neurospora crassa, N. crassa;
Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa; Saccharomyces cerevisiae, S. cerevisiae; y Salmonella
ryphirrturium, S. ryphimuriwn.

Varias síntesis químicas de compuestos de interés han se ha descrito recientemente. Además de

los que figuran en una lista completa para SHK y CHA,” se pueden señalar: metil
SHK; 12'4 metil SHK con etiqueta 2H a 6R o 6s; " metilo 4-
epi-SHK; 16 metil 5-epi-SHK; " ICHA; " metil 6S-fluoroSHK; I9 (Z) -9-metil-CHA.zo En las
figuras, estereoquímica en los centros quirales se indica mediante enlaces "discontinuos" (debajo
del avión de papel) y un enlace simple en lugar de una cuña (por encima del avion de papel). Los
grupos metilo generalmente se representan como una línea sin la adición de CH3, y de manera
similar, el CH2 se omite en representación de derivados de enolpiruvoilo.

II. EL TRONCO PRINCIPAL DEL CAMINO SHlKlMATO.

Aunque la formación de PPA e ICHA siempre implica los mismos intermedios químicos (ver
Figura 1), existe una variación considerable de un organismo a otro en la organización de las
enzimas participantes. En bacterias entéricas como E. coli, las primeras siete reacciones son
catalizadas por separado enzimas que se pueden purificar de forma independiente; la reacción,
CHA + PPA, es catalizada por una mutasa CHA asociada como enzima bifuncional con PPA
deshidratasa (que conduce aphe) o PPA deshidrogenasa (que conduce a tyr). Sin embargo, E. coli
se conocen mutantes sin las actividades de PPA. La conversión,CHA + ICHA, es catalizado por
una enzima separada que forma partede un operón policistrónico para la biosíntesis de
enterobactina. E. coli también muestra otra característica que se encuentra comúnmente, la
ocurrencia de algunas enzimas en formas isozimáticas (por ejemplo, DAHP sintasa).
Doce genes (ver Tabla 1), ampliamente dispersos en el cromosoma E.Coli, dirigen la síntesis de
las enzimas de E. coli.
Una situación muy diferente se encuentra en algunos hongos (A. nidulam, N. crassa), en S.
cerevisiae y otras levaduras, y en Euglena. En estos organismos, las reacciones segunda a sexta
son catalizados por un polipéptido pentafuncional, codificado por un gen estructural único. Así,
en N. crassa, el "complejo amm" consta de dos cadenas polipeptídicas idénticas con M, de
165.000. Además de la CHA mutasa-PPA deshidratasa bifuncional y CHA mutasa-PPA
deshidrogenasa, DAHP bifuncional. En algunos organismos se conocen las enzimas sintasa-CHA
mutasa y DHQ deshidratasa-SHK deshidrogenasa.

Una consideración particular en bioquímica vegetal es si cualquier enzima se encuentra en el

cloroplasto o en el citosol. La vía SHK para la biosíntesis de aminoácidos aromáticos es
normalmente asignado al compartimento del cloroplasto. En un reciente estudio detallado con
brotes de plántulas de guisantes jóvenes, el análisis de gradiente de densidad y la cromatografía
de intercambio aniónico de alto rendimiento establecieron que la DHQ deshidratasa, SHK
deshidrogenasa, y EPSP sintasa eran predominantemente cloroplásticos

El análisis de las preparaciones de cloroplasto lisado mostró que estaban presentes las primeras
seis enzimas de la vía SHK. Se concluyó que los cloroplastos “son un sitio importante para la
biosíntesis de los precursores comunes de los aminoácidos aromáticos "

Sin embargo, ha quedado claro que varias de las vías de las enzimas pueden detectarse como
formas isozimáticas en el citosol en muchas y quizás todas las plantas. La existencia de DAHP
citosólico sintasa (DAHP sintasa-Co2 +) y CHA mutasa citosólica sugirió que la sucesión
interviniente de enzimas también fue presente en el citosol. Es probable que una vía dual intacta
existe en el citosol y se ocupa de la biosíntesis de metabolitos secundarios, pero no de la
formación de aminoácidos aromáticos. La evidencia es más fuerte para DAHP sintasa y CHA
mutasa, y se conocen dos formas de antranilato sintasa. Los detalles son administrados en
conexión con enzimas individuales.

Muchas de las principales enzimas del tronco están presentes en bajas concentraciones en
organismos como E. coli, por lo que la purificación es difícil. Sin embargo, la tecnología de
ADN recombinante para la clonación de genes, (particularmente en E. coli), ha cambiado la
situación dramáticamente. Varias de las enzimas ahora están disponibles fácilmente en
cantidades mg, e incluso 100 mg. Además, al menos uno (EPSP sintasa de E. coli) se ha
cristalizado. Se espera que los estudios tridimensionales de estas importantes proteínas
pronto será posible. Dos enzimas para la biosíntesis de trp también han cristalizado y
determinadas estructuras tridimensionales.

La organización que se sigue aquí es para revisar las actividades enzimáticas separables primero,
seguido de una discusión de bifuncionales complejos. Una sección separada considera el
pentafuncional “aromáticos" complejos. Volumen 142 de Métodos en enzimología”
contiene mucha información útil sobre la purificación de varias de las enzimas, métodos de
ensayo y preparación del sustrato. No todas las enzimas de interés para los lectores de esta
presente revisión están cubiertas y, por supuesto, ha habido más desarrollos desde que se publicó
el volumen de la revista en 1987.
La regulación de la vía SHK ha sido ampliamente estudiada. Dado que hay varias revisiones de
este tema, los mecanismos reguladores se discuten aquí solo en términos generales, Algunos
artículos recientes cubren regulaciones generales aspectos para estos microorganismos:
Acholeplasma laylawii, Neisseria gonorrhoeae, P. aerugino, Anabaena variabilis, Pichia
guilliermondii, Nocardia meditteranei, ”Norcardia sp. 239. En plantas, artículos recientes se
refieren al tabaco callus en condiciones de formación de brotes y Cinchona succirubra.

A. 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato sintasa

El nombre recomendado de la enzima, EC 4.1.2.15, que forma 3-desoxi- ~ -arabino-

heptulosonato 7-fosfato (DAHP) de FAP y PEP, es fosfo-2-dehidro-3-desoxiheptonato
aldolasa. Debido al extenso nombre químico se le conoce a como DAHP sintasa. Las formas
reguladoras de la enzima, que se encuentran en diferentes organismos, se describen a
continuación:
(Las enzimas y genes de la sintasa de prefenato e isocorismato en E. coli)
(nombre de la enzima) tabla 1

Sintasa de DAHP
DAHP sintasa-tyr
DAHP sintasa-phe
DAHP sintasa-trp
3-deshidroquinato sintasa
3-deshidroquinato deshidratado
Shikimato deshidrogenasa
Quinasa shikimato
5-enolppvylshikimate 3-fosfato sintasa
Corismato sintasa
Corismato mutasa
Corismato mutasa-prefenato deshidratasa
Corismato mutasa-prefenato deshidrogenasa
Isocorismato sintasa

DAHP ~ ynthsse-0 alostéricamente insensible

DAHP Syntha ~ e-x Inhibido por X
DAHP sintasa-XCY)
DAHP sintasa-M2 +
Inhibido por X e Y, con X. (siendo el mas poderoso)
Estimulado por metal divalente, M2 +

Por lo tanto, DAHP sintasa-CHA (Trp) se refiere a un sujeto enzimático a la inhibición por
retroalimentación tanto por CHA como por trp, siendo CHA el inhibidor más fuerte.

La reacción procede con escisión C-0 en lugar de P-0 escisión (ver Figura 2), y Hz de PEP se
convierte en Hs en C-3 de DAHP. Tan recientemente como 1988, este patrón de escisión todavía
eradescrito como sorprendente y no entendido. Un mecanismo de reacción sugerido por Ganem
'postula la adición de una enzima -Grupo SH (E-SH) a PEP. Un paso clave para qué las analogías
quimicas disponibles es una migración del grupo E-S-, con una eliminación concomitante de
fosfato. El efecto de este paso es proporcionar un sustrato modificado con el grupo fosfato de
PEP reemplazado por E-S- (Figura 2).

El análogo Z-fluoro de PEP fue un sustrato alternativo para E. coli DAHP sintasa-Phe; el
producto era un 3-fluoro-DAHP, con configuración supuesta S. Análogos de fosfonato de E4P
(4-desoxi-D-eritro-teetrosa 4-fosfonato y 4,5-didesoxi-r> - eritro-pentosa 5-fosfonato) se
convirtieron en los correspondientes análogos de fosfonato u homofosfonato de DAHP
por E. coli DAHP ~ sintasa-Tyr. La DAHP sintasa de E. coli y otros microorganismos fue
inhibido por el compuesto de fosfonato, glifosato, un herbicida ampliamente utilizado.
En las levaduras, esta acción inhibidora fue específica para DAHP sintasa TYr, y en E. coli se
superó la inhibición del glifosato por CO2 +. La acción de este inhibidor sobre las DAHP
sintasas de plantas se analiza más adelante; para trabajar en su objetivo principal, Ver
Sección II.F.7.
FIGURA 2. Posible mecanismo de reacción de la DAHP sintasa. X = -COOH.
Reordenamientos conformacionales BTC mostrados por el símbolo de equivalencia, =.
Tenga en cuenta que la eliminación del ion fosfato proporciona el C-0 observado
escote. E-S = grupo sulfhídrico en la enzima. La estructura final de DAHP
se muestra en la conformación 4C 1 habitual.

1. Isoenzimas DAHP
Antes de discutir las propiedades de DAHP sintasas específicas, Es útil considerar las múltiples
formas de esta enzima. Como Se obtuvo información sobre la vía SHK(shikimato), se hizo
evidente que, como la primera de las enzimas del "tronco principal",
La DAHP sintasa era un objetivo probable para la regulación del flujo metabólico. En 1968, se
sabía que una variedad de tipos de inhibición por retroalimentación estuvo presente en varios
microorganismos. Por tanto, E. coli y S. cerevisiae contenían formas isoenzimáticas de
esta enzima que fueron inhibidas por los aminoácidos aromáticos.
Por otro lado, en B. subtilis había una sola enzima con inhibición por retroalimentación por CHA
y PPA. Además, en B. subtilis, DAHP sintasa y CHA mutasa formaron una proteína
multifuncional (Sección ILK).

El trabajo que se acaba de resumir brevemente es simplemente la punta del

iceberg. Ahora se sabe que esta enzima posee la mayornúmero de patrones reguladores
alostéricos descritos hasta ahora para cualquier proteína. Estos patrones tienen utilidad en
taxonomía ya que parecen delimitar taxones aproximadamente al nivel genérico, 'y
en algunos casos puede diferenciar aún más géneros. Los patrones de inhibición observados
incluyen la presencia de isoenzimas y patrones secuenciales, concertados, acumulativos y de
unimetabolito de inhibición por retroalimentación.

2. DAHP sintasas de E. coli

Las tres isoenzimas DAHP sintasa de E. coli están codificadas
por los genes aroF (DAHP sintasa-Tyr), aroG (DAHP sintasa-Phe) y aroH (DAHP sintasa-Trp).
Más detalles que se pueden proporcionar aquí están disponibles. Las actividades y tarifas de
síntesis de estas isoenzimas se ven afectada diferencialmente por los aminoácidos aromáticos;
por lo tanto, la célula puede cambiar tasas sintéticas rápidamente en respuesta a la disponibilidad
exógena de aminoácidos aromáticos. C NMR espectroscopia, utilizada como sonda no invasiva
para estudiar células completas de derivados de E. coli K 12, indicó que la inhibición por
retroalimentación de las isoenzimas de la DAHP sintasa es el principal mecanismo cuantitativo
para controlar el flujo de carbono en la vía SHK. 'aroF existe como un operón con
un componente regulador, tyrR; este operón ha sido discutido en detalle en otro lugar.

Se resumen las propiedades de las tres isoenzimas de E. coli en la Tabla 2. La DAHP sintasa-Trp
es solo un componente menor. Las dos isoenzimas principales son inestables en ausencia de PEP,
y ambas son proteínas que contienen Fez +. Todas las isoenzimas se han purificado hasta
homogeneidad y el gen ADN se han determinado las secuencias (Tabla 2). Las secuencias
muestran considerables áreas de homología. El aminoácido las homologías son (indicadas como
porcentajes) aroH, aroF, 48 aroG, aroF, 53 y aroH, aroGS7. Cuando se comparan los tres, (4 1%)
de los residuos son idénticos. El alto grado de similitud de la secuencia de las tres isoenzimas
sugiere un origen evolutivo común. La DAHP sintasa-Phe ha evolucionado más recientemente,
ya que está ausente de todos los demás miembros de las bacterias entéricas Gramnegativas que
contienen grupos. Todos los géneros de la familia de las enterobacterias contemporáneas poseen
este desarrolló DAHP sintasa-Phe además de las otras dos isoenzimas.

( a. Para todas las enzimas, se han determinado las secuencias de nucleótidos completas de
los genes y se han obtenido proteínas homogéneas.
b. Inestable en ausencia de PEP; conocido por contener Fe2 +)
strain = raza/ especie/cepa
gene= gen
native enzyme = enzima native

3. DAHP sintasas de otros microorganismos

Algunas investigaciones de la DAHP sintasa de otros microorganismos se resumen en la Tabla 3.
Los siguientes organismos no enumeradas allí muestran un patrón de tres isoenzimas:
K.pneumoniae, Aeromonas hydrophila y Alteromonas putrefacien. En el micoplasma,
Acholeplasma laylawii, estaba presente un DAHP- Tyr, pero la inhibición no aumentó con una
mayor concentración de tyr (43% de inhibición a 0,1 y 0,5 mM tyr); la actividad residual puede
deberse a la presencia de DAHP sintasa-0. La actividad general de la DAHP sintasa
fue estimulado de una manera dependiente de la concentración por trp.
Dos isoenzimas de la sintasa de DAHP (tyr y phe) presente en Anabaenu variabilis también
mostraron la característica inusual de la estimulación trp. 'Esta característica también se observó
con enzimas vegetales
(ver Sección II.A.4).

La DAHP sintasa juega un papel importante en una clasificación de organismos dependiendo de

si su metabolismo está orientado a la utilización eficiente de los materiales disponibles en el
medio ambiente, o si su metabolismo es más interno dirigido con productos finales (por ejemplo,
los aminoácidos aromáticos) hecho íntegramente por la célula. Organismos como las
cianobacterias dirigen la regulación de la vía SHK a la formación endógena de intermedios de la
vía inicial. Tales organismos "endo-orientados", entre otros, utilizan un patrón "asimétrico" para
el control del producto final de la DAHP sintasa; por tanto, las cianobacterias suelen tener
sintasas de DAHP del efector tipo único. En un organismo "exo-orientado", la maquinaria debe
responder de manera eficiente para utilizar esos aminoácidos aromáticos. que están disponibles
de forma exógena. Por tanto, en E. coli, las tres isoenzimas DAHP muestran un patrón de
inhibición "simétrico" por el cual cada isoenzima es inhibida por retroalimentación y también
reprimida por uno de los aminoácidos aromáticos. P. ueruginosa posee ambos tipos de regulación
(vía temprana y vía tardía). La ruta de la biosíntesis de phe vía PPY se asemeja a la de E. coli en
composición y regulación enzimática, mientras que la ruta no regulada de AGN se asemeja a la
de la regulación de la vía tardía en cianobacterias.

La historia evolutiva de las isoenzimas DAHP sintasa en un grupo filogenético de procariotas

("superfamilia B") que incluye E. coli e indica que los organismos más antiguos probablemente
poseían DAHP sintasa-0 y DAHP -Tyr. Los "dinosaurios" de esta super familia, conservando
esta ancestral característica isoenzima, son las especies Oceunospirillum minutulum y
Acinerobucter. Los probables eventos evolutivos más importantes fueron:

1. Evolución de la DAHP sintasa-0 no regulada a una isoenzima con sensibilidad a trp así como
sensibilidad débil a CHA, es decir, DAHP sintasa-0 - * DAHP sintasaTrp (CHA) (grupo I
Pseudomonas)
2. Conversión de DAHP sintasa-Trp (CHA) en DAHP sintasa-Trp.
3. La nueva aparición de una tercera isoenzima, DAHP sintasa Phe
4. Además de estos tres eventos importantes, un pequeño grupo
de organismos (grupo V Pseudomonuds y Lysobucter)
se formó por la pérdida de DAHP sintasa-Tyr y la evolución
de DAHP sintasa-Trp (CHA) a uno con una patrón inverso de sensibilidad, DAHP sintasa-CHA
(Trp)
Una distribución filogenética de las isoenzimas sintasa DAHP en 32 bacterias y 4 crías
bacterianas han sido descritas. Para más detalles de las relaciones evolutivas para la vía SHK,
Se deben consultar otros artículos de Jensen y sus colegas.

En S. cerevisiue, la DAHP sintasa-Phe está codificada por el Gen AR03 y DAHP sintasa-Tyr por
aro4. Se han obtenido cepas con una sola mutación aro3 y una doble aro3 aro4. El gen AR03 se
clonó en un fragmento de 1,9 kb; los niveles de DAHP sintasa de cepas con tales plásmidos
fueron aproximadamente 50 veces más altos que los de las cepas de tipo salvaje. El aro3 gen se
secuenció y codificó una proteína con 370 amino ácidos y Mr = 42,137.
Ambos genes de levadura respondieron igualmente bien al "Control general" de la biosíntesis de
aminoácidos ". La proteína activadora general de control, GCN4, es esencial para un nivel basal
de expresión del gen aro3 en S. LA cerevisiae cultivada en presencia de aminoácidos. Bajo la
inanición de aminoácidos, el gen AR03 es desreprimido a una tasa de transcripción más alta por
GCN4.

Para varios Streptomyces, la actividad de la DAHP sintasa fue, ya sea parcialmente inhibido por
trp o no, sufrió inhibición de cualquiera de los aminoácidos aromáticos. Estos organismos
aparentemente contienen una sola especie de enzima. La enzima de Nocurdiu mediterranea fue
inhibido por E4P; bajos niveles de inhibición se observaron con trp. Een Nocurdiu sp. 239, la
DAHP sintasa fue inhibida de forma acumulativa por los aminoácidos aromáticos. No se obtuvo
evidencia de la existencia de isoenzimas. Se obtuvo una preparación enzimática prácticamente
homogénea obtenido y se encontró que era un tetrámero de subunidades con aproximadamente
Mr = 41.000.
 (a. Abreviaturas: DS, DAHP synthsse; C. inhibición competitiva; CAROLINA DEL
NORTE. inhibición no competitiva; CU: inhibición no competitiva; wrt, con
respecto a; DTT,ditiotreitol.
(b. Esta cianobacteria autófica es un ejemplo de organismo "endoorientado".
(c. Este grupo incluye 0. bcijcrinckii, 0. man. 0. linum y 0. japonicwn.
d. Para la clasificación de las pseudomonas sobre la base de los mecanismos
biosintéticos de phe y tyr, véanse los Referencias 46, 47 y 64.
e. Algunos mutantes reguladores tienen un "DS-Tyr" que es completamente insensible a la
inhibición por retroalimentación por tyr, pero que todavía es inhibido por PPY.
f. Los genes de N. crassa son arom6, arom7 y arom8.)

4. DAHP sintasa en plantas

Aunque hace menos de una década parecía que las enzimas vegetales no mostraban patrones de
inhibición por los aminoácidos aromáticos o materiales como CHA y PPA, la situación ha
cambiado notablemente. No solo se reconocen ahora los patrones de inhibición, sino que hay
casos de activación. Además, en cuanto a las bacterias, el cuadro de la DAHP sintasa es
complejo y hay varias características que no se encuentran en las enzimas bacterianas. Una
generalización es que las DAHP sintasas vegetales parecen ser menos estables que las de las
bacterias; sin embargo, algunos de ellos se han purificado hasta la homogeneidad.

Gran parte del trabajo antes realizado con sintasas de DAHP vegetales, aproximadamente a 1985
probablemente necesite un nuevo examen experimental. Como se demuestra en este artículo, las
isoenzimas, DAHP sintasa-Co2 + y DAHP sintasa-Mn2 +, ahora se han claramente caracterizado.
Estas isoenzimas no solo difieren en ubicación celular y en mostrar diferentes respuestas a la luz
durante el crecimiento, pero las condiciones de ensayo para una isoenzima son también
completamente inapropiadas para el otro (pH óptimo, presencia de ditiotreitol). Por tanto, es
posible que en los primeros trabajos donde solo se describió un tipo de enzima, un segundo tipo
puede se han pasado por alto.

Las raíces de zanahoria contienen tres formas de actividad sintasa de DAHP,

nombrados como enzimas I, 11 y III. Mientras I y 11 permanecen relativamente
sin caracterizar, la enzima 111 se purificó 338 veces hasta homogeneidad electroforética. La
enzima nativa (M, = 103,000) era un dímero de subunidades (M, = 53.000). Esta enzima mostró
comportamiento histerético y fue activado por concentraciones fisiológicas de trp y en menor
medida por tyr. La enzima puede sufrir un cambio conformacional o un cambio en la subunidad
agregación facilitada por trp que es lenta en relación con la catálisis.
La activación de retroalimentación observada por trp se interpretó como una señal reguladora
temprana para la biosíntesis de polifenoles. Adicionalmente, Mn2 + enzima DAHP sintasa
activada, también sujeta a la activación por trp y tyr, se observó en extractos de células de
zanahoria cultivadas en cultivos en suspensión.

Estos efectos de activación con las enzimas de zanahoria contrastan con resultados reportados
para una DAHP sintasa altamente purificada (1000 veces) de flores de coliflor. Esta enzima
contenía un grupo AH esencial, requería Mn2 + y no estaba influenciada
ya sea por aminoácidos aromáticos o CHA y PPA.

En otros tejidos vegetales, los efectos inhibidores de los amino aromáticos se han observados. La
enzima de los brotes de Zea mays fue inhibida por trp, pero no por phe ni por tyr; compuestos de
tiol fueron necesarios para la actividad, Mn2 + era un activador y las formas isoenzimáticas no
fueron demostradas. Las preparaciones de DAHP sintasa de hojas de guisantes fueron inhibidas
por tyr; la inhibición fue revertida por phe y trp. Una preparación parcialmente purificada se
estimuló ligeramente (5%) por phe o trp. Quizás estaba presente en las preparaciones una enzima
insensible al producto final.

La DAHP sintasa de tubérculos de Solanum tuberosum purificada a homogeneidad

electroforética, se obtuvo como dos formas distinguibles con puntos isoeléctricos de 7.8 y 8.4.
Eso era un dímero con Mr = 110, OOO y mostraba comportamiento histérico. La enzima fue
estabilizada por ditiotreitol y estimulada por trp y Mn2 +. Otros metales divalentes como Fe, Zn,
Cu, eran fuertemente inhibitorios. En contraste con este trabajo, la presencia
de dos isoenzimas, DAHP sintasa-Co2 + y DAHP sintasaMn2 +, se ha establecido claramente en
un trabajo reciente con tubérculos de papa.

Varias de las DAHP sintasas vegetales recién descritas fueron estimuladas por Mn2 +.
Sin embargo, en frijol mungo (Vigna radiata) y tabaco (Nicotiana silvestris), estaban presentes
dos isoenzimas, una que respondía al Mn2 + y la otra al Co2 +. En
frijoles mungo, la DAHP sintasa-Co2 + tenía un requisito absoluto de un catión divalente, siendo
el Co2 + el más eficaz. La segunda isoenzima, DAHP sintasa-Mn2 +, no requiere Mn2 +, pero
fue estimulado por este metal. Cuanto mas estable La DAHP sintasa -Co2 + se purificó
parcialmente y se separó de las actividades acompañantes de fosfatasa y CHA mutasa. El
requisito de Co2 + fue parcialmente satisfecho por Mg2 + y Mn2 +. Esta isoenzima no fue
influenciada por intermedios de la vía SHK o por los aminoácidos aromáticos. sin embargo, el
metabolito secundario, el ácido cafeico, fue un inhibidor eficaz.

La DAHP sintasa-Mn2 +, que todavía estaba contaminada con considerable actividad fosfatasa,
estaba activa en ausencia de Mn2 +, pero 0.4 mM Mn2 + dio un aumento de 2,6 veces
en actividad. A diferencia de la enzima sensible al cobalto, había cuatro efectores alostéricos de
la enzima Mn. Los efectos inhibidores fueron observados con trp, PPA y AGN; CHA fue un
activador.
Este patrón complejo de regulación alostérica se interpretó como un mecanismo de control de la
inhibición de retroalimentación secuencial que gobierna el flujo de la vía general.

Se llevaron a cabo investigaciones detalladas de las isoenzimas de la DAHP sintasa en células

cultivadas de N. silvestris. Esta planta tiene una serie de ventajas técnicas, incluido el
crecimiento rápido en cultivos en suspensión. Las isoenzimas se separaron mediante
cromatografía de celulosa DEAE y tenían propiedades distintivamente diferentes además del
requisito de metal divalente. La enzima activada con Mnz + tenía un pH óptimo de 8.0 y requería
ditreotreitol; la activación por este material fue histerética. La enzima activada por Co2 + tenía
un pH óptimo de 8,6 y fue inhibida por ditiotreitol. Además, las dos isoenzimas se distinguieron
por sus ubicaciones celulares; la DAHP sintasaMn2 + se localizó en los cloroplastos, mientras
que la DAHP sintasaCo2 + se localizó en el citosol. La DAHP sintasa-Co2 + parcialmente
purificada (37 veces) de N. silvestris tenía M = 440.000.
Antes del reconocimiento de las dos isoenzimas, "DAHP sintasa" se informó que de Pisum
sativum ocurre en cloroplastos purificados en gradiente de densidad intacta.

No está claro de inmediato si la enzima estimulada por Co2 + está presente en la mayoría de los
tejidos vegetales. Esto es porque las mejores condiciones para el ensayo de esta enzima no son
óptimas para el DAHP sintasa-Mn2 + (diferentes pH óptimos y ditiotreitolrequisitos; consulte la
sección anterior). Por lo tanto, el Co2 + -enzima estimulada puede haberse pasado por alto en
algunos de los experimentos anteriores informados aquí. Observaciones preliminares
sugirió que la presencia de las dos isoenzimas es general en plantas; se notaron en espinacas,
coliflor y brócoli floretes y plántulas de soja, alfalfa, calabaza, trigo y
centeno. además de las plantas ya descritas.

Existen más complejidades para las sintasas de DAHP de plantas. Un informe preliminar muestra
que la DAHP sintasa-Mn2 + respondió a la luz durante el crecimiento de la planta. Por lo tanto,
cuando las plantas tratadas con luz y en oscuridad se comparan, la actividad del Mn2 + enzima
sensible aumenta 11 veces, por otro lado, la DAHP sintasa-Co2 + no se modificó bajo estas
condiciones ~.Otros trabajadores encontraron que herir el tejido de papa o el tomate induce
DAHP sintasa, con un aumento real de la cantidad de la enzima.92 Además, la actividad
específica de plastídica DAHP sintasa-Mn2 + en células de perejil cultivadas fue aumentado de 2
a 3 veces por una fracción de la pared celular del hongo Phytophthora megasperma; sin embargo,
la DAHP sintasa-Co2 + citosólica no se vio afectada. La regulación transcripcional fue
indicada ya que la actinomicina D o la cicloheximida impidieron la aumento de la actividad de la
DAHP sintasa-Mn2 +.

5. Acción del glifosato sobre las sintasas de DAHP vegetales

En 1982, se mostró la DAHP sintasa-Coz + de frijol mungo ser inhibido por el glifosato. Un
hallazgo importante fue que las dos isoenzimas de N silvestris se comportaron de manera
diferente con este inhibidor. La DAHP sintasa-Mn2 +, (localizada en cloroplastos) era resistente
a la inhibición del glifosato, mientras que la DAHP se inhibió la sintasa-Co2 + (ubicada en el
citosol). Las observaciones espectrofotométricas proporcionaron evidencia de la formación de
un complejo de cobalto (II): glifosato con propiedades electrónicas compatibles con la
coordinación octaédrica.

Con células de Solanum tuberosum cultivadas en cultivo en suspensión, los niveles de DAHP
sintasa variaron durante el ciclo de crecimiento. La actividad específica aumentó hasta el día 15
(a la mitad la fase de crecimiento lineal) y posteriormente disminuyó. Si el glifosato
se añadió al medio de cultivo de células cultivadas durante 9 dias, hubo un aumento en la
actividad específica de la DAHP sintasa.
Aunque el glifosato causó esta inducción en vivo de la actividad de DAHP sintasa, no hubo
efecto sobre la enzima en experimentos in vitro. El aumento se debió al aumento de la cantidad
de la enzima, probablemente como resultado de la nueva síntesis de proteína inducida. La posible
presencia de co2+ - y Mn2 + -isoenzimas dependientes no se estudiaron en este trabajo. Un
aumento similar en los niveles de DAHP sintasa se informaron cuando un fármaco tolerante al
glifosato de línea celular Nicotiana tubacum se cultivó en ausencia de
glifosato.

La disponibilidad en el cloroplasto de los dos subestados requeridos por la DAHP sintasa es

motivo de preocupación. Como intermedio del ciclo de Calvin-Bassham, E4P se puede obtener
directamente en el cloroplasto por fotosíntesis. Sin embargo, CO2 fue solo mal incorporada en
aminoácidos aromáticos cuando cloroplastos de espinaca intactos altamente purificados fueron
examinados, la adición de fosfoglicerato mutasa y enolasa al medio de incubación produjo un
aumento de 10 veces de la fijación de CO2 en phe y tyr, sugiriendo la ausencia de estas enzimas
del cloroplasto.
Por lo tanto, la PEP, el otro sustrato de la DAHP sintasa, probablemente fue sintetizado en el
citoplasma y luego importado al cloroplasto. Más recientemente, los cloroplastos de espinaca
intactos fueron demostrando poseer la siguiente capacidad efectiva, pero baja,
vía para la síntesis de PEP y piruvato después de la fijación de C02.

El paso limitante fue probablemente la mutasa de fosfoglicerato de cloroplasto.

6. 3-deshidroquinato sintasa
Esta enzima (EC 4.6.1.3) que forma DHQ, formalmente denominada
7-fosfo-3-desoxi- d-arabino-heptulosonato fosfato liasa,
se abrevia como DHQ sintasa. La enzima generalmente se supone que requiere Co2 y la enzima
homogénea de una cepa de sobreexpresión de E. coli contenía 1 mol de Co 2+ fuertemente unido.
En incubación con actividad enzimática EDTA se perdió rápidamente y se formó una proteína
estable pero inactiva. La presencia del sustrato DAHP evitó esta inactivación.
Co 2+ restauró la actividad completa y la actividad parcial (aproximadamente 50%) por Zn2 +.
En base a su mayor biodisponibilidad, se propuso que Zn2 + era el metal divalente funcional real
in vivo. Zn2 + también se unió a una segunda afinidad más baja del sitio inhibitorio.
Interesantemente, la proteína arom de N. crassa también tiene un requisito de Zn2 + (consulte la
Sección II. L).

La conversión de DAHP a DHQ requiere una considerable química, específicamente oxidación,

p-eliminación, reducción y finalmente una condensación aldólica intramolecular, de hecho,
Los detalles mecanicistas de la transformacin reflejan tanta manipulación funcional del grupo y
destreza estereoquímica por parte de la enzima. ”10 'Un aspecto de la manipulación inteligente es
que el grupo 4HOH en C-5 de DAHP está temporalmente oxidado a 44 para facilitar la
eliminación de protones y luego la eliminación de fosfato. Después de la eliminación de fosfato,
la cetona es reducido, produciendo el grupo 4HOH de DHQ con el mismo
configuración tal como estaba presente originalmente. Dado que el grupo fosfato C-7 debe
eliminarse, es probable que intervenga un enol. Por tanto, la reacción se puede representar como
una primera aproximación por la secuencia de la Figura 3. Esta secuencia indica que el
la reacción invierte la configuración en C-7 de DAHP.

NAD es el cofactor de los procesos de oxidación-reducción y la enzima purificada se une a 1 mol

de NAD +. Disociación de NAD de la holoenzima es un proceso complejo. Incluso en
la presencia de DAHP, los análogos de NAD pueden unirse con alta afinidad. A menos que se
utilice NAD de alta pureza, la actividad catalítica puede perderse como resultado de la presencia
de impurezas no identificadas que funcionan como inhibidores
Aunque DAHP se mostró en la Figura 3 en una cadena lineal conformación, es probable la
participación de una forma de piranosa.
La reacción de DAHP con 4-hidrminobenzoato prosiguió con una pequeña ráfaga
(correspondiente a sólo el 0,3% de la absorbancia final) y luego continuó lentamente con
cinéticas de primer orden, lo que sugiere que más del 99% de la DAHP era piranoide ”. Además,
la 2-desoxi DAHP sintética (Figura 4A, R = H ) era un sustrato para la DHQ sintasa (la enzima
utilizada era un material homogéneo de una cepa de E. coli sobreproductora- vaya a la última
sección). Sin el grupo -OH en C-2, este análogo no puede someterse a la piranosa > cadena
lineal isomerización de cetona. Se eliminó el fosfato de este sustrato, siendo el producto un éter
em1 (Figura 4B, R = H). Por lo tanto, con este análogo de sustrato sintético, la enzima
aparentemente catalizó los primeros tres pasos de la reacción normal: oxidación,
eliminación, reducción.

FIGURA 3. Mecanismo de reacción simplificado para la DHQ sintasa. Para el paso 1,

NAD+ se convierte en NADH, el proceso inverso ocurre en el paso 2.

FIGURA 4. Acción de la DHQ sintasa sobre 2-desoxi-DAHP (A, R = H).

FIGURA 5. Intento de síntesis del intermedio de enolpiranosa, B, para DHQ
sintasa. En A, R = -CH && - N02. Paso 1, fotólisis a 0 ° C; paso 2,
reacción espontánea.

Por analogía, era razonable postular una enol piranosa (Figura 4B, R = OH) como el intermedio
real formado a partir de el propio DAHP. Un intento de síntesis de la enol piranosa
(Figura 4B, R = OH y Figura 5B) por irradiación fotoquímica (a 0 ° C) del correspondiente o-
nitrobencilcetal (Figura 5A) dio solo DHQ. Mientras que algunos intermedios fueron
observado por reacción a temperaturas más bajas, ninguno de ellos predominó antes de la
formación de DHQ. Por tanto, la conversión de la enol piranosa (Figura 5B) en DHQ fue al
menos tan rápida como los pasos implicados en la eliminación del grupo o-nitrobencilo. Dado
que la conversión espontánea del enof piranosa en DHQ fue tan rápida, la catálisis real por la
DHQ sintasa probablemente concluyó con este intermedio; en este caso, el afd de ciclización no
fue enzimático.

Fotólisis del cetal de o-nitrobencilo, marcado con 'H en l a posición Z en C-7, dio lugar a (2R) -
[2-2H] -DHQ (Figura 5).
Esto era consistente con la conversión conocida del 7-HR protón de DAHP al protón 2-HR de
DHQ (inversión de configuración), asumiendo que la eliminación de fosfato fue syn. Evidencia
de la estereoquímica syn de la eliminación de fosfato se obtuvo con 2-desoxi-DAHP marcado
con 'H en C-7 (S configuración) (consulte la Figura 6A). Después de la conversión del producto
enólico (Figura 6B) en la cetona bicíclica (Figura 6C), el análisis de RMN indicó que el H estaba
en la posición E.
Más información sobre el posible estado de transición para la condensación aldólica se obtuvo
considerando la estereoquímica general para la eliminación de sin. Como ya se señaló, durante la
conversión de DAHP a DHQ, la configuración C-7 de DAHP sufre una inversión. Para satisfacer
estas dos observaciones (eliminación de syn, inversión general), lo más probable posibilidad era
un estado de transición similar a una silla. Se puede obtener mediante una rotación de 180
"alrededor del enlace entre C-5 y C-6. Este también parece probable ya que la conformación
preferida para DHQ es una estructura de silla. El doble enlace C-6 a C-7 se suma a la revestida
del enlace C = 0 en C-2 desde arriba. El panorama general para las reacciones complejas
catalizadas por la DHQ sintasa se muestra en la Figura 7. Los pasos enzimáticos conducen a C
intermedio (Figura7), que avanza más, probablemente por catalizadores no enzimáticos
paso, al propio DHQ.
FIGURA 6. Evidencia de la estereoquímica syn en la reacción de la DHQ sintasa.
E-B = enzima con grupo básico, B. El sustrato, A, es 2-desoxi-DAHP con
(S 2H) en C-7. La estereoquímica general de sincronización se visualiza más fácilmente mediante
la reacción simplificada, A >> B, que se muestra en la parte superior de la figura.

