La criobiología estudia los efectos de las bajas temperaturas en sistemas biológicos como células y tejidos. La criopreservación utiliza temperaturas frías para preservar la viabilidad celular mediante la desaceleración de reacciones enzimáticas. El proceso requiere crioprotectores como el glicerol o DMSO para evitar daños durante la congelación y descongelación. A pesar de protocolos estandarizados, la criopreservación exitosa depende de las propiedades físicas de cada tipo
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La criobiología estudia los efectos de las bajas temperaturas en sistemas biológicos como células y tejidos. La criopreservación utiliza temperaturas frías para preservar la viabilidad celular mediante la desaceleración de reacciones enzimáticas. El proceso requiere crioprotectores como el glicerol o DMSO para evitar daños durante la congelación y descongelación. A pesar de protocolos estandarizados, la criopreservación exitosa depende de las propiedades físicas de cada tipo
La criobiología estudia los efectos de las bajas temperaturas en sistemas biológicos como células y tejidos. La criopreservación utiliza temperaturas frías para preservar la viabilidad celular mediante la desaceleración de reacciones enzimáticas. El proceso requiere crioprotectores como el glicerol o DMSO para evitar daños durante la congelación y descongelación. A pesar de protocolos estandarizados, la criopreservación exitosa depende de las propiedades físicas de cada tipo
La criobiología estudia los efectos de las bajas temperaturas en sistemas biológicos como células y tejidos. La criopreservación utiliza temperaturas frías para preservar la viabilidad celular mediante la desaceleración de reacciones enzimáticas. El proceso requiere crioprotectores como el glicerol o DMSO para evitar daños durante la congelación y descongelación. A pesar de protocolos estandarizados, la criopreservación exitosa depende de las propiedades físicas de cada tipo
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Introducción
La criobiología es la ciencia que estudia los efectos de las temperaturas extremadamente
bajas en los sistemas biológicos, tales como células, tejidos u organismos. (Gil, 2011). La finalidad de la Criobiología es la Criopreservación: este término proviene de las palabras griegas “crio” = frio, “bio” = vida, “logos” = ciencia. La criopreservación es el método dónde se utilizan bajas temperaturas con el fin de preservar las estructuras intactas de las células vivas, por ello tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad y funcionabilidad celular a temperaturas bajas; esto se consigue porque el frío enlentece las reacciones enzimáticas que se producen dentro de las células. Las células se criopreservan para evitar pérdidas por contaminación, para minimizar cambios genéticos en líneas continuas y evitar la transformación en líneas finitas. Una criopreservación exitosa de células requiere seguir protocolos estandarizados y reproducibles, aunque cada protocolo puede requerir modificaciones según el tipo celular o línea a usar (la obtención de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la célula y/o el tejido puesto que este proceso está afectado por diferentes variables como especie, tipo y estado de la célula a congelar), para lograr la máxima viabilidad después del descongelamiento. Las células de mamíferos criopreservadas incluyen líneas celulares inmortalizadas, células primarias aisladas a partir de tejidos y células madre. La estructura y composición de las membranas plasmáticas determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservación, su comportamiento durante la congelación y descongelación define los índices de supervivencia de la célula congelada. Los periodos críticos para la sobrevida celular durante la criopreservación son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a condiciones fisiológicas. A pesar de todo, éste no es un proceso exento de problemas ya que puede inducir variaciones extremas en las propiedades químicas, térmicas y eléctricas las cuales pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada interacción célula- célula inherente en las células y tejidos a criopreservar. (Ávila et al., 2006). Además, aunque desde hace mucho tiempo se han implementado protocolos para criopreservación, estos son aún subóptimos en la mayoría de los casos; ya que la obtención de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la célula y o el tejido puesto que este proceso está afectado por diferentes variables como especie, tipo y estadio de la célula a congelar. Las células tienen diferente tamaño y manejan diferente composición de solutos y en general el éxito de la criopreservación es inversamente correlacionado con la complejidad de los sistemas biológicos congelados. (Ávila et al., 2006) *Los crioprotectores son parte del fundamento de la criopreservación (principalmente de la congelación): son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que disminuyen el punto eutéctico de una solución dada, (punto en el cual una composición dada de A y B solidifica como un elemento puro), el descenso del punto eutéctico implica que se alcanzará una concentración dada de solutos a una temperatura menor, de forma que la célula estará más deshidratada y el gradiente osmótico al que estará sometido será menor. La elección del crioprotector depende del tipo de célula que se quiera criopreservar, bioquímicamente es posible distinguir tres tipos de crioprotectores, los alcoholes (metanol, etanol, propanol, 1-2 propanediol y glicerol), azúcares (glucosa, lactosa, sucrosa, sacarosa) y el dimetilsulfóxido, los crioprotectores, a su vez, también pueden clasificarse en agentes penetrantes y no penetrantes de acuerdo a la permeabilidad celular:
