MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

RA 4. Selecciona y aplica técnicas de criopreservación y

descongelación de células, siguiendo procedimientos que
aseguren su viabilidad y trazabilidad.
Criterios de evaluación:

a) Se ha caracterizado el proceso de la criopreservación celular.

b) Se han descrito las ventajas e inconvenientes de los
criopreservantes.
c) Se han aplicado las técnicas de criopreservación de una línea
celular.
d) Se han controlado las condiciones de almacenamiento de células
criopreservadas.
e) Se han aplicado las técnicas de descongelación celular.
f) Se ha analizado la viabilidad y recuperabilidad (capacidad
proliferativa) celular tras la descongelación.
g) Se han mantenido las condiciones asépticas durante las técnicas
de criopreservación y descongelación.
h) Se han registrado los datos correspondientes a la
criopreservación y descongelación, siguiendo los procedimientos
descritos para asegurar la trazabilidad.
i) Se han gestionado correctamente los residuos generados en el
proceso.

Contenidos básicos:

Técnicas de criopreservación y descongelación de células:

1. Concepto de criopreservación. Criopreservantes utilizados.

2. Condiciones particulares que hay que tener en cuenta en la
criopreservación y descongelación de células.
3. Concepto de viabilidad y recuperabilidad celular.
4. Condiciones de almacenamiento de células criopreservadas.
5. Registro de células criopreservadas e importancia de su
trazabilidad

UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

1
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

UD 6 Criopreservación

6.1. Criopreservación

Cuando se hacen subcultivos repetidos, las células van acumulando

cambios genéticos de forma progresiva y esto puede desvirtuar los
resultados que se obtengan del estudio que ha motivado el cultivo. Por
otro lado, no todas las líneas celulares son continuas (inmortales) sino que
hay líneas finitas, que después de unos cuantos pases, envejecen y
mueren.
La criopreservación es la conservación de líneas celulares a bajas
temperaturas, esto es entre -80 y -196 ºC. Esto evita los continuos
subcultivos y permite mantener de forma estable e indefinidamente
muestras de interés para futuros estudios. Es el caso de líneas celulares
procedentes de pacientes, que a veces son únicas e irrepetibles y que
pueden ser importantes en el futuro para estudios familiares o para
investigación. A temperaturas por debajo de -135ªC la actividad
metabólica se detiene y el período de conservación es indefinido, mientras
que a -80ºC la supervivencia de células de mamífero es de 1 año. Pero
para conseguir el objetivo final que es la recuperación en buen estado de
las células criopreservadas una vez descongeladas, es importante la
estandarización de los procesos de congelación y descongelación
porque pequeñas variaciones pueden ocasionar cambios en los materiales
criopreservados. Una vez descongeladas, la mayoría de células no tolera
un nuevo ciclo de congelación.

6.1.1. Efectos biológicos

Los efectos biológicos de la congelación se deben principalmente a la
congelación del agua que provoca:
 Formación de cristales de hielo intracelulares que pueden lesionar
mecánicamente a la célula.
 Concentración de los solutos que llevaba en disolución porque el
hielo deja de actuar como disolvente, provocando un desequilibrio
osmótico.

Los dos mecanismos son importantes y contribuyen al éxito o

fracaso de la congelación dependiendo de las velocidades de congelación y
descongelación y del tipo de célula.
Los fenómenos que tienen lugar en la célula durante la congelación
dependen de la velocidad de la congelación:
UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

2
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

 Cuando la congelación es lenta, lo primero que se congela es el

agua extracelular y eso comporta un aumento de los solutos en el
espacio extracelular. En respuesta al desequilibrio osmótico, el agua
intracelular migra hacia fuera y aumentan entonces los solutos
intracelulares a la vez que la célula se deshidrata. El desequilibrio
osmótico es máximo, pero el efecto del hielo mínimo porque como
menos agua haya en el interior de la célula, menos hielo se formará.
Si la deshidratación llega al 30% la célula ya no es recuperable: no
puede ser demasiado lenta.
 Cuando la congelación es rápida, se forma hielo tanto en el
compartimento intracelular como en el extracelular y puede lesionar
a las células. Tenemos efecto osmótico mínimo y efecto del hielo
intracelular es máximo.
Hay que conseguir un punto medio entre las dos situaciones. Este
equilibrio se consigue con crioprotectores y una velocidad de
enfriamiento de 1ºC por minuto.

6.1.2. Crioprotectores
Los crioprotectores son substancias hidrosolubles que protegen a la
célula durante los procesos de congelación y descongelación. Previenen la
lisis celular porque minimizan el desequilibrio osmótico y la formación de
cristales de hielo. Cuando estos penetran en la célula, aumenta la
concentración de solutos, reduciendo la cantidad de hielo intracelular
que se forma. Por otro lado, el crioprotector también reduce el punto de
congelación y eso permite que la velocidad de enfriamiento sea menor
(retrasa la congelación) y los cristales que se forman son más pequeños.
Hay dos tipos de crioprotectores:
a) Permeables - de bajo peso molecular, atraviesan la membrana celular
y penetran dentro de la célula. Son de este tipo los usados con más
frecuencia:
- DMSO o dimetil-sulfóxido.
- Glicerol.
b) No permeables - de alto peso molecular, provocan una rápida
deshidratación de la célula. Se usan siempre en combinación con otros
permeables.
- Sacarosa.
- Glucosa.
- Dextrosa y dextrano.
- Polietilenglicol (PEG).
- Polivinilpirrolidona (PVP).

UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

3
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

Los crioprotectores se usan estériles y se añaden al medio de

congelación, normalmente a una concentración del 10% (v/v). El medio
así preparado se añade a la suspensión celular.

6.1.3. Materiales de congelación

Los materiales de congelación usados han de ser:
- criotolerantes, esto es resistentes a las temperaturas a que serán
expuestos.
- estériles. En caso de no serlo, han de ser autoclavables.
- libres de endotoxinas.
- herméticos.
Las suspensiones celulares que van a ser criopreservadas se
guardan en crioviales o criotubos de plástico, o ampollas de vidrio que
hay que sellar a la llama. Estos recipientes se mantienen clasificados en
pequeñas gradillas contenidas en cajas que llamamos cajas de
congelación.

Cajas de
Crioviales Criotubos Ampolla congelación

6.2. Condiciones particulares que hay que tener en

cuenta en la criopreservación y descongelación de
células.

Las condiciones críticas durante la criopreservación son la fase inicial de la

congelación y el periodo de retorno a condiciones fisiológicas, la
descongelación. Para que sea exitosa, hay que tener el control de las
tasas de congelación y descongelación: a medida que la tasa de
enfriamiento aumenta, la probabilidad de que el hielo intracelular pueda
formarse también aumenta. Para cada célula hay una óptima tasa de
enfriamiento la cual depende de varios factores, particularmente el
volumen celular y la composición de la membrana.
En la actualidad el mejor método de almacenamiento es la
congelación en nitrógeno líquido.

UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

4
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

Dentro de este hay diferentes métodos de criopreservación según la

velocidad de congelación:
a) Método lento: La suspensión, idealmente de alta concentración
celular, debe ser congelada lentamente (descenso de aproximadamente
1ºC/min) con congeladores programables en rampa o recipientes de
congelación (como pueden ser Mr.Frosty o CoolCell ) en los que desciende
la temperatura de forma controlada, en presencia de un agente
preservante como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO). Las células
cuando alcanzan una temperatura inferior a -80ºC se transfieren y se
almacenan sumergidas en nitrógeno líquido (-196ºC), o en la fase gaseosa
superior durante largos periodos de tiempo (años) sin deterioro celular
apreciable.
b) Método rápido: Implica la rápida deshidratación celular,
utilizando altas concentraciones de crioprotector, usualmente DMSO y
sacarosa, seguida de inmersión en nitrógeno líquido. En pocos segundos
se congela la muestra a -196 ºC. Existen varios tipos:
- Vitrificación: es un estado de criopreservación en el que se evita la
congelación del agua. Se basa en la congelación rápida en una mezcla de
altas concentraciones de crioprotectores (al 30%), que a bajas
temperaturas aumentan su viscosidad formando un sólido amorfo, sin
formación de hielo que al enfriarse parece vidrio en el interior de las
células. En este caso no se producirán daños por formación de cristales de
hielo. Suele usarse para embriones y tejidos, que por su naturaleza
multicelular necesitan una congelación muy controlada.

- Ultrarrápido: Inmersión de las células en nitrógeno líquido. Se usa muy

baja concentración de crioprotector, ya que no se producen cristales de
hielo.

6.2.1. Proceso de congelación.

El proceso de congelación requiere de procedimientos estrictos que
han de permitir la recuperación de más del 90% de las células congeladas.
En resumen:
1. Partimos de un cultivo celular joven, reciente y sano:
 Joven porque ha de llevar máximo 2 subcultivos.
 Reciente porque ha de estar en la fase exponencial de
crecimiento, cuando aún no hay muerte celular. En células
adherentes esto representa que aún no hay confluencia.
 Sano porque la viabilidad ha de ser superior al 90%.

UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

5
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

2. El medio de congelación depende del tipo celular, pero ha de llevar

alta concentración de suero (20% de suero bovino fetal) y un
crioprotector (10%). El medio preparado se guarda en nevera hasta el
momento de su uso.
3. Preparamos una suspensión densa, de 106 a 107 células/ml, en
previsión de que al descongelar recuperemos un número suficiente de
células a pesar de las que mueran.
4. Añadimos a la suspensión el mismo volumen de medio de congelación
con crioprotector y se reparte en varios crioviales estériles, llenándolos
solo hasta la mitad, en previsión del aumento de volumen durante la
congelación.
5. Antes de pasar al congelador, los crioviales se dejan 15 minutos a
temperatura ambiente para dar tiempo a que el crioprotector penetre en
las células: tiempo de equilibrio.
6. Pasamos a congelar las células. La congelación ideal ha de ser
lenta, bajando la temperatura 1ºC /minuto.