FIGURA 7. Posible mecanismo general de acción de la DHQ sintasa. Nota

que en el paso final, la suma ocurre desde arriba del plano del C==0.
En la Figura 7, se postuló un grupo básico de la enzima, E-B-, para la desprotonación en C-6.
Sobre la base del trabajo con análogos de fosfonato carbacíclico de DAHP, ahora parece que
no se requiere un grupo enzimático y, en cambio, el grupo de fosfato de DAHP en sí mismo
funciona como base. Los análogos fueron los compuestos A y B de homofosfonato (isostérico
con DAHP) y fosfonato (Figura 8), y dos compuestos insaturados (Figura 8C y D). Mientras que
la oxidación en C-5 e intercambio de protones en C-6 (usando el sistema de numeración de
piranosa) fueron posibilidades teóricas con estos análogos, la reacción de eliminación de fosfato
catalizada por DHQ sintasa no podría completarse (fosfonato presente, no fosfato). Los
resultados de estos experimentos, utilizando una preparación de DHQ sintasa de
E. coli, fueron los siguientes:

(a.'Este es el mejor inhibidor descubierto hasta ahora para esta enzima, Ki,
aproximadamente 0,8 nM.)
A = Se une tan bien como DAHF "
B= Se une muy fuerte
C= Se une mejor que A
D= Se une débilmente.
C6(intercambio de protón)
FIGURA 8. Análogos de fosfonato carbacíclico y homofosfonato de DAHP.
Una versión modificada de la posibilidad de desprotonación, que se muestra en la Figura 7
como que involucra un grupo enzimático, también se dibuja aquí como E >> F.

Estas observaciones implicaron un papel crucial para el posicionamiento del grupo fosfonato. En
particular, solo intercambio de protones ocurrido en las dos estructuras (Figura 8A y C) donde un
oxígeno del fosfonato estaba cerca del protón C-6. En otras palabras, la base responsable de la
abstracción de protones era un oxígeno del grupo fosfonato. Por extrapolación, parecía que, con
el sustrato real, DAHP, el fosfato grupo jugó un papel similar. De ahí el segundo paso de
reacción, mostrado anteriormente como Figura 7, A >> B, podría postularse como
Figura 8, E >> F. Las características atractivas de esta propuesta incluyen:

1. La enzima explota una de las bases más fuertes disponibles en el pH fisiológico, a saber -
𝑂𝑃𝑂#$ .

2. La enzima evita la eliminación del C-6 hidrógeno ubicado axialmente en un centro terciario,
que está en un 1,3-diaxial situación con el grupo C-2 OH axial.
3. La desprotonación produce un mejor grupo saliente para la posterior eliminación de fosfato.

Si esta propuesta y la que sugiere que la conversión de la enolpiranosa, Figura 7C, en DHQ no es
enzimática, son correctas, el trabajo real que se requiere de la enzima se simplifica enormemente.
Los números de grupos catalíticos requeridos se vuelve razonable y qué en un principio apareció
como un mecanismo complejo que es ingeniosamente simple.
Aparte de unir sustrato, metal, NAD + y posiblemente estados de transición, todo lo que se
requiere de la catálisis enzimática es la oxidación. y reducción. La enzima ha sido descrita como
"una oveja en ropa de lobo”. El uso de los análogos de sustrato mencionados aquí y otros para
dilucidar los pasos tempranos y tardíos de los mecanismos de reacción de la DHQ sintasa se ha
informado recientemente en detalle. Mientras la racionalización de la química aparentemente
compleja es un logro importante, se advierte a los investigadores que existe un dilema: ¿cómo
pueden todos los grupos catalíticos necesarios, NAD +, y un catión divalente ser ensamblados en
un solo sitio activo?
La química elegantemente racional impone aparentemente imposibles demandas estructurales en
la proteína.
Se obtuvo un resultado interesante con un análogo carbacíclico de DAHP que contiene el grupo
fosfato normal (Figura 9A). Este material fue un precursor potencial de un análogo (Figura
9B) del intermedio de reacción (Figura 9C). Mientras lo hizo funcionar como un inhibidor’”, en
la incubación con enzima en la ausencia de DAHP se convirtió en el compuesto D (Figura
9). fue consistente con la teoría general recién esbozada y con la utilización del anómero 𝞪 de
DAHP.
Los análogos de flúor C-3 de DAHP se convirtieron mediante una combinación de DHQ sintasa
y DHQ deshidratasa de E. coli a 6-fluoro-DHS (Figura 10). Estos análogos fueron preparados
químicamente, o enzimáticamente de la reacción de Z fluoro fosfoenolpiruvato y E4P.

Análogos de fosfonato carbacíclico de DAHP (incluido el inhibidor más poderoso hasta ahora
descubierto, estructura B, Figura8), se discutieron previamente en relación con la reacción
Del mecanismo de la DHQ sintasa. Anteriormente, se habían examinado análogos de fosfonato y
homofosfonato con la estructura del anillo de piranosa y se afirmó que tanto A como B de la
Figura 11, inhiben la sintasa DHQ de E. coli ”. La Reexaminación con sintasa DHQ de E. coli
homogénea y un método de ensayo directo, indicó que A era un inhibidor competitivo, pero que
B era sin efecto.

FIGURA 9. Utilización de un análogo carbacíclico de DAHF, A, por la DHQ sintasa.

FIGURA 10. Conversión de 3-fluoro-DAHP en 6-fluoro-DHS por la acción de unión de la

DHQ sintasa y la DHQ deshidratasa. Se muestra la reacción para el diastereoisómero 3R,
3F de 3-fluoro-DAHP, el producto, B, es 6S6F -DHS. El diastereoisómero 3-S se comportó
de manera similar.
FIGURA 11. Análogos de Fy-ranosa para la DHQ sintasa. A y B, respectivamente,
son las estructuras de fosfonato y homofosfonato correspondientes a DAHP
sí mismo. C y D son análogos de "anhidrofosfonato" y E y F son análogos de
"anhidrofosfato".

Las estructuras de piranosa que carecen del grupo C-2 OH también tienen examinado. Tres
materiales, Figura 1 lD, E y F fueron inhibidores competitivos de E. coli DHQ sintasa, y C fue
sin acción. La acción inhibidora de la Figura 11E (Ki = 193 uM) fue significativamente menor
que el de F (Ki = 33 uM). Los compuestos A y D de la Figura 11 fueron inhibidores
competitivos a una DHQ sintasa parcialmente purificada de plántulas de guisantes y Figura
11B y C quedaron sin acción.
Se investigó la acción del fosfonato no isostérico, Figura 11 A, en el tratamiento postemergente
de plántulas de Pisum sativum, Echimchloa crusgalli, Setaria viridis, Sorghum hulepense y
Avenu fazua. Con la excepción de E. crusgalli, todas las plantas mostraron una acumulación
cuádruple de DAHP desfosforada (DAH) y se produjo decoloración y desecación del tejido
vegetal. Estos “efectos visuales” fueron los menores para P. sativum. La DHQ sintasa también es
inhibida por el compuesto de fosfonato, glifosato.

1. DHQ sintasas de bacterias y plantas

La DHQ sintasa monofuncional de E. coli ha sido purificado hasta la homogeneidad por varios
trabajadores. Una purificación temprana (2840 veces) hasta la homogeneidad indicó Mr =
57.000. Este valor ahora parece demasiado alto.
Más recientemente, se obtuvo una purificación de 9000 veces de E. coli K12 de tipo salvaje
(cepa MM 294), pero la preparación no fue homogénea. La tecnología de ADN recombinante fue
por lo tanto, utilizada para producir una cepa (E. coli JB12 [pLC29-47])
con un aumento de 20 veces en la actividad de la DHQ sintasa en crudo lisados.
Una purificación de 550 veces produjo casi 2 mg de casi enzima homogénea de 19 g de células.
Además, por insertar el gen aroB de pLC29-47 detrás de un promotor Tac en el plásmido
pKK223-3, se aisló un subclon pJB 14 y insertado en E. coli RB791. El transformante, E. coli
RB79l (pJB 14), cuando se indujo con isopropil p-D-tiO-gUlacto-piranósido, produjo casi 1000
veces el rendimiento de la cepa de tipo salvaje. A partir de lisados de esta cepa, DHQ
homogéneo se obtuvo mediante sólo dos pasos cromatográficos.
Se pudieron obtener más de 100 mg de enzima homogéneas de 50 g de células. El Mr de esta
preparación fue de 40.000 a 44,000.
También se preparó DHQ sintasa homogénea a partir de E. coli AB2826pGM107.La secuencia
de aminoácidos de 362 residuos fue determinada por un nucleótido combinado y amino directo
estrategia de secuenciación ácida. El Mr calculado de 38,880 concuerda bien con lo determinado
por Frost et al.
Una preparación electroforéticamente homogénea de DHQ vegetal sintasa se obtuvo de plántulas
de Phuseolus mungo (4400-veces la purificación de una fracción de extracto de sulfato de
amonio de un crudo). La preparación contenía pequeñas cantidades de Cu2+. Eso estaba activo
sin más adiciones de metales, pero fue estimulado tanto por Co 2+ como por Cu2 +. El Mr fue
67.000 (Sephadex G100) y el M mínimo fue 43.000 (electroforesis en gel SDS). '' La DHQ
sintasa también se ha purificado (4900 veces) de plántulas de guisantes; la preparación no era
homogénea en condiciones de desnaturalización. La enzima nativa tenía Mr = 66,000
por cromatografía de exclusión por tamaño y aparentemente era un dímero (subunidad Mr =
33.000).

2. Preparación de DAHP
Muchos de los intermedios de la vía SHK no son fácilmente accesibles, y DAHP no es una
excepción. Ha sido obtenido de organismos que carecen de DHQ sintasa como E. coli AB2847A
(aroB-). Se obtuvieron rendimientos algo mejores de E. coli
JB-5, pero estos no podrían incrementarse mediante la transformación con un plásmido
multicopia (pKB-45) que codifica la sintasa de DAHP- Tyr.

Se ha realizado una comparación detallada de vario métodos químicos y microbiológicos. Para

producir DAHP como sustrato, la ruta microbiológica es probablemente la mejor. Por
crecimiento de E. coli JB-5 en condiciones definidas (crecimiento inicial en un
medio rico, seguido de la transferencia a un medio mínimo), el rendimiento combinado de
DAHP y DAH es 342 umol / 108 células (la densidad celular es 10,5 x 108/1). Las cantidades de
DAH producidas microbiológicamente en E. coli JB-5 y AB2847 son cinco a seis veces mayor
que DAHP. Para producir análogos de DAHP de sustrato, Se recomienda la síntesis química.

Las enzimas inmovilizadas se han ensamblado en un "reactor"

para síntesis de DAHP. El arreglo requería fructosa y PEP como "sustratos" y cuatro enzimas
inmovilizadas (hexoquinasa, piruvato cinasa, transcetolasa y DAHP sintasa). El rendimiento de
DAHP "impecablemente puro" fue del 85% en base a la fructosa. Otro enfoque enzimático para
la síntesis de DAHP utilizó aldolasa para catalizar la formación de enlaces C-4 a C-5 con la
estereoquímica correcta. Desafortunadamente, mucha manipulación química fue requerida y
varias purificaciones cromatografías. El 95% del producto puro era menos activo como sustrato
de sintasa DHQ que DAHP auténtico y probablemente contenía un inhibidor.
Dos síntesis químicas recientes de DAH (o su éster) han logrado a partir de D-arabinosa con
grupos -OH protegidos por ya sea acetona o ciclohexanona. DAH producidos química o
microbiológicamente también se pueden convertir químicamente a DAHP después de la
formación de metil (metil 1-3desoxi-D-urubino-heptu1opiranosid) onato. Este último compuesto
está hecho disponible por síntesis química.

C. 3-deshidroquinato deshidratasa
La enzima EC 4.2.1.10 convierte DHQ en DHS. Está, por tanto, responsable de iniciar el proceso
de aromatización, introduciendo el primero de tres dobles enlaces. Aunque a menudo
denominada 3-deshidroquinasa, el nombre recomendado es 3-deshidroquinato deshidratasa,
abreviado aquí como DHQ deshidratasa.

La reacción es una de las relativamente pocas deshidrataciones enzimáticas conocidas que

procede con una eliminación syn (cis) de elementos de agua (ver Figura 12). Considerando la syn
estereoquímica observada, se propuso que los componentes H + y OH se eliminaran en pasos
separados. El protón se elimina primero y se forma un carbanión intermedio y
estabilizado como formas de resonancia. 12 ’Desde NaBH., Inactiva el
enzima en presencia (pero no en ausencia) de DHQ, el sustrato puede unirse covalentemente a la
enzima a través de un residuo lys.
Además, la inhibición por el dietilpirocarbonato dirigido por sugirió que una cadena lateral de
imidazol llevó a cabo la desprotonación. Este residuo, conocido como B-H +, también podría
estar involucrado en la expulsión del ion hidroxilo (ver Figura 12).

Una conformación de barco sesgado proporciona la mejor posibilidad espacial para la expulsión
del protón HR en C-2, ya que coloca a HR en una disposición axial. Esta posibilidad se vio
reforzada por el hecho de que el derivado de isopropilideno, Figura 13A, era un sustrato para la
DHQ deshidratasa; arreglos conformacionales con HR axial, que no sea el barco de inclinación
(Figura 13B), son imposible para este substrato. La secuencia, C >>D >>E de la Figura 13,
parece probable que represente la conformación posibilidades de la reacción de DHQ
deshidratasa.

Tres análogos de sustrato, con grupos funcionales reactivos, se examinaron como inhibidores
irreversibles de DHQ dehidratasa. Se sugirió un residuo de lys como un sitio de unión para la
-C00- grupo; el análogo, A, Figura 14, con un con un grupo clorometil cetona fue inhibidor,
posiblemente por la alquilación de la supuesta lys. El análogo B, pero no C, Figura 14, también
fue inhibitorio como una etiqueta de fotoafinidad que sugiere un posible papel para un sitio C-4
OH.

En un intento de "etiquetar" el grupo básico del sitio activo (presumiblemente suyo, como ya se
señaló), el epóxido racémico (Figura 14D), fue encontrado para ser inhibitorio. Aunque la
cuestión de la especificidad enantiomérica no se resolvió, el mecanismo que se muestra en la
Figura 14 (E>> F) se propuso para tener en cuenta la inhibición observada. Las estructuras
mostradas presumiblemente se eligieron para acomodar la probabilidad de que el grupo básico
esté ubicado en el sitio activo debajo del plano del anillo de ciclohexanona. Esta
da como resultado la configuración C-2 del producto D, Figura 14, siendo el inverso al del
sustrato habitual. Claramente, es deseable trabajar más en el inhibidor de epóxido.
FIGURA 12. Mecanismos de reacción de la DHQ deshidratasa. (Línea 1) la
eliminación general sincrónica de los elementos del agua. (Línea 2) Posible mecanismo
para la eliminación de protones por su residuo de enzima (E) con formación de base de
Schiff por un residuo de lys (E-lys). Tenga en cuenta la posibilidad de estabilización por
resonancia del Carbanion intensificado como A c * B. (Línea 3) Posible mecanismo de
eliminación de hidroxilo del intermedio A.

FIGURA 13. Posibilidades de conformación para sustratos de DHQ deshidratasa.

A >> B representa el cambio conformacional del derivado de isopropilideno
de DHQ. C > D > E es un posible mecanismo de reacción con DHQ como sustrato
unido a la enzima a través de un residuo de lys. En la estructura D, movimiento del
solitario par de electrones del nitrógeno se ha dejado fuera debido a limitaciones de
espacio.
FIGURA 14. Sustratos análogos de DHQ deshidratasa. Todos los compuestos
fueron examinados en forma racémica

En E. coli, esta enzima monofuncional está codificada por el gen aroD, que ha sido localizado y
secuenciado con precisión.
En un inserto Cla 1 de 1.8 kb en el plásmido pKD201, el aroD, la secuencia comenzó con ATG
(met) en la posición 703 y terminó con un codón TGA (parada) en la posición 1423. La enzima
nativa era un dímero y el monómero tenía 240 aminoácidos; la secuencia predicha fue
confirmada por el análisis N-terminal de los primeros 17 residuos de aminoácidos. La enzima se
purificó hasta homogeneidad (4000 veces, 19%) a partir de E. coli de tipo salvaje. Sin embargo,
se obtuvo un rendimiento mayor (7 mg de 20 g de células) de la cepa sobreproductora de E. coli
AB 2848 / pKD201. En plántulas de guisantes, DHQ deshidratasa está presente en cloroplastos
intactos y plastidios radiculares.

D. Shikimato deshidrogenasa
Aunque a menudo se denomina shikimato oxido-reductasa (SHORasa), parece más apropiado
utilizar SHK deshidrogenasa; este es el nombre recomendado por la Comisión de Enzimas para
EC 1.1.1.25 (shikimato: NADP + oxido-reductasa). Esta deshidrogenasa convierte la DHS en
SHK mediante una reacción sencilla que utiliza el protón HA de NADPH (ver Figura 1).

1. Monofuncional SHK Dehydmgenase de E. coil

Una purificación de 20.000 veces a partir de E. coli ATCC de tipo salvaje
14948 produjo material electroforéticamente homogéneo. La SHK deshidrogenasa era algo
inusual por ser monomérica. Una purificación a gran escala (10,5 mg homogéneos
enzima de 20 g de células) se llevó a cabo con un E. coli cepa (AB2834 / pZA321) que contiene
el ORF aroE bajo el control del promotor tac en el vector de expresión pKK223-3.
Se secuenció el gen aroE y en un ORF de 846 pb
fue identificado. La secuencia asignada coincidió con el parcial
secuencia de aminoácidos determinada en la enzima pura (la primera se determinó de forma
inequívoca 30 residuos de aminoácidos). Curiosamente, la "huella digital" de aminoácidos (29 a
31 residuos gobernada por un conjunto de 11 reglas) característica de un pliegue de ADP
vinculante en 𝞫𝞪𝞫, estaba presente entre los residuos 121 y 151. Este pliegue era probablemente
el sitio de unión de NADP +.

La enzima E. coli redujo otras tres cetonas. El enantiómero S del análogo 5-desoxi racémico
(Figura 15A) fue un sustrato excelente (Kcat = 75 S-1) en comparación con DHS
(Kcat = 100 S-1). El enantiómero R (Figura 15B) también fue reducido, pero muy lentamente. El
análogo aquiral que carece de ambos grupos de OH, Figura 15C, y el enantiómero S del
compuesto dihidrodidesoxi, Figura 15D, también se redujeron lentamente. En en todos los casos,
la configuración del C-3 -OH recién formado grupo correspondía al de SHK mismo. La
presencia de un C-4 -OH, pero no un C-5 -OH es importante para esta enzima,
y la formación del complejo sustrato de enzimas puede implicar el enlace de hidrógeno con el C-
4-OH. La enzima es enantioselectiva con respecto a los sustratos racémicos, con preferencia por
la configuración S en C-1 y C-4.

2. Enzimas vegetales
La siguiente información se refiere a las enzimas descritas simplemente como SHK
deshidrogenasas: DHQ deshidratasa bifuncional Las deshidrogenasas SHK están presentes en
plantas como la espinaca, plántulas de guisantes y maíz (Sección II.J.4).

FIGURA 15. Análogos de sustrato de SHK deshidrogenasa. No hubo reducción del (R)
dihidrodidesoxi compuesto E.

Una purificación parcial de SHK deshidrogenasa de tomate fruto producido, en cromatografía de

hidroxiapatita, evidencia de dos isoenzimas (tales isoenzimas se han descrito anteriormente en
otras preparaciones de plantas ^). La fracción principal (purificación 1 1,5 veces) no era
homogénea; se estimó que el Mr era 73.000. Entre una serie de compuestos, solo protocatechicos
El ácido funcionaba como inhibidor. Hg, Zn y Cu fueron inhibidores; se estableció un requisito
de grupos -SH para la actividad.
En las agujas de pino Ponderosa, la deshidrogenasa SHK era un monómero y había tres
aloenzimas producidas por tres alelos diferentes en la población encuestada. Cualquier individuo
dado tenía un fenotipo de una, o como máximo dos, de las tres aloenzimas. 'SHK
deshidrogenasas se purificaron parcialmente de agujas de alerce y pino. Se afirmó que en las
coníferas (a diferencia de todas las demás plantas) las tres isoenzimas de la SHK deshidrogenasa
eran activas, no solo con NADP, sino también con NAD. Se pensó que la SHK deshidrogenasa
dependiente de NAD, catalizaba reacciones iniciales de una ruta alternativa para la conversión de
SHK en hidroxibenzoatos. El herbicida, Sandoz 6706 [4-cloro-5- (dimetilamina) -2-
(a, a, a-trifluoro-m -tolil) -3 (2H) -piridazinona] aumento de SHK
actividad deshidrogenasa en brotes de cebada (Hordeum vulgare), particularmente con luz de alta
intensidad.

E. Shikimate quinasa
La quinasa shikimato, EC 2.7.1.71 (ATP: shikimato 3-fosfotransferasa), se abreviará aquí como
quinasa SHK. La reacción es una transferencia de fosfato poco excepcional desde el ATP al
Grupo C-3 -OH de SHK (ver Figura 1). Se conoce la quinasa SHK existir en formas
isoenzimáticas en E. coli y S. typhimurium y en formas complejas en otro organismo. Este
comportamiento es algo inusual para una enzima en medio de una vía del metabolismo, y no se
ha presentado una explicación convincente para ello. Weiss y Edwards sugirieron la posibilidad
de ramificación en SHK a través de vías catabólicas o anabólicas no reconocidas. Tales ramas
biosintéticas ahora se conocen (ver Sección III.A.3), pero aparentemente no existen en E. coli ni
en S. typhimurium; el papel de las isoenzimas quinasas SHK en las ramas SHK sigue siendo
enigmático.

1. E. coli SHK quinasa II

Las investigaciones más recientes se han centrado en la quinasa SHK II, y la quinasa SHK I
permanece relativamente inexplorada. El gen estructural de la quinasa SHK II en E. coli es aroL
y su expresión está bajo el control del gen regulador, tyrR. El gen ha sido clonado y
secuenciado, y las cepas de sobreexpresión han sido construidas. La enzima ha sido purificada
por dos grupos de investigadores. De E. coli HW87 / pMH423, un 81- veces la purificación dio
una enzima homogénea y de E. coli JP1680 (que contiene el plásmido pMU377 aroL + y
sobreproduce aproximadamente 50 veces), una purificación de 73 veces dio casi
material homogéneo. Los valores de M observados, alrededor de 20.000 a 22.000, de acuerdo
con el valor de 18.937 calculado a partir de la secuencia de aminoácidos; la enzima es
monomérica. La secuencia de codificación contenía 519 pb produciendo un polipéptido con 173
aminoácidos. La secuencia de aminoácidos, determinada por los primeros 24 residuos, de
acuerdo con lo predicho por la secuencia de ADN.

La actividad enzimática dependía de la presencia de cationes divalentes, siendo el Mg2 + el más

eficaz. La enzima no fue inhibida por una variedad de aminoácidos aromáticos y benzoatos
sustituidos. Las afinidades de las dos quinasas por SHK fueron muy diferente: para SHK quinasa
I,> 20 mM, y para SHK quinasa II, 200 uM. Estos valores indican que SHK quinasa II funciona
en la vía biosintética SHK.

El gen aroL en E. coli contranscribe con al menos otro gen, aroM. Este último codifica un
polipéptido de aproximadamente M = 26.000 (225 residuos de aminoácidos). Se desconoce la
función de este gen y su producto. El aroL Se ha clonado el gen de Brevibacteriurn
lactoferrnentum, de importancia comercial. Plásmidos recombinantes con este
gen tenía niveles elevados de quinasa SHK. Además, el aroB (codifica la DHQ sintasa) y los
genes aroE (codifica la deshidrogenasa SHK) también estaban presentes en estos plásmidos
recombinantes.
Los tres genes estaban ubicados de cerca en el fragmento de ADN en el orden aroL, aroB y aroE,
formando un grupo en el cromosoma.

2. Enzimas vegetales
La quinasa SHK se ha purificado parcialmente de Phaseolus mungo
plántulas y Sorghum bicolor. 'En ambos casos, la actividad fue máximo a pH 8,6 a 9,0 y se
requirió Mg2 +. La enzima del sorgo fue inhibida por el cafeato y menos por el pcoumarato. Una
enzima de plántula de guisante se localizó en preparaciones de cloroplastos lavados.
La tiorredoxina estimuló la quinasa SHK de los cloroplastos de espinaca y el efecto
probablemente se relacionó con una dependencia observada de la luz para la biosíntesis de
aminoácidos aromáticos.
La enzima parcialmente purificada (36 veces, Sephadex (cromatografía G-75) tenía un Mr
aparente de aproximadamente 27.000.

F. 5-Enoipyruvyl-Shlklmate 3-Fosfato sintasa

La enzima que forma EPSP [5-0- (1-carboxivinil) -3-fosfosfosquimato] es EC 2.5.1.19. El
nombre formal modificado en 1984 se convirtió en fosfoenolpiruvato: 3-fosfosquimato 5-0-
(1-carboxivinil) transferasa. Aunque el nombre recomendado es 3-fosfoshikimato 1-
carboxiviniltransferasa, la abreviatura EPSP sintasa es común y se usa aquí.
La reacción general entre S3P y PEP se muestra en la Figura 1. Esta reacción ha asumido una
importancia considerable ya que la EPSP sintasa es el principal objetivo de inhibición por parte
del amplio espectro, herbicida de postemergencia no selectivo, glifosato (el componente activo
del herbicida Roundup @).

1. Mecanismo de reacción
La EPSP sintasa se ha investigado intensamente; parece conveniente discutir los resultados
recientes relacionados con el mecanismo primero.

Hace dos décadas, Sprinson y sus colegas sugirieron un mecanismo de adición-eliminación con
formación del "intermedio tetraédrico" (Figura 16A). Aunque solo sea transitoriamente, el
El grupo 4H2 de PEP y EPSP en realidad existía como un método. ~ El "mecanismo de
Sprinson" fue consistente con la escisión observada del enlace C-0 de PEP (en lugar del enlace
0-P). Más recientemente, un mecanismo que involucra un sustrato enzimático (PEP) fue
sugerido. El mecanismo requería la enzima y PEP para formar un complejo (complejo 1, Figura
16B) que añadió S3P, seguido de eliminación de fosfato. Otro
posibilidad era la formación de un segundo complejo (complejo 11, Figura 16C) por eliminación
de fosfato, seguida de la adición de S3P. El mecanismo se basó en lo observado del Intercambio
catalizado por enzimas de 3H del disolvente 3H2 0 en PEP. En presencia del análogo de sustrato,
didesoxi-s3P. el intercambio, sin embargo, fue más lento que el recambio catalítico.
El intermedio tetraédrico, Figura 16A, ahora ha sido aislado y caracterizado. La evidencia inicial
vino de muchos estudios detallados utilizando métodos cinéticos rápidos de enfriamiento rápido-
flujo químico. Los experimentos de trampeo establecieron que el orden cinemático preferido de
reacción fue la unión de S3P primero, seguido de Unión PEP. Cuando se controló la formación
de EPSP mezclando el exceso de enzima con un nivel de saturación de S3P y un nivel limitante
de PEP, una formación transitoria de piruvato fue observada (máximo a 10 ms; sin formación de
piruvato de EPSP o PEP en las condiciones de enfriamiento utilizadas).
La formación de piruvato se atribuyó a la degradación de un intermedio, lábil en las condiciones
de inactivación ácida. Se obtuvieron resultados similares con un exceso de enzima, EPSP y una
alta concentración de fosfato, impulsando así la reacción a la inversa.
El análisis cinético de estado transitorio condujo al siguiente esquema, obteniendo valores para
las 12 constantes de velocidad (I= Intermedio).

FIGURA 16. Mecanismo de reacción de la EPSP sintasa. (Línea 1) El Sprinson

mecanismo con el intermedio tetraédrico, A. (Cal 2) Posible implicación
del grupo X en la enzima. El complejo I (estructura B) puede ser atacado por S3P
con pérdida de fosfato, o como se muestra en la línea 3, puede perder fosfato para formar
complejo II (estructura C). ROH es S3P con el grupo OH "expuesto" en C-5.
Aunque el intermedio se descompuso en condiciones ácidas a piruvato y S3P, fue estable a la
desnaturalización rápida de la enzima en condiciones básicas suaves (trietilamina pura).
De esta forma, cantidades de microgramos de intermedio aislado; fue descompuesto en EPSP por
la acción de EPSP sintasa. La estructura tetraédrica se dedujo de las observaciones 1H NMR,
31
P NMR y 13C NMR. Esta conclusión fue confirmada por el fracaso de los intentos de
demostrar parcialmente reacciones esperadas sobre la base de la posibilidad del complejo
enzima-sustrato. La evidencia del uso de inhibidores de fosfonato (ver más adelante) sugiere
tentativamente que el intermedio tetraédrico (Figura 16A) tiene la configuración R en el nivel
quiral centro de la cadena lateral. Más recientemente, se obtuvo evidencia para la existencia de
dos complejos intermedios enzimáticos por” Espectroscopía de RMN C. Las estructuras
completas de estos complejos aún no se conocen.

2. Estereoquímica de la reacción EPSP sinthasa

El mecanismo de reacción aceptado requiere (l), la adición de S3P y un protón al doble enlace de
PEP para formar el intermedio de reacción tetraédrica, y (2) eliminación de PO3H2- y un protón
del intermedio para formar el doble enlace presente en el resto enolpiruvil de EPSP. En cada
caso, La adición o eliminación podría proceder con un syn o anti estereoquímica. Por tanto, una
posibilidad es una adición seguida de eliminación de syn (ver Figura 17). Este diagrama asume
un etiquetado "a granel" con todos los isótopos (es decir, 100%
2
H, 10096 3H), y que un efecto isotópico en la eliminación conduce a la pérdida exclusiva de "H.
Considerando todas las combinaciones de opciones estereoquímicas, se obtienen los resultados
que se muestran en la Figura 17.

Se determinó la ubicación de los isótopos de hidrógeno en el producto. por conversión del -CH,
que contiene EPSP en un compuesto con un metilo quiral; este último se analizó de la forma
habitual.
En la práctica, el EPSP se convirtió primero en CHA (ya sea utilizando células completas de K.
pneumoniue o CHA sintasa aislada). En los procedimientos analíticos, una hidrogenación
catalítica conocida por proceder específicamente con la síntesis química generando grupos
metilo quirales como se muestra en la Figura 18. El material reducido luego se convirtió
químicamente en racémico lactato. Por lo tanto, comenzando con EPSP (figura 18A), los dos
lactatos, en la Figura 18B y C. Reacción de alícuotas de estos lactatos en experimentos separados
con L- y D-lactato deshidrogenasa produjo muestras de piruvato, Figura 18D y E,
FIGURA 17. Posibilidades de la esteroquímica de la EPSP sintasa. X = --COOH,
y RO- es el ion de S3P. (Línea 1) Consecuencias de anti-adición y la eliminación syn . El
símbolo de equivalencia, ≣, se utiliza para indicar un cambio. (Línea 2) Resumen de todas
las posibilidades estereoquímicas. 1 = adición de syn y eliminación; 2 = anti adición y
eliminación; 3 = adición syn, anti eliminación, 4 = anti adición, eliminación syn.

FIGURA 18. Análisis estereoquímico de EPSP sintasa. El proceso

se supone que comienza (reacción 1) con la conversión de (E) - [3-2H, 3H) PEP a
EPSP por anti-adición, eliminación de syn (ver también Figura 17, línea 1); EPSP es
luego convertido a CHA (ver texto). Reacción 2, hidrogenación catalítica con
estereoquímica syn; reacción 3, conversión en lactato racémico; reacción 4,
tratamiento con L-lactato deshidrogenasa; reacción 5, tratamiento con D-lactato
deshidrogenasa; reacción 6, oxidación de piruvato a acetato después de la eliminación de
C sin reaccionar; reacción 7, como 6, después de la eliminación de B.

con un grupo metilo como único centro de quiralidad. Después de eliminar el lactato sin
reaccionar, los piruvatos se convirtieron en acetato para el análisis de quiralidad final.
Los formidables problemas técnicos en la realización de este trabajo fueron superados por dos
grupos de investigadores. Se debe tener en cuenta que la cuenta dada aquí está simplificada e
ignora estos problemas técnicos:

1. A diferencia de 2H, que está disponible en cerca de 100% de átomo, 3H se usa a niveles
de trazador.
 2. Aunque se observa un efecto isotópico cinético primario en la etapa de desprotonación de
la reacción EPSP sintasa , no conduce a la eliminación exclusiva de 'H como se ilustra
aquí
3. Pueden ocurrir intercambios de protones con solvente y deben ser minimizado.

La relación estereoquímica observada es la de (E) - [3-2H, 3H] PEP el EPSP y CHA tienen
configuración E en el 2H, 3H que contiene cadena lateral. Esto implica un anti/syn o situación
syn/anti, para el proceso de eliminación adicional. La posibilidad anti/syn se muestra en un
diagrama en la Figura 18 (no se conoce a qué "cara" del doble enlace PEP se lleva acabo la
adición).

