Introducción Criobiología

Introducción
La criobiología es la ciencia que estudia los efectos de las temperaturas extremadamente

bajas en los sistemas biológicos, tales como células, tejidos u organismos. (Gil, 2011).
La finalidad de la Criobiología es la Criopreservación: este término proviene de las
palabras griegas “crio” = frio, “bio” = vida, “logos” = ciencia.
La criopreservación es el método dónde se utilizan bajas temperaturas con el fin de
preservar las estructuras intactas de las células vivas, por ello tiene como objetivo el
mantenimiento de la viabilidad y funcionabilidad celular a temperaturas bajas; esto se
consigue porque el frío enlentece las reacciones enzimáticas que se producen dentro de
las células.
Las células se criopreservan para evitar pérdidas por contaminación, para minimizar
cambios genéticos en líneas continuas y evitar la transformación en líneas finitas. Una
criopreservación exitosa de células requiere seguir protocolos estandarizados y
reproducibles, aunque cada protocolo puede requerir modificaciones según el tipo celular
o línea a usar (la obtención de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del
conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la célula y/o el tejido puesto que este
proceso está afectado por diferentes variables como especie, tipo y estado de la célula a
congelar), para lograr la máxima viabilidad después del descongelamiento. Las células de
mamíferos criopreservadas incluyen líneas celulares inmortalizadas, células primarias
aisladas a partir de tejidos y células madre.
La estructura y composición de las membranas plasmáticas determinan los principales
eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservación, su
comportamiento durante la congelación y descongelación define los índices de
supervivencia de la célula congelada. Los periodos críticos para la sobrevida celular
durante la criopreservación son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a
condiciones fisiológicas.
A pesar de todo, éste no es un proceso exento de problemas ya que puede inducir
variaciones extremas en las propiedades químicas, térmicas y eléctricas las cuales
pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada interacción célula-
célula inherente en las células y tejidos a criopreservar. (Ávila et al., 2006).
Además, aunque desde hace mucho tiempo se han implementado protocolos para
criopreservación, estos son aún subóptimos en la mayoría de los casos; ya que la
obtención de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del conocimiento de las
propiedades fisicoquímicas de la célula y o el tejido puesto que este proceso está
afectado por diferentes variables como especie, tipo y estadio de la célula a congelar. Las
células tienen diferente tamaño y manejan diferente composición de solutos y en general
el éxito de la criopreservación es inversamente correlacionado con la complejidad de los
sistemas biológicos congelados. (Ávila et al., 2006)
*Los crioprotectores son parte del fundamento de la criopreservación (principalmente de la
congelación): son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que disminuyen el punto
eutéctico de una solución dada, (punto en el cual una composición dada de A y B
solidifica como un elemento puro), el descenso del punto eutéctico implica que se
alcanzará una concentración dada de solutos a una temperatura menor, de forma que la
célula estará más deshidratada y el gradiente osmótico al que estará sometido será
menor. La elección del crioprotector depende del tipo de célula que se quiera
criopreservar, bioquímicamente es posible distinguir tres tipos de crioprotectores, los
alcoholes (metanol, etanol, propanol, 1-2 propanediol y glicerol), azúcares (glucosa,
lactosa, sucrosa, sacarosa) y el dimetilsulfóxido, los crioprotectores, a su vez, también
pueden clasificarse en agentes penetrantes y no penetrantes de acuerdo a la
permeabilidad celular:
 Los crioprotectores penetrantes son de bajo peso molecular y permeables a través

de la membrana celular. Ejemplo de ellos son el glicerol, el dimetilsulfoxido
(DMSO) y propanediol (PROH).
 Los crioprotectores no penetrantes son sustancias de alto peso molecular,
efectivas a velocidades altas de congelación, son importantes por ejercer su
acción crioprotectora promoviendo la rápida deshidratación celular y suelen usarse
asociados a los agentes penetrantes. Los más utilizados son: sacarosa, glucosa,
dextrosa y dextrano. Estos compuestos generalmente son polímeros que forman
puentes hidrógeno con el agua, reduciendo la actividad de agua a una magnitud
mucho mayor que la que se predeciría por su concentración molar.
A pesar de haber diferentes sustancias que presentan un carácter protector en las células,
los más utilizados son los agentes penetrantes, específicamente el glicerol y el DMSO.
Para muchas células, el glicerol es el agente de elección porque es el menos tóxico; sin
embargo el DMSO penetra mejor en las células, su acción crioprotectora se atribuye
principalmente a su habilidad de prevenir acumulación excesiva de electrolitos y otras
sustancias durante el proceso de congelamiento, así como también prevenir la formación
de cristales de hielo, los cuales rompen la estructura de la membrana. Su bajo peso
molecular permite la entrada rápida a través de la membrana (García, 1984).
Cabe destacar que los crioprotectores tienen que diluirse en un medio adecuado antes de
ser añadidos a la suspensión celular, esto garantiza una exposición homogénea de todas
las células y reduce los efectos tóxicos.
La adición del criopreservante genera estrés osmótico sobre las células porque aumenta
la osmolaridad del medio. Las células inicialmente se deshidratan para compensar la
fuerza osmótica inducida por la presencia de los crioprotectores y después se hidrata.
Es por ello que las células se comportan como osmómetros, por lo tanto, variarán su
volumen en respuesta a los cambios osmóticos extracelulares, de ese modo las células
pierden o captan agua según se expongan a condiciones hipo o hiper osmóticas,
respectivamente; los movimientos de agua y crioprotectores a través de la membrana
celular durante la criopreservación se rigen por diversos parámetros biofísicos que
deben ser definidos para cada tipo celular a diferentes temperaturas, sin embargo, de
manera general, los más estudiados son:
1.) el volumen osmóticamente inactivo, éste se puede definir como el agua que nunca
va a dejar el interior celular en respuesta a un aumento de concentración de solutos en el
espacio extracelular por estar asociado a las macromoléculas y estructuras intracelulares;
está relacionado con la hipótesis de volumen mínimo de Meryman y se puede conocer
mediante micro perfusión en un sistema de micro manipulación.
2.) la permeabilidad de la membrana celular (al agua, criopreservantes, solutos),
basada en que, durante la deshidratación de la célula, sin congelación intracelular, se
aumenta la concentración de electrolitos, sustratos, cofactores, proteínas celulares y
asimismo se aumenta el transporte de agua al medio externo en congelación, este último
fenómeno genera liberación de calor de fusión proporcional a la cantidad de agua
removida de la célula.
3.) la relación área de superficie celular a volumen que es variable entre las células.
Es necesario indicar que la definición de los parámetros biofísicos de cada célula y el
estudio de la interacción con los agentes crioprotectores durante la congelación y
descongelación de las células deben ser definidos para establecer los límites físicos que
aseguren la supervivencia de la célula.
El entender y aplicar adecuadamente la criopreservación de material biológico es
fundamental para los bancos de células de humanos y de células animales, los
laboratorios de cultivo celular (mantener una línea celular en cultivo continuo por largos
periodos de tiempo es costosa, hay un gran riesgo de contaminación así como la
posibilidad de una alteración genética) y los laboratorios de farmacia, por lo cual hay una
especial atención a la conservación de tejidos, órganos y embriones humanos para ser
utilizados en investigación y su posterior aplicación terapéutica (trasplantes) llegando a
crear verdaderos archivos biológicos. (Ávila et al., 2006)

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