Los crioprotectores penetrantes son de bajo peso molecular y permeables a través
de la membrana celular. Ejemplo de ellos son el glicerol, el dimetilsulfoxido (DMSO) y propanediol (PROH). Los crioprotectores no penetrantes son sustancias de alto peso molecular, efectivas a velocidades altas de congelación, son importantes por ejercer su acción crioprotectora promoviendo la rápida deshidratación celular y suelen usarse asociados a los agentes penetrantes. Los más utilizados son: sacarosa, glucosa, dextrosa y dextrano. Estos compuestos generalmente son polímeros que forman puentes hidrógeno con el agua, reduciendo la actividad de agua a una magnitud mucho mayor que la que se predeciría por su concentración molar. A pesar de haber diferentes sustancias que presentan un carácter protector en las células, los más utilizados son los agentes penetrantes, específicamente el glicerol y el DMSO. Para muchas células, el glicerol es el agente de elección porque es el menos tóxico; sin embargo el DMSO penetra mejor en las células, su acción crioprotectora se atribuye principalmente a su habilidad de prevenir acumulación excesiva de electrolitos y otras sustancias durante el proceso de congelamiento, así como también prevenir la formación de cristales de hielo, los cuales rompen la estructura de la membrana. Su bajo peso molecular permite la entrada rápida a través de la membrana (García, 1984). Cabe destacar que los crioprotectores tienen que diluirse en un medio adecuado antes de ser añadidos a la suspensión celular, esto garantiza una exposición homogénea de todas las células y reduce los efectos tóxicos. La adición del criopreservante genera estrés osmótico sobre las células porque aumenta la osmolaridad del medio. Las células inicialmente se deshidratan para compensar la fuerza osmótica inducida por la presencia de los crioprotectores y después se hidrata. Es por ello que las células se comportan como osmómetros, por lo tanto, variarán su volumen en respuesta a los cambios osmóticos extracelulares, de ese modo las células pierden o captan agua según se expongan a condiciones hipo o hiper osmóticas, respectivamente; los movimientos de agua y crioprotectores a través de la membrana celular durante la criopreservación se rigen por diversos parámetros biofísicos que deben ser definidos para cada tipo celular a diferentes temperaturas, sin embargo, de manera general, los más estudiados son: 1.) el volumen osmóticamente inactivo, éste se puede definir como el agua que nunca va a dejar el interior celular en respuesta a un aumento de concentración de solutos en el espacio extracelular por estar asociado a las macromoléculas y estructuras intracelulares; está relacionado con la hipótesis de volumen mínimo de Meryman y se puede conocer mediante micro perfusión en un sistema de micro manipulación. 2.) la permeabilidad de la membrana celular (al agua, criopreservantes, solutos), basada en que, durante la deshidratación de la célula, sin congelación intracelular, se aumenta la concentración de electrolitos, sustratos, cofactores, proteínas celulares y asimismo se aumenta el transporte de agua al medio externo en congelación, este último fenómeno genera liberación de calor de fusión proporcional a la cantidad de agua removida de la célula. 3.) la relación área de superficie celular a volumen que es variable entre las células. Es necesario indicar que la definición de los parámetros biofísicos de cada célula y el estudio de la interacción con los agentes crioprotectores durante la congelación y descongelación de las células deben ser definidos para establecer los límites físicos que aseguren la supervivencia de la célula. El entender y aplicar adecuadamente la criopreservación de material biológico es fundamental para los bancos de células de humanos y de células animales, los laboratorios de cultivo celular (mantener una línea celular en cultivo continuo por largos periodos de tiempo es costosa, hay un gran riesgo de contaminación así como la posibilidad de una alteración genética) y los laboratorios de farmacia, por lo cual hay una especial atención a la conservación de tejidos, órganos y embriones humanos para ser utilizados en investigación y su posterior aplicación terapéutica (trasplantes) llegando a crear verdaderos archivos biológicos. (Ávila et al., 2006)