3. Aminoácidos involucrados en el sitio activo

Un número sorprendentemente grande de aminoácidos ha sido implicado en el sitio activo de la
EPSP sintasa, ya sea para actividad catalítica o para la unión de sustratos e inhibidores. Incluyen
arg, glu, his y lys; un residuo de cys es proximal al activo sitio, pero no es esencial para la
catálisis o la unión del sustrato.
Una imagen clara de sus roles debe esperar la determinación de la estructura tridimensional de la
enzima. Esta sección incluye algunos trabajos con el inhibidor, glifosato (consulte la Sección II.
F. 7).

a. ARGININA
Un posible papel de un grupo guanidino en el sitio activo de la EPSP sintasa de K. pneumoniae
fue sugerida por una inhibición observada con el reactivo dirigido por arg, fenilglioxal.
Experimentos más detallados utilizan Petunia hybrida EPSP sintasa homogénea, con fenilglioxal
o 4-hidro ~ fenilglioxal. ~~~ La posibilidad de que un residuo cys estaba siendo modificado por
estos reactivos. La modificación de los residuos de arg siguió una cinética de pseudoprimer
orden. Se obtuvo una protección parcial contra la inhibición con S3P y protección completa con
una mezcla de S3P y glifosato (sin protección con glifosato solo). De tres reactivos residuos de
arg, arg-28 y arg-131 se identificaron como dos que se etiquetó cuando se utilizó fenilglioxal
marcado. Estos dos residuos de arg se conservan en todas las EPSP sintasas hasta ahora
estudiadas. Curiosamente, el residuo arg-28 está cerca del lys-23 también identificado como un
componente reactivo en la enzima de petunia.

b.CISTEÍNA
Cuando se hizo reaccionar la EPSP sintasa de E. coli con el reactivo tiol, DTNB [ácido 5,5'
ditiobis- (2-nitrobenzoico)], dos de seis residuos de cys se modificaron y con una pérdida
significativa de enzimas. Los puentes disulfuro no estaban presentes. En la presencia de S3P y
glifosato, uno de los dos residuos de cys reaccionó con DTNB pero sin pérdida de actividad
catalítica. Por reacción del Material inactivado con DTNB con KCN, los grupos -SH fueron
convertido a -SCN. La enzima que contiene dos de estos grupos tiene una actividad comparable a
la de la enzima nativa. Por tanto, se concluyó que estos residuos de cys reactivos no eran
necesarios para la actividad catalítica. Los residuos de cys reactivos fueron cys-288 y cys408;
este último fue protegido de la reacción con DTNB por S3P
y glifosato. La enzima de E. coli apenas se vio afectada por yodoacetamida y N-etilmaleimida,
pero la enzima de Kpneumoniue fue inactivado por este último reactivo.
C. GLUTAMATO
La EPSP sintasa de E. coli fue inactivada por letil-3- (dimetilaminopropil1) carbodiimida en
presencia de glicina éster etílico. La inactivación completa requirió la modificación de cuatro
grupos carboxilo, con solo uno, identificado como glu-418, siendo esencial para la actividad. La
inactivación se evitó mediante la pre incubación de la enzima con S3P y glifosato y la unión
de glifosato a la enzima modificada fue menor que con la proteína nativa. Aunque el papel
exacto de este residuo de glutamato no se estableció, aparentemente se encuentra en o cerca de la
sitio de unión al glifosato.

d. HISTIDINA
El reactivo dirigido por his, dietilpirocarbonato, inactivado EPSP sintasa de E. coli, y se evitó la
inactivación por la presencia de sustratos. Los datos de la tasa de inactivación del pH
participación implícita de un grupo con pKa = 6,8; esto era dentro del rango esperado para su
forma no protonada.
Aunque la inactivación completa requirió la modificación de cuatro sus residuos, solo uno era
crítico para la actividad catalítica. Este esencial residuo reaccionó con pirocarbonato de dietilo
dos veces tan rápidamente como lo hicieron sus residuos no esenciales. Dado que la enzima
inactiva del dietil pirocarbonato aún podría unirse a S3P y glifosato. a su residuo se le asignó un
papel en la catálisis, pero no vinculante. Este his esencial puede ser el nucleófilo requerido para
formar el intermedio de reacción tetraédrico.

e. Lisina
La EPSP sintasa de E. coli fue inactivada por piridoxal fosfato y sustratos impidieron la
inactivación. Este y un trabajo anterior sugirieron un papel para lys en el sitio activo, con el
unión de base de Schiff habitual para el fosfato de piridoxal. Con 90% de inactivación, se
incorporó aproximadamente 1 mol de fosfato de piridoxal por mol de enzima. Después de la
reducción de borohidruro y digestión tríptica, se obtuvo un péptido que contenía la lys residuo en
la posición 22. La confirmación de un papel para lys-22 fue obtenida por mutagénesis dirigida al
sitio en esta posición, utilizando la enzima Petunia hybrida expresada en E. coli. En el
enzima de petunia, lys-23 es equivalente a lys-22 en la secuencia de la enzima E. coli. De tres
reemplazos, ala, arg y glu, para lys-23, solo la enzima que contiene arg tuvo actividad. La
enzima purificada con arg-23 fue menos sensible que enzima de tipo salvaje (lys-23) a la
inactivación por fosfato de piridoxal. La enzima modificada arg-23, pero no catalíticamente
enzima inactiva ala-23, fue capaz de unirse a S3P. Por tanto, es probable
que un grupo fuertemente catiónico, específicamente lys-23 (petunia) o lys-22 (E. coli), tiene un
papel importante en la unión del sustrato.
La secuencia de aminoácidos alrededor de lys-22 (23) y arg-28 se conserva en las enzimas
bacterianas, fúngicas y vegetales. Esta región es presumiblemente un componente importante del
sitio activo.

4. EPSP Sintasa de E. coli

La EPSP sintasa de E. coli no transformada ATCC 14948 se purificó (843 veces) hasta
homogeneidad como un monómero con M, = 55.000 (cromatografía de exclusión) y 49.000 (gel
de poliacrilamida). Además, el gen aroA se clonó y se insertó en un plásmido multicopia. La
cepa transformada, E. coli AB2829 / pKD501, sobreprodujo la EPSP sintasa aproximadamente
100 veces. y era resistente al glifosato. La enzima homogénea purificada se puede obtener en
cantidades de miligramos. por un procedimiento que requiere sólo una purificación de 50 veces.
La enzima monomérica tenía Mr, que variaba de 42.000 a 49.000.

La disponibilidad del gen uroA clonado y cantidades de miligramos de enzima pura permitieron
el uso de una estrategia de combinación de aminoácidos y nucleótidos para obtener la
secuencia de aminoácidos del polipéptido. La secuencia de aminoácidos de leu-44 se determinó
directamente (con tres residuos no identificados). La secuencia predicha a partir de los resultados
del ADN correspondía a un polipéptido de 427 residuos con calculado M = 46.112; este valor
concuerda bien con los que se acaban de dar para la enzima aislada. '66 La EPSP sintasa de S.
ryphimurium tenía la misma longitud que la de E. coli y había 11% de divergencia en la
secuencia de aminoácidos.
La EPSP sintasa de E. coli es aparentemente la primera de las principales enzimas del tronco que
se van a cristalizar. Los cristales (1,5 x 0,4 X 0,4 mm) fueron adecuados para estudios de
difracción de rayos X de monocristal de resolución media. Se espera que se estén abriendo
caminos para determinar la arquitectura tridimensional de este y otras enzimas de la vía SHK.
Tanto en E. coli como en S. fyphimurium, la expresión del gen aroA está vinculado al del gen
serC. Este último codifica para 3-fosfoserina amotransferasa, una enzima en la vía biosintética
de la serina y la que también se requiere para la biosíntesis de piridoxina.
Estos dos genes forman una inusual "función mixta de Operon” con sus productos que participan
en dos caminos separados. El significado de la asociación no está claro de inmediato. Una
posibilidad es una participación en biosíntesis de enterobactina, para la cual tanto la serina como
el corismato son requeridos. La enterobactina es un compuesto que se une al hierro (ver Sección
III.D.3) y la falta de hierro causa la defresión de varios genes de proteínas implicadas en la
adquisición de hierro.
La agrupación de un gen de la vía SHK y un gen involucrado en biosíntesis puede permitir la
corregulación de acuerdo con el estado de hierro del organismo. Cepas de S. typhimurium con
mutaciones de supresión en las vías biosintéticas SHK (aroA) y purina
se han construido como posibles candidatos para una vacuna contra la fiebre tifoidea. 'Cepas
vacunales de S. ryphimurium con mutaciones estables en aroC solo o en aroC y
aroA juntos también se han construido.

5. EPSP sintasa de otras bacterias

Una purificación de EPSP sintasa de K. pneumoniae ATCC 8724 (> 700 veces) produjo material
al menos 95% homogéneo y de K. pneumoniae 62-1, una purificación de 3300 veces dio proteína
homogénea estabilizada por "Polybuffer 74" que contiene Ditiotreitol 1 mM. La enzima constaba
de una sola cadena polipeptídica, M = 32.400 (cromatografía Sephadex G-100) y 42.900
(electroforesis en gel SDS). Un mecanismo cinético secuencial aleatorio era probable para la
reacción directa.
Cuando se clonó el locus aroA de Bordetella pertussis en E. coli, el gen se expresó y
complementó un aroA Mutante de E. coli. La secuencia genética de 1329 nucleótidos fue
determinado, incluido el codón de terminación TGA, que conduce a un polipéptido de 442
residuos de aminoácidos. La M deducida fue 46.688. Hubo una homología considerable en la
secuencia de ADN con los de otros microorganismos.
Una purificación parcial (187 veces) de la EPSP sintasa de B. subtilis dio una enzima estimada
en un 70% de pureza. Cationes Monovalente se requerían para la actividad, siendo NH4 + el más
eficaz. Esta activación catiónica estaba en contraste con un requisito de anión descrito para la
enzima K. pneumoniae. La enzima B. subtilis activada por NH4+ mostró una mayor sensibilidad
al glifosato. No reconocer los requisitos de cationes para EPSP sintasas en general puede haber
dado estimaciones poco fiables de inhibición del glifosato.

6. EPSP sintasas de plantas

La EPSP sintasa de plántula de guisante se purificó (3150 veces) hasta homogeneidad
electroforética mediante una modificación del proceso utilizado para la enzima E. coli.176 La
enzima monofuncional fue monomérico con MI = 50.000 (desnaturalizado) y 44.000 (gel
cromatografía de permeación). La reacción hacia adelante fue fuertemente inhibida por glifosato.

Con plántulas de sorgo bicolor de crecimiento oscuro, con 1300 veces de purificación en la que
aparentemente se copularon tres isoenzimas. Se resolvieron dos enzimas (II y III) de la
preparación purificada por intercambio aniónico de alta resolución HPLC; ocasionalmente
estaban presentes pequeñas cantidades de la tercera isoenzima (I). Las tres de estas isoenzimas se
detectaron en extractos parcialmente purificados de brotes de S. bicolor de crecimiento oscuro.
Valores para Mr, osciló entre 51.000 y 57.000. La actividad EPSP sintasa fue inhibida por
metales como Cuz +, Pbz + y Zn2 +, sugiriendo la necesidad de grupo (s) -SH para la actividad.
La actividad EPSP sintasa de petunia se expresó a un alto niveles en flores. Se ha estudiado la
regulación específica del tejido y del desarrollo del gen. Otro trabajo con las enzimas de planta
EPSP se describen en la siguiente sección.

7. Inhibición de EPSP sintasa por glifosato

El mecanismo de acción de los herbicidas tiene una enorme importancia económica y un interés
intrínseco. Recientemente han aparecido dos revisiones generales sobre la acción de los
herbicidas en la biosíntesis de aminoácidos y deben consultarse para obtener más detalles de los
que se pueden dar aquí. Se ha prestado mucha atención al material ampliamente utilizado, el
glifosato [N- (fosfonometil1) -glicina] . Este herbicida de postemergencia no selectivo de amplio
espectro está presente en el herbicida Roundup @ y es el tema de The Herbicide Glyphosate;
este libro se refiere a unas 7000 publicaciones. Las ventas mundiales proyectadas de glifosato
para 1986 indicaron que se convertiría en la primera “molécula herbicida de mil millones de
dólares”. En vista de la importancia económica del glifosato, se ha realizado un enorme volumen
de trabajo. Aquí sólo se analizan algunos de los desarrollos recientes de interés en bioquímica.

El principal objetivo de este herbicida es la EPSP sintasa, aunque también se inhiben otras
enzimas de la vía SHK. Por ejemplo, en Candidu multosa, DAHP sintasa-Tyr y DHQ
sintasa (ver Secciones II.A y II.B) son inhibidas por concentraciones de glifosato en el rango
milimolar, mientras que EPSP sintasa se inhibe en el rango micromolar.
Las plantas y las células vegetales cultivadas tratadas con glifosato contienen altos niveles de
SHK. En las plantas, la concentración de glifosato para permitir la acumulación de SHK fue
menor en la luz (0,01 mM) que en la oscuridad (0,04 mM).

Con K. pneumoniae, crecimiento en presencia de glifosato conduce a la excreción de S3P en el

medio S3p. El efecto de glifosato en E. coli, P. aeruginosa y B. subtilis ha comparado en un
estudio de los efectos de "drenaje de energía" de glifosato en organismos con una diversidad de
vías reguladoras para la vía SHK. A diferencia de los dos primeros organismos, B. subtilis no
acumuló S3P. En condiciones similares con glifosato C. multosa y otras levaduras acumularon
SHK y S3P en células en concentraciones aproximadamente equimolares y excretaron
SHK en el medio.

El valor de este herbicida sería aún mayor si el cultivo plantas resistentes al glifosato podrían ser
producidas por ingeniería genética. Por transformación con vectores que conducen a
sobreproducción de EPSP sintasa de tipo salvaje, o por producción de enzimas con afinidad
alterada por el glifosato, ya se ha obtenido resistencia al glifosato en petunia, tabaco y
plantas de tomate. Para más detalles, se deben consultar otras revisiones. En mayo de 1989, se
habían realizado pruebas de campo de tomates tolerantes al glifosato durante 2 años y durante 1
año en una variedad de colza (canola) que producía un aceite. Entonces se estaban llevando a
cabo las primeras pruebas de campo con algodón y soja tolerantes al glifosato.

Los dos métodos para obtener tolerancia al glifosato son:

1. Sobreproducción de EPSP sintasa. En células de E. coli con un plásmido multicopia que

lleva aroA (E. coli 594 / pMON4), la sobreproducción de EPSP sintasa (de 5 a 17 veces)
proporcionó una tolerancia al glifosato al menos 8 veces mayor. Este efecto también se
observó en otra cepa de sobreexpresión (E. coli AB 28291pKD501) y en K. pneumoniae.
Los cultivos de células vegetales de Petunia hybrida se han hecho tolerantes al glifosato y
muestran niveles elevados de EPSP sintasa. Además, como se señaló anteriormente, se
han obtenido plantas de petunia transgénicas resistentes al glifosato. Este trabajo
representó un gran avance para establecer una resistencia selectiva a herbicidas en plantas
de cultivo económicamente importantes.
2. La modificación de EPSP sintasa. Se obtuvo un fenotipo de S. typhimurium resistente al
glifosato mediante mutagénesis de etilmetano sulfonato. El gen aroA mutante de S.
typhimurium se clonó en E. coli y confirió resistencia a ese organismo. La mutación
responsable fue un cambio de pro a ser en la posición 101. Resultó de una mutación de un
solo punto en el gen aroA que codifica la EPSP sintasa. La expresión del gen aroA de S.
typhimurium mutante se obtuvo en plantas de tabaco y dichas plantas transformadas
mostraron una mayor tolerancia al glifosato.

Se aisló una EPSP sintasa resistente al glifosato de una cepa de Kpneumoniae resistente al
glifosato; los datos inmunológicos indicaron que la enzima mutante y de tipo salvaje tenía un
determinante antigénico similar, pero no idéntico.

Además de los cultivos celulares de P. hybrida, los cultivos celulares de varias plantas (Corydalis
sempervirens, Daucus curota, Petunia hybriaiz) que se han hecho resistentes al glifosato
muestran niveles elevados (de 10 a 40 veces) de EPSP sintasa. También estaban presentes
niveles elevados de EPSP sintasa en células cultivadas de la cepa tolerante al glifosato de
Nicotiana tabacum 17. En este caso, el nivel de actividad fue aproximadamente el doble que el
de una línea sensible al glifosato (W 38). Con C. sempervirens, las células cultivadas resistentes
al glifosato sobre produjeron EPSP sintasa unas 43 veces; la enzima se purificó
(aproximadamente 60 veces) hasta homogeneidad. Las enzimas de células adaptadas y no
adaptadas no mostraron diferencias significativas en las propiedades cinéticas y tenían valores
idénticos para M = 44.700. La sobreproducción de EPSP sintasa en cultivos en suspensión de
células tolerantes al glifosato de C. sempervirens aparentemente no se basó en la amplificación
del gen correspondiente. Probablemente hubo una reducción en la tasa de degradación
proteolítica de la enzima.

La enzima resistente al glifosato de las células P. hybrida MP4-G también se purificó (82 veces)
hasta homogeneidad. Era un monómero monofuncional con M, =, 49.000 a 55.800. La actividad
específica de la enzima MP4-G fue de 10 a 20 veces mayor que la de la enzima de células MP4
no resistentes. Las dos enzimas no difirieron en su sensibilidad al glifosato en experimentos
cinéticos.

Se logró un aislamiento más eficiente de esta última enzima mediante un procedimiento

cromatográfico de alta resolución a pequeña escala. Inicialmente se utilizó cromatografía en una
columna de intercambio aniónico de amonio cuaternario Pharmacia HR 10/10 MonoQ. Se
obtuvieron varias fracciones activas (¿derivados de carga modificada o isoenzimas?); los de alta
actividad se cromatografiaron adicionalmente en una columna de HPLC de interacción hidrófoba
de fenilo 5PW de Bio-Rad TSK. En el enfoque isoeléctrico analítico, las fracciones de alta
actividad mostraron una sola banda.

En un desarrollo posterior, el ADNc de la EPSP sintasa de petunia madura, que carece de una
secuencia de tránsito de cloroplasto (ver una sección posterior), se ha clonado en el plásmido
pMON342 y luego se ha expresado en E. coli. El aislamiento a gran escala de la enzima de E.
coli SR48 l / pMON342 (cultivada en condiciones de fermentación de alta densidad) produjo 220
mg de enzima a partir de 1,2 kg de células (purificación 1 12 veces). Este material era
esencialmente homogéneo en electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), con M = 44.000;
este valor estaba de acuerdo con el deducido de la secuencia de ADN.

Se han aislado y secuenciado clones de ADNc similares que codifican la EPSP sintasa en tomate
y Arabidopsis thuliana. Las secuencias de aminoácidos deducidas para la enzima son muy
similares para todas las plantas y suman 445 residuos. Existe una homología considerable con las
enzimas de las bacterias, menos con las enzimas de los hongos. Se ha obtenido un mapa
completo de exón-intrón de los genes de EPSP sintasa de tomate y petunia y se ha analizado en
detalle la expresión de EPSP sintasa.

En las EPSP sintasas de plantas, está involucrada una secuencia de péptido de tránsito, que
contiene de 72 a 76 aminoácidos. Esta secuencia es necesaria ya que la EPSP sintasa se sintetiza
como un precursor citoplásmico y luego se transloca al estroma de los plástidos donde se
produce la escisión a la enzima madura. Es de interés que una secuencia de péptido de tránsito de
Petunia hybrida pueda dirigir eficazmente una EPSP sintasa bacteriana (E. coli) al
compartimento del cloroplasto. La secuencia del péptido de tránsito se elimina en el cloroplasto
para producir una enzima resistente al glifosato completamente activa.

Se han construido vectores plásmidos que proporcionan resistencia contra el glifosato y se han
encontrado aplicaciones en la transformación de cepas de laboratorio, silvestres e industriales sin
marcar genéticamente de S. cerevisiae.
A pesar de este volumen de trabajo, el modo de acción del glifosato no está del todo claro. Los
estudios cinéticos con la EPSP sintasa fúngica del complejo arom indicaron un mecanismo
cinético secuencial con la unión de S3P primero (ver también trabajos anteriores sobre el
intermedio tetraédrico). La inhibición por el glifosato se debió a una interacción específica y
reversible con el complejo E-S3P para formar un complejo sin salida. El glifosato no se unió a la
enzima libre. De manera similar, los estudios cinéticos de una enzima parcialmente purificada de
células de Nicotiana silvestris también fueron consistentes con la competencia entre PEP y
glifosato por el complejo E-S3P.

Sobre la base de tales observaciones, se propuso la forma iónica del glifosato como un análogo
del estado de transición de un carbanión PEP protonado '". Esta idea se desarrolló antes de la
identificación inequívoca del intermedio de reacción tetraédrica (ver una sección anterior); el
carbanión no se ha identificado como un componente del mecanismo de reacción actualmente
aceptado. La aclaración del mecanismo inhibidor preciso debe esperar más observaciones.

Un estudio reciente ha detallado los cambios químicos I3C, I5N y 31P NMR del glifosato en el
rango de pH: 1.0 a + 13.0. En el rango de pH 0.0 a 9.0, el glifosato existe como una
conformación espiro cíclica, rotacionalmente restringida con enlaces H entre aniones de oxígeno
(carboxilato, fosfonato) y protones de iones de amonio. Esta conformación puede ser aproximada
por la Figura 19A (se debe consultar el documento original para obtener descripciones precisas
de los ángulos y distancias de unión). Por debajo de pH 0.0 (con carga neta de + 1) o por encima
de pH 11.5 (carga neta de - 3) la conformación es la de una estructura lineal. Las distancias P-C-
N y N-C-C han aumentado y la formación de un enlace H entre un anión fosfonato y un protón
de amonio requeriría la distancia poco probable de aproximadamente 2.8 a 2.9 A (Figura 19B)

Estas observaciones se ampliaron al "callejón sin salida” del complejo enzima-S3P-glifosato. Se

observaron perturbaciones de desplazamiento químico para el glifosato unido y se atribuyeron a
cambios en los ángulos de enlace alrededor de los restos de fosfonato, amina y carboxilo. El
glifosato estaba presente en forma de ión amonio protonado, pero el grupo carboxilo no estaba
protonado. La conformación unida fue equivalente a la que se observaría con el propio glifosato
en solución a pH 10,1 o pH -0,8. Esta conclusión indica una conformación generalmente lineal
para el glifosato unido.

Se sintetizaron dos análogos de fosfonato, Figura 20A y B, del intermedio tetraédrico. El

diastereoisómero R (Figura 20A) mostró Ki de 15 nM para P. hybrida EPSP sintasa y fue el
inhibidor más potente informado hasta ahora. Se unió a la enzima con más fuerza que el glifosato
en un orden de magnitud y más fuertemente que el diastereoisómero S (Figura 20B) en dos
órdenes de magnitud. Suponiendo que estos inhibidores se unieran al grupo fosfonato en el sitio
normalmente ocupado por el fosfato, se predijo que el intermedio de reacción real, Figura 2OC,
tenía quiralidad R en el carbono quiral de la cadena lateral.
FIGURA 19. Conformaciones del glifosato. A = conformación aproximada
sobre el rango de pH, de 0,0 a 9,0; B = conformación aproximada a pH CO.0
y pH> 11,5, y para glifosato unido a EPSP sintasa. Longitudes de enlace: a
= 2.00Å, b = 1.75Å, c = 2.90Å, d = 1.98Å.

FIGURA 20. Análogos de fosfonato del intermedio tetraédrico EPSP sintasa (A, B) y la
configuración del intermedio de reacción real, C.

G. Corismato sintasa.
La conversión de EPSP en CHA es catalizada por EC 4.6.1.4 [05- (1-carboxivinil) -3-
fosfosquimato fosfato liasa], de aquí en adelante abreviado como CHA sintasa. Dado que el
CHA es una estructura de ciclohexadieno, esta enzima introduce el segundo de los tres dobles
enlaces que son necesarios para la formación del anillo de benceno. La reacción es, formalmente,
una eliminación 1,4 de fosfato y se produce con pérdida del protón C- 6HR. Sin embargo, si está
involucrado un mecanismo concertado (como era de esperar), se esperaría que la eliminación del
ion fosfato y el protón C-6 ocurriera desde el mismo lado del plano del anillo, y esto requeriría la
eliminación del protón H2. La pérdida del protón HR sería posible, sin embargo, con un proceso
de dos pasos que involucre un intermedio ligado a una enzima (ver Figura 21A).

Una posibilidad alternativa requería una migración de fosfato para formar un intermedio
transitorio, Figura 21B. Una posterior anti-eliminación de fosfato sería posible entonces con el
HR original de EPSP. (Nótese que, por la variante de la regla de secuencia, este protón es Hs en
el intermedio B de la Figura 21.) Se llevó a cabo una síntesis estéreo específica del intermedio,
denominada iso-EPSP, a partir de (-) - QA. La iso-EPSP no funcionó como sustrato para la CHA
sintasa de N. crassa, pero sí se comportó como un inhibidor competitivo (Ki comparable a la de
Km para el sustrato normal). Aunque era posible que la unión productiva de la iso-EPSP no
tuviera lugar desde el exterior de la proteína, el proceso de dos pasos con el intermedio ligado a
la enzima aparentemente sigue siendo la explicación más probable.

Si bien es evidente que la reacción no implica ningún cambio en el estado de oxidación del
sustrato, la CHA sintasa de diversas fuentes es inusual al requerir un cofactor de flavina
reducido, FMNH2 o FADH2, para la actividad catalítica. Las enzimas descritas hasta ahora se
dividen en uno de dos grupos:

1. En E. coli y Pisum sativum, la CHA sintasa es monofuncional y no tiene capacidad para

generar la flavina reducida por oxidación de NADH o NADPH [por ejemplo, F + NAD
(P) H + H + >> FN2 + NAD (P) +; esta reacción se describe como actividad "diaforasa" en
varios artículos]. Por tanto, el ensayo sólo es posible cuando se suministra flavina
reducida y en condiciones anaeróbicas. Se ha desarrollado un ensayo rápido y sencillo
para la CHA sintasa en estas condiciones.

2. En N. crassu y B. subtilis, la enzima es bi-funcional y contiene una actividad de flavina

reductasa. El enzima N. crassu reductasa tiene una especificidad absoluta por FMN y
NADPH, y aparentemente está asociada covalentemente con la CHA sintasa. La enzima
de este organismo puede utilizar FMNH2 o FADH 'suministrados de forma exógena
(consulte la Sección ll.K).

FIGURA 21. Mecanismo de reacción de la CHA sintasa. X = -COOH. (Línea

1) Pérdida anticipada de protón HS de EPSP por eliminación 1,4 de fosfato.
(Liie 2) Pérdida de protón HR por proceso de dos pasos con intermedio ligado a enzima.
(Línea 3) Pérdida de protón HR por proceso de dos pasos que involucra
migración de grupo fosfato.
1.CHA sintasa de bacterias.
Para E. coli, se construyó un plásmido que portaba el gen aroC y se determinó la secuencia de
ADN. Estaba presente un ORF que codifica una cadena polipeptídica de 357 residuos; la MR
calculada para la proteína fue 38.183. La enzima se purificó (658 veces) hasta homogeneidad
electroforética de la cepa superproductora, E. coli AB28491pGM602 (rinde 1,16 mg a partir de
20 g de células). Se secuenciaron los primeros 30 aminoácidos del terminal N y la secuencia
correspondió a la predicha a partir de la secuencia de ADN. La enzima nativa era un tetrámero.
La enzima purificada no tenía capacidad detectable para utilizar NADH para reducir la flavina.
Se han utilizado células inmovilizadas de K. pneumoniae 62-1 para la síntesis secuencial de
CHA.

2.CHA Sintase de N. crassa.

En N. crassa, esta enzima está codificada por el gen arom3; Se obtuvieron preparaciones no
homogéneas antes de 1975. Más recientemente, se encontró que el enzima N. crassa era muy
susceptible a las proteinasas presentes en el organismo. Una purificación (3210 veces) usando
"una estrategia antiproteinasa completa" dio material electroforético homogéneo (0,42 mg de 90
g de micelio en polvo liofilizado). Este material tenía una actividad específica (32 U / mg de
proteína) más de 10 veces mayor que la de las preparaciones anteriores. La proteína nativa era un
tetrámero, teniendo la subunidad Mr = 50.000. Esta enzima, a diferencia de la de E. coli, tenía
una capacidad intrínseca para reducir la flavina (específicamente FMN) usando NADPH.
Presumiblemente, la presencia de esta segunda actividad explica el tamaño más grande del
enzima N. crassa en comparación con la de E. coli (Mr = 50.000 frente a 38.183). Aunque no se
ha determinado la secuencia de aminoácidos completa, tres péptidos obtenidos por proteólisis
mostraron una homología significativa con tramos de la secuencia de E. coli hacia el terminal C.

3. Enzima vegetal.
Antes de 1986, no hubo informes de CHA sintasa en ninguna planta. Esta enzima se ha detectado
ahora en plántulas de guisantes y se ha demostrado que se encuentra, en gran medida, en el
cloroplasto.

H. corismato mutasa

7. Mecanismo de reacción.
La enzima para la conversión de CHA en PPA (EC 5.4.99.5, corismato piruvato mutasa) se
abrevia aquí como CHA mutasa. En E. coli y algunas otras bacterias, la CHA mutasa existe
como un único polipéptido bifuncional con prefenato deshidratasa (EC 4.2.1.51; abreviatura,
PPA deshidratasa) o prefenato deshidrogenasa (EC 1.3.1.12; abreviatura, PPA deshidrogenasa).
La combinación CHA mutasa-PPA deshidratasa está codificada por el gen pheA y proporciona el
precursor de phe; se le ha denominado proteína P. De manera similar, la CHA mutasa-PPA
deshidrogenasa está codificada por el gen tyrA y conduce al precursor tyr; se le ha denominado
proteína T. Las enzimas bifuncionales se tratan en la Sección 11. J. Sin embargo, al tratar con el
mecanismo de reacción de la CHA mutasa, aquí se incluyen algunos resultados obtenidos con
proteínas bifuncionales.
El doble enlace C-1 a C-6 se reorganiza durante la reacción de CHA mutasa; PPA contiene
dobles enlaces en las posiciones 2, 3 y 5, 6 (asumiendo la numeración SHK original). La
reacción es un ejemplo algo inusual de un reordenamiento de Claisen [3,3] -sigmatrópico en el
metabolismo. Aunque a menudo se cita como el único ejemplo de este tipo, Camino4deoxy-
CHA y -1CHA experimentan reordenamientos similares. Aunque también se propuso un
mecanismo pericíclico para la PEP-fosfomutasa, ahora parece que puede haber una explicación
alternativa '”. Como primera aproximación, el reordenamiento de CHA mutasa se puede
diagramar como se muestra en la Figura 22. Solo (-) CHA funcionó como un sustrato para E. coli
CHA mutasa-PPA deshidrogenasa y CHA mutasa de Streptomyces aureofaciens; el enantiómero
(+) no inhibió la preparación de E. coli.

El mecanismo de reacción de esta enzima ha recibido una atención considerable. Un paso

importante fue determinar la estereoquímica general rastreando el destino de los hidrógenos del
grupo = CH2 en la cadena lateral enolpiruvil de CHA durante la conversión en el grupo -CH2 de
la cadena lateral PPA. La pregunta es si el protón HR del último grupo se deriva de HE o Hz del
metileno CHA. En un conjunto de experimentos, se alimentó a células de E. coli con CHA
marcado estereoespecíficamente, preparado enzimáticamente a partir de E- (3, 2H, 3H] PEP (a
través de EPSP sintasa, véase la sección 11.F.2). La proteína celular se hidrolizó para phe y tyr
aislamiento, y tyr se degradó mediante piruvato a acetato para el ensayo de quiralidad, Como se
muestra en la Figura 23, CHA mutasa convierte el protón HE de CHA en HR de PPA.

Se obtuvieron resultados similares con material sintetizado químicamente, CHA racémico o

sintetizado enzimáticamente. En este trabajo, la conversión a PPA se llevó a cabo con E. coli
CHA mutasa-PPA deshidrogenasa. El PPA se convirtió de forma no enzimática (pH <6) en PPY
y este último se hizo reaccionar con PPY tautomerasa. Se sabía que la última enzima liberaba el
protón HR de PPY al disolvente (ver Figura 23).
Aunque la tasa de transposición catalizada por enzimas es más de 1 millón de veces más rápida
en el sitio activo que el de libre en solución, el proceso no enzimático todavía ocurre fácilmente
(por ejemplo, pH 7.5, 60ºC, 25 min). La transposición no enzimática procede con la misma
estereoquímica que el proceso catalizado por enzimas.

A partir de estas observaciones estereoquímicas, se puede hacer una distinción entre dos
estructuras alternativas para el estado de transición de la reacción. En esta reordenación, es
necesario incorporar enlaces parciales entre C-5 y 0-7 en CHA (enlace de ruptura) y entre C-1 y
C-9 en PPA (enlace de formación). El estado de transición contiene seis átomos (5 C y 1 O) en
una disposición cíclica y puede existir como una conformación de silla o de barco. Como se
muestra en la Figura 24, la estereoquímica observada es consistente solo con la utilización de un
estado de transición similar a una silla. El estado de transición es en realidad algo asimétrico,
siendo la ruptura del enlace C-0 (aproximadamente 0,145 nm) significativamente más corta que
la formación del enlace C-C.

Se llegó a la misma conclusión anteriormente mediante el uso de análogos estructurales del

estado de transición como inhibidores. Como análogo conformacional de silla, se usó exo-6-
hidroxibiciclo [3,3, llnonano-lexo-3-dicarboxilato (Figura 24A) y como análogo para la
conformación de bote, exo-6-hidroxibiciclo- [3,3, 1) nonanel -endo-3-dicarboxilato (Figura
24B). De estos dos materiales, solo el isómero exo-COOH (Figura 24A) era un inhibidor.
FIGURA 22. Conversión de CHA en PPA por CHA mutasa. Los vinculos de
“rompimiento" y "formadores" son identificados.

FIGURA 23. Estereoquímica de CHA mutasa. Resultados de los dos grupos

de los investigadores se muestran aquí. El sustrato CHA se preparó químicamente o a
partir de (E) - [3-2H, 3H] -PEP mediante EPSP sintasa. Las enzimas y los reactivos fueron
los siguientes: (1) corismato mutasa ya sea como enzima bifuncional aislada con PPA
deshidrogenasa o contenida en células bacterianas completas. (2)
PPA deshidrogenasa, tyr aminotransferasa. (3) Tyr fenil liasa. Esta reacción
se sabe que continúa con la conservación de la configuración. (4) 1, lactato deshidrogenasa
y NADH, 2, K2 Cr2 O7 / H +. (5) pH <6,0. (6) PPY tautomerasa. Esta se sabe que la
reacción elimina el HR al disolvente.
FIGURA 24. Estructuras en estado de transición e inhibidores de CHA mutasa.
Dado que la CHA mutasa convierte el protón HE de CHA en HR de PPA, solo el
el estado de transición de la silla es probable.

Para obviar la posibilidad de que la Figura 24A funcionara a través de una conformación
energéticamente menos favorable (menos poblada), se probó una estructura de adamantano con
una conformación de silla-silla "bloqueada". El 1,3-dicarboxilato de 6-hidroxiadamantano
(Figura 24C) tenía una Ki similar a la del nonano exo-COOH, lo que indica que la conformación
de silla-silla estable de este último era responsable de la inhibición observada. De otro trabajo se
concluyó que tanto los grupos C-6 -OH como C-1 COOH eran importantes para unirse al sitio
activo.
También se sugirió una participación de los grupos -COOH de CHA y posiblemente del grupo -
OH, ya que la mutasa de CHA de Streptomyces aureofuaciens Tu 24 fue inhibida por aniones
orgánicos y por ácidos aromáticos simples (2-, 3- y 4- hidroxibenzoatos, y más eficazmente 4-
hidroxiisoftalato) . Sin embargo, ahora parece que el grupo -OH no está involucrado, al menos
para E. coli CHA mutasa-PPA deshidrogenasa. Esta conclusión se deriva de dos hechos.
Primero, el metil éter racémico de CHA (es decir, con -OCH3 reemplazando a -OH) era un
sustrato razonable con kcat /kuncat = 2.0 X l04 (comparar 2.3 x l06 para (-) - CHA). En segundo
lugar, la transposición de CHA sin el grupo C-4-OH (Figura 25A), se aceleró al menos 100 veces
por CHA mutasa-PPA deshidrogenasa (Figura 25, Reacción 1). Este trabajo fue algo complicado
por la inestabilidad térmica de este análogo; en solución tamponada de HZO (p 2H = 7.2) a 30 °
C, las semividas para el reordenamiento a la Figura 25B y la eliminación (aromatización a
benzoato) fueron de 3.5 y 8.0 min, respectivamente (comparar para (-) - CHA, 935 y 8400 min).
Sin embargo, la presencia de enzima aumentó el grado de reordenamiento en relación con la
eliminación. Con [S]: [E] = 90, se obtuvo aproximadamente un 47% de mejora de la
transposición sobre el proceso térmico. Este valor aumentó con el aumento de [E; en [S]: [E] =
30, la mejora fue del 100%. Por tanto, en estas condiciones de alta concentración de enzima, el
compuesto fue completamente metabolizado por la enzima.
Si bien las condiciones que se acaban de describir no son fisiológicas y están muy alejadas de las
relaciones [S]: [E] habituales de la enzimología convencional, establecen sin embargo que el
grupo C-4 -OH no es necesario para la catálisis. La mejora de la transposición no se produjo con
la enzima desnaturalizada térmicamente, por lo que el efecto se debió claramente a una proteína
catalítica.
Dado que un análogo de CHA que carece del grupo 400H (Figura 25C) no era un sustrato, se
concluyó que los únicos grupos funcionales necesarios para la transposición catalizada por
mutasa de CHA son los dos grupos carboxilo. Todavía es posible que la formación de enlaces H
con el grupo C-4-OH mejore la estabilización del estado de transición y contribuya a la
velocidad de aceleración observada con el propio CHA.

El epóxido, Figura 25D, y 5,6-dihidro-CHA, Figura 25E, eran inhibidores reversibles

competitivos; además, el éster metílico, Figura 25F, no era un sustrato ni un inhibidor. El citrato
y el L-2-hidroxiglutarato inhibieron la CHA mutasa-PPA deshidratasa, y se propuso que estos
dos materiales también eran análogos del estado de transición. La relación más cercana se
observó con L-2-hidroxiglutarato; quizás de manera significativa, este fue el más eficaz de los
dos inhibidores.

La utilización de derivados de adamantano se ha explorado más a fondo en trabajos más

recientes, utilizando K. pneumoniae CHA mutasa-PPA deshidrogenasa. El derivado de 1-
fosfonato (Figura 25G), R = -P𝑂#$ :, fue más eficaz que los descritos anteriormente. Para los
sustituyentes en la posición 1, la actividad inhibidora disminuyó en la siguiente secuencia:

La actividad del derivado de fosfonato parece indicar que la unión no requiere necesariamente
grupos -OH y COOH. El PPA ha sido conocido como un inhibidor durante algún tiempo y la
Figura 25H, ácido [2- (1 carboxi-1,4-dihidrobencil) acrílico, también fue eficaz.

Se han examinado otros inhibidores potenciales, incluido uno en el que un resto de nitronato
sustituyó al carboxilo derivado de la PEP. Contrariamente a lo esperado, no resultó ser un buen
inhibidor. La Figura 26 resume los resultados con materiales que varían de pobres a muy
efectivos con respecto a la acción inhibidora. El endodiácido (3-endo-8-exo-8-hidroxi2-
oxabiciclo- [3.3.l] non-6-ene-3,5-dicarboxilato; Figura 26A) es, hasta ahora, el inhibidor más
potente conocido de la CHA mutasa. Los inhibidores de adamantano afectan las dos actividades
de la enzima CHA mutasa-PPA deshidrogenasa. También se ha sintetizado un análogo del anillo
de cicloheptadieno y es un inhibidor moderado de la CHA mutasa-PPA deshidrogenasa de E.
coli.

Se han considerado en detalle pruebas antiguas y nuevas relacionadas con el mecanismo de la

CHA mutasa. Se determinaron los efectos secundarios del isótopo de tritio para el enlace de
formación de C-1 a C-9 y el enlace de ruptura de C-5 a 0 de CHA tanto en el proceso enzimático
como en el no enzimático. Los sustratos fueron [9-3H, 7-14C] CHA o [5-3H, 7-14C] CHA. Para la
conversión no enzimática (pH 7,5, 60 ° C), kH/kT = 1,149 para la rotura de la unión (con
material marcado con 5- 3H) y 0,992 para la formación de la unión (con material marcado con 9-
3
H). Se concluyó que el enlace C-O se rompió aproximadamente en un 40% en el estado de
transición, pero el nuevo enlace C-C no se formó entonces de forma detectable.

Por otro lado, para el reordenamiento catalizado enzimáticamente, los efectos isotópicos para la
formación de enlaces (C4) y la rotura de enlaces ((2-0) fueron la unidad dentro del error
experimental. Se sugirió que los efectos isotópicos se suprimieron en el proceso enzimático y
que un El estado de transición limitante de la velocidad precedió a un paso de reordenamiento
isotópicamente sensible. El efecto secundario del isótopo de tritio en C-4 se investigó con [4-
3H, 7-14C] CHA. Se observó un pequeño valor inverso de kH / kT de 0,96. Además, Para la
reacción enzimática se estableció un efecto isotópico del solvente, kH2 0 / kT2 0 = 2.2, para el
proceso no enzimático el efecto del isótopo del solvente fue de 0,95.
Otro hecho a considerar es que, en soluciones de agua y metanol, el conformador favorecido de
CHA es el del grupo -OH en C-5 y el grupo piruvilo en C-4 en la disposición pseudoecuatorial.
Para que ocurra la reacción, ambos grupos deben volverse axiales. Sin embargo, el equilibrio
conformacional es rápido en la escala de tiempo de RMN.

Se han evaluado cuatro posibilidades mecanicistas a priori a la luz de la masa de datos. Aunque
los argumentos muy detallados no se pueden resumir fácilmente, la interpretación favorecida es
una escisión heterolítica de CHA entre C-5 y el átomo de oxígeno del éter (ver Figura 27). Se
propone un grupo enzimático nucleofílico para iniciar el ataque en C-5 (después de la
isomerización conformacional de CHA a la estructura diaxial). No es el menor de los atractivos
de este mecanismo que “le da a la enzima algo más que hacer que simplemente unirse a la
conformación apropiada del sustrato. . . ”. También está en armonía con los efectos isotópicos
del tritio observados. Además, el efecto sustancial del isótopo de hidrógeno del disolvente es
indicativo del movimiento protónico requerido por la catálisis general ácida y / o básica en el
mecanismo propuesto.

No se presentaron sugerencias en cuanto a la identidad del nucleófilo X y H-A. Los primeros

trabajos con la enzima CHA mutasa-PPA deshidratasa indicaron claramente un papel para un
residuo de lis. Los únicos otros residuos para los que los experimentos sugieren un papel en la
reacción mutasa son tyr y trp. Desafortunadamente, aparentemente no ha habido exploraciones
de un papel para él. Cabe señalar que la misma enzima bifuncional mostró una velocidad para la
reacción de mutasa (en tampón acetato / fosfatohorato) que aumentó solo ligeramente en el rango
de pH de 6,5 a 9. Se sugirió que los residuos de enzima ionizantes en el rango de pH de 5 a Era
poco probable que 9 estuvieran involucrados en el sitio catalítico ".

Grupos de las universidades de Cornell e Indiana han informado de manera conjunta sobre
estudios detallados de la reordenación no enzimática de CHA y muchos compuestos
relacionados. Se encontró que el medio polar (agua) en el que normalmente se lleva a cabo la
transposición es un factor significativo para la facilidad de reacción. El trabajo generalmente
respalda la conclusión de que el enlace C-0 sufre una disociación sustancial antes de que se
forme el nuevo enlace C4. Existe cierto desacuerdo entre los dos grupos en cuanto a una
estructura dipolar versus radical para el estado de transición. También se consideró el hecho de
que la transposición va acompañada de eliminación de modo que el CHA, por ejemplo, da lugar
tanto a PPA como a 4-hidroxibenzoato. Los dos procesos no parecen estar vinculados
mecánicamente, pero los dos estados de transición respectivos deben ser muy similares. Al igual
que con la reordenación, el proceso de eliminación implica una extensa escisión del enlace C-0
como evento inicial.

FIGURA 25. Sustratos e inhibidores alternativos para CHA mutasa. (Ver texto
para descripciones.)

Formas racémicas y (-) de Q-9-rnetil-CHA (Figura 28A) se sometieron a un reordenamiento de

Claisen no catalizado a pH 7.5 y 30 ° C con una vida media de 5.7 h formando “metilprefenato”
(Figura 28B) y la descarboxilación producto (Figura 28C).
FIGURA 28. Uso de 9-metil-CHA en reacciones de CHA mutasa y sistemas
diseñado para imitar el sitio activo. X = -COOH. Para las estructuras D, n =
1 y R = CH3; con n = 3, R = H, --CH3,--CL, --Br, o --OCH3.

El (Z) -9-metil-CHA era un sustrato limitado para CHA mutasa. La relación ~ Kcatalizado/Kno
4 6
catalizado fue de 4,2 x 10 (compárese con 1,5 x l0 para (-) CHA). Se obtuvo evidencia de un
estado de transición similar a una silla en estas reacciones enzimáticas. Se han c0nsmcte-d
sistemas moleculares que, se esperaba, imitarían las propiedades del sitio activo de la CHA
mutasa. Este trabajo permanece en una fase preliminar; sin embargo, se observó unión de fenoles
sustituidos (R-C 6 H4-OH, R = H, C1, NO2) y 2,2,2-trifluoroetanol a criptandos del tipo mostrado
en la Figura 28D.

En otra dirección, se generó un anticuerpo monoclonal que catalizó la transposición de CHA a

PPA. Los anticuerpos se indujeron al análogo del estado de transición, Figura 26A (el inhibidor
más potente conocido hasta ahora). El anticuerpo aparentemente proporcionó un entorno que era
complementario al estado de transición conformacionalmente restringido. La velocidad de
aceleración, k catálisis anticuerpo/ Kreordenamiento termal, fue de 1 X 104 (10 ° C, pH 7,0) en comparación
con un valor de 3 X 106 para la catálisis enzimática en las mismas condiciones. Se construyó otro
anticuerpo usando el mismo análogo del estado de transición que el hapteno. En este caso, la
velocidad de aceleración fue 1 X 102 (25 ºC, pH 8.0). Solo (-) - CHA, y no el enantiómero (+),
fue un sustrato para esta catálisis de anticuerpos, lo que confirma la" naturaleza enzimática de
este sitio de unión de anticuerpos adaptado.

2. CHA Mutasa monofuncional en microorganismos

a. BACTERIA
CHA mutasa, purificada hasta la homogeneidad (2200 veces) de Streptomyces aureofaciens
(antes de 1975) tenía la útil propiedad de ser notablemente estable al calor. Después de la
inactivación a 100 ° C, fue posible la reactivación entre el 30 y el 100% de la actividad original.
El Mr para la enzima nativa (probablemente un trímero, subunidad Mr = 14.500) estaba en el
intervalo de 51.000 a 63.000.
La P. aeruginosa de tipo salvaje contenía un nivel bajo de actividad CHA mutasa monofuncional
que fue inhibida por el PPA, así como una CHA mutasa bifuncional-PPA deshidratasa (proteína
P) como componente principal. La enzima monofuncional se denominó CHA mutasa-F.
En P. aeruginosa PAT 1051, un mutante que requiere phe, la CHA mutasa-F era la única
actividad de mutasa presente. Se detectó CHA mutasa-F en Erwinia sp., En Serratia marcescens,
y quizás sorprendentemente, en S. typhimurium.

Una CHA mutasa disociable de Brevibacterium flavum tenía propiedades únicas. Fue
fuertemente inhibido por phe y tyr, y la inhibición fue superada por trp. Contenía dos
componentes no idénticos A y B. A era un tetrámero de subunidades de M = 55.000 y B un
dímero de subunidades con M = 13.500.
Además, A era una proteína bifuncional que también contenía actividad DAHP sintasa. La
actividad de CHA mutasa estaba presente en varios organismos formadores de esporas del orden
Actinomycetales. Se observó inhibición con tyr (todos los casos) y trp (la mayoría de los casos).
b. Levaduras
La CHA mutasa monofuncional de S. cerevisiae estuvo sujeta a inhibición por retroalimentación
por tyr, pero fue fuertemente activada por trp en un mecanismo de control único. Se clonó y
secuenció el gen AR07 de tipo salvaje; un ORF de 771 pb codificaba un polipéptido de 256
residuos de aminoácidos (incluido el met de iniciación) con MI = 29.750. No hubo homología
entre la CHA mutasa de levadura y las actividades de CHA mutasa N-terminal de las dos
enzimas bifuncionales de E. coli. Las mutaciones de CHA mutantes que no responden a tyr y trp,
mostraron un aumento de 10 veces en la actividad enzimática. La mutación resultó de un
intercambio de un solo par de bases que provocó una sustitución de thr a ile en la porción C-
terminal de la enzima.

La levadura, Pichia guilliermondii, produjo un mutante con una pérdida completa de sensibilidad
a phe y una pérdida considerable de sensibilidad a trp. Además, en ausencia de trp, la actividad
de CHA mutasa del mutante fue siete veces mayor que la del tipo salvaje. Los cambios son
similares a los que se acaban de señalar en S. cerevisiae. Una CHA mutasa parcialmente
purificada (MI = 63.000) de Candida maltosa estaba inactiva a menos que estuviera presente trp.
No se observaron formas isocímicas. Era similar a una preparación de Hansenula henricci.

C. CHA MUTASE EN PLANTAS

Se ha reconocido desde hace algún tiempo que las plantas contienen con frecuencia más de una
forma de CHA mutasa. La mayor parte de la atención se ha centrado en dos especies: CHA
mutasa-1, una enzima cloroplasto, activada por trp e inhibida por phe y tyr; y CHA mutasa-2,
una enzima citosólica, que no está regulada por aminoácidos aromáticos. Aunque las primeras
pruebas de una tercera isoenzima inestable se habían descartado en gran medida, un artículo
reciente informó la separación de tres formas de CHA mutasa de Solunum fuberosum mediante
cromatografía de celulosa DEAE en el sistema de tampón Pipes; otros búferes no produjeron este
nivel de resolución. Dos de las formas, CHA mutasa-1A y CHA mutasa-1B, fueron activadas por
trp e inhibidas por phe y tyr. La tercera forma, CHA mutasa-2, no se vio afectada por los
aminoácidos aromáticos. Las formas 1A y 1B tenían ambas Mr = 60.000 y parecían ser artefactos
generados por el tampón aniónico. Previamente, se purificó una forma inducible, sensible a
aminoácidos aromáticos de patata CHA mutasa (1033-f0ld); no se examinó la homogeneidad.

La purificación de las isoenzimas CHA mutasa de plántulas de frijol mungo y sorgo se logró
antes de 1975. Al parecer, la homogeneidad electroforética se ha obtenido sólo con CHA mutasa-
1 de sorgo (purificación de 1389 veces). Esta isoenzima regulada era posiblemente un dímero
con Mr nativo = 56.000 y subunidad Mr = 36.5000. La isozima CHA mutasa-2 purificada (1018
veces, M, = 48.000) todavía mostraba un componente menor en la electroforesis. Estas dos
isoenzimas de Sorghum bicolor eran inmunológicamente distintas. Todavía no se sabe si los dos
han evolucionado a partir de un ancestro común o si los dos genes han evolucionado de forma
independiente.

Muchas plantas contienen las dos formas isozimáticas. Aunque en algunos casos no se había
detectado la especie citosólica no regulada, ahora se ha documentado la existencia de esta
isoenzima en una de las excepciones, Solunum fuberosum. La proporción de actividades mutasa
también se examinó en respuesta a las heridas. La proporción de CHA mutasa-1: CHA mutasa-2
fue de 2: l en discos frescos y de 9: l en discos de tubérculos envejecidos. En contraste con la alta
actividad de CHA mutasa-1 en discos envejecidos, CHA mutasa-2 comprendía la actividad total
mayoritaria en hojas verdes (CHA mutasa-1: CHA mutasa-2 = 1: 4). Aparentemente, existe una
regulación específica de órganos de la expresión de las dos isoenzimas. Este trabajo proporcionó
más evidencia de la existencia general de la disposición de "vía dual".

Se purificaron parcialmente dos isozimas de CHA mutasa a partir de Nicotianu sylvestris. CHA
mutasa-1 (M, = 52.000) fue la fracción principal en protoplastidos de cultivos en suspensión o
cloroplastos de hojas verdes; estaba sujeto a inhibición por retroalimentación por tyr. La CHA
mutasa-2 (M, = 65.000) era una enzima citosólica no inhibida por tyr. Una consideración
detallada de la regulación alostérica diferencial de las dos isoenzimas indicó que la enzima del
cloroplasto, CHA mutasa-1, estaba relacionada con la biosíntesis de aminoácidos aromáticos,
mientras que la isoenzima citosólica, CHA mutasa-2, estaba involucrada en la biosíntesis de
metabolitos secundarios.

FIGURA 29. Mecanismo de reacción de adición-eliminación para ICHA sintasa.

1- Isocorismato sintasa
Esta importante enzima se clasifica formalmente como isomerasa (EC 5.4.99.6); la reacción, sin
embargo, implica la adición y eliminación de -0H- (ver Figura 29). Es solo recientemente que
la situación se aclaró con respecto a entC, el gen que codifica la ICHA sintasa en E. coli. Ahora
parece que cuatro genes necesarios para la síntesis de enterobactina (Sección II.D.3) están
enlazados en un operón policistrónico regulado por hierro, entCEBA (PI5); P15 es una proteína
no caracterizada, con Mr = 15.000. La secuencia de nucleótidos completa de entC se ha
determinado recientemente; un ORF de 1173 pb codifica una proteína de 391 residuos, M =
42.917. Existe una homología considerable con otras dos proteínas que utilizan CHA, trpE y
pabB.

Antes de 1990, el producto polipeptídico de entC, ICHA sintasa, se había purificado solo
parcialmente, utilizando K. pneumoniae como fuente. Se informaron algunas mejoras en el
procedimiento estándar”. La sintasa ICHA ahora se ha purificado (12 veces) hasta homogeneidad
a partir de una cepa de E. coli de sobreexpresión (K38 / pGPl-2 / pJLT5053). Se obtuvo un
rendimiento de 11 mg a partir de 3 l de células. La subunidad Mr era 43.000 en excelente acuerdo
con el valor predicho a partir de la secuencia de nucleótidos. Se demostró que el grupo hidroxilo
entrante se deriva del agua, en lugar de por transferencia intermolecular de CHA.
J. Actividades enzimáticas bifuncionales del tronco principal

1.CHA Mutasa-PPA Deshidratasa de E. coli.

La CHA mutasa-PPA deshidratasa bifuncional de E. coli se purificó (250 veces) hasta
homogeneidad electroforética mediante el uso de una columna de afinidad Sepharosyl-phe en
presencia de NaCl 0,4 M (pH 8,2). El NaCl inhibió ambas actividades enzimáticas y aumentó la
sensibilidad de la enzima a la inhibición de la phe. Este método de purificación ha sido utilizado
por muchos otros investigadores; Aparentemente, no hay informes de métodos mejorados, por
ejemplo, usando cepas de sobreexpresión. El gen pheA, que codifica esta proteína bifuncional,
ha sido secuenciado y especifica una proteína de 386 residuos con M = 43,111 (incluye el primer
residuo met, pero no formilo). Existe cierta homología entre las enzimas CHA mutasa-PPA
deshidratasa y CHA mutasa PPA deshidrogenasa.

Se han obtenido todas las clases posibles de mutantes de E. coli sin actividad deshidratasa,
actividad mutasa o ambas. En un estudio detallado, se aisló primero una cepa de E. coli que
carece de CHA mutasaPPA deshidrogenasa y se sometió a mutagénesis adicional (se requirió
que no estuviera presente ninguna actividad mutasa, aparte de la asociada con la deshidratasa).
Fue posible obtener una proteína (> 95% pura) que carece de PPA deshidratasa; la M mínima fue
40.000 (similar a la de la enzima de tipo salvaje). Los intentos de purificar proteínas solo con
PPA deshidratasa, o sin ninguna actividad, no tuvieron éxito ya que las proteínas no se unieron a
la columna de afinidad Sepharosyl-phe. La mutación a la condición de deshidratasa negativa
tuvo poco efecto estructural en el sitio de la mutasa, de acuerdo con que los dos sitios estuvieran
separados. Todavía estaba presente una cys reactiva (ver más adelante), y un residuo thr estaba
implicado en la actividad de la deshidratasa.

El tamaño más pequeño de la CHA mutasa-PPA deshidratasa es probablemente un dímero de dos

subunidades idénticas (M = 43.000). A pH 8,2, tiene lugar una autoasociación dependiente de la
concentración, y un dímero y un tetrámero coexisten en un rápido equilibrio reversible. También
es posible una asociación adicional a una forma polimérica superior. A pH 7,4, la especie
principal es probablemente un octámero. La adición del inhibidor de retroalimentación, phe, o un
aumento de la fuerza iónica también provoca un aumento de formas de polímeros superiores a
pH 8,2. Una variedad de efectos (por ejemplo, la cinética alostérica, la unión del inhibidor) son
probablemente todas consecuencias de la autoasociación y / o isomerización de la enzima.

Los valores de PKM para CHA en un tampón citrato / fosfato / borato diferían significativamente
de los obtenidos en soluciones de acetato / fosfato / borato, particularmente en la región de pH 6
a 8. El trabajo posterior mostró que varios ácidos di y tricarboxílicos eran inhibidores y de
manera diferencial como se muestra a continuación (ver también Mecanismo de reacción):
Estos resultados son consistentes con la existencia de dos sitios de actividad separados para CHA
mutasa y PPA deshidratasa. Dado que todos estos inhibidores tienen un efecto sobre ambas
actividades, puede haber alguna interconexión entre los sitios. No hubo evidencia de
canalización de PPA de un sitio a otro. Los efectos de la modificación química específica de los
residuos de aminoácidos en la CHA mutasa-PPA deshidratasa purificada (E. coli) son los
siguientes:

1. Cisteína. El reactivo dirigido a cys, 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoato) (DTNB), inhibió

completamente la actividad de la deshidratasa en una proporción de 1,2 mol de -SH por
mol de subunidad enzimática, pero dio solo una inhibición del 5% de la mutasa CHA.
actividad. La reacción de dos moles más de -SH por mol de subunidad enzimática elevó
la inhibición de mutasa al 30%. Este reactivo provocó cambios significativos en la
estructura secundaria de la proteína (el contenido de la hélice a aumentó del 25 al 28%),
probablemente en el entorno alrededor de uno o más residuos tyr. La adición de PPA
(inhibidor competitivo de la actividad CHA mutasa) a la enzima modificada redujo el
contenido helicoidal al de la enzima nativa. Tal adición también disminuyó o eliminó la
reactividad del grupo -SH con DTNB. La inactivación diferencial de las dos actividades
proporcionó más evidencia de sitios separados o ligeramente superpuestos. Resultados
similares obtenidos con N-etilmaleimida y tetrationato llevaron a la conclusión de que no
había ningún papel funcional para cys-SH en el sitio activo de la mutasa.

2. Tirosina. La modificación por tetranitrometano de 2 residuos tyr por subunidad

enzimática dio de nuevo una inactivación diferencial; La actividad de la deshidratasa se
perdió por completo, pero solo el 30% de la actividad de la mutasa.

3. Lisina. El sulfonato de 2,4,6-trinitrobenceno dio una inactivación completa de la

actividad mutasa y sólo una pérdida del 20% de la actividad deshidratasa.

4. Triptófano. En la reacción con bromuro de dimetil (2-hidroxi-54-trobenzy1) sulfonio,

hubo una pérdida parcial de ambas actividades y una desensibilización de ambas a la
inhibición por phe. El posible papel de los residuos de trp no estaba claro.
En resumen, todos estos resultados indicaron sitios separados o solo ligeramente superpuestos
para las dos actividades. Se han preparado cuatro análogos de sulfóxido de tetrahidro- y dihidro-
PPA. Todos se comportaron como inhibidores competitivos modestos de E. coli CHA mutasa-
PPA deshidratasa sin diferencias significativas en la afinidad. Por tanto, es poco probable que se
unan como análogos de sustrato.

2. CHA Mutasa-PPA deshidratasa de otros organismos

La enzima bifuncional de Acinetobacter calcoaceticus se purificó hasta homogeneidad
electroforética, siendo la purificación 714 veces (CHA mutasa) y 885 veces (PPA deshidratasa).
La enzima nativa era un dímero (subunidad Mr = 45.000); en presencia de phe o tyr, hubo un
doble aumento de M, de la enzima nativa. La Phe fue un inhibidor no competitivo relativamente
pobre de la CHA mutasa y un fuerte inhibidor de la actividad de la PPA deshidratasa. La
actividad de CHA mutasa fue inhibida por retroalimentación (competitivamente) por el producto
de reacción, PPA. La PPA deshidratasa, pero no la actividad CHA mutasa, fue estimulada por
una alta fuerza iónica que redujo la unión cooperativa positiva observada de PPA. Tyr activó la
actividad de la PPA deshidratasa al reducir KM para PPA (sin afectar la cooperatividad).
Una proteína bifuncional CHA mutasa-PPA deshidratasa estaba presente en Neisseria
gonorrhoeae. Ambas actividades enzimáticas fueron inhibidas por phe y la PPA deshidratasa fue
fuertemente activada por tyr.

3. CHA Mutasa-PPA Deshidrogenasa de E. coli

La CHA mutasa-PPA deshidrogenasa se purificó primero hasta homogeneidad (65 veces con
respecto a la actividad mutasa) de E. coli JP232 en 1971. La enzima nativa era dimérica con M =
82.000. Se ha obtenido una proteína dimérica homogénea de E. coli JP 2312 (un mutante
regulador), con una actividad específica tres veces mayor que la preparada anteriormente. Los
datos cinéticos sugirieron un mecanismo aleatorio de equilibrio rápido con dos complejos sin
salida (E-NADH-PPA y E-NAD-HPP). Otra purificación de E. coli JP2319 (contiene los alelos
tyrR 370 y trpS 378) aprovechó el hecho de que el crecimiento con cantidades limitantes de trp
proporcionó la enzima a niveles de 50 a 100 veces los de las cepas de tipo salvaje. Las altas
concentraciones de glicerol (20 a 50% v / v) promovieron la estabilidad.

Se utilizaron técnicas de ADN recombinante para producir altos rendimientos de CHA mutasa-
PPA deshidrogenasa homogénea (hasta el 4% del peso seco de la célula). E. coli K12 se
transformó con un plásmido multicopia, pKB45, para producir la cepa KB9397 que dio 55 mg de
enzima pura a partir de 20 g de células. Dado que se producía pérdida de plásmido de esta cepa si
se omitía la tetraciclina del medio de crecimiento, se construyó una segunda cepa, JFM30, con
prototrofia tyr. El rendimiento de enzima de esta cepa fue comparable al de KB9397 y la cepa se
utilizó con éxito durante un período de 2 años. Los niveles de enzima fueron 5000 veces más
altos que los de las cepas de tipo salvaje y 6 veces más altos que los de los mutantes reguladores.
La enzima era idéntica a la de una cepa tyrR.

El gen fyrA se ha secuenciado y conduce a una longitud calculada de 373 residuos de

aminoácidos para CHA mutasa-PPA deshidrogenasa. El Mr = 42.042 calculado es consistente
con los realmente observados. N-formil met se eliminó después de la traducción. En los primeros
54 aminoácidos del producto del gen tyrA, 22 residuos eran idénticos y 4 eran similares a los del
producto del gen pheA. El tercio N-terminal de cada proteína contiene la actividad mutasa
(común) y el resto la actividad PPA deshidrogenasa o PPA deshidratasa. Además de tyrA, el
operón tyr contiene un segundo gen estructural, aroF, que codifica la DHA sintasa-Tyr.

Mediante mutagénesis in vitro del ADN plasmídico que contiene el gen fyrA, seguida de la
transformación posterior de cepas de E. coli, se obtuvieron seis mutantes que produjeron una
enzima mutasa positiva-deshidrogenasa negativa y una proteína que carecía de ambas
actividades. La pérdida de la actividad de la PPA deshidrogenasa se debió aparentemente a una
marcada reducción de su capacidad para unirse a NAD ». El punto isoeléctrico de esta enzima
mutante fue más bajo que el de la enzima de tipo salvaje, consistente con la alteración de un
único residuo de aminoácido relacionado con la unión de NAD +. Esta alteración no afectó la
interacción de la enzima con CHA, PPA y tyr. No fue posible sacar conclusiones definitivas
sobre la relación de los sitios activos para las actividades.
Más recientemente, se han diseñado fragmentos del gen tyrA para expresar actividades COA
mutasa o PPA deshidrogenasa sin el otro.

a. RELACIONES EN EL SITIO PARA CHA MUTASA-PPA DESHIDROGENASA

Aunque parece haber una relación estrecha entre los dos sitios enzimáticos, la situación no es tan
sencilla como la de CHA mutasa-PPA deshidratasa. En los primeros trabajos, los datos
experimentales para el curso temporal de la reacción general se compararon con simulaciones
por computadora derivadas de modelos de uno y dos sitios. En relación con otras observaciones,
el modelo de dos sitios se consideró poco probable y se llegó a la conclusión bastante inusual de
que las dos reacciones diferentes ocurrieron en un solo sitio.

Esta hipótesis se modificó posteriormente ya que el malonato en concentraciones bajas impedía

la reacción de la enzima con PPA pero no con CHA; El malonato de dietilo, sin embargo,
impidió la unión de ambos sustratos. Luego se sugirió que los dos sitios comparten algunas
características comunes y se superponen. Un trabajo más reciente sobre la inhibición del
producto final por tyr en presencia de NAD + apoyó esta idea. Tyr a 100 pJ4 inhibe ambas
actividades de manera diferencial: 95% para PPA deshidrogenasa y un máximo de 45% para
CHA mutasa. La afinidad de la enzima por tyr se incrementó mediante NAD + y la afinidad por
NAD + se incrementó en tyr. Estos efectos resultaron de la agregación enzimática con NAD + y
la unión preferencial de tyr a un tetrámero. Los derivados de tyr sustituidos en la posición 3
también fueron inhibidores, 3-fluoro-DL-tyr más que tyr. La tiramina, HPP y D-tyr fueron
inhibidores deficientes de la PPA deshidrogenasa. Se concluyó que, para la vinculación,
la configuración L era necesaria y tanto 𝝰-COO- como -NH3 + eran necesarios.

Aunque los derivados de CHA y adamantano eran inhibidores competitivos lineales (ambas
reacciones) en condiciones cinéticas de Michaelis-Menten, esto no era así con concentraciones
de sustrato más bajas y / o concentraciones de inhibidor más altas. Además, se produjo una
cooperatividad positiva para la unión del sustrato en ausencia de inhibidores con un intervalo
más amplio de concentraciones de sustrato. Claramente, la enzima no exhibe propiedades de una
proteína alostérica. La adición de albúmina activó tanto la CHA mutasa como la PPA
deshidrogenasa y hubo un cambio en la cinética de Michaelis-Menten.

Este revoltijo de información cinética apoyó una estrecha relación espacial entre dos sitios
activos que interactúan. Un apoyo adicional fue el hallazgo de tres secuencias únicas que
contienen cys en cada subunidad de la CHA mutasa-PPA deshidrogenasa de E. coli. Una cys
particularmente importante fue esencial para ambas actividades. El PPA protegió a la enzima de
la inactivación por DTNB y la combinación de NAD + y tyr fue más eficaz para reducir la tasa
de inactivación y proteger las actividades enzimáticas. Estos resultados fueron consistentes con
dos actividades enzimáticas ubicadas en sitios cercanos e interactuando. Será útil estudiar las dos
actividades separadas que presumiblemente ahora se pueden obtener de los componentes
genéticos separados de E. coli.

4.DHQ deshidratasa-SHK deshidrogenasas de plantas

Se ha reconocido desde hace algún tiempo que la DHQ deshidratasa SHK deshidrogenasa
generalmente se asociaban juntas en plantas superiores. Esta enzima bifuncional se aisló antes
del musgo, Phycomitrella patens y se purificó (aproximadamente 1300 veces) hasta
homogeneidad. Las dos actividades enzimáticas se asociaron con un único polipéptido (M,
aproximadamente 48.000). En algunos casos, la enzima bifuncional se presentó como formas
isoenzimáticas. Se purificó un complejo a partir de hojas de espinaca desvenados (60 ug de hojas
de 8 kg). La preparación dio "esencialmente una banda de proteína" en SDS-PAGE. Sin
embargo, en condiciones no desnaturalizantes, se obtuvo un patrón de cuatro bandas; se creía que
estos eran isómeros de carga y no diferían significativamente en Mr (59.000 a 67.000,
dependiendo de las condiciones electroforéticas). Las dos actividades enzimáticas se asociaron
claramente con una única proteína ubicada en el estroma.

Se encontraron formas isozimáticas de SHK deshidrogenasa en extractos de cloroplasto de

plántulas de guisantes. La enzima fue codificada por el gen nuclear Skdh 1. Otros investigadores
encontraron que la SHK deshidrogenasa de los cloroplastos de guisante (probablemente un
complejo bifuncional) producía dos bandas principales en la electroforesis en gel de gradiente de
poliacrilamida. el otro tenía M, de aproximadamente 110.000. Ambos constaban de varias
subbandas aparentemente debido a una desagregación dependiente del tiempo. Estas variantes de
tamaño molecular de la SHK deshidrogenasa eran posiblemente productos de degradación de un
complejo multiproteico lábil estrechamente relacionado con la proteína aromática (ver Sección
II.L)

Se purificó una proteína definitivamente bifuncional (6500 veces) hasta homogeneidad a partir
de plántulas de guisantes. La enzima era monomérica con M = 59.000. Este valor fue cercano a
la suma de la subunidad M, valores de las dos enzimas separables de E. coli - DHQ deshidratasa
= 29,000 y SHK deshidrogenasa = 32,000 (Sección 1I.C y II.D.l). Por lo tanto, la enzima
bifuncional de la planta puede haberse formado por la fusión de dos genes, similares a los que se
pueden separar en E. coli. Existían tres formas isoenzimáticas, dos de las cuales eran
cloroplastídicas. Otros trabajadores también han observado una deshidrogenasa SHK
extraplastídica en plantas de guisantes; tanto las actividades intraplastídicas como las
extraplastídicas fueron reguladas por la intensidad de la luz y la disponibilidad de nutrientes
minerales.

Una situación diferente se encontró en extractos de plántulas de maíz. Una DHQ deshidratasa-
SHK deshidrogenasa ("DHQase 1") estaba acompañada de una DHQ deshidratasa-QA
deshidrogenasa ("DHQase2"). La actividad enzimática para QA requirió NAD y fue fuertemente
activada por la presencia de SHK. O las dos actividades de "DHQase2" se asociaron como un
complejo o como un polipéptido bifuncional (para QA deshidrogenasa, consulte la Sección
III.J.2.a).

5.Otras enzimas polifunctlonales

Además de los complejos aromáticos (Sección II.L), ciertas enzimas polifuncionales en B.

subtilis se analizan por separado (Sección 1I.K). En Brevibacferium flavum se produce una
DAHP sintasa-CHA mutasa bifuncional. La purificación dio una enzima aparentemente
homogénea con Mr = 250.000; un grupo -SH fue esencial para la DAHP sintasa, pero no para la
actividad de la CHA mutasa.
La naturaleza compleja de subunidades de esta preparación se analiza en la Sección II.J.2.a).

K. Enzimas polifuncionales en B. subtilis

Es conveniente discutir por separado ciertos complejos enzimáticos polifuncionales de B.

subtilis. En este organismo, los genes que codifican enzimas biosintéticas tienden a estar más
agrupados que en el caso de E. coli y los genes aro y trp pueden ser parte de un "supra operón".

Entre 1972 y 1978, se estudiaron algunas enzimas de la vía SHK en este organismo utilizando la
cepa WB 2802 (un derivado prototrófico de B. subtilis 168). Se purificó una DAHP sintasa-CHA
mutasa bifuncional hasta homogeneidad (160 veces) como una única proteína; M, de monómero
= 38.500. Se concluyó que ambas actividades enzimáticas residían en una única cadena
polipeptídica. Se podrían formar varios polímeros, hasta un tetrámero. La actividad de la DAHP
sintasa fue sensible a la inhibición por retroalimentación por PPA o CHA. Esta proteína
bifuncional tenía la notable capacidad de activar la quinasa SHK. La última enzima se obtuvo
durante la cromatografía con solo un rastro de actividad. Se restauró la actividad quinasa
completa al mezclar con el complejo DAHP sintasa-CHA mutasa.

En la proteólisis leve de la proteína bifuncional, se eliminó la actividad CHA mutasa, dejando

una proteína con solo DAHP sintasa. Los datos sugirieron que el sitio activo de CHA mutasa era
idéntico al sitio de inhibición por retroalimentación para la DAHP sintasa. Además, en estas
condiciones, se perdió la capacidad de activar la quinasa SHK. Parecía haber dos sitios distintos
para la actividad de la CHA mutasa y para la activación de la quinasa SHK, y estos sitios
aparentemente estaban ubicados muy cerca de la cadena polipeptídica.
En resumen, este organismo contenía un complejo enzimático trifuncional de DAHP sintasa,
SHK quinasa y CHA mutasa, estando la primera y la tercera de estas actividades localizadas en
una única cadena polipeptídica bifuncional.
Otro complejo trifuncional contenía dos de las enzimas restantes de la vía SHK (DHQ sintasa y
CHA sintasa) y, además, una flavina reductasa dependiente de NADPH que cataliza la siguiente
reacción:

La actividad de la CHA sintasa se purificó (aproximadamente 139 veces) hasta homogeneidad

electroforética y tenía M = 24.000 (electroforesis en gel de SDS). Necesitaba para la actividad la
flavina reductasa dependiente de NADPH, flavina (FMN o FAD), NADPH (NADH estaba
inactivo) y Mg2 +. La flavina reductasa, también purificada hasta la homogeneidad, tenía Mr =
13.000 (electroforesis en gel SDS).
La B. subtilis DHQ sintasa se purificó como un complejo en asociación con las dos enzimas que
se acaban de describir (CHA sintasa y flavina reductasa dependiente de NADPH). La DHQ
sintasa solo fue activa en asociación con la CHA sintasa. Sin embargo, como se acaba de indicar,
la flavina reductasa podría separarse del complejo que luego retuvo la actividad de la DHQ
sintasa. Se requirieron tanto NAD + como Co2 + para la actividad de la DHQ sintasa.

Estos resultados concuerdan con la observación de que los mutantes de un solo paso que carecen
de actividad CHA sintasa también carecían de actividad DHQ sintasa. Sin embargo, los mutantes
de un solo paso que carecen de actividad de DHQ sintasa tenían niveles normales de actividad de
CHA sintasa. Las tres enzimas, DHQ sintasa, CHA sintasa y flavina reductasa dependiente de
NADPH, estaban ubicadas en cadenas polipeptídicas separadas, pero asociadas juntas para
formar un complejo enzimático trifuncional.
Parece que se ha trabajado poco en este interesante sistema. Claramente, la clonación y
secuenciación de genes sería muy útil para desentrañar esta compleja situación. Es alentador que
ahora se haya informado de una amplificación genética de una unidad que contiene, entre otros,
el gen estructural de la quinasa SHK (arol). En las cepas NMM13 y NMM14, la actividad de la
enzima quinasa SHK fue cuatro veces mayor que la de la cepa original, NA64.

Aunque se indicó anteriormente que B. subtilis contenía una DAHP sintasa-CHA mutasa
bifuncional, esto es probablemente cierto solo para ciertas cepas como la 168. En la cepa de
Marburg de tipo salvaje, las enzimas son monofuncionales. Ambas enzimas se han purificado
parcialmente y tienen Mr idéntico, de 180.000 (tetramérico). La enzima monofuncional es
inhibida por PPA solamente; el bifuncional tanto por PPA como por CHA. Para dar cuenta de la
formación de la DAHP sintasa CHA mutasa bifuncional, se propuso la siguiente explicación.
Cada subunidad del tipo de enzima monofuncional tiene dos dominios distintos: uno compacto
con el sitio activo y un área más pequeña y más expuesta que contiene un sitio para el inhibidor
de retroalimentación, PPA. CHA no se une en este sitio. Sin embargo, la mutagénesis conduce a
la alteración del sitio de unión (¿cambio de un solo aminoácido?), Permitiendo ahora la unión de
ambos CHA y, preferentemente, del estado de transición intermedio para la reacción, CHA >>
PPA. Es decir, la enzima bifuncional surgió por generación artificial como resultado de una
mutación.
La importancia de estos complejos enzimáticos para la regulación no está clara. Cabe señalar
también que se han obtenido resultados muy diferentes con Bacillus licheniformis. En este
organismo, las tres enzimas de la vía SHK que acabamos de comentar se separaron fácilmente y
no formaron complejos.

L. Los complejos Arom

En algunos organismos, las cinco enzimas que catalizan la conversión de DAHP en EPSP se
especifican mediante grupos de genes, y las enzimas están presentes como un polipéptido
pentafuncional complejo. El polipéptido se denomina proteína aromática y ha sido objeto de una
revisión general.
Estos complejos han sido estudiados en hongos, particularmente N. crassa y A. nidulans, en
levaduras como S. cerevisiae y Schizosucchuromyces pombe, y en Euglena gracilis.

En general, los polipéptidos arom y las cinco enzimas separables de E. coli son homólogos. Por
tanto, los complejos pueden haber surgido por fusión de genes ancestrales similares a E. coli. Si
es así, al menos algunas de las regiones funcionales de las proteínas aromáticas deberían haber
mantenido un grado de autonomía estructural y podrían aislarse mediante proteólisis limitada. En
un estudio detallado de la proteólisis de la proteína arom de N. crassa, se obtuvo un polipéptido
estable de M = 68.000. Los mejores agentes proteolíticos fueron tripsina y subtilisina, pero
también se utilizaron quimotripsina y papaína. Un bucle corto y expuesto en el polipéptido arom
fue aparentemente particularmente susceptible a la proteólisis. El fragmento aislado resistió más
proteólisis.

El fragmento M, = 68.000 de la proteína urom original contenía actividades DHQ deshidratasa y

SHK deshidrogenasa; como se demuestra en este artículo, estas son las penúltimas y últimas
actividades en el extremo C-terminal de la proteína urom. Incluso después de la
desnaturalización con SDS o urea 8 M, el péptido del fragmento se replegó y recuperó parte de la
actividad deshidrogenasa de SHK. Es sorprendente que estas dos actividades enzimáticas
también se produzcan juntas como proteína bifuncional en algunas levaduras, el musgo
Phycomirrellu patens, y en varias plantas (véase la Sección II.J). Se han obtenido otros
fragmentos proteolíticos de la proteína arom de N. crussu pero aún no están bien caracterizados.
Se obtuvo un péptido truncado con actividades EPSP sintasa y DHQ deshidratasa a partir de la
proteína arom de A. niduluns.

En S. cerevisiae, el gen AROI codifica el polipéptido arom pentafuncional. La expresión de este

gen estuvo bajo el mecanismo de “control general”, con una respuesta a la limitación en el aporte
de aminoácidos. La longitud de la molécula de ARNm (después de la eliminación de la cola poli
A) fue de alrededor de 5000 nucleótidos. En las secuencias flanqueantes en 5 'no traducidas del
gen, había múltiples copias del hexanucleótido, TGACTC. Esta secuencia de ADN corta y
repetida es característica de varios genes co-regulados bajo control general y funciona como un
sitio de unión para la proteína activadora reguladora de GCN4 (ver también el trabajo sobre el
producto del gen AR03, DAHP sintasa-Phe).

Los genes y enzimas individuales de S. cerevisiae son los siguientes: AROIC, DHQ sintasa;
AROIE, DHQ deshidratasa; AROID, SHK deshidrogenasa; AROIB, quinasa SHK; y AROIA,
EPSP sintasa. Se determinó la secuencia de nucleótidos completa (4767 bases, incluido el codón
de terminación TAG) y correspondía a un polipéptido de 1588 residuos de aminoácidos con un
M calculado = 174.555. Este valor es cercano al de 159,698 para la suma de las masas de las
cinco enzimas separables de E. coli. El número total de aminoácidos para la suma de las enzimas
de E. coli es 113 más pequeño que para la proteína de S. cerevisiue. Muchos de los residuos
adicionales en la proteína de S. cerevisiae ocurren en regiones que unen los dominios catalíticos.
Al comparar las secuencias de proteínas de E. coli y arom, se encontraron claras homologías
entre la secuencia de cada enzima de E. coli y una región de longitud correspondiente en la
proteína arom. Los primeros 392 residuos eran homólogos con la DHQ sintasa de E. coli; a partir
de entonces, el orden de la enzima fue EPSP sintasa, quinasa SHK, deshidratasa DHQ y, en el
extremo C-terminal, deshidrogenasa SHK. Las homologías observadas variaron del 38% para la
EPSP sintasa al 21% para la DHQ deshidratasa. Las características de las enzimas individuales
de la proteína arom de S. cerevisiae son:

1. Sintetizador DHQ. Hay dos subdominios muy conservados (residuos 100-213 y 258-387) en
comparación con la enzima de E. coli. Una de estas regiones incluye el pliegue de unión a
nucleótidos de Pap.

2. Sintetizador EPSP. Este dominio, ubicado entre los residuos 404 y 866, está bien conservado.
La homología con la enzima de E. coli es del 38% y con la de A. nidulans del 55%; hay dos
subdominios muy bien conservados. Hay una cys altamente conservada (cys-853 en S.
cerevisiue) en todas las secuencias examinadas. Aunque pro 10 1 es aparentemente importante en
las enzimas bacterianas (la resistencia al glifosato en S. typhirnuriurn implica el cambio, pro >>
ser), se reemplaza por phe en S. cerevisiue (posición 505) y en A. nidulans. Parece que pro no
puede ser una característica esencial en la sensibilidad al glifosato.

3. SHK quinasa II. Esta enzima, ubicada desde el residuo 887 hasta 1059, muestra menos
homología en comparación con E. coli. Hay una región bien conservada (895-909) que tiene
homología de secuencia con los sitios de unión de ATP en algunas otras enzimas
(fosfofructoquinasa y adenilato cinasa).

4. Deshidrutusa DHQ. Es probable que Lys-1227 esté implicado en la formación de imina, y un

residuo "his" para la abstracción de protones es probablemente his-1 198. Este residuo también
se conserva en el correspondiente dominio de proteína aromática de A. nidulans.

5. SHK deshidrogenasa. Aunque el E. coli-S. La homología cerevisiue es del 25%, la

deshidrogenasa SHK de A. nidulans ha divergido sustancialmente (15% de homología con E.
coli y 27% de homología con S. cerevisiae).

En N. crussu, los cinco genes que codifican la proteína arom son arom2, DHQ sintasa; urom9,
DHQ deshidratasa; arom1, SHK deshidrogenasa; arom5, quinasa SHK; y arom4, EPSP sintasa.
La reinterpretación de la evidencia genética temprana indica que las actividades están ubicadas
en el polipéptido en la misma secuencia que en S. cerevisiue. Al menos parte del gen del
agrupamiento arom de N. crassa se ha clonado en un vector de fago 𝝺 y se expresó en E. coli. El
inserto era de 4,0 kb y, por tanto, más pequeño que el tamaño esperado para el gen completo
(entre 4,5 y 4,6 kb). Estaba presente un nivel bajo de actividad deshidratasa DHQ (biosintética).
La ausencia de una parte del gen puede haber cambiado la estructura terciaria de la proteína y,
por lo tanto, reducido la actividad específica esperada para la enzima.

La proteína urom de N. crussu, purificada hasta homogeneidad electroforética (730 veces con
respecto a la actividad sintasa de DHQ), era un dímero de dos subunidades idénticas, cada una
con M = 165.000. Para obtener una proteína de este tamaño, la purificación tuvo que realizarse
rápidamente en presencia de inhibidores de proteinasa. Había un solo Zn2 + por subunidad, y
este metal (y NAD) era necesario para la actividad de la DHQ deshidratasa. Este requisito de
Zn2 + es interesante, ya que la DHQ sintasa de E. coli probablemente requiere Zn2 + in vivo en
lugar de Co2 +.
El locus arom de A. nidulans se clonó en un vector bacteriófago de E. coli. El análisis de 6,5 kb
de secuencia única reveló un único ORF de 4812 bases (incluyendo TAA como condón de
parada). La M inferida del polipéptido pentafuncional fue 175,101 (1603 residuos de
aminoácidos). Hubo una homología considerable (del 15 al 36%) con las enzimas individuales de
E. coli.
Se determinaron las posiciones físicas de las secuencias de ADN para el polipéptido urom y se
expresaron los subfragmentos en mutantes de E. coli uro apropiados. Las enzimas E. coli y A.
nidulans pueden haber surgido por evolución divergente de secuencias ancestrales comunes; el
locus del arom de A. nidulans es probablemente derivado de la fusión de gen múltiple.

El gen aro3 de Schizosuccharomyces pombe se clonó en el plásmido pBR322 de E. coli. El grupo

de genes especificó cinco actividades enzimáticas en el mismo orden que en N. crassa (diferente
de la de S. cerevisiea). La proteína Euglena gracilis arom se purificó (aproximadamente 2000
veces) y se estimó que tenía Mr = 249.000.

111. RAMAS DE LOS COMPONENTES DEL TRONCO PRINCIPAL

Las muchas posibilidades de ramificación que ocurren a lo largo de la vía SHK se examinan bajo
los siguientes encabezados: A, de intermedios pre-SHK y SHK; B, de S3P, EPSP y CHA; C de
PPA; y D, de ICHA. En cada título se identifica una figura esquemática de descripción general
para cada categoría.

A. Ramas de Pre-Shikimate Intermedias y Shikimato (Figura 30)

1. El papel de DAHP y DHQ

a. UNIDADES mC7 N DERIVADAS DEL 3-AMINO-5-HIDROXIBENZOATO

La ramificación de DAHP o DHQ puede dar lugar a 3-hidroxi-5-aminobenzoato o a 3-

aminObenzOato. Estos compuestos son los precursores de un resto metabólico particular, que se
encuentra en muchos antibióticos, etc., con siete átomos de carbono y un átomo de nitrógeno. En
particular, esta unidad es un rasgo característico de las ansamicinas. Estos compuestos tienen un
largo puente ansa alifático de origen policétido que une dos posiciones de un núcleo. El núcleo
puede ser naftalenoide (rifamicinas, estreptovaricinas, tolipomicinas, halomicinas, naftomicina,
actamicina, rubransaroles) o benzenoide (geldanamicina, herbimicinas, macbecinas,
ansatrieninas, maitansoides, ansamitocinas). Tienen muchas propiedades biológicas, incluidas
acciones antibióticas útiles o potencialmente útiles y actividades antivirales y antitumorales.
Todos contienen un anillo carbocíclico de seis miembros con un séptimo carbono y un átomo de
nitrógeno dispuestos en una disposición m. Esta unidad se conoce como unidad mC7N, o
simplemente unidad C7N. Una unidad similar está presente en otros productos naturales.

A pesar de las similitudes estructurales, existen varios medios para producir estas unidades,
incluidas algunas que no están relacionadas con la vía SHK. Para obtener más detalles y
referencias principales, se deben consultar otras revisiones. El esquema biosintético detallado
para muchas ansamicinas presentado por Ghisalba necesita cierta revisión a la luz de los estudios
sobre el origen de los átomos de oxígeno en las rifamicinas B, 0 y S.

Los experimentos genéticos y de trazadores han establecido un papel importante para el 3-

amino-5-hidroxibenzoato como una fuente de unidades mC7N. Probablemente actúa como una
unidad "de arranque" para el ensamblaje de la cadena de policétidos, presumiblemente como su
derivado de CoA. Los compuestos identificados como que utilizan 3-amino-5-hidroxibenzoato
incluyen rifamicinas, actamicina, ansamitocina, mitomicina, geldanomicina, naftomicina,
porfiromicina y ansatrieninas; la utilización de esta unidad se ejemplifica para el caso de
rifamicina S en la Figura 31.
En estos compuestos, SHK marcado no funciona como precursor de la unidad mC7N. Si bien
esta falla podría atribuirse a problemas de permeabilidad, no fue así para la formación de
ansatrienina por Streptomyces collinus. Este compuesto contiene, además de la unidad mC7N,
una unidad carboxilato de ciclohexano; con la etiqueta SHK se convierte a la última unidad, pero
no a la primera. Tal evidencia apunta fuertemente a un compuesto pre-SHK. Una posibilidad,
DHQ, no se incorporó a la mitomicina. Aunque las reacciones obvias conducirían desde DHQ o
DHS a 3-amino-5-hidroxibenoato, implican transaminación en el carbonilo C-3 de estos
compuestos. Es sabido, sin embargo, que el átomo de N se introduce en el átomo de carbono que
corresponde a C-5 de SHK. Otra posibilidad es la formación de un 5-DHQ (3-DHQ + QA + 5-
DHQ).

Quizás es más probable la formación de 4-desoxi-4-amino-DAHP ("amino-DAHP"). Una DAHP

sintasa que contenga una subunidad adicional con la capacidad de transferir el grupo gln-NH2
produciría fácilmente amino-DAHP. Las reacciones posteriores, similares a las de la propia vía
SHK, producirían 5-amino-DHS y, por tanto, 3-amino-5-hidroxibenoato (véase la Figura 31).
Aunque especulativo, la ruta puede estar respaldada por el hecho de que el nitrógeno amídico de
gln es el mejor donante de nitrógeno para la biosíntesis de rifamicina.

Cuando se administró [carboxi-13C] -3-amino-5-hidroxibenzoato a cultivos de Streptomyces

verticillatus, se formó [6-metil - 13C] -porfiromicina. El 3-amino-5-hidroxiboato recuperado
mostró una reducción significativa en el contenido de 13C (de 85 a 52% de exceso en átomos), lo
que estableció este compuesto como un nuevo aminoácido aromático natural". De hecho, se ha
aislado de una cepa de Nocurdiu meditterunei bloqueó la producción de rifamicina.

La adición de 3-amino-5-hidroxibenzoato a una fermentación de actamicina aumentó el

rendimiento de antibiótico, apoyando así un papel en la biosíntesis de actamicina. Adiciones
similares de los derivados 4-cloro, 6-cloro- y N y O-metilo reprimieron la biosíntesis de
actamicina y no condujeron a la producción de actamicinas estructuralmente modificadas.
FIGURA 30. Ramas de la vía SHK en DAHP, DHQ, DHS y SHK. Las estructuras
saturadas (ciclohexanos) se agrupan en la parte superior de la figura.

FIGURA 31. Posible vía de biosíntesis de 3-amino-5-hidroxibenzoato (D) y su papel en la

formación de ansamicina. A = "amino-DAHP", B = "Amino-DHQ, C =" amino-DHS ". La
ansamicina que se muestra es rifamicina S. Por supuesto, se requiere para la formación de A,
una molécula de PEP. B + C y C + D ambos requieren pérdida de agua. No hay información
sobre configuraciones en los centros quirales transportando el grupo putativo -NH2. El resto de
la molécula de ansamicina deriva como policétido a partir de unidades de acetato y propionato, y
también requiere S-adenosilmetionina para la formación del grupo metoxilo.
b. UNIDADES mC7N DE SAMINOBENZOATE

Durante la formación de pactamicina por Streptomyces pactum, se incorporó 3-aminobenzoato

como una unidad mC7N. Una posible ruta al 3-aminobenzoato sería mediante la transaminación
de DHS o DHQ (Figura 32).

C. UNIDADES mC7N NO DERIVADAS DE LOS INTERMEDIOS DE SHK.

Por conveniencia, se señalarán brevemente las vías que no involucran intermedios de SHK. Las
unidades mC7N de asukamicina (ver Sección III.A.3) y manumicina (Figura 32B) pueden
originarse en un resto C4 del ciclo de Krebs (posiblemente succinato) y una unidad C3 de una
combinación de triosa (posiblemente glicerol). Curiosamente, la adición de 3-aminobenzoato a
Streptomyces parvulus suprime la formación de manumicina y conduce a un nuevo metabolito
(Figura 32C) que carece de la estructura de epóxido característica y con un sistema de anillo
completamente aromático. El componente valienamina de la acarbosa y la validamicina A surge
de una condensación C3 + C2 + C2 y la unidad mC7N de la quinamicina tiene un origen
policétido vía 4-amino-2-hidroxitoluato.

D. CAMINO QUINADO

Aquí se dan algunas explicaciones de los procesos que involucran QA. Este ácido se encuentra
comúnmente en plantas libres o en estructuras combinadas como ésteres y puede estar presente
en cantidades tan altas como 2 a 10% del peso seco de hojas de plantas superiores. Se sabe desde
hace bastante más de 100 años que la QA se convierte en ácido hipúrico en el hombre; esta
transformación se limita al hombre y a los monos del Viejo Mundo. Requiere la formación de
benzoato seguida de conjugación con glicina para hipurato.

El carboxilato de ciclohexano es un intermediario y se forma por la acción de bacterias

intestinales, con la aromatización adicional a benzoato llevada a cabo por enzimas animales. Por
tanto, los monos Rhesus tratados con neomicina para suprimir las bacterias intestinales muestran
una disminución considerable en la formación general de benzoato. La conversión
presumiblemente ocurre de la siguiente manera:

Los pasos para DHS forman parte de la "vía de QA" que se analiza aquí con referencia a plantas
y varios microorganismos (ver Figura 33).
El papel de la garantía de calidad en las plantas es algo enigmático. Una posibilidad es que QA
funcione como un reservorio para proporcionar intermedios de la vía SHK bajo ciertas
condiciones. Sin embargo, los experimentos con trazadores han establecido que el grupo de QA
es metabólicamente activo con un rápido recambio. Aunque QA podría estar formado por una
rama de la vía SHK del tronco principal al nivel de DHQ, algunas pruebas han sugerido una vía
independiente para la biosíntesis de QA. En cultivos de células de tabaco, en condiciones de
formación y no formación de brotes, hubo una mayor tasa de síntesis neta de QA que SHK a
partir de glucosa [14C]. Estos resultados se sostuvieron para indicar que QA posiblemente era un
componente regulador en la vía SHK.

Para la formación de QA a partir de la vía SHK, sería necesaria una QA deshidrogenasa. Tras los
primeros informes sobre el aislamiento de tales preparaciones de plantas, se ha realizado un
trabajo más detallado. En cultivos de tejido de células de tabaco formadoras de brotes, hubo un
aumento rápido y significativo en la actividad QA deshidrogenasa, en la dirección, QA + SHK,
desde los días 3 a 12. Esta actividad fue mayor en el tejido formador de brotes que en el tejido no
formador de brotes. . QA deshidrogenasa estaba presente en extractos de plántulas de pino
etioladas; estas preparaciones convirtieron QA marcado en protocatecuato, galato y vanilato.

FIGURA 32. Utilización de 3-aminobenZOato. "La linea superior muestra una posible ruta
de DHS al 3-aminobemato y su posterior incorporación a la pactamicina, estructura A. La
unidad mC7N en la pactamicina parece ser C8 a primera vista; sin embargo, el -CH3 unido
al carbonilo deriva del acetato. El compuesto B, manumicina (de S. pantulus) contiene una
unidad mC7N no derivada de la vía SHK. Sin embargo, este organismo utiliza 3-
aminobenzoato añadido, formando la estructura C, como se describe en el texto. Las
unidades mC7N están resaltadas por recuadros. Reacción 1, transaminación y pérdida de 2
H20; reacción 2; biotransformación por S. pactum; reacción 3; biotransformación por S.
parvulus.
FIGURA 33. La vía de las quinasas. Las enzimas son las siguientes: 1, QA deshidrogenasa;
2, DHQ deshidratasa; 3, DHA deshidratasa; 4, SHK deshidrogenasa. El protocatecuato (A)
puede sufrir más reacciones catabólicas para formar 3-cetoadipato. En la parte inferior de
la figura también se muestra un mecanismo para la eliminación sintetizada observada de
los elementos del agua por DHS deshidratasa como un proceso de dos pasos, 3a y 3b.

La QA deshidrogenasa (EC 1.1.1.24 - dependiente de NAD) de cultivos en suspensión de células

de zanahoria tenía la propiedad única de estar sujeta a modificación covalente. La enzima (M =
42.000) estaba activa cuando se fosforilaba e inactiva cuando se desfosforilaba. La reactivación
de la enzima desfosforilada requirió una proteína quinasa dependiente de calmodulina Ca2 + y
ATP. La calmodulina no era una subunidad fuertemente unida de la proteína quinasa. El
monofosfato de adenosina cíclico (CAMP) no tuvo ningún efecto sobre la tasa de fosforilación.
La actividad QA deshidrogenasa disminuyó en cultivos en suspensión de células de zanahoria
suplementados con un ionóforo Ca2 + y EGTA (ácido etilenglicol bis- [aminoetil éter) NN ”-
ácido tetraacético). Se creía que el Ca2 + intracelular controlaba la proporción de QA
deshidrogenasa activa-inactiva mediante una cascada de dos ciclos: (1) activación, desactivación
de la proteína quinasa dependiente de calmodulina y (2) fosforilación-desfosforilación de QA
deshidrogenasa. La actividad de la proteína quinasa dependía de ATP-Mg2 + con un pH máximo
de 8.0. La actividad de la proteína fosfatasa fue inhibida por NaF y mejorada por Mg2 + en un
amplio rango de pH (e incluso a la baja temperatura de 10ºC).

Una complejidad adicional con la QA deshidrogenasa de células de zanahoria fue el hallazgo de

que, en las células de crecimiento oscuro, la enzima se comportaba como un dímero de Mr =
110.000 con dos subunidades, M = 42.000 y 60.000. Este último, aparentemente una subunidad
reguladora, contenía un sitio de unión de Ca2+. La QA deshidrogenasa de las células de
crecimiento oscuro no se sometió a fosforilación-desfosforilación y fue activada directamente
por Ca2+ mediante un proceso que no involucra calmodulina.
Una vía catabólica para el metabolismo de QA a ácido protocatecuico en microorganismos ha
recibido una atención considerable y solo puede considerarse brevemente aquí. Se necesitan tres
enzimas para la conversión a protocatecuato, y en el siguiente orden: QA deshidrogenasa, DHQ
deshidratasa y DHS deshidratasa (ver Figura 33). La conversión de DHQ en DHS ocurre, por
supuesto, como parte de la vía SHK del tronco principal. Sin embargo, los organismos que se
analizarán, N. crassa y A. nidulans, contienen una enzima biosintética (B-DHQ deshidratasa) y,
además, una enzima catabólica inducible separada (CDHQ deshidratasa), que se distingue
genética y físicamente de la B -DHQ deshidratasa. Los genes de la deshidratasa BDHQ son parte
del grupo de genes arom. En N. crassa y A. nidulans, los genes catabólicos también están
organizados como grupos qa y QUT. Los genes estructurales que codifican las enzimas y los
genes reguladores son los siguientes:

I. El grupo QUT en A. nidulans.

El grupo de genes QUT de A. nidulans se ha sometido a un análisis genético extenso. El orden de

los genes es:

Permease= permear
Repressor= represor

Este orden es diferente al de N. crassa. Los genes estructurales se han clonado en E. coli. La
función del gen QUTD (permeasa) se ha localizado dentro del grupo de genes clonados y
corresponde a una región con homología de secuencia con el gen qa-Y de N. crassa.

La secuencia de ADN determinada de QuTB contenía un ORF de 993 nucleótidos que codificaba
una proteína de Mr inferido = 36.000. Hubo una homología significativa con la SHK
deshidrogenasa de la proteína aromática de este organismo y la QA deshidrogenasa de N. crassa.
La secuencia de nucleótidos de QuTE mostró un ORF de 462 nucleótidos que codifica una
proteína de 153 residuos, Mr = 16.505. Hubo una amplia homología con la proteína N. crassa,
pero ninguna con la deshidratasa B-DHQ de la proteína arom.
ii. El grupo de qa en N. crassa

En N. crarsa, el grupo de genes qa estrechamente ligado tiene el siguiente orden de genes: qa-I,
qa-3, qa-4, qa-2. Se ha determinado la secuencia completa de ADN del grupo. Hay siete genes
muy adyacentes en un segmento de aproximadamente 17,3 kb; aproximadamente el 60% del
grupo qu consiste en secuencias codificantes. Los componentes individuales de las tres enzimas
de interés se describen por separado. Se ha revisado el papel de los genes reguladores (qa-1f y
qa-1s). Hay dos presuntos genes qa adicionales, qa-X y qa-Y; sus funciones aún no están del
todo claras.

La primera enzima de la ruta, QA deshidrogenasa (dependiente de NAD), aparentemente es

responsable no solo de la conversión QA + DHQ, sino también de la conversión de SHK en
DHS. Se le conoce más apropiadamente como QA (SHK) deshidrogenasa. La actividad SHK es
presumiblemente necesaria ya que tanto SHK como QA pueden servir como única fuente de
carbono para el crecimiento de hongos. La enzima es un polipéptido de 321 residuos de
aminoácidos, con un Mr calculado = 35,210. Se ha purificado hasta homogeneidad a partir de N.
crassa M18. Aunque la enzima es un monómero, Mr = 41.000, se detectaron tres especies
(probablemente isómeros de carga) por electroforesis en condiciones no desnaturalizantes. La
enzima tenía un solo sitio de unión para ambos sustratos. Esta deshidrogenasa QA catabólica
inducible (SHK) de N. crassa es homóloga con la deshidrogenasa SHK de E. coli. Esta
homología es del 19%, pero en la región N-terminal, hasta el residuo 153 de E. coli, aumenta al
27%.

Es de interés que la deshidrogenasa QA catabólica (SHK) sea dependiente de NAD, mientras que
la deshidrogenasa SHK biosintética requiere NADP. Además, se han descrito otras
deshidrogenasas catabólicas-QA (SHK) que no utilizan ninguno de los nucleótidos de piridina y
es probable que requieran componentes de flavina y citocromo. Por ejemplo, Acinerobacrer
calcouceticus (Moraxella calcoacetica) contenía una SHK deshidrogenasa dependiente de
NADP (presumiblemente biosintética) y una segunda deshidrogenasa, no dependiente de
nucleótidos piridina, a la que se le asignó una función catabólica. La utilización de NAD por las
SHK deshidrogenasas vegetales se ha descrito en la Sección II.D.2.

El gen estructural (qa-2) para N. crassa C-DHQ deshidratasa se ha clonado y se expresó en E.

coli (los genes del grupo qa-2, distintos de qa-2, no se expresaron en E. coli). La C-DHQ
deshidratasa contenía 173 aminoácidos y tenía M = 18.270. Dado que la enzima nativa de tipo
salvaje tenía M, de aproximadamente 222.000, debe estar compuesta por 12 subunidades
idénticas. La enzima se ha purificado a partir de N. crassu M18 (que carece de QA
deshidrogenasa) o de E. coli SK2884 que contiene los plásmidos apropiados con el gen qa-2. La
enzima nativa aparentemente pura de N. crassa era una mezcla de monómeros enzimáticos
intactos y escindidos por proteinasa. Con la enzima de E. coli, también se truncaron algunos
monómeros, pero en menor medida. Los datos de la secuencia de proteínas de la enzima
expresada en bacterias correspondían a la secuencia N-terminal verdadera deducida de la
secuencia de nucleótidos del gen qa-2. Como resultado de la actividad proteinasa, no hubo
homología para las secuencias de aminoácidos N-terminales de las enzimas expresadas por
hongos y bacterias.
Se obtuvo un aumento de 20 a 50 veces en la expresión de C-DHQ deshidratasa en E. coli
cuando las cepas bacterianas eran deficientes en polinucleótido fosforilasa; sin embargo, el nivel
de B-DHQ deshidratasa codificada cromosómicamente no se vio afectado. Aparentemente,
existen diferencias estructurales entre los ARNm eucarióticos y procarióticos.
El gen qa-4 de N. crassa codifica un polipéptido de 359 aminoácidos con M = 40.000; la DHS
deshidratasa purificada era un monómero. La secuencia determinada a partir de los datos de
ADN coincidió con una secuencia de aminoácidos parcial determinada a partir del extremo N-
terminal. La DHS deshidratasa fue muy susceptible a la desnaturalización por calor, pero fue
estabilizada por Mg2 +; la actividad catalítica máxima requirió la presencia de Mg2 + u otros
cationes divalentes. La remoción de los elementos del agua fue una eliminación sintomática (ver
Figura 33).

e. CICLOHEXENOS

Varios metabolitos de ciclohexeno tienen una relación estructural con DHQ, excepto que el
grupo DHQ -COOH aparentemente se ha reducido a -CH2 OH. Las micosporinas contienen
restos relacionados con aminoácidos y son producidas por hongos y un número sorprendente de
organismos marinos. Los ejemplos típicos son micosporina glutaminol (Figura 34A) e
iminomicosporina-gly (Figura 34B). Un posible precursor (Figura 34C) de estos compuestos se
ha aislado de los huevos de peces; otro material llamado gadusol (Figura 34D) también está
presente en huevas de bacalao y otros huevos de pescado.

Alguna evidencia implica al DHQ en la biosíntesis de glutaminol de micosporina en

Tricorhecium roseum. La adición de QA estimuló la formación de metabolitos en este
organismo, y [U 14 C] - DHQ se incorporó predominantemente en la unidad C6-C1. Al parecer,
algo de radiactividad en la porción de glutaminol surgió del acetato formado a través de la vía
cetoadipato. En la Figura 34, se muestra una posible secuencia biosintética (DHQ >> C >> A).

Es poco probable que esta posible vía de DHQ esté involucrada en la formación de gadusol y
compuestos relacionados en los huevos de pescado, ya que los peces requieren aminoácidos
esenciales en su dieta y presumiblemente carecen de la vía básica de SHK. El pescado puede
degradar las micosporinas de la dieta eliminando la unidad que contiene N. Si es así, la cantidad
de micosporinas consumidas por el bacalao debe ser considerable; sus huevas contienen 4 g de
gadusol por kilogramo de peso seco.

2. El papel del DHS

a. ÁCIDO GÁLICO

El ácido gálico (Figura 30K), a menudo presente en forma derivatizada como ésteres con
glucosa, otros polioles, QA y SHK, es un componente vegetal común. Se han propuesto varias
vías biosintéticas, incluida una deshidrogenación directa de DHS. La evidencia de esta última
ruta está disponible para el moho, Phycomyces blakesleeanus, y en varias plantas.
Se dice que es el único ejemplo de un hidroxibenzoato vegetal derivado directamente de un
precursor alicíclico.
Por tanto, tiene una posición un tanto enigmática, ya que estos hidroxibenzoatos vegetales se
derivan generalmente de la degradación catabólica de materiales C6-33. El galato se forma por
hidroxilación de protocatecuato en Pelargonium hortorum.

FIGURA 34. Ciclohexenos posiblemente formados a partir de DHQ. A = micosporina

glutaminol; B = iminomicosporina-gly; C = posible precursor de A y B, aislado de huevos
de pescado; D = gadusol.

b. ACIDO PROTOCATECUICO

El ácido protocatecuico (Figura 30L), otro componente común de la planta, generalmente se

supone que se deriva del DHS por una DHS deshidratasa. Hay poca evidencia directa para esta
suposición. Sin embargo, las células de Quercus robus y Rhus typhina tratadas con glifosato
acumulan protocatecuato, presumiblemente como un producto de respaldo de la inhibición de la
EPSP sintasa.

Sin embargo, existe evidencia considerable de la formación de protocatecuato a partir de DHS en

microorganismos, y el trabajo en Neurospora se ha revisado ampliamente. Las preparaciones de
DHS deshidratasa de N. crassa se discutieron en relación con la vía QA. El metabolismo de SHK
por bacterias intestinales conduce a catecol de la siguiente manera: SHK >>DHS >>
protocatecuato >> catecol. Esta conversión también se ha demostrado utilizando cultivos puros
de Lactobacillus plantarum utilizando SHK o QA.336 Se han aislado cuatro compuestos
benzenoides (moskachans A a D) de Ruta angustifolia y se describieron como metabolitos SHK
(sin evidencia experimental). Pueden surgir del protocatecuato.
3. El papel del SHK

En 1980, Weiss y Edwards comentaron sobre las peculiaridades de la quinasa SHK (ver la
Sección II.E) y dijeron que “puede ser permisible especular que quizás alguna ruta biosintética o
degradativa aún no reconocida se bifurca del shikimato. El trabajo reciente sobre los ácidos
grasos ciclohexilo. . . puede sugerir que la búsqueda de productos de esa vía no tiene por qué
limitarse necesariamente a compuestos aromáticos ". Es gratificante que ahora se disponga de
información considerable sobre la producción de carboxilato de ciclohexano (y compuestos
derivados), algunos derivados de ciclohexanona y otros productos, todos los cuales se derivan de
SHK

a. CARBOXILATO DE CICLOHEXANO

Varios productos naturales contienen anillos de ciclohexano que no surgen por reducción de
sistemas aromáticos como phe o benzoato. Ciertos carboxilatos de dihidroxiciclohexano se
describen más adelante en relación con dihidro-SHK. Los materiales, ansatrienina y asukamicina
(Figura 35A y B, respectivamente), contienen tanto una unidad de carboxilato de ciclohexano
(Figura 30C) como una unidad mC7N; ya se han mencionado con respecto a este último. La
unidad de ciclohexano carbonilo de estas estructuras puede originarse a partir de SHK mediante
la secuencia de reacción de la Figura 35. Para el procesamiento adicional, se asume la formación
del éster CoA de ciclohexano carboxilato.

En la formación del sistema ciclohexano simétrico, ambos átomos de hidrógeno originalmente en

C-6 de SHK se pierden y C-2 de SHK se convierte en C-6 del carboxilato de ciclohexano
(usando numeración sn). La secuencia que se muestra en la Figura 36 puede conducir a la
biosíntesis de ansatrienina en Streptomyces collinus.

Se sabía desde hace algún tiempo que la adición de SHK (o QA, véase la Sección II.A.1.d) a las
dietas de ratas dio lugar a un aumento de la producción de hipurato (el conjugado de benzoato de
glicina). Esto se debe al metabolismo de SHK inicialmente a carboxilato de ciclohexano por las
bacterias intestinales; el carboxilato de ciclohexano se aromatiza luego a benzoato por enzimas
de mamíferos y se excreta como hipurato. Aunque se sugirió que dihidro-SHK era un
intermediario para la formación de ciclohexano-carboxilato, esta posibilidad debería
reexaminarse a la luz de la vía que se acaba de discutir en Streptomycetes.
FIGURA 35. Formación de carboxilato de ciclohexano y compuestos relacionados.
A = asukamicina; B = ansatrienina. La unidad en la caja de forma irregular de
B se deriva del 3-amino-5-hidroxibenoato. La unidad C7 N de A no es
derivado de la vía SHK.

b. ÁCIDOS GRASOS OMEGA-CICLOHEXILOS

Los ácidos de este tipo (Figura 30B) se encuentran en varias bacterias acidófilas termófilas y en
dos cepas del mesófilo, Curtobacterium pusillum. Los primeros trabajos establecieron un papel
para el carboxilato de ciclohexano, derivado de SHK. El éster de CoA de carboxilato de
ciclohexano funciona como un "iniciador" para el alargamiento de policétidos a través de malonil
CoA. Se dispone de cierta información sobre la sintasa de ácidos grasos de C. pusillum. La
estereoquímica del proceso se estudió utilizando [6,6-2H2] -glucosa como precursor de SHK. Se
obtuvo evidencia de la vía que se muestra en la Figura 37. Aparentemente, no hay evidencia de
participación de intermediarios usados para la biosíntesis de ansatrienina.

C. CARBOXILATOS DIHYDRQSHK Y DIHIDROXICICLOHEXANO

Ya se señaló que Lactobacillus plantarum convierte SHK o QA agregado en protocatecuato.

Además, este organismo y L. pastorianus reducen la SHK añadida a dihidro-SHK (Figura 30D y
Figura 38). En L. plantarum, dihidro-SHK sufre un metabolismo extenso adicional a (3R, 4S) -
dihidroxiciclohexano- (1 S) -carboxilato (Figura 38B). Se han obtenido pruebas de todas las
reacciones que se muestran en la Figura 38; todos fueron representados como reversibles. La
enzima, la “deshidrogenasa hidroaromática” dependiente de NAD, se ha aislado de L. plantarum
y se ha purificado hasta cierto punto. Cataliza el paso 2 de oxidación; dos de las reducciones,
pasos 3 y 4, que se muestran en la Figura 38; y la reacción, QA >> DHQ. No se excluyó
totalmente la posible presencia de otras deshidrogenasas. La reducción de SHK a dihidro-SHK,
Figura 38, paso 1, se atribuyó a una flavoproteína. El producto inicial de la oxidación de
dihidroSHK, 3,4-dihidroxi-5-oxociclohexano-1-carboxilato (Figura 38A), se aisló de
Acetomonas oxydans.

Cuando se administró SHK a ratas, se identificaron dos isómeros de 3,4-

dihidroxiciclohexanocarboxilato en las heces. Se asumió que estos productos surgen de la acción
de las bacterias intestinales por un mecanismo no especificado ". Uno fue el (3R, 4S) -
dihidroxiciclohexano- (1s) -carboxilato (Figura 38B) que se acaba de describir como un producto
del metabolismo SHK por L. plantarum. Por lo tanto, puede haber sido producido por la ruta
mostrada en la Figura 38. El otro isómero era (3R, 4R) -dihidroxiciclohexano- (1R) -carboxilato.
Este producto podría haberse derivado de la reducción de un intermedio producido durante la
biosíntesis de ansatrienina (Figura 36A). Por supuesto, son posibles otros mecanismos.
FIGURA 36. R = -H o -C (= CH2) COOH.
Estereoquímica de conversión de SHK marcado con 2H en carboxilato de hexano

FIGURA 37. Formación de ácidos grasos 𝞈-ciclohexilo a partir de SHK. La enzima

se utilizó una preparación de ácido graso sintasa de Curtobacterium pusillwn. los
SHK marcado se derivó biosintéticamente de [6,6-2H2] glucosa.

FIGURA 38. Formación de dihidro-SHK y cierto dihidroxiciclohexano

carboxilatos por bacterias. FP = un componente de Bavopmtein. B = (3R, 4S) -
dihidroxiciclohexano- (1S) -carboxilato; C = (3R, 4R) -dihidroxiciclohexme- (1R) -carboxilato.
1, reducción de SHK con FPH2; 2, "deshidrogenasa hidroaromática" y NAD +; 3 y 4.
“deshidragenasa hidroaromática” y NADH.
Una posible ruta a C se muestra en la línea inferior.

d.CYCLOHEXANEYCYCL0HEXENESTRUCTURAS CON EL GRUPO SHK COOH

REDUCIDO

Algunos compuestos parecen derivar de SHK mediante la adición de un cuarto átomo de oxígeno
en el C-6 original de SHK. Más intrigante es que el grupo -COOH se ha reducido, ya sea a -
CHO, -CH20H o -CH3, mostrando una serie completa para la reducción de COOH a -CH3
(consulte la Figura 39).

La Figura 39A, (R = H), rancinamicina III, fue producida por crecimiento de Streptomyces
lincolnensis en medio empobrecido en azufre. En realidad, era una mezcla de cuatro
componentes con diferencias estereoquímicas. También se produjeron en estas condiciones las
rancinamicinas I y II, que tienen grupos acilo (cuatro o cinco carbonos) sustituidos en la nueva
función hidroxilo.
Los autores sugirieron que “la quiralidad en C-3, C-4 y C-5 en las rancinamicinas sigue siendo la
misma que en el ácido shikímico”. Lamentablemente, dibujaron estructuras basadas en el
enantiómero antinatural de SHK.

La Figura 39B es un metabolito (KD 1641) de Steptromyces filipiensis; no se determinó la

configuración en C-6 (basada en C = O = 1). La Figura 39C se aisló como inhibidor de la
glioxalasa I de Streptomyces griseosporeus (R = CO-CH = CH-CH3). En este caso, la
configuración de la posición C-5 SHK aparentemente se había invertido. El compuesto con una
SHK 400H completamente reducida (Figura 39D) se aisló de Streptomyces phaeochromogenes y
S. albus.

Varios de los metabolitos considerados en relación con la Figura 30 también se presentan como
ésteres o derivados de acilo. Como se señaló, QA esterificado con ácido cafeico es ácido
clorogénico. El galato esterifica con glucosa, otros polioles, QA y SHK. La propia SHK se
presenta como derivados de acilo (Figura 30N) con varios ácidos como cafeico, cis-crotonato de
3-etilo y 3-hidroxi-3-metilglutarato.
FIGURA 39. Estructuras de ciclohexano y ciclohexeno con aparente reducción del grupo SHK
COOH. A, R, = H, rancinamicina III; B, metabolito KD 16-U1; C, un inhibidor de la glioxalasa:
D se deriva de varios Streptomyceres.

b. Ramas de S3P, EPSP y CHA (Figuras 40 y 41)

Debido al número de metabolitos que contienen nitrógeno interesantes e importantes derivados

de CHA, el esquema general de esta sección utiliza dos cifras. La Figura 40 incluye los
metabolitos no nitrogenados de S3P, EPSP y CHA. Aunque la reductiomicina contiene
nitrógeno, el átomo de nitrógeno no está relacionado con la vía SHK; por tanto, la
reductiomicina se incluye en la Figura 40. La Figura 41 ilustra los metabolitos nitrogenados que
se originan en CHA.

1. Metabolitos no nitrogenados (Figura 40)

a. EL PAPEL DE S3P

El éster metílico de 3,4-anhidro-SHK (Figura 42A) se aisló del hongo Chalara microspora. Un
nucleófilo, X-, probablemente atacó a S3P con eliminación de HX (ver Figura 42). Otro epóxido,
la chaloxona, acompañó al metil 3,4-anhidro-SHK. Si bien este compuesto también puede ser un
metabolito SHK, no hay pruebas.

FIGURA 40. Ramas de S3P, EPSP y CHA que forman sustancias no nitrogenadas
productos. A, éster metílico de 3,4-anhidro-SHK (véase la Figura 42); B = 5-en01
piruvil-SHK (ver Figura 43); C = metil 5-lactil-SHK lactona (ver Figura
43); D = 2-amino-2-desoxi-ICHA (ver Figura 41); E = ICHA (ver figura
41); F = gentisato; G = 4-hidroxibenzoato (véanse las Figuras 44 y 45); H =
4-amino-4-desoxi-CHA (ver Figura 41).
FIGURA 41. Ramas de CHA que forman productos nitrogenados. A = 6-amino-Shidroxi-
1,3-ciclohexano-1-carboxaldehído; B = metabolito LL-C10037𝝰; C = 4-aminoantranilato
(ver Figura 56); D = 2,3-dihidro-3-hidroxiantranilato; E = 3-hidroxiantranilato; F = 2-
aminofenoxazinona; G = fenazina-1,6-dicarboxilato (véase la Figura 55); H = 2-amino-2-
desoxiICHA; I = antranilato; J = 4-amino-4-desoxi-CHA; K = 4-aminobenzoato; L = 3-
acetamido-4-hidroxibemato; M = 3-amino-4-hidroxibenzoato (ver Figura 62); N = 2-
acetamidofenol; 0 = producto "como-prefenato" formado a partir de J; y P = ~ - (4-
aminofenil) alanina. La formación de otros productos se indica como sigue: W = formación
de estreptonigrina; X = formación de orizoximicina, Y = formación de folato y N- (y- L-
glutamil) 4-hidroxianilina; Z = formación de cloranfenicol y obafiuorina.
Figura 42. Productos derivados de S3P. A = éster metílico de 3,4-anhidro SHK, B =
chaloxona.

b. EL PAPEL DE EPSP

Es de interés que el EPSP haya sido considerado en algún momento como "el compuesto del
punto de ramificación, que termina el tronco principal de la vía biosintética aromática. El propio
5-enofpiruvil-SHK (Figura 43A) se produce de forma natural y presumiblemente se deriva de la
desfosforilación del EPSP. Se ha sintetizado químicamente. Se ha sugerido que el 5-Enolppvyl-
SHK es un probable precursor de la metil 5-lactil-SHK lactona (Figura 43B) de Penicillium sp
K-114. No se sabe en qué secuencia se producen las reacciones necesarias de reducción,
lactonización y metilación.

C. COMPUESTOS NO NITRÓGENOS DERIVADOS DE CHA

I. Blosíntesis de ublquinona

Un gran número de quinonas (benzo-, nafto-, antra-) se producen de forma natural, y algunas
tienen funciones biológicas vitales. El importante libro de consulta de Thomson proporciona
descripciones de materiales recientemente aislados. Sin duda, conducirá a mucha especulación y
experimentación biosintética.

Una de las benzoquinonas funcionalmente importantes es la ubiquinona (Q-n, donde n indica el

número de residuos de isoprenilo). El término abarca en realidad una serie de materiales que
difieren en la longitud de la cadena lateral de isoprenilo y su grado de insaturación. El CHA es el
precursor del 4-hidroxibenzoato, un intermedio importante en la biosíntesis de Q en
microorganismos. En E. coli, la vía a Q se ha caracterizado bien durante algún tiempo, tanto en
términos de genética (hay ocho genes para la conversión de CHA en Q) como de bioquímica (ver
Figura 44). El paso inicial, CHA >> 4-hidroxibenzoato, requiere la eliminación de piruvato,
posiblemente mediante un mecanismo concertado (Figura 44, D>>E). De los compuestos
mostrados en la Figura 44, A es el menos bien caracterizado y no se han identificado mutantes
defectuosos en su metilación.

Los genes ubi de E. coli aparentemente no se han secuenciado y se sabe poco sobre los
mecanismos de control de la biosíntesis de Q en este organismo. Recientemente, se ha estudiado
la expresión del gen ubiG con la ayuda de una fusión ubiG-lacZ.
La expresión de ubiG fue mayor en condiciones aeróbicas que anaeróbicas, y la presencia de
glucosa en el medio de cultivo disminuyó la transcripción del gen. La transcripción de ubiG
probablemente fue modulada positivamente por el complejo de la proteína del receptor CAMP-
CAMP. Las cepas de E. coli con resistencia a la estreptomicina y a la fleomicina y la bleomicina
eran aparentemente deficientes en el gen ubiF.

Los eucariotas tienen una variación en los primeros pasos de la vía biosintética como se muestra
en la Figura 44, B >> C. En la levadura, la biosíntesis de Q está regulada por la glucosa en este
paso. En los animales, el 4-hidroxibenzoato obviamente no se deriva de la vía CHA; en cambio,
se forma a partir de tyr. En vista de este hecho, no tiene sentido intentar describir Q como una
"vitamina".
Se ha logrado un nivel notablemente alto de producción de Q-10 en cultivos en suspensión de
células de tabaco mediante una técnica de clonación múltiple. El único sustrato orgánico en el
medio de cultivo es la sacarosa, pero no se sabe si la degradación de tyr es la fuente del 4-
hidroxibenzoato. La cepa Z8A-3B-22 produce 1,85 mg Q-10 por gramo de peso seco de células.
Esta línea celular tiene posibles aplicaciones industriales.
FIGURA 43. Formación de 5-enolpiruvil-SHK (A) y metil 5-lactil SHK
lactona (B).

FIGURA 44. Biosíntesis de ubiquinonas. La vía de E. coli está indicada con los genes
necesarios; para ahorrar espacio; ubi se ha omitido en las designaciones genéticas. La
variación eucariota se muestra como B >>C. SAM = S-adenosilmetionina; SA = S-
adenosilhomocisteína.

II. Biosinthesis de reductiomycina

La reductiomicina, un metabolito de Streptomyces xanthochromegenus, contiene una unidad de

ácido dihidrofuranilacrílico que aparentemente se deriva del CHA a través del 4-hidroxibenzoato
(o su aldehído). No se pudo detectar la utilización de tyr. [13CCOOH] -4-hidroxibenzoato,
cuando se administró a cultivos del microorganismo, dio reductiomicina con isótopo en la
posición prevista. Hay dos vías posibles (Figura 45) para la escisión del 4-hidroxibenzoato
simétrico que podrían distinguirse mediante el uso de glicerol marcado (la Figura 45 muestra
solo una posibilidad). Aunque la escisión de un anillo de benceno es algo inusual, ha sido bien
documentada en varios casos. Este proceso en particular recuerda al involucrado en la biosíntesis
del ácido penicílico. Además, el anillo de benceno del gentisaldehído se rompe durante la
biosíntesis de patulina.

FIGURA 45. Biosíntesis de reductiomycina (A). Escisión del benceno

anillo de 4-hidroxibenzoato podría ocurrir en cualquier posición A o B. Sólo la
posibilidad A se indica aquí. La unidad C3 N se deriva del S-aminolevulinato.

El 4-hidroxibenzoato también se puede derivar del carboxilato de ciclohexano durante el

crecimiento de Corynebacterium cyclohexanicum. En esta vía catabólica sufre una mayor
hidroxilación a 3,4-dihidroxibenzoato. Este último está formado por varios microorganismos y la
enzima 4-hidroxibenzoato hidroxilasa se ha purificado hasta homogeneidad. Las cepas de
Bacillus que utilizan 4-hidroxibenzoato lo convierten en gentisato (Figura 40F). La introducción
del segundo grupo -OH va acompañada de una migración del grupo carboxilo.
2. Metabolitos nitrogenados (Figura 41)

El CHA puede sufrir aminación con la formación de 2- amino-2-desoxi-ICHA (Figura 40D) o 4-

amino-4-desoxi-CHA (Figura 40H). De estos dos intermediarios, se derivan muchos otros
compuestos nitrogenados variados, incluidos importantes metabolitos primarios como trp y
folato, y metabolitos secundarios, incluidos antibióticos. Los compuestos aromáticos derivados
de 2-amino-Zdeoxi-ICHA tienen característicamente -NH2 orto a -COOH, siendo el prototipo el
ácido antranílico (Zaminobenzoato). Los compuestos derivados de 4-amini-4-desoxi-CHA tienen
característicamente -NH2 para a -COOH, siendo el prototipo 4-aminobenzoato.

a. 2-AMINO-2-DEOXY-ICHA Y METABOLITOS DERIVADOS

El compuesto al que aquí se hace referencia como 2-amino-2-desoxi-ICHA es formalmente

trans-6-amino-5 - [(1-carboxietenil) oxi] -1,3-ciclohexadieno-lcarboxilato. Ahora se ha
caracterizado definitivamente como un intermedio en la biosíntesis del ácido antranílico y, como
tal, juega un papel importante en la biosíntesis de trp. Por lo tanto, se considera en primer lugar
con referencia a trp.
La larga rama de CHA a trp (Figura 46) se ha investigado intensamente, particularmente con
respecto a la regulación y la genética. Existe una variación considerable de un microorganismo a
otro con respecto a la organización de los genes de la ruta biosintética trp.
Algunos productos génicos son enzimáticamente bi o trifuncionales, y algunas actividades
enzimáticas requieren dos productos génicos. El número de genes implicados es cuatro (A.
nidulans, Coprinus sp., N. crassa, Schizosaccharomyces pombe), cinco (S. cerevisiae, E. coli),
seis (Serratia murcescens, B. subtilis) o siete (Pseudomonas putida, Brevibacterium
lactofermentum).

Los genes que codifican las enzimas necesarias en las bacterias entéricas, E. coli y S.
ryphimurium, son contiguos y constituyen el merecidamente famoso “operón trp”. Este operón
es uno de los grupos de genes anabólicos más estudiados en estos dos organismos y otras
bacterias entéricas. La secuencia de nucleótidos del operón completo (cinco genes, trpE, trpD,
trpC, trpA y trpB) es conocida tanto para E. coli como para S. typhimurium.
En. B. subtilis, un operón trp de seis genes estructurales, ha sido secuenciado. Este operón es
parte de un grupo trpEDCFBA-hisH-tyrA-aroE o incluso más grande con aroFBH en el extremo
5 '. El operón trp completo también se ha secuenciado en Brevibacterium lactofermentum; el
fragmento de ADN de 7725 pb contiene siete OFW correspondientes a los genes trpL, trpE,
trpG, trpD, trpC, trpB y trpA.

En vista de la existencia de muchas revisiones que enfatizan la genética y la regulación, sería

presuntuoso intentar un tratamiento general aquí. La atención se centra en la bioquímica de la
biosíntesis de trp. Se pueden destacar los siguientes artículos recientes por conveniencia: el
estudio de los genes trp en Pseudomonas acidovorans y en Zymomonas, y la regulación de la
biosíntesis de trp en Caulobacter crescentus.

De los cinco genes de E. coli, dos especifican una proteína con actividad enzimática bifuncional
y dos especifican subunidades diferentes de una sola enzima. En secuencia biosintética, son los
siguientes:
(a. Actividad con NH2 como donante de amino.
b.Este componente también es necesario para la actividad general de antranilato sintasa
cuando gln es el donante de amino).

En la levadura, la fosforribosilantranilato isomerasa y la indoleglicerol fosfato sintasa son

enzimas monofuncionales especificadas por dos genes. El patrón de levadura se muestra a
continuación; todos los genes han sido secuenciados. Se han revisado otros organismos
eucariotas.

Yeast= levadura

Aunque, por supuesto, el trp se forma en plantas, las enzimas no están tan bien caracterizadas
como en los microorganismos. El derivado 4-cloro de trp se encuentra en la proteína de semilla
de guisante como componente menor. Probablemente sea el precursor del ácido 4-cloroindol-3-
acético (una auxina natural). El esclarecimiento del mecanismo de introducción del átomo de
cloro sería de considerable interés.

1. Antranilato sintasa (AS)

Esta primera enzima en la ruta de CHA a trp es fuertemente inhibida por trp. Tanto NH3 como
gln pueden funcionar como donadores del grupo amino.
El 2-amino-2-desoxi-ICHA (Figura 46A) se había considerado un posible intermedio en la
reacción de AS. Se sintetizó en forma (+) o racémica y fue enzimáticamente competente en la
reacción de AS. Dado que, en general, la protonación de la cadena lateral de emlpiruvol ocurre
en la superficie, la reacción 2- amino-2-desoxi-ICHA >> piruvato + antranilato, puede estar
concertada (Figura 47, A >> B + C).

No se ha obtenido evidencia directa de la participación de 2-amino-2-deoxyICHA en el proceso

general. Sin embargo, utilizando un análogo de lactil-CHA (Figura 47D), se obtuvo evidencia de
la acumulación real del intermedio correspondiente (Figura 47E) hasta aproximadamente el 15%
en moles durante la reacción. La Vmax con este análogo de lactilo fue del 3% de la de CHA. El
producto, Figura 47E, fue convertido por AS en antranilato en ausencia de NH3. El análogo (S) -
lactilo también fue un sustrato para AS que tiene Vmax = 4,4% del que tiene CHA. El análogo de
cicloheptadieno de CHA fue un buen inhibidor de AS (como lo fue de Caminobenzoato sintasa).

El 2-Amino-2-desoxi-ICHA es bastante inestable y sufre la transposición no enzimática (20 h,

término ambiente) que se muestra en la Figura 47, A >> F; el último compuesto es un inhibidor
de AS. Este reordenamiento se parece al de ICHA para isoprefenato.

FIGURA 47. Formación de antranilato a partir de 2-amino-2-desoxi-ICHA y análogos;

reordenamiento de 2-amino-2-desoxi-ICHA. A = 2-Amino-2-desoxiICHA; B = piruvato; C
= antranilato; D = análogo de lactilo de CHA, E = análogo de lactilo de 2-amino-2-desoxi-
IcHA; F = producto de transposición de 2- amino-2-desoxi-ICHA; G = 3- (4-amino-3-
carboxifenil) piruvato; H = 3- (4-amino-3-carboxifenil) alanina.
Es un proceso que se había propuesto hace algún tiempo como una ruta a la 3- (4-amino-3-
carboxifenil) alanina (Figura 47H) a través de un cetoácido (Figura 47G). Aunque este
aminoácido aparentemente no se conoce como producto natural, se ha sintetizado como
racemato.

El AS bacteriano tiene dos subunidades. El componente I (AS I) cataliza la conversión global,

CHA + NH3 >>antranilato + piruvato, mientras que el componente II (AS II) tiene una actividad
gln amidotransferasa (lo que permite utilizar gln como donante de amino). En la reacción de AS-
gln, gln se une a cys 84 de AS II. La AS II a menudo se fusiona como una proteína
multifuncional con otras enzimas biosintéticas trp.

Una de las preparaciones de AS mejor estudiadas es la presente en S. typhimurium donde AS 11

también lleva una actividad de antranilato fosforribosil transferasa (PRT). El complejo AS-PRT
nativo intacto es un tetrámero (M, = 228.000) que contiene dos moléculas de AS I (M, de
monómero = 57.000) y AS II (M, de monómero = 56.900). La digestión proteolítica de este
complejo 𝝰2 𝝱2 intacto conduce a un "complejo parcial AS" (M, = 156,00), que contiene un
fragmento amino-terminal de AS II. El AS 11 así modificado carece de actividad PRT. Tanto los
complejos como las subunidades individuales (obtenidas a partir de cepas mutantes trpE y trpD
apropiadas) se han purificado hasta homogeneidad. Por tanto, a partir de S. typhimurium TB
1409 / pSTp89, una purificación en dos etapas dio preparaciones homogéneas del complejo AS-
PRT intacto (purificación de 20,3 veces con respecto a la actividad de AS, 17,8 veces con
respecto a la actividad de PRT). También se han descrito bien preparaciones enzimáticas de otros
organismos.

Recientemente se investigaron la cinética y las propiedades de unión a metales de las

preparaciones AS de S. typhimurium. Los metales interactúan en el sitio activo con CHA pero no
con gln.

En N. crassa, AS II (glutamina amidotransferasa) es parte de un polipéptido trifuncional con

fosforribosilantranilato isomerasa e indoleglicerol fosfato sintasa. Este polipéptido está
codificado por el gen TRP1, que ha sido clonado en E. coli y secuenciado. El complejo AS
tetramérico multifuncional de este organismo fue degradado por elastasa en dos fragmentos. Uno
de ellos poseía actividad AS, el otro tenía actividad tanto de indoleglicerol fosfato sintasa como
de fosforribosilantranilato isomerasa. Para obtener un modelo detallado del complejo AS, se
debe consultar el artículo original.

En las plantas, AS aparentemente carece de una estructura de subunidad y solo gln sirve como
donante de amino. Se separaron parcialmente dos isoenzimas de AS de extractos de plantas y
células cultivadas de Nicotianu tubacum. Una forma era resistente a la inhibición por
retroalimentación por trp y estaba localizada en el citosol de protoplastos de células cultivadas; el
otro era sensible a trp y estaba ubicado en la fracción de partículas. En un trabajo anterior, se
obtuvieron dos formas de AS a partir de células cultivadas de Solanum tuberosum susceptibles y
resistentes al 5-metil-trp.
Los genes, trpE y trpD, se han secuenciado como parte del operón trp en E. coli y S.
typhimuriwn. Las secuencias de ADN de estos genes muestran una homología considerable con
solo una diferencia del 12,5% en la composición de aminoácidos.

Como ya se señaló, se ha determinado la secuencia de nucleótidos de la levadura TRP2 (que

codifica AS I). En este organismo, la actividad de AS se localiza como una enzima
heterooligomérica multifuncional con indoleglicerol fosfato sintasa. El gen AS de Rhizobium
meliloti se ha clonado en E. coli y se ha determinado su secuencia. De manera similar, el gen
trpE del termófilo, Thermus thermophilus (codifica AS I), ha sido clonado y secuenciado.

II. Antranilato fosforribosil transferasa (PRT)

Como ya se señaló, en E. coli y S. typhimurium la fosforribosilación de antranilato con

pirofosfato de fosforribosilo (ver Figura 46) es catalizada por el componente AS 11 (producto del
gen trpD). Esta proteína se purificó (136 veces para la forma dimérica) de S. typhimurium TB41
hasta aproximadamente un 95% de homogeneidad. A partir de una cepa superproductora (400
veces) de S. cerevisiae, la PRT también se ha purificado 15,8 veces hasta alcanzar casi la
homogeneidad (95%). La enzima era un dímero (Mr = 83.000) de subunidades idénticas, con un
mecanismo catalítico secuencial. Esta enzima purificada es valiosa para la generación in situ del
compuesto inestable, fosforribosilantranilato.

III. Isomerasa de fosforiborilantranilato (PRAI)

La fosforribosilantranilato isomerasa convierte el fosforribosilantranilato (Figura 48A) en 1 - (2-

carboxifenilamino) - l-desoxirribulosa 5-fosfato (Figura 48C). Esta reacción (ver Figura 48) es
un reordenamiento de Amadori prácticamente irreversible. En bacterias entéricas, ocurre con
actividad de indoleglicerol fosfato sintasa (IGPS) en una sola cadena polipeptídica de Mr =
49,500 (452 residuos de aminoácidos). Una purificación de 39 veces a partir de E. coli W3110
dio un producto puro que se pudo cristalizar y para el que se determinó la estructura
tridimensional. Las dos actividades catalíticas ocurren como IGPS N-terminal, residuos 1 a 255,
y PRAI C-terminal, residuos 256 a 452. Estas actividades residen en dominios funcionales
distintos de plegamiento similar: el de un 𝝱-barril, ocho veces paralelo con 𝝰-hélices en el
exterior conectando los hilos 𝝱. Ambos sitios activos están en depresiones en la superficie de los
dominios creados por los bucles que se curvan hacia afuera entre los extremos carboxilo de las
hebras de la hoja 𝝱 y las hélices 𝝰 subsiguientes. Los sitios activos no se enfrentan entre sí, por
lo que probablemente no sea posible la canalización de sustrato entre ellos. La ventaja obtenida
por la fusión de genes parece ser las interacciones que se estabilizan mutuamente entre los dos
dominios funcionales.
El gen TRP1 de Kluyveromyces lactis ha sido clonado y analizado. Se ha investigado el papel
del gen TRP1 en la biosíntesis de trp de levadura.
FIGURA 48. Acción de la fosforribosil antranilato isomerasa en la formación de enol-1-
carboxifenilarnino-1-desoxirribulosa 5-fosfato. La transposición de fosforribosilantranilato
(A) conduce al producto enol, B;
la tautomerización de la estructura cetogénica [1- (2carboxifenilamina) -l-desoxirribulosa
5-fosfato] se produce presumiblemente de forma espontánea.

Iv. Indoleglicerol fosfato sintasa (IGPS)

Esta enzima cataliza la ciclación de 1 - (Zcarboxifenilamino) - 1 -desoxirribulosa 5-fosfato a

indoleglicerol fosfato (ver Figura 49). Como se señaló, IGPS se asocia con PRT como una
proteína bifuncional en bacterias entéricas. B. subtilis y Pseudomom putih tienen dos enzimas
separadas para estas actividades; Brevibacterium flavum tiene un complejo multienzimático.
En la levadura, IGPS es parte de una enzima heterooligomérica multifuncional codificada por
TRP3 y TRp2; Se han determinado las secuencias de nucleótidos. En A. nidulans, IGPS es parte
de un polipéptido trifuncional que cataliza los pasos primero, tercero y cuarto de la biosíntesis de
trp. Los genes han sido secuenciados. En N. crassa, IGPS es parte de un "complejo
multienzimático postcorismato" que también contiene actividades AS y PRAI. Se ha descrito un
procedimiento de purificación para este complejo (Mr = 240.000).
FIGURA 49. Posible mecanismo de reacción de la indoleglicerol fosfato sintasa. El sustrato
[1- (2-carboxifenilamino-lI-desoxirribulosa 5-fosfato1,
A, se convierte en indoleglicerol fosfato, B, con pérdida de C02.

v. Trp sintasa

A pesar del ya enorme número de publicaciones relacionadas con esta enzima tan estudiada, un
artículo histórico, publicado en 1988, probablemente desencadenará una nueva avalancha de
información. Esta publicación proporciona la estructura tridimensional completa de la trp sintasa
cristalina de S. typhimurium. Es indicativo del volumen de la literatura que este único artículo
enumera 94 referencias. Todo lo que se puede intentar aquí es una breve exposición de la imagen
actual con énfasis en la compleja química de las reacciones catalíticas. Se ha revisado la
"atractiva historia" de la trp sintasa.

Esta descripción se centra en la enzima de E. coli o S. typhimurium. Para el presente propósito,

es necesario saber que la holoenzima es un tetrámero de dos subunidades diferentes (𝝰2 𝝱2); los
polipéptidos individuales también se describen como proteínas A y B (hay más detalles en una
sección posterior). La reacción general es la de la Figura 50. Está catalizada por la holoenzima
tetramérica o por el dímero 𝝱2 aislado. La trp sintasa cataliza muchas otras reacciones tales
como eliminaciones y reemplazos 𝝱, transaminaciones y racemizaciones; estas reacciones no se
consideran aquí.

La reacción que cataliza la síntesis de trp es un proceso de dos pasos; sin embargo, el indol
normalmente no se libera como intermedio. Las dos reacciones separadas son las siguientes:

FIGURA 50. Mecanismo de reacción de la trp sintasa. (Línea 1) Reacción general

para la formación de trp. (Cal 2) Formación de indol; tres grupos unidos de enzimas,
Se postulan BI, B2 y B3 (ver texto).
a. Fosfato de Indoleglicerol >> Indol + Gliceraldehído 3-fosfato
b. Indol + Ser >> Trp + H20

La reacción a es catalizada por la 𝝰-subunidad (o por el tetrámero libre de piridoxal) y b por la

subunidad 𝝱2 (o tetrámero) en presencia de fosfato de piridoxal.

La reacción a es esencialmente una escisión aldólica, probablemente facilitada por tres grupos
catalíticos que utilizan catálisis ácido-base general "empuja y hala" (ver Figura 50). De los tres
grupos mostrados, existe una fuerte evidencia de que B3 es el grupo carboxilato de glu 49 de la
subunidad 𝝰. Este es el grupo que cataliza la escisión real después de la formación de una
estructura tautomérica, Figura 50A. Un segundo grupo catalítico, B2 es muy probablemente asp
60.

Este grupo participa en la eliminación del hidrógeno en N-1 del anillo de indol; B, protona el
anillo de indol en C-3 para que estos dos grupos cooperen para formar la estructura del
tautómero (Figura 50A). Asp 60 se puede reemplazar por glu con retención de alguna actividad
catalítica.

Un residuo tyr, 175, se encuentra cerca del sitio activo y su grupo -OH podría tener algún papel;
ya que puede ser reemplazado por phe, no es esencial. La sustitución de tyr 175 por cisteína
provocó una pérdida de actividad, al igual que la sustitución de gly 211 por glu. De manera algo
sorprendente, el doble mutante que contenía ambos cambios (tyr >> cys en 175 y gly >> glu en
211) tuvo alguna actividad. Esto se atribuyó al mantenimiento de la geometría adecuada de la
unión del sustrato más que a los efectos compensatorios sobre la catálisis.

La subunidad 𝝰 de la trp sintasa de E. coli, S. typhimurium y cinco híbridos interespecies se

examinó mediante métodos de equilibrio y cinéticos con respecto al despliegue de la proteína
inducido por urea. Todas las proteínas siguieron el mismo mecanismo de plegamiento y este
comportamiento fue consistente con el postulado de que los mecanismos de plegado se
conservan en proteínas homólogas. Esta conservación es aparentemente una presión evolutiva
importante.
En la reacción b entre indol y ser, el grupo 𝝱-OH de ser se reemplaza por un residuo de indol. La
configuración se retiene en la posición 𝝱 durante este reemplazo para la reacción con indol o
indoleglicerol fosfato. Esta simple declaración ignora las dificultades técnicas de esta elegante
obra; participaron unas 14 reacciones catalizadas por enzimas. Cualquier mecanismo detallado
debe tener en cuenta esta estereoquímica general (Figura 51).

El ser reacciona primero con el fosfato de piridoxal (PLP) (unido a la enzima) para formar la
estructura de aldimina habitual en estas reacciones. Cada subunidad 𝝱 contiene 1 mol de PLP
unido. Tras la pérdida del grupo 𝝱-OH, se produce la sustitución por indol (Figura 52); la
aldimina trp-PLP forma fosfato de piridoxamina y trp de la forma habitual.

Se creía que la indolenina intermedia, Figura 52A, tenía la configuración S ya que el

diastereoisómero (𝝰S, 3S) del 2,3-dihidro-L-trp (Figura 53A) era un potente inhibidor de la trp
sintasa, mientras que el otro diastereoisómero (𝝰S , 3R, Figura 53B) fue mucho menos potente.
El dihidm-L-trp es un análogo intermedio de la reacción, por lo que se postuló que la indolenina
(Figura 52A) tenía una configuración 3s. Es de interés que el diastereoisómero (𝝰S, 3R) (y no el
𝝰S, 3S) fuera inhibidor de otra enzima, la hipofanasa.

FIGURA 51. Estereoquímica del reemplazo del grupo ser -OH por indol
durante la acción de la trp sintasa. El cambio de R a S es el resultado de la operación
de la regla de secuencia; existe una retención real de la configuración.

FIGURA 52. Papel del fosfato de piridoxal en la reacción de trp sintasa. PLP =
fosfato de piridoxal; R = -CH2 OP; "Etc" indica un desglose de trp y
fosfato de piridoxamina.
FIGURA 53. Diastereoisómeros de 2,3-dihydro-trp.

Este mecanismo es simplificado en el sentido de que se ignoró la interacción real de la subunidad

𝝱 y PLP (presumiblemente unida a lisina). Mediante el uso de varios análogos de sustrato y
mediante análisis cinético, se obtuvo evidencia de una serie muy compleja de intermedios
transitorios.
Aunque los primeros trabajos habían sugerido roles para su 86, arg 148 y cys 230 en las
reacciones de la subunidad 𝝱, estas conclusiones se han descartado. En la subunidad 𝝱 de tipo
salvaje, lys 87 forma la base de Schiff con PLP. La sustitución de aminoácidos de lys 87 produce
una proteína catalíticamente inactiva que, sin embargo, se une a PLP, subunidad a y ser. En la
forma homodimérica de la trp sintasa de N. crussa, la lys que se une a PLP se encuentra en la
misma posición relativa que en las enzimas de levadura y E. coli.

Se ha descubierto un nuevo ejemplo de la versatilidad de la trp sintasa. El complejo holo 𝝰2𝝱2

se convirtió en apotetrámero mediante la eliminación de PLP. Se descubrió que este complejo de
apo 𝝰2𝝱2 cataliza una reacción de “semitransaminasa” (ver Figura 54) entre indol-Zpiruvato y
fosfato de piridoxamina, formando PLP y trp.

Piridoxamina-P + Indol-3-piruvato >> PLP + Trp

El producto de este proceso, trp, no es un sustrato natural para la trp sintasa y el fosfato de
piridoxamina normalmente se formaría durante una reacción de “transaminasa completa” y se
reciclaría por la segunda semirreacción de regreso a PLP. El PLP formado en este proceso no se
libera de la enzima y, por tanto, la reacción es estequiométrica con respecto al complejo apo
𝝰2𝝱2 utilizado inicialmente.

La holoenzima trp sintasa y las subunidades individuales se han purificado de muchos

organismos. Por tanto, por citar sólo un ejemplo, una purificación de 7,4 veces del complejo
tetramérico de la cepa de E. coli W3 110 dio un material homogéneo que pudo cristalizarse (y
con un rendimiento de 2,85 g a partir de 500 g de pasta de células bacterianas). Las dos
subunidades se pueden preparar convenientemente a partir del complejo tetramérico (que es más
estable que las dos subunidades separadas).

Como se indicó anteriormente, la estructura tridimensional del tetrámero cristalino de la trp

sintasa de S. typhimurium se ha determinado a una resolución de 2,5 Å. Las cuatro cadenas
polipeptídicas se dispusieron casi linealmente en el orden 𝝰2𝝱2 como un complejo de longitud
150 A. El pliegue polipeptídico total de la subunidad 𝝰 era el de un barril 𝝰 / 𝝱 de ocho veces. La
subunidad 𝝱 contenía dos dominios de tamaño casi igual plegados de manera similar como
estructuras de hélice / hoja / hélice. El sitio de unión de PLP estaba profundamente dentro de la
interfaz entre los dos dominios de la subunidad 𝝱. Los sitios activos de las subunidades a y p
vecinas estaban separados por una distancia de aproximadamente 25 A; un túnel conectaba estos
sitios activos y su diámetro era el del indol. Se postuló que este túnel desempeñaba un papel en
la facilitación de la difusión de indol desde su punto de producción (sitio activo de subunidad a)
hasta su sitio de utilización (sitio activo de subunidad). Por tanto, el indol libre no se libera
durante la acción de la trp sintasa.

Se ha determinado que una tercera secuencia de trpA de enterobacterias es la de K. aerogenes

(sic - ¿K. pneumoniae?). Existe una homología considerable con las secuencias de E. coli y s.
typhimurium.

FIGURA 54. Reacción de la “semitransaminasa” de la trp sintasa. La estructura,

A, se forma a partir de fosfato de piridoxamina e indol-3-piruvato por acción
de apo 𝝰2𝝱2-trp sintasa. La estructura final, B, se descompone en PLP y trp.
En S. cerevisiae, la trp sintasa es un homodímero de dos subunidades de Mr = 76.000 (esto es un
poco más grande que la suma de las cadenas A y B de la enzima de E. coli). Es probable que sea
una proteína en la que los dominios A y B, característicos de E. coli, se hayan fusionado. Los dos
segmentos están unidos por una región de conexión de 28 residuos. En general, la proteína
probablemente contiene 706 residuos (se supone que un met inicial se elimina mediante
procesamiento). El gen estructural, TRP5, se ha secuenciado en parte y por completo. Existe una
homología considerable entre la trp sintasa de levadura y las cadenas A y B de la enzima de las
bacterias entéricas. Una característica inusual es que las regiones codificantes A y B están
fusionadas en el orden A seguido de B. En todos los demás procariotas examinados hasta ahora,
los dos genes estructurales están en el mismo operón y el de la cadena B precede al de la cadena
A.

La secuencia de N. crassa trp-3 (que codifica trp sintasa) tiene una fuerte homología con el
polipéptido TRP5 de levadura (dominio A, 54% y dominio B, 75%), pero menos con el
polipéptido trpA de E. coli (31% de identidad) y trpB polipéptido (50% de identidad).
Se han determinado las secuencias de nucleótidos de los genes trpBA de la arquebacteria
Methanococcus voltae. Hubo homologías significativas con las secuencias de aminoácidos de la
trp sintasa de otras fuentes. En P. aeruginosa, los genes trpB y trpA no forman parte de un
operón. Están separados de los otros genes estructurales de la vía trp y se regulan por inducción
más que por represión. Se transcriben en el orden trpB-trPA. Las secuencias de ADN de los dos
genes se han determinado junto con las secuencias flanqueantes. De nuevo, existen considerables
homologías con otras trp sythases.

La subunidad P de trp sintasa de E. coli y otros organismos muestra una homología significativa
con la O-acetilserina sulfhidrasa A dependiente de PLP y con la treonina sintasa. Estas
homologías son consistentes con similitudes en los procesos catalíticos de estas enzimas. Las
enzimas pueden haber evolucionado de un ancestro común.

vi. Fenazinas

Hay más de 50 pigmentos de fenazina bacteriana (Figura 41) que representan “todos los colores
del espectro visible”. Tienen una larga historia desde que se conoce la piocianina de color azul
desde 1859. Las fenazinas a menudo muestran propiedades antibióticas y la capacidad de
intercalarse con el ADN bicatenario. La biosíntesis de 1-carboxilato de fenazina es importante
para el control biológico de la enfermedad generalizada en la raíz del trigo. En términos
biosintéticos, es probable que todos se deriven de la fenazina-1,6-dicarboxilato (ver Figura 55) a
través de la vía SHK. Dado que no intervienen ni antranilato ni 3-aminobenzoato, el precursor de
antranilato, 2-amino-2-desoxi-ICHA, puede representar el punto de ramificación.
FIGURA 55. Posible ruta biosintética desde 2 moles de 2-amino-2-desoxi ICHA, A, hasta
fenazina-1, 6 dicarboxilato. B. El último compuesto es el Probable precursor de otras
fenazinas.

FIGURA 56. Papel del 4-amino antranilato, A, en la biosíntesis de estreptonigrina.

Se muestran tres posibles mecanismos para la síntesis de 4-amino antranilato.
vll. Estreptonigrina

La estreptonigrina (ver Figura 41), un antibiótico contra el cáncer de Streptomyces jlocculus,

tiene un anillo derivado de SHK, probablemente a través de 4-aminoantranilato. El último
aminoácido se aisló de cultivos de S. flocculus. Aunque se desconoce el origen exacto del 4-
aminoantranilato, podría provenir de intermedios derivados de CHA.430 * 431 O 2-amino-2-
deoxyICHA (Figura 56B) o 2,3-dihidm-3-hidroxiantranilato (Figura 56C) , o 4-amino-4-desoxi-
CHA (Figura 56D) podría ser el precursor.

vlil. 2,3-dihidro ~ 3-hidroxiantranilato

Se sabe desde hace algún tiempo que el compuesto trans-2,3-dihidro-3-hidroxiantranilato (Figura

41D) es un metabolito de Streptomyces aureofaciens. Es probable que se derive de 2-amino-2-
desoxi-ICHA.

ix. 3-hidroxiantranilato

Se sugirió que el trans-2,3-dihidro-3-hidroxiantranilato era un precursor del 3-hidroxiantranilato

(Figura 41E). El éster de ácido láctico del 3-hidroxiantranilato es el antibiótico oryzoxymycin. El
aldehído derivado de 3-hidroxiantranilato, 6-amino-5-hidroxi-1,3-ciclohexadieno-1-
carboxaldehído (Figura 41A), es el antibiótico, P-3355, producido por Streptomyces amylovorus.

Aunque el 3-hidroxiantranilato es un precursor de las actinomicinas, en esos casos se deriva de

trp. Sin embargo, Brevibacterium iodinum produce no solo el compuesto de fenazina, yodinina,
sino también pequeñas cantidades de 2-aminofenoxazinona (Figura 41F). Si bien este compuesto
muestra una relación estructural con las actinomicinas, el precursor del 3-hidroxiantranilato
aparentemente no se deriva de trp. Para la producción de 2-aminofenoxazinona, la SHK marcada
fue un precursor más eficaz que la tq y la adición de trp no disminuyó la incorporación de la
marca de SHK al metabolito. Por tanto, es probable que en este organismo el 3-hidroxiantranilato
se derive de 2-amino-2-desoxi-ICHA a través del dihidro-3-hidroxi antranilato.

Más recientemente, se estableció el 3-hidroxiantranilato como precursor del antibiótico LL-

C10037a (Figura 41B) producido por Streptomyces LL-C10037𝝰. Se comprobó que el grupo -
NH2 se introdujo en la posición correspondiente a C-6 de SHK. Se han investigado los pasos
más allá del 3-hidroxiantranilato.434 Un segundo hidroxiantranilato, con el grupo OH en la
posición 6, se deriva de ICHA y se analiza más adelante.

b. 4-AMIN04-DEOXY-CHA Y METABOLITOS DERIVADOS

Además de la aminación del corismato en su posición 2 (= posición 6 de SHK) como en la

formación de antranilato, el CHA también se somete a un proceso que conduce a la producción
de 4-aminobenzoato; esto representa formalmente la pérdida de 4H y la aminación en la posición
4. El 4-AminObenzOate es un intermedio importante para la formación de folato y algunos otros
compuestos. Esta revisión utiliza 4 en lugar de para para describir la ubicación del grupo amino;
desafortunadamente, los nombres de genes relevantes usan la abreviatura PABA para 4-
aminobenzoato.

La biosíntesis del 4-aminobenzoato aún no se comprende completamente. Las preparaciones de

enzimas que convierten CHA en 4ABA se han purificado hasta cierto punto. En E. coli, la
enzima (holo) denominada 4ABA sintasa contiene una subunidad grande (4ABA sintasa I, Mr =
53,400, codificada por pabB) y una pequeña subunidad (4ABA sintasa II, Mr = 212,700,
codificada por pabB). Se han determinado secuencias de nucleótidos para pabB en E. coli, S.
typhiimwiwn y K. pneumoniae. Se han determinado secuencias de nucleótidos de pabA similares
para E. coli, S. typhimurium, K. pneumoniae y Serratia marcescens.

Existe una homología considerable entre estas secuencias y las de los componentes I y II de AS.
Aparentemente, existía un ancestro común para los genes que codifican 4ABA sintasa y AS.

La gran subunidad de E. coli se ha purificado parcialmente (9 veces) a una homogeneidad del 25

al 30% a partir de una cepa sobreexprimida. También se ha informado de la sobreexpresión en
tándem de los productos génicos pabA y pabB junto con una modesta purificación de los
productos.
Algunos otros organismos contienen una enzima similar de dos subunidades, pero en
Streptomyces griseus este no es el caso. En este organismo, la enzima parcialmente purificada no
se pudo separar en dos fracciones y se determinó que tenía una Mr = 50.000 aproximadamente.
Aunque existen mecanismos atractivos para la formación de 4ABA a partir de ICHA, la 4ABA
sintasa I de la cepa E. coli BN116, que contiene el plásmido pAS4, no logró producir 4ABA a
partir de ICHA y NH3. Se ha confirmado el uso de CHA en lugar de ICHA en K. pneumoniae y
Streptomyces sp.

La holoenzima, 4ABA sintasa, forma un intermedio, probablemente pre-aromático, y una enzima

separada (denominada provisionalmente X, Mr = 49.000) convierte el intermedio en 4ABA (ver
Figura 57). El componente 4ABA sintasa 11 es una subunidad gln amidotransferasa y puede
omitirse de las mezclas de incubación si se suministra NH3. Aparentemente, es responsable de la
transferencia de amida al componente I de 4ABA sintasa. Los dos componentes deben
interactuar físicamente para que se produzca la síntesis de 4ABA.
El único material identificado de forma segura como un intermedio en la bioíntesis de 4ABA es
4-amino-4-desoxi-CHA (Figura 57A) sintetizado como el racemato. El 4-amino-4-desoxi-CHA
se convierte enzimáticamente en 4ABA y es posiblemente el sustrato de la "enzima X". Si es así,
el problema restante es ¿cómo se convierte el CHA en 4-amino-4-deaxi-CHA sin la intervención
de ICHA? El precursor de antranilato, 2-amino-2-desoxi-ICHA, podría producirse y convertirse
en 4-amino-4-desoxi-CHA mediante un desplazamiento sigmatrópico, una reacción de adición-
eliminación o una migración de grupo carboxilo.

Esta propuesta presumiblemente requiere al menos tres enzimas si se usa NH3, cuatro si gln es el
donante de amido. Sin embargo, la evidencia disponible hasta ahora sugiere un máximo de tres
para la reacción con gln. Una posibilidad de reacción más simple requeriría un grupo nucleófilo,
X-, en 4ABA sintasa I (Ver Figura 58).
FIGURA 57. Formación de 4-aminobenzoato por acción de CABA sintasa.
La reacción 1 requiere CABA sintasa I y II, y la reacción 2 requiere la
enzima putativa “X”.

Se han examinado varios compuestos para determinar la inactivación e inhibición de 4ABA

sintasa. Una estructura de cicloheptadieno, Figura 59A, fue el inhibidor más potente con Ki =
230 uM (KM para la reacción dependiente de NH3 con CHA = 42 uM). Como ya se señaló, este
material también inhibe la CHA mutasa y AS. Además, el éter glicolílico, Figura 59B, era en
realidad un mejor sustrato que el propio CHA (Vmax = 140% del que tiene el CHA). Los éteres
lactílicos R y S, Figura 59C y D, también eran sustratos, pero con los valores de Vmax, reducidos,
respectivamente, al 13 y al 5,4% de los de CHA.

FIGURA 58. Posible mecanismo de formación de 4-amino-4- deoxi-CHA. R = - (CH2)3

COOH. Se postula que la 4-ABA sintasa I tiene un grupo básico, X-, y un residuo cys como
se muestra a la izquierda. Posteriormente, en esta figura, la 4-ABA sintasa I está
representada por E. Inicialmente, el residuo cys se combina con gln; posteriormente, el
cachorro X- interacciona en la posición 2 de CHA y el complejo "ECHA" es más atacado
por el gln unido a enzima en la posición 4. 4-ABA Synthasc II podría estar involucrado en
estas reacciones posteriores, y X podría estar asociado con él en lugar de 4-ABA sintasa I
FIGURA 59. Inhibidores y sustratos para 4-ABA sintasa.

Además de su importante papel en la formación de folato, 4ABA también puede estar

involucrado en la biosíntesis de metanopterina. Este cofactor, producido por bacterias
metanogénicas como Methanobacterium thermouutotrophicum, contiene una unidad
“pentitilanilina” que aparentemente deriva de una cadena de pentosa intacta, y 4ABA que ha
sufrido descarboxilación.

I. N- (y-L. Glutamil) 4-hidroxianilina y compuestos relacionados.

Los compuestos derivados de 4ABA se encuentran en el hongo Agaricus bisporus. Uno es el

metabolito inusual, N- (y-L-glutamil) -4-hidroxianilina (Figura 60A). No se utilizaron ni PPA ni
antranilato marcados como precursores de este compuesto; sin embargo, se observó una
excelente incorporación de CHA y 4ABA marcados con I4C. Por tanto, es probable que 4ABA
sea el precursor directo; sufre una hidroxilación acompañada de descarboxilación (compárese
con la unidad de “pentitilanilina” que acabamos de discutir para la metanopterina).

La enzima 4ABA hidroxilasa, que requiere FAD, se purificó hasta homogeneidad y se utilizó el
protón HA del nucleótido piridina reducido. El metabolismo adicional de N- (y-L-glutamil) -4-
hidroxianilina conduce a la hidroxiazaquinona, Figura 60B. Este material es un inhibidor de
algunas enzimas que requieren grupos -SH en el sitio activo.
II. Cloranfenicol, obafluorina y compuestos relacionados.

La formación de cloranfenicol requiere L- (4-aminofenil) alanina que probablemente se deriva

de 4-amino4desoxiCHA. Como se señaló, el 4-amino-4-desoxi-CHA se reorganizó
espontáneamente a la estructura "similar a un prefenato" correspondiente (ver Figura 61). Este
proceso, y la conversión posterior a L-(4-aminofenil) -alanina (Figura 61C), es catalizada por un
sistema de "arilamina sintasa" de Streptomyces venezuelue.

FIGURA 60. Formación de N- (y-L-glutamil) 4-hidroxianilina, A y compuestos

relacionados. En la formación de B, también se produce piroglutamato (5-oxoprolina).

FIGURA 61. Formación de cloranfenicol y otros compuestos a partir de L- (4-aminofenil)

alanina. En la estravidina (D), R = -C2 H5. El material de partida es 4-amino-4desoxi-CHA.
C = ~L- (4-aminofenil) alanina; E = 4-nitrofenilacetato; F = aureotina, G = obatluorina, H
= cloranfenicol.
El papel de la fuente de carbono en la regulación de la biosíntesis de cloranfenicol por
Streptomyces venezuelue se ha investigado en detalle en cultivos continuos y discontinuos.
Durante la transición trofase-idiofase inducida por la inanición de nitrógeno, la "represión del
catabolito de carbono" regula la síntesis de enzimas, pero no establece el momento de la
biosíntesis de cloranfenicol. Además, este mecanismo no funciona para un crecimiento con
suficiente nitrógeno con exceso de glucosa.

L- (4-Aminofenil) alanina, Figura 6 lC, se ha aislado de semillas y hojas de Vignu vexillutu. Los
estudios de trazadores descartan una vía a través de phe o tyr. Sin embargo, la SHK marcada se
incorporó bien y los resultados son compatibles con el papel propuesto de 4-amin0-4-desoxi-
CHA. El compuesto "PPA", Figura 61A, es un posible precursor de parte de la estructura de la
estravidina, Figura 61D, de Streptomyces avidini.

La L- (4-aminofenil) alanina también es un precursor de la aureotina (Figura 61F) y la

obafluorina (Figura 61G) La obafluorina es un antibiótico 𝝱-lactona producido por Pseudomom
fluorescens. La L- (4-aminofenil) alanina en el último caso se convierte en 4-nitrofenilacetato
(Figura 61E), y este compuesto también se aisló del organismo.

Ill. Aminación de CHA a Posición 5

El 3-acetamido4hidmxybemato (Figura 41L y Figura 62A) se ha aislado de cultivos de

Pseudomoms cepuciu y puede derivar de CHA por aminación en la posición 5 como se muestra
en la Figura 62. 2-Acetamidopheno1, (Figura 41N y Figura 62B) se ha aislado de P. aeruginosa.
Podría derivarse del 3-acetamid0-4-hidroxibenzoato, pero no se puede descartar un posible papel
del 3-hidroxiantranilato. Curiosamente, el nitrosofenol que contiene hierro, ferroverdina,
contiene un resto de 3-nitroso-4-hidroxibenzoato.

RGURE 62. Posible aminación de CHA en la posición 5. A = 3-acetamido 4-

hidroxibenzoato; B = 2-acetamidofenol.
FIGURA 63. Ramas de PPA. A = ciclohexenilglicina; B = cetomicina; C = 2, '5'-dihidro-
phe; D = faseolidina, E = anticapsina, F =homogentisato; X = formación de plastoquinonas
y tocoferoles.

C.Las ramas del prefenato (Figura 63)

1. La biosíntesis de Phe y Tyr

La ramificación de la PPA es extensa, lo que lleva no solo a phe y tyr, sino también a varios
metabolitos secundarios (ver Figura 63). Las enzimas bifuncionales, CHA mutasa-PPA
deshidratasa y CHA mutasa-PPA deshidrogenasa se consideraron en la Sección II.J. 1 y II.J.2.
Además de las vías "clásicas" a phe y tyr vía, respectivamente, fenilpiruvato (PPY) y 4-
hidroxifenilpiruvato (HPP), las vías alternativas vía arogenate (AGN) han asumido una
importancia considerable (ver Figura 64). En los primeros trabajos, la AGN se denominó
"pretirosina"; En 1980 se obtuvo una rigurosa confirmación de la estructura propuesta para este
compuesto y se sintetizó químicamente como el enantiómero ópticamente puro (+).

FIGURA 64. Las rutas biosintéticas a phe y tyr de PPA.

La ruta AGN se describió en 1974 para la biosíntesis de tyr en cianobacterias, particularmente
Agmenellum quudruplicatum y Amcystis nidulans, en lo que debe considerarse un documento
histórico. El impacto de esta observación aumentó constantemente y en 1981 se reconoció a la
AGN como el único precursor tanto de phe como de tyr en Euglena graci1is. Además, ahora
parece probable que AGN sea el precursor principal, si no exclusivo, de phe y tyr en plantas
superiores.

Ambas vías para phe requieren en una etapa una enzima deshidratasa para catalizar una
deshidratación acoplada a una descarboxilación (en la vía "clásica", PPA >> PPY + H20 + CO2;
en la vía AGN, AGN >> Phe + H2O + CO2) . Para las vías de tyr, se requiere una actividad
deshidrogenasa que se acompañe de descarboxilación. Estas enzimas muestran diversas
especificidades de sustrato y, para las deshidrogenasas, especificidades de cofactor. La
nomenclatura utilizada para describir las diversas enzimas todavía se encuentra en un estado algo
fluido, pero parece que está surgiendo lo siguiente:

Dehydratases (dishidratasa).

PPA específico, no usa AGN, se conocen varios activadores e inhibidores

AGN específico, no usa PPA, retroalimentación inhibida por phe.
Utiliza PPA o AGN, no inhibidos por phe.
Dehydrogenases (deshidrogenasa)

La situación es compleja y se requerirá un trabajo considerable antes de obtener una

comprensión más completa. Además, pueden surgir ambigüedades por la presencia de mezclas
de enzimas. No todos los tipos enumerados anteriormente están bien caracterizados, por ejemplo,
por preparaciones enzimáticas homogéneas. De hecho, relativamente pocas de las enzimas se han
purificado hasta homogeneidad. No siempre se han evitado algunos errores técnicos. Por
ejemplo, una proteína homogénea obtenida de Phenylobacterium immobile se describió como
AGN deshidrogenasa; El PPA no era un sustrato. Sin embargo, no se proporcionó la prueba
crucial de la formación de tyr para que alguna otra deshidrogenasa pudiera haber sido purificada.
Es particularmente importante señalar que las preparaciones de AGN pueden estar contaminadas
con PPA o compuestos desconocidos que pueden comportarse como sustratos de deshidrogenasa.

En términos de utilización de enzimas in vivo, se han observado las siguientes combinaciones:

1.Solo se usa la ruta clásica a través de PPY y HPP tanto para phe como para tyr, por ejemplo, E.
coli, B. subtilis. A pesar de la similitud en la vía post-PPA, estos dos organismos difieren
considerablemente en los componentes pre-PPA. En E. coli, las enzimas que utilizan PPA
existen como complejos bifuncionales con CHA mutasa. En B. subtilis de tipo salvaje, la CHA
mutasa es monofuncional y en la cepa 168 de B. subtilis es bifuncional con la DAHP sintasa (ver
Sección II. K). N. crassa utiliza la vía dual clásica; sin embargo, los mutantes bloqueados triples
de este organismo (bloqueados en la biosíntesis de phe, tyr y trp) acumulan AGN esencialmente
como un metabolito “sin salida” (ver la Sección III.C.1.h).

2.Solo se usa la vía AGN para phe y tyr, por ejemplo, Euglena gracilis, probablemente plantas
superiores.

3.La ruta clásica a través de PPY se usa para la biosíntesis de phe y la ruta de AGN se usa para la
biosíntesis de tyr, por ejemplo, cianobacterias, bacterias del ácido glutámico, varios
Streptomyces y varios Actinomycetales.

4.La ruta clásica a través de HPP se usa para la biosíntesis de try y la ruta de AGN para la
biosíntesis de phe, por ejemplo, Pseudomom diminuta.

5. Ambas vías completas coexisten, por ejemplo, Pseudomoms aeruginosa, Xanthomonas

campestris, Neisseria gonorrhoeae, Claviceps sp. (forma phe de AGN y PPY, tyr
preferentemente de AGN).

Aunque muchos organismos contienen tanto PPA deshidratasa como ciclohexadienil

deshidratasa, aparentemente no hay ejemplos de organismos con dos de las deshidrogenasas.
Como ya se señaló, la regulación de las rutas de biosíntesis de los aminoácidos aromáticos,
comenzando con la DAHP sintasa, ha recibido una atención considerable; la situación, por
supuesto, se complica más por la existencia de la vía AGN. Una excelente descripción general de
las vías del posprefenato incluye un análisis de los problemas técnicos.

Es de interés que las deshidrogenasas CHA mutasa-PPA bifuncionales parcialmente purificadas

de K. pneumoniae y E. coli pudieron utilizar AGN. Se demostró la formación de tyr a partir de
este sustrato. La utilización tanto de PPA como de AGN fue inhibida por tyr. Otras enzimas
microbianas, que no ocurren en asociación con una actividad enzimática totalmente diferente, se
consideran ahora brevemente; pueden mostrar ambigüedades de sustrato como ya se mencionó.
El papel de los AGN en las plantas se considera en la Sección III.C. 1 .g.
a. PPA DESHIDRATASA

La formación de PPY a partir de PPA es catalizada por EC 4.2.1.51, hidroliasa de prefenato

(descarboxilasa), generalmente conocida como PPA deshidratasa. Esta enzima tiene una amplia
distribución en microorganismos, pero no se han descrito actividades de PPA deshidratasa en
plantas superiores.

La PPA deshidratasa se ha purificado (10.000 veces) hasta homogeneidad electroforética a partir

de B. subtilis NP1. Esta enzima fue activada, entre otros, por met y leu y fuertemente inhibida
por phe, trp y análogos estructurales de estos aminoácidos. La presencia o ausencia de tales
moléculas activadoras influyó considerablemente en el nivel de polimerización de la molécula;
Se observaron todas las formas con M de 35.000 (monómero), 55.000 (dímero) y 210.000
(octámero). En presencia de activadores (met, leu, PPA), el octámero activado al máximo estaba
presente y se convirtió reversiblemente en el dímero activado de forma variable mediante
inhibidores (phe, trp). El calentamiento a 32 ° C en ausencia de moléculas efectoras formó el
monómero inactivo.

Esta regulación observada por metabolitos de vías aparentemente inconexas (met, leu) se ha
denominado "interbloqueo metabólico". La utilización de un tipo de "interbloqueo" de PPA
deshidratasa es aparentemente característica de las bacterias Gram-positivas. Este patrón
entrelazado también se observó cuando se investigó la actividad de la PPA deshidratasa de una
arquebacteria halófila extrema. La enzima se estabilizó mediante altas concentraciones de sal (>
2,0 M de NaCl) con una actividad máxima a 3,0 M de NaCl. De los tres aminoácidos aromáticos,
phe fue fuertemente inhibidor, tyr fue un activador bastante bueno y trp fue inhibidor de una
manera compleja. Además, met, leu e ile eran efectores de activación.

Se obtuvo PPA deshidratasa altamente purificada (2000 veces), sin actividad AGN, de
Microtetraspora glauca. Phe, tyr y trp eran inhibidores de retroalimentación y la enzima nativa
tenía Mr = 110.000.

La PPA deshidratasa de Flavobacterium devorans se purificó (43 veces) y el valor estimado de

Mr fue 135.000. En contraste con la enzima B. subtilis que se acaba de describir, esta enzima fue
activada por phe, tyr y trp. Varios organismos formadores de esporas del orden Actinomycetales
contienen una actividad de PPA deshidratasa que generalmente es inhibida por phe; en unos
pocos casos con estos organismos, tyr fue un fuerte activador.
El gen pheA (que codifica la PPA deshidratasa) del Corymbacterium glutamicum de importancia
comercial se ha clonado y secuenciado. Se complementó un auxótrofo pheA de E. coli cuando el
gen se clonó en ambas orientaciones en el vector pUC8 de E. coli. El gen estructural se localizó
en un OW de 1070 pb, la enzima tenía 315 residuos de aminoácidos con Mr = 33.740. El
producto génico predicho tenía una homología significativa (26%) con la región C-terminal de E.
coli CHA mutasa-PPA deshidratasa. Estos resultados confirmaron la localización de la actividad
PPA deshidratasa en los dos tercios C-terminales de la enzima E. coli (ver Sección II. J. 1) y
confirmaron que había actividades CHA mutasa y PPA deshidratasa separadas en C.
glutamicum.
En Candiah maltosa, la PPA deshidratasa también era separable de la CHA mutasa y tenía Mr =
88.000. La actividad deshidratasa fue estimulada por trp y sus análogos metilados.

b. AGN DESHIDRATASA

La AGN deshidratasa aún no se ha purificado hasta la homogeneidad. Se ha descrito una

purificación de aproximadamente cinco veces a partir de Pseudomonas diminuta 13184. La
enzima de la cepa 11568 fue fuertemente inhibida por phe. Hasta hace poco, era difícil analizar
esta enzima a pesar de que había cuatro métodos disponibles. Ahora se ha introducido un método
más simple, basado en las dos reacciones siguientes. La formación de PPY en este ensayo se
mide a 320 nm en condiciones básicas.

Aromatic aminotransferase from (la aminotranseferasa aromatica de )

C. CICLOHEXADIENIL DESHIDRATASA

Una ciclohexadienil deshidratasa que utiliza PPA o AGN está presente en Xanthomonas
campestris, P. aeruginosa y otras Pseudomonas, Serratia marcescens y Erwinia sp. A diferencia
de la AGN deshidratasa descrita anteriormente, esta enzima no es inhibida por phe. El método de
purificación utilizado para la AGN deshidratasa de Pseudomonas diminuta se aplicó a P.
aeruginosa ciclohexadienil deshidratasa; no se dio el grado de purificación.

d. PPA DESHIDROGENASA

Las deshidrogenasas que convierten PPA en HPP son específicas de NAD [EC 1.3.1.12,
prefenato: NAD + oxidorreductasa (descarboxilante)] o específicas de NADP [EC 1.3.1.13,
prefenato: NADP + oxidorreductasa (descarboxilante)]. Se describen aquí en general como PPA
deshidrogenasas. Se han investigado en varios microorganismos y presentan una amplia variedad
de requisitos con respecto a NAD o NADP.
Con la excepción de algunos frijoles, no se han encontrado deshidrogenasas de PPA en plantas.

La PPA deshidrogenasa de Alcaligenes eutrophus ATCC 17699 se purificó (740 veces), pero no
se obtuvo un producto homogéneo. La enzima fue inhibida por el producto HPP y análogos
estructurales. Candida maltosa contiene una PPA deshidrogenasa dependiente de NAD con Mr =
75.000. La enzima, que no ha sido purificada, fue inhibida por tyr.
e.AGN DESHIDROGENASA

El número de la Comisión de Enzimas EC 1.3.1.43 se ha asignado a la AGN deshidrogenasa

específica de NAD. El nombre sistemático de la enzima es 3- (1-carboxi-4-hidroxiciclohexa-2,5-
dien-1- y1) -L-alanina: NAD + oxidorreductasa. Lamentablemente, el nombre recomendado es
pretirosina deshidrogenasa, que utiliza el término abandonado para AGN. Dado que existe una
amplia variación en las especificidades de los cofactores para las AGN deshidrogenasas y dado
que algunas enzimas deben clasificarse como ciclohexadienil deshidrogenasas, es necesaria una
revisión de la nomenclatura formal.
Se han purificado hasta homogeneidad dos preparaciones de AGN deshidrogenasa. Se ha
introducido la salvedad de que en ningún caso se demostró la formación de tyr. Se obtuvo una
purificación de 95 veces de una enzima inestable de Streptomyces phaeochromogenes. La
enzima homogénea constaba de dos subunidades idénticas, cada una de Mr = 28.100. Se estimó
que la enzima nativa tenía Mr = 66,300. Fue específico de NAD y no hubo inhibición por PPA.
Otra AGN deshidrogenasa dependiente de NAD se purificó 8 1 veces a partir de
Phenylobaccerium inmóvil. La enzima era un dímero (Mr = 69.000) de dos subunidades
idénticas (Mr = 37.700). El PPA no era un sustrato y, de hecho, era inhibidor.

La AGN deshidrogenasa se purificó parcialmente a partir de tres especies de bacterias

corineformes (Corynebacterium glutamicum, Brevibacterim flavum, Brevibacteriwn
ammoniagenes). Estos organismos no contenían actividad PPA deshidrogenasa.

f. CICLOHEXADIENIL DESHIDROGENASA

Las actividades de la PPA deshidrogenasa y la AGN deshidrogenasa no se han separado en

organismos como P. aeruginosa, que tienen vías duales. Las proteínas deshidrogenasas simples
con especificidad dual probablemente están involucradas y se denominan apropiadamente
ciclohexadienil deshidrogenasas. También se ha demostrado actividad ciclohexadienil
deshidrogenasa específica de NAD en Microtetraspora glauca y Neisseria gonorrhoeaea. La
ciclohexadienil deshidrogenasa específica de NADP está presente en Acinetobacter
calcoaceticus.

g. EL PAPEL DEl AGN EN LAS PLANTAS

En 1986 estaba claro que la vía de AGN a tyr desempeñaba un papel importante en las plantas.
Con la excepción del frijol mungo y posiblemente otras especies de frijol, la PPA deshidrogenasa
(obligatoria para la vía clásica a tyr) no se había detectado en plantas. Por tanto, la única
posibilidad de biosíntesis de tyr era a través de la AGN deshidrogenasa.

Puede parecer sorprendente que en ese mismo año se pudiera afirmar que “la ruta enzimológica
específica de la biosíntesis de L-fenilalanina no se ha establecido en ningún sistema vegetal
superior. sin embargo, la actividad de AGN deshidratasa ahora se ha detectado de manera
inequívoca (y parcialmente purificada) en poblaciones de células cultivadas de Nicotianu
silvestris y cloroplastos de espinaca lavados.
Un problema experimental importante fue que los altos niveles de actividad proteasa también
dieron lugar a la producción de phe en mezclas de incubación de enzimas. Para N. silvestris, la
adición de inhibidores de proteasa (leupeptina, pepstatina) fue útil, y con las espinacas, los
cloroplastos lavados no presentaron este problema. Ambas enzimas fueron activadas por tyr e
inhibidas por phe. La mayor parte de la actividad AGN deshidratasa de la espinaca estaba
presente en el compartimento del cloroplasto.

Quizás debería recalcarse que la actividad de la PPA deshidratasa para la biosíntesis de la fe por
la vía clásica nunca se detectó en ninguna planta. Parece más probable que las plantas superiores
usen generalmente la vía de AGN para la síntesis tanto de phe como de tyr. La única excepción
conocida a esta declaración parece ser para la etapa de desarrollo de la germinación de semillas
en frijol mungo y posiblemente otros frijoles como la soja y la cera. No está del todo claro si los
frijoles mungo tienen enzimas separadas o una sola enzima del tipo ciclohexadienilo con doble
especificidad.

En plantas, se obtuvo una purificación parcial (816 veces) de una AGN deshidrogenasa
dependiente de NADP a partir de cultivos celulares de Nicotianu silvestris. Esta preparación fue
inhibida por tyr. Se purificó (10,5 veces) otra AGN deshidrogenasa de planta a partir de plántulas
de Sorghum bicolor etioladas con estabilización mediante etilenglicol al 20% y mercaptoetanol
al 0,1%. El gradiente de elución de una columna de DEAE-celulosa dio un solo pico de actividad
AGN deshidrogenasa dependiente de NADP con un 93% de recuperación. No se estableció la
homogeneidad electroforética. La AGN deshidrogenasa fue fuertemente inhibida por tyr y no fue
afectada por phe, trp y PPA. No hubo actividad PPA deshidrogenasa. Se ha informado de un bajo
grado de purificación de AGN deshidrogenasa dependiente de NAD del maíz. Esta enzima
dependiente de NAD es una excepción al hecho de que todos los demás eucariotas fotosintéticos
tienen enzimas unidas a NADP.

Se ha informado de una purificación seis veces mayor de la AGN deshidratasa a partir de

plántulas etioladas de Sorghum bicolor, pero la enzima no era una proteína homogénea. La
enzima fue inhibida competitivamente por phe y estimulada por tyr. No hubo evidencia de
actividad PPA deshidratasa.

h. COMPUESTOS Y ENZIMAS RELACIONADOS CON AGN

Un mutante triple bloqueado de N. crassa, ATCC 36373, carece de PPA deshidratasa, PPA
deshidrogenasa y AS; por lo tanto, no puede convertir PPA en PPY o HPP. Acumula PPA, AGN
y otros dos compuestos de ciclohexadienilo (ver Figura 65). Uno de estos nuevos materiales se
deriva por ciclación de AGN (Figura 65B) a una espiro-y-lactona (Figura 65C); esta lactona se
llama espiro-arogenato (SPN). En SPN, C-8 tiene la configuración (esperada) L (= S) y, al igual
que con el propio AGN, se asume razonablemente que la configuración en C-1 es la misma que
en PPA. La producción de SPN está catalizada por una supuesta espirasa. Los experimentos de
trazadores con [3-3H] SHK en N. crassu 36373 establecieron que, como se esperaba, AGN
aparece antes que SPN.
FIGURA 65. Formación de espiro-AGN y prefenilactato en triple bloqueo
mutante de N. crassa.

FIGURA 66. Aromatización de compuestos de ciclohexadienilo. Si R =

-CH2 COCOOH, la conversión es PPA>>PPY; si R = -CH2CHOHCOOH,
la conversión es PPL >> fenilactato; si R = -CH2 CHNH2 COOH. los
la conversión es AGN >> phe.

La segunda estructura de ciclohexadienilo, Figura 65A, está formada por una reducción del
grupo carbonilo de PPA y se denomina prefenilactato (PPL). En PPL, la configuración en C-8 es
R. Claramente, se requiere una deshidrogenasa putativa para esta reacción. En condiciones
ligeramente ácidas, las estructuras de ciclohexadienilo se aromatizan (véase la figura 66) en el
siguiente orden; PPL> PPA> AGN> SPN. PPL funciona como sustrato para dos enzimas; K.
pneumniae ciclohexadienil deshidrogenasa formando 4-hidroxifenilactato y K. pneumoniae
formando fenilactato ciclohexadienil deshidratasa. La CHA mutasa-PPA deshidratasa
bifuncional de este organismo, sin embargo, no usa PPL como sustrato.
AGN se puede convertir en SPN calentando a un pH de 7,5 a 12 y 100 ° C. Estas condiciones
argumentan a la fuerza que la supuesta espirasa debe existir para la conversión in vivo. El
proceso inverso, SPN >> AGN requiere pH> 12 y 100 ° C. Para obtener un resumen de estos
procesos, consulte la Figura 67.

FIGURA 67. Interconversión de AGN y espiro-AGN y formación de phe.

Reacción 1, H +; reacción 2, AGN deshibtasa; reacción 3, AGN espirasa;
reacción 4, pH de 7,5 a 12,0, 100ºC; reacción 5. pH> 12, 100 ° C; reacción 6,
SPN deshidratasa.

I. AMINOTRANSFERENCIA DE PPA

La PPA aminotransferasa cataliza la conversión de PPA en AGN y, por tanto, es una enzima
importante. Se han obtenido preparaciones electroforéticamente homogéneas para Nicotiana
silvestris. La enzima nativa altamente purificada tenía Mr = 220.000, aparentemente con dos
subunidades diferentes (valores de Mr de 44.000 y 57.000). Estos datos sugirieron una estructura
𝝰2𝝱2. Se obtuvo una preparación casi homogénea de PPA aminotransferasa (purificación de 41
veces) de Anchusa oflcinallis. En Sorghum bicolor, la PPA aminotransferasa estaba presente en
los protoplastos epidérmicos y mesófilos y en las células de la vaina del haz, y estaba localizada
predominantemente en el plastidio.

En general, estas enzimas se caracterizan por un pH óptimo alto (pH 8,0 a 9,0), por estabilidad
térmica y por una fuerte especificidad de sustrato para PPA. Esta especificidad contrasta con las
enzimas microbianas que muestran una acomodación multiespecífica de sustratos. Se aprovechó
la estabilidad térmica para obtener un ensayo selectivo de esta actividad en células cultivadas en
suspensión de N. silvestris.

I. AMINOTRANSFERASAS

Hay cuatro amino transferasas en E. coli que catalizan los pasos terminales en la biosíntesis de
aminoácidos. De estos, la transferasa de aminoácidos aromáticos (EC 2.6.1.57) aparentemente
tiene el papel principal en la biosíntesis de phe y tyr. Una asp amino transferasa (EC 2.6.1.1)
tiene una amplia especificidad y utilizará PPY y HPP, pero tiene una afinidad menor por estos
materiales que la transferasa de aminoácidos aromáticos. Estas dos enzimas están codificadas por
los genes tyrB y aspC, ambos secuenciados.

La transferasa de aminoácidos aromáticos es un polipéptido de 397 residuos. Los productos

génicos tyrB y mpC (396 residuos) son proteínas relacionadas y muestran homologías
significativas. El gen tyrB es parte del regulón tyrR. Se ha identificado el locus operador para
tyrB y se ha encontrado que su expresión está controlada a nivel transcripcional por la proteína
TyrR con tyr como correpresor. Estos aspectos regulatorios han sido revisados por Pittard. El
aminoácido aromático transferasa se ha purificado (750 veces) hasta homogeneidad de E. coli, al
igual que el producto del gen aspC (213 veces). Ambas enzimas son homodímeros con Mr nativo
en el rango de 42.000 a 45.000.

En P. aeruginosa, no solo hay secuencias enzimáticas duales tanto para phe como para tyr, sino
que, además, este organismo posee cinco transferasas de aminoácidos aromáticos. Dos enzimas,
AT-1 y AT-2, se separaron fácilmente mediante filtración en gel. A partir de la caracterización
fenotípica y enzimológica de mutantes apropiados, se concluyó que AT-2 (Mr = 50.000) tenía el
papel principal en la biosíntesis de phe y tyr, mientras que AT1 (Mr = 64.000) estaba
involucrado en la biosíntesis de asp y glu. A una enzima menos caracterizada, AT-4 (Mr =
200.000), también se le asignó un papel in vivo para la biosíntesis de phe y tyr.

En B. subtilis, hay dos transferasas de aminoácidos aromáticos, una de las cuales también es
responsable de la transaminación de imidazol acetol fosfato a histidinol fosfato (requerido en su
síntesis). El gen involucrado en la síntesis de la transaminasa de función dual, hisH, se encuentra
en medio de un grupo de genes relacionados con la biosíntesis de aminoácidos.
Las transferasas de aminoácidos aromáticos no están bien descritas en plantas, y aparentemente
ninguna se ha purificado hasta homogeneidad.

2. Productos para homogentisato (a través de hidroxifenilpiruvato)

a. PLASTOQUINONAS Y TOCOFEROLES

El homogentisato (Figura 63F) es un intermedio importante para la biosíntesis de plastoquinonas

(abreviado como FQ-n donde n define el número de residuos de isoprenilo en la cadena lateral),
tocoferoles y compuestos relacionados (ver Figura 63). Se presenta naturalmente como su 𝝱-D-
glumside (phaseoloidin) en la planta Entudu phaseoloides. El homogentisato puede derivarse de
PPA a través de HPP; La 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (EC 1.13.1 1.27) cataliza una
reacción compleja de hidroxilación y migración del grupo -CH2COOH con retención de la
configuración (ver Figura 68)

Por el momento, no está del todo claro cómo las plantas en general obtienen HPP para la
biosíntesis de homogentisatos. Se ha dicho que “es probable que el homogentisato se forme
directamente a partir de 4-hidroxifenilpiruvato (HPP) directamente a través de la vía del
shikimato. La enzima dioxigenasa necesaria se localizó predominantemente en cloroplastos. Las
membranas de la envoltura tenían la mayor actividad específica para esta enzima, pero la mayor
parte de la actividad se localizaba en el estroma. Las reacciones separadas, que se muestran a
continuación, se demostraron en preparaciones de membranas de envoltura.

FIGURA 88. Estereoquímica de HPP dioxigenasa. A = homogentisato.

FIGURA 69. Formación de plastoquinona (FQ-9, B) a partir del homogentisato, A

La utilización de tyr se consideró solo como un desvío. Como se demuestra aquí, todas las
enzimas para los últimos pasos de la biosíntesis de tocoferol y PQ se localizan en la membrana
de la envoltura interna.

En contradicción con estas conclusiones, ahora parece que la mayoría de las plantas sintetizan tyr
a través de la vía AGN y no tienen actividades PPA deshidrogenasa (PPA -- // >> HPP). Por
tanto, deben derivar HPP de tyr (PPA >> AGN>> tyr >>HPP).
En la biosíntesis de los tocoferoles y PQ, el -CH2 COOH pup se descarboxila para proporcionar
uno de los grupos metilo característicos (los otros se originan en S-adenosilmetionina). Como
ejemplo, la formación de PQ-9 ocurre como se muestra en la Figura 69. Se encontró que la
descarboxilación procedía con retención de la configuración cuando los cloroplastos de
Raphanus sativus sintetizaban tocoferoles y PQ. Se creía que el proceso implicaba un intermedio
de quinona de estructura desconocida con respecto a la presencia o ausencia de sustituyentes
adicionales (ver Figura 70).

Existe un acuerdo general de que en las preparaciones de cloroplasto (p. Ej., De lechuga,
espinaca) la biosíntesis de 𝝰-tocoferol es como se muestra en la Figura 71. Mientras que el 2-
metil-6-fitilbenzoquinol (Figura 71A) parece ser el único producto derivado del homogentisato
en estas preparaciones, existen formas isoméricas en Scenedesmus obliquus y en otros lugares.
Puede haber una segunda vía extracloroplastídica para la biosíntesis de tocoferol.

FIGURA 70. Mecanismo posible de descarboxilación del homogentisato marcado, A, para

formar PQ, B. En la secuencia de reacción detallada en la parte inferior, no se han indicado
posibles sustituyentes de anillo.

FIGURA 71. Biosíntesis de 𝞪-tocoferol. SAM = S-adenosilmetbionina;

SAH = S-adenosilhomocisteína. A = 2-metil-6-fitil-benzoquinol; B =
2,3-dietil-6-fitil-benzoquinol; C = y-tocoferol; D = 𝞪-tocoferol.
La situación sigue siendo confusa y se debe consultar la literatura original para obtener más
detalles. Se han revisado las dificultades para dilucidar la (s) vía (s) de la biosíntesis de tocoferol.

A nivel de enzima, la y-tocoferol metiltransferasa (𝞬 >> 𝝰-tocoferol, Figura 71, C + D) de los

cromoplastos de Capsicum anuum se purificó hasta homogeneidad electroforética (Mr = 33.000
por SDS-PAGE). En ausencia de detergentes, se formaron agregados de mayor peso molecular.

b. OTROS PRODUCTOS DE PPA

Los estudios de trazadores y genéticos han indicado que el aminoácido inusual, anticapsina
(Figura 63E), se deriva de la vía SHK a través de la PPA. La anticapsina es un componente,
junto con el ala, del antibiótico dipéptido, bacilisina, producido por B. subtilis. Otro antibiótico
es 2 ', 5'-dihidro-phe (Figura 63C), producido por Streptomyces arenae y Erwinia amylovora;
este compuesto también es necrotóxico para las células de la pera. Los estudios de trazadores han
establecido la PPA (pero no la 5,6-dihidro-PPA) como un intermedio biosintético (ver Figura
72).

El cetoácido, cetomicina (Figura 63B), es un antibiótico producido por Sneptomyces

antibioticus. Los experimentos con trazadores biosintéticos han indicado funciones para CHA y
PPA. No se utilizaron ni phe ni 2 ', 5'-dihidro-phe. La utilización de PPA procedió de una manera
estereoespecífica (ver Figura 73). La cetomicina inhibe las bacterias gramnegativas y B. subtilis
en virtud de su conversión en 3-ciclohexenilglicina (Figura 63A); se sabe que este aminoácido se
encuentra en algunos Streptomycetes.

FIGURA 72. Vía biosintética para la formación de 2 ', 5'-dihidro-phe, A.

FIGURA 73. Biosíntesis de cetomicina, A, y ciclohexenilglicina, B,
de PPA.
FIGURA 74. Ramas de ICHA. A = 3 (3sarboxifenil) almina; B =
iso-PPA; C = 3 (3carboxi4hidroxifenil) alanina; D = SHCHC; E =
OSB; F = 2,3-dihidroxibe-te; G = salicilato; H = intermedio epóxido;
I = 6-hidroxiantranilato.

D. Sucursales de ICHA (Figura 74)

7. Naftoquinonas

Además de las quinonas benzenoides, ubiquinona y plastoquinona, otro grupo de quinonas

funcionalmente importantes se basa en un núcleo naftalenoide. Estas quinonas son filoquinona
(abreviada K, que se encuentra en plantas y algunos organismos fotosintéticos) y las
demetilmenaquinonas bacterianas (abreviada DMK-n, donde n indica el número de residuos
isoprenoides en la cadena lateral) y menaquinonas (MKn). La distribución de estas quinonas en
microorganismos y sus vías biosintéticas se han revisado extensamente.

Estas naftoquinonas se originan en ICHA, con funciones importantes para el benzenoide

ammático, 0-succinilbenmato (OSB), su derivado CoA y el naftalenoide aromático, 1,4-
dihidroxi-znaftoato (DHNA) (ver Figura 75). Se ha publicado la evidencia de la estructura
asignada del derivado CoA de OSB.

En general, las reacciones de la biosíntesis de MK son razonablemente sencillas y guardan cierta

semejanza con las de la biosíntesis de Q (prenilación, metilación nuclear). El paso más intrigante
es la conversión de ICHA a OSB: este proceso también requiere la presencia de 2-cetoglutarato y
pirofosfato de tiamina (TPP). El aislamiento del intermedio, 2-SUCcinyld-hidroxi-2,4-
ciclohexadieno-1-carboxilato (SHCHC, ver Figura 73, es consistente con el hecho de que dos
genes, menD y menC están involucrados en E. coli. que una actividad descarboxilasa convierte
el 2-cetoglutarato en el anión TPP del semialdehído succínico; esta actividad descarboxilasa es
distinta de la del complejo 2-cetoglutarato deshidrogenasa.
El propio succinato puede reemplazar al 2-cetoglutarato para la biosíntesis de MK en
preparaciones de membrana de Micrococcus leisodeikticus. Como se indica en la Figura 76, el
semialdehído succínico-TPP presuntamente ataca a ICHA en la posición 6 y, tras la pérdida de
TPP y piruvato, se forma SHCHC. Esta reacción es catalizada por SHCHC sintasa, el producto
proteico del gen menD. A continuación, la SHCHC se deshidrata a OSB mediante la OSB
sintasa, el producto proteico del gen menC (SHCHC sintasa y OSB sintasa, antes denominadas
OSB sintasa I y II).

FIGURA 75. Biosíntesis de menaquinona de ICHA. R1 = HOOC

CH2---CH2-; R2 = prenilo; TPP = pirofosfato de tiamina. Las enzimas
son los siguientes: 1, ICHA sintasa, 2, SHCHC sintasa; 3, sincronización OSB, 4,
OSB-CoA sintasa, 5, DHNA sintasa; 6, preniltransferasa; 7, metiltransferasa.

FIGURA 76. Mecanismo de reacción postulado para SHCHC sintasa. Reacción

1 = actividad cetoglutarato descarboxilasa. R = HOOC ~ CH2-CH2--; TPP
= pirofosfato de tiamina
OSB se convierte en OSB-CoA por la enzima OSB-CoA sintasa en una reacción dependiente de
ATP. Esta enzima, el producto proteico de menE, se ha purificado casi hasta su homogeneidad.
OSB-CoA se cicla a DHNA (gen menB); en este proceso, se retiene el protón 3'-HR (Figura 75).
Los pasos finales de la biosíntesis de MK requieren prenilación acompañada de descarboxilación
y metilación de la DMK así formada.

Como se acaba de resumir, la biosíntesis de MK en E. coli requiere cinco genes. Uno de ellos,
me &, ha sido clonado, secuenciado y utilizado en la construcción de una cepa de sobreexpresión
para la primera enzima (SHCHC sintasa) de la vía biosintética. Ha sido posible alguna
purificación inicial de SHCHC sintasa.

La regulación de la vía biosintética de MK en E. coli no se comprende bien. Se sabe desde hace

algún tiempo que el nivel de naftoquinona (suma de DMK y MK) aumenta en condiciones
anaeróbicas. Esta desrepresión anaeróbica de la biosíntesis de naftoquinona no está regulada por
FNR (el producto del gen fnr). El crecimiento con fumarato o dimetilsulfóxido conduce a MK
como componente predominante, mientras que con nitrato predomina DMK. El locus de
hombres de B. subtilis ha sido clonado e investigado con cierto detalle. El análisis indica un gen
y un orden de transcripción del promotor-menC, DmenE-menB. El grupo de hombres se expresa
en forma de al menos un mensaje policistrónico, que indica la presencia de un operón de
hombres. Se han determinado algunas secuencias de nucleótidos y se ha estudiado la expresión
con la fusión del gen men'-lacZ.

Las plantas contienen filoquinona (K) en lugar de MK; la única diferencia es la de un fitilo en
lugar de una cadena lateral de poliprenilo más larga. La biosíntesis de K sigue el mismo patrón
que la de MK,
pero se dispone de información menos detallada. Recientemente se ha observado la formación de
OSB y DHNA en extractos enzimáticos de células de Euglena gracilis. También se sabe que el
DHNA sufre una fitilación con difosfato de fitilo en la membrana de la envoltura de los
cloroplastos de espinaca.535 El paso terminal, la metilación, se produce en las membranas
tilacoides de los cloroplastos; es necesaria la adición de proteína de estroma soluble. Se han
informado resultados similares para preparaciones de frutos de Capsicum annuum. Algunas
plantas contienen MK-1 y una ruta biosintética diferente puede estar involucrada en su
formación (ver la siguiente sección).

OSB también es un intermedio importante para la producción de algunas naftoquinonas vegetales

(distintas del K), antraquinonas y otros productos. En la biosíntesis de K, MK, lawsona (2-
hidroxinaftoquinona) y algunas antraquinonas (p. Ej., Alizarina), no intervienen intermediarios
simétricos entre OSB y las naftoquinonas finales. Sin embargo, para la biosíntesis de juglona (5-
hidroxinaftoquinona), está involucrado un intermedio simétrico, posiblemente 1, 4-naftoquinona;
este tema ha sido revisado.

En la formación de K y MK, la adición del grupo fitilo o prenilo se produce en el átomo de

carbono derivado de C-2 'de OSB (= C-2 de DHNA; consulte la Figura 75). Esta posición C-2 'de
OSB también agrega una sola unidad de isopentenilo en la formación de algunos metabolitos por
los tejidos del callo de Catalpa ovata. Muchas publicaciones en esta área del laboratorio de
Inouye solo pueden resumirse brevemente aquí. Dos de los metabolitos observados son DMK-1
(= desoxilapachol) y MK-1 (ver Figura 771 y J). Parece que el intermedio MK habitual, DHNA,
no participa en la formación de estos y otros metabolitos relacionados; en cambio, OSB se cicla a
carboxioxotetralona (Figura 77D), y este último compuesto se somete a prenilación para formar
el enantiómero 2S de 2-prenil-2-carboxi-4-0x0-1-tetralona (Figura 77E).

FIGURA 77. Metabolitos formados por tejidos de callos de Catalpa ovata. A =

forma tautomérica de D; B = catalponol; C = catalpalactona; D = carboxi-4-oxo-1-
tetralona; E = prenil-carboxi-4-oxo-1-tetralona; F = catalponona;
G = dihidroxilapachona; H = 1-hidroxy-2-metilantraquinona; I= deoxilapacol (DMK-1);
J=MK-1.

La descarboxilación conduce luego a 2R-catalponona (Figura 77F); Este compuesto está

definitivamente implicado como intermedio en la biosíntesis de catalpalactona (Figura 77C),
catalponol (Figura 77B), 4-9-dihidroxi-ar-lapachona (Figura 77G), 1 -hidroxi-2-metil-
antraquinona (Figura 77H ), DMK-1 (Figura 77I) y MK-1 (Figura 77J). Hasta cierto punto, una
red metabólica compleja está involucrada con rutas alternativas posibles para algunos de los
compuestos.

Un patrón de prenilación que es diferente al observado con MK y los metabolitos de Catalpa

ovuta ocurrió en la síntesis de antraquinona por algunas otras plantas de la familia Rubiaceae
(por ejemplo, Rubia tinctorum, Galium mollugo, Morindu lucidu). En estas plantas, el proceso
requirió DHNA. En cultivos en suspensión de células productoras de antraquinona de Galium
sp., ICHA fue el precursor de OSB. Una ligasa OSB-CoA, obtenida de cultivos en suspensión de
células Galium mollugo productoras de antraquinona, produjo el éster OSB-CoA "alifático",
idéntico al de las bacterias.
Después de la formación de DHNA, se añadió una sola unidad de isopentenilo en C-3 (de
DHNA) y se retuvo la XOOH en C-2 (formando la Figura 78A). Las reacciones posteriores
dieron lucidina (Figura 78B). Esta vía se reforzó mediante el aislamiento de compuestos
relacionados (Figura 78C y D) de plantas intactas y cultivos en suspensión celular de Galium
mollugo.
Un desarrollo interesante ha sido la preparación de cultivos en suspensión de células
fotoheterotróficas y fotoautotróficas derivadas de una planta Morindu lucidu. En esta planta, se
encuentran glucósidos de antraquinona en mts y estos materiales estaban ausentes de los cultivos
fotoautótrofos. Las lipoquinonas, normalmente constituyentes de las hojas, estuvieron presentes
en cantidades equivalentes en los cultivos fotoautótrofos y fueron menos abundantes en los
cultivos fotoheterótrofos. Cuando cualquiera de los tipos de cultivo se mantuvo en la oscuridad
en presencia de sacarosa, resultó una síntesis abundante de antraquinona, coincidiendo con la
desaparición de las lipoquinonas. Como reflejo de la situación en la planta intacta, la biosíntesis
de antraquinona se correlacionó con la heterotrofia, la síntesis de lipoquinona con la autotrofia.

FIGURA 78. Formación de lucidina y compuestos relacionados. A= penil-DHNA; B =

lucidina, C, D, otros metabolitos formados por Galio mollugo; R= glucosa.

Ha surgido una variación adicional para la prenilación de OSB para la biosíntesis de

naftoquinonas y antraquinonas en cultivos celulares de Streptocurpus dunnii (Gesneriaceae). La
formación de antraquinona requiere el intermedio clave, 2-prenil-1,4-naftohidroquinona (Figura
79A), que aparentemente experimenta una conversión de CH3 + -CH20H antes de la ciclación a
2-metilantraquinona (Figura 79C). Otras antraquinonas con un -OH adicional derivan de 2-
rnetilantraquinoe.
La Figura 79A es, por supuesto, la forma quinol de DMK-1. En Catalpa ovata, se dice que este
material está formado por la vía catalponona. Sin embargo, para la situación de S. dunnii, el
intermedio clave se deriva a través de DHNA o de la ruta de catalponona. Cualquiera que sea la
ruta precisa, el paso inicial de prenilación de estas antraquinonas es en el átomo de carbono
equivalente a la posición C-2 'de OSB.

En contraste, a ciertas naftoquinonas (Figura 80) se les asigna sin ambigüedades una ruta a través
de DHNA y Lawson (Figura 80A). Este último se convierte en su 2-prenil éter (prenilación en el
oxígeno; Figura 80B) y una transposición de tipo Claisen conduce a 2-hidroxi-3- (1, l-dimetilal1)
- 1,4-naftoquinona (Figura 8OC) , que luego se utiliza para la formación de otras naftoquinonas.
El resultado neto del reordenamiento de Claisen es colocar el grupo prenilo en el átomo de
carbono equivalente a C-3 'de OSB.
FIGURA 79. Biosíntesis de quiione en cultivos celulares de Streptocarpus dunnii.
A = 2-Renil-1, Cnaftoquinona; B = producto de hidroxilación putativo de A.
; C = 2-metil-antraquinonenona; D, E, otros metabolitos formados a partir de C.

FIGURA 80. Papel de la Lawsone en la formación de más naftoquinonas. A

= lawsona; B = 2-0-prenil-lawsona; C = 2-hidroxi-3- (1, l-d & tildilo) -
1, haphthoqhone; D. E, F, otros metabolitos de C.

Si bien el trabajo de Inouye y sus colegas en esta área general es impresionante y aparentemente
intachable, es deseable una confirmación independiente de la vía de la catalponona.

2. El alcaloide, Shihunina

Otro producto derivado de OSB es el alcaloide único, shihunine, producido por Dendrobium
pierardii. La ruta biosintética propuesta para la formación de esta ftalidopirrolidina se muestra en
la Figura 81. Es interesante que el primer aislamiento de SHK en sí de cualquier planta de
Orchidaceae se haya informado para Dendrobium fuscens.
3. Sideróforos de ICHA

Muchos metabolitos que quelan el hierro son sintetizados por microorganismos a menudo en
condiciones de privación de hierro. Estos materiales, denominados sideróforos, generalmente
contienen un hidroxiácido aromático como parte de una estructura compleja. Dos de estos
ácidos, salicilato (Figura 74s) y 2,3-dihidroxibenzoato (Figura 74F), se derivan de ICHA.
Aunque hay muchos sideróforos de diferentes tipos estructurales, la evidencia de rutas
biosintéticas es limitada.

a. EL PAPEL DEL SALICILATO

Mycobacterium smegmatis produce un sideróforo, micobactina S, que contiene una unidad de

salicilato; El salicilato libre también se secreta en el medio de cultivo. Se sabe desde hace algún
tiempo que los siete átomos de carbono de SHK se incorporaron intactos en las unidades de
salicilato. Se supone que esta incorporación procede de la siguiente manera: SHK - * CHA - *
ICHA - * Salicilato (Figura 82). Se sabe que los extractos libres de células de micobacterias que
producen salicilato convierten ICHA en salicilato en ausencia de NAD +; CHA fue menos eficaz
como precursor. Otras micobactinas, por ejemplo, micobactina P (de M. phlei), contienen el 6-
metilsalicilato derivado de policétidos; los extractos de M. phlei no catalizan la formación de
salicilatos. En el caso de M. fortuitum, ambos ácidos están presentes; Se obtuvo evidencia de que
en este organismo el salicilato era derivado de ICHA, y el salicilato de metilo 6 era derivado de
policétido.ss1 Los materiales extracelulares que se unen al hierro (exochelinas) se encuentran en
las micobacterias.

Pyochelin, un sideróforo de ciertas Pseudomonas (P. aeruginosa, P. cepacia, P. fluorescens) tiene

una estructura química única (Figura 83A); contiene una unidad de salicilato. Se han obtenido
mutantes de P. aeruginosa que requieren salicilato para la biosíntesis de pioquelina; además, el
salicilato marcado se incorporó a la estructura de la pioquelina como se predijo. Se asumió que el
salicilato se originó como se describió previamente.

Aunque no es un sideróforo, el antibiótico termorubina (Figura 83B), producido por

Thermactinomyces vulgaris, también se deriva del salicilato. De los 29 átomos de carbono de
este compuesto, 22 tenían un origen policétido. Los siete restantes provienen del salicilato, que
presumiblemente funcionó como un "iniciador" a través de su derivado CoA. Dado que la unidad
de salicilato claramente no se deriva de acetato, presumiblemente se originó a través de ICHA.
FIGURA 81. Biosíntesis del alcaloide de la orquídea, shihunina.

b. EL PAPEL DEL 2,3-DIHIDROXIBENZOATO (DHBA)

El ácido dihidroxibenzoico (DHBA, Figura 74) está presente en muchos sideróforos.5ss Sólo se
considera aquí el prototipo, enterobactina (= enteroquelina), producida por E. coli y otras
bacterias entéricas, con énfasis en la formación de DHBA. DHBA (Figura 84A) deriva del 2,3-
dihidro-2,3-dihidroxibenzoato. Tres genes (entC, entB, entA) están implicados en la conversión
de CHA; tres o cuatro genes más, entD-F (G), forman proteínas que convierten DHBA en
enterobactina (Figura 84C). Aunque ha habido cierta confusión y controversia, ahora parece que
cuatro genes están enlazados en un operón policistrónico entCEBA (P15) regulado por hierro
(P15 es una proteína no caracterizada, Mr de aproximadamente 15.000). Esta área de trabajo está
actualmente muy activa.

entC. El producto proteico de este gen cataliza la conversión de CHA en ICHA y se discutió en
relación con el tronco principal de la vía SHK. Ahora se afirma que la proteína entA no
contribuye a la actividad sintasa de ICHA. entB, entA. El producto polipeptídico de entB
probablemente se denomine mejor 2,3-dihidro-2-3, -dihidroxibenzoato sintasa (EC 3.3.2.1,
nombre recomendado, isocorismatasa). La reacción es formalmente

Se ha obtenido una sobreexpresión del gen entB y la enzima se ha purificado hasta

homogeneidad.
FIGURA 82. Estructura de las micobactinas y acción de la salicilato sintasa. Para:

fIGURA83. Papel del salicilato en la formación de pioquelina, A y la termorubina ,B

El producto polipeptídico de enrA es una deshidrogenasa que oxida 2,3dihidro-DHBA a DHBA

con un requisito de NAD + (Ec 1.3.1.28, 2,3-dihidro-2,3-dihidroxibenzoato deshidrogenasa). El
polipéptido enrA, 2,3-dihidro-DHBA deshidrogenasa, se ha sobreproducido y purificado hasta
homogeneidad electroforética. La enzima nativa tenía Mr = 210.000 y era inusual entre las
deshidrogenasas por ser octamérica. Contrariamente a las sugerencias anteriores, esta enzima no
tenía actividad sintasa ICHA.
Se determinó una secuencia de nucleótidos de 2137 pb y contenía ORF para enfE, entA y la
proteína de 15 kDa. Otros investigadores secuenciaron un fragmento de 3,25 kb que codifica el
extremo carboxi de enfE, la totalidad de las regiones enfB, enrA y el polipéptido de 15 kDa. Por
conveniencia, cabe señalar que enfD y enfE también se han secuenciado. La enzima DHBAAMP
ligasa se ha purificado hasta homogeneidad.

Es apropiado señalar que el DHBA se distribuye ampliamente en diversas bacterias y hongos. En

la mayoría de los casos, no se ha determinado la vía biosintética. Además, la derivación de la via
ICHA, DHBA también se puede obtener a partir de salicilato, antranilato, 3-hidroxiantranilato y
benzoato.

4. Epóxidos vegetales

Se ha postulado que los productos vegetales, crotepóxido (de Croton macrostachys), senepóxido
(from Uvuria carocarpa) y pipoxido (fmm Piper hookeri) se originan en ICHA a través de un
epóxido (Figura 74H). En la Figura 85 se muestra una posible vía para la biosíntesis de
crotepóxido.

5. Ácido 6- hidroxiantranílico
El ácido 6-hidroxiantharnílico es necesario para la biosíntesis del antibiótico sarubicina (un
producto de Streptomyces helicus) y se ha postulado la ICHA ya que sus dos vías biosintéticas
son posibles (ver Figura 86), dependiendo de si el paso de oxidación ocurre antes o después.
eliminación de la unidad de piruvoilo. El ataque inicial del NH3 (o gln) recuerda al del anión
TPP-succínico semialdehído en la biosíntesis de MK.

6.Aminoácidos aromáticos 3-Carboxy

Se conocen cuatro aminoácidos aromáticos 3-carboxi-sustituidos en varias plantas y hay buena

evidencia de que ICHA es el precursor de todos ellos. Los experimentos con SHK marcado
indican que el grupo 3-carboxi en 3- (3-carboxi-4-hidroxifenil) alanina (Figura 87C) y 3- (3-
carboxifenil) -alanina.
FIGURA 84. Formación de 2,3-dihidroxibenzoato (B) y estructura de enterobactina
(endotelina). En la conversión de ICHA en A (dihidro-dihidroxibenzoato), se presume que
interviene un intermedio.

FIGURA 85. Posible formación de crotepóxido, A, de ICHA. R =

COC6 H5; AC = COCH3.
FIGURA 86. Biosíntesis de sarubicina, A, vía 6-hidroxiantranilato. 1 =
pérdida de 2H.

(Figura 87E), se deriva del grupo carboxilo de SHK con el átomo de hidrógeno pro-6-S retenido.
Estos resultados se racionalizan mediante una reordenación postulada de ICHA en una estructura
de 1,4-ciclohexadieno (Figura 87A), denominada apropiadamente iso-PPA. Los correspondientes
derivados de fenilglicina (Figura 87H) (R = H y OH) aparentemente pueden derivarse de los
aminoácidos o de los cetoácidos a través de las estructuras de mandelato (Figura 87F). Estos
derivados de glicina se aíslan de plantas como enantiómeros D parcialmente racemizados.
FIGURA 87. Biosíntesis de aminoácidos aromáticos 3-carboxi. En todos los casos, R = H u
OH. A = iso-PPA, B = 3- (3-carboxi-4-hidroxifenil) piruvato; C = 3- (3-carboxi-4-
hidroxifenil) alanina; D = 3- (3carboxifenil) piruvato; E = 3- (3tarboxifenil) alanina. Los
derivados de fenilglicina, H, podrían derivarse de los cetoácidos, B o D, a través de los
mandelatos, F, y glioxilato de fenilo sustituido, G.

RECONOCIMIENTO

Estoy en deuda con Christine Berliner por su valiosa ayuda en relación con las citas y las cifras.

APÉNDICE

El trabajo en la vía SHK continúa a un ritmo vigoroso. Los siguientes artículos se publicaron
después de la finalización de esta revisión en noviembre de 1989. Se enumeran con referencia a
la sección correspondiente de la revisión.