Medio de congelación Cryostor CS10

Contenedor para congelación Mr. Frosty

Congelador en rampa

Contenedor para congelación Coolcell

UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

6
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

6.2.2. Proceso de descongelación

La supervivencia de las células congeladas depende también del proceso
de descongelación que ha de ser rápida. Lo primero que se
descongela es el espacio extracelular y por osmosis, para compensar el
desequilibrio hay entrada de agua en la célula y evitamos la
recristalización.
Se diluye la suspensión y se elimina el agente preservante con la máxima
rapidez. El resultado es la obtención de células para su cultivo sin ningún
tipo de cambio.
La manipulación de las células durante la congelación y descongelación
es un proceso que conlleva riesgo de contaminación celular. Habrá que
prestar especial atención a no tocar las roscas de los tapones de los
crioviales/criotubos, y tras descongelar las células en el baño, es
imprescindible esterilizar el exterior del tubo con abundante etanol al
70%, antes de abrirlo y/o manipularlo en campana.
Las concentraciones de los agentes criopreservantes son
lamentablemente tóxicas para las células a temperatura ambiente, por lo
cual en el procedimiento de criopreservación se deben respetar ciertos
tiempos de exposición del material a 4ºC, para que el agente protector
penetre el tejido sin alcanzar los niveles tóxicos referidos, antes del inicio
del proceso de congelación propiamente dicho.
El proceso consiste en:
1. Calentar el criovial en el baño termostático a 37ºC. En menos de 1
minuto estará descongelado. Cuando sacamos el vial del baño, hay que
pasarle alcohol para llevarlo a la cabina de flujo laminar y abrirlo.
2. Lavar la suspensión en medio de cultivo precalentado a 37ºC para
eliminar el medio de congelación y el DMSO.
3. Centrifugar a 100-200g durante 5-10 minutos.
4. Decantar y resuspender el pellet en medio de cultivo.
5. Transferir las células al soporte de cultivo escogido.

6.3. Concepto de viabilidad y recuperabilidad celular.

o Concepto de Viabilidad celular

Es la proporción de células vivas y funcionales existentes en una población
celular. La estimación de la viabilidad de una población celular sirve como

UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

7
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

una condición de control de calidad para ver en qué estado están dichas
células.

o Concepto de recuperabilidad celular:

La recuperación celular de un vial descongelado se determina según la
capacidad proliferativa que poseen las células después de la
descongelación, evaluando la viabilidad celular después de varios días en
cultivos y viendo la velocidad de proliferación que presenta la línea celular
descongelada.

Entre las técnicas que clásicamente se han utilizado para evaluar la

viabilidad celular se encuentra el test de exclusión con azul tripán, ya que
se trata de un ensayo rápido, sencillo, económico y efectivo además no
requiere de mucho instrumental técnico.

El azul tripán es un colorante vital que tiñe las células no viables de

color azul al ser observadas bajo un microscopio óptico en una cámara de
recuento, mientras que las células viables aparecen sin teñir ya que tienen
la membrana celular intacta, estas son selectivas a los compuestos que
dejan pasar y, por ende, no permiten que el colorante penetre en la
célula.

6.4. Condiciones de almacenamiento de células

criopreservadas.

Aunque en la actualidad el mejor método de almacenamiento es la

preservación en tanques de nitrógeno líquido en fase gaseosa, existen
otras condiciones de almacenamiento para otras necesidades:

- Congelación a -20ºC: Las células pueden conservarse periodos de

una semana. El congelador no difiere del doméstico.

- Congelación a -80ºC: Las células pueden permanecer varias

semanas y/o meses viables, aunque se empieza a detectar deterioro.
Se trata de un ultracongelador un poco más especial que el
doméstico. En ocasiones este tipo de congelador es usado para una
congelación inicial de las células con los recipientes de congelación
mencionados anteriormente (Mr Frosty y Coolcell) que bajan la
UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

8
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

temperatura de los viales hasta -80ºC. Posteriormente las muestras

son trasladadas a los tanques de nitrógeno líquido, en fase gaseosa
para su almacenamiento definitivo. El traslado de los crioviales debe
realizarse en hielo seco para evitar variaciones en la temperatura
durante el traslado.

- Congelación con Nitrógeno líquido (-196ºC): Las células pueden

permanecer preservadas durante años. Es la técnica más empleada
para mantener líneas celulares, puesto que es el mejor método de
almacenamiento celular.

Es importante asegurar un sistema de seguridad, de continuidad del

nitrógeno líquido mediante sensores y alarmas además de tener un
mantenimiento interno y externo. Por otro lado son importantes los
ensayos de control de calidad por medio de pruebas de viabilidad que
se realizarán periódicamente.

Los crioviales de congelación deben ser aptos al nitrógeno líquido y

deben almacenarse en cajas definidas y registradas para poder
trazabilizarlas rápidamente.

Por último hay que tener en cuenta las medidas de seguridad que
conllevan el manejo del nitrógeno líquido y tomar las medidas
adecuadas.

6.4.1. Criogenización: Nitrógeno líquido y unidades de

criogenia

La criogenización es la conservación de células congeladas en nitrógeno

líquido (LN2). El proceso de congelación y almacenaje de los materiales
congelados se realiza en tanques de nitrógeno líquido, que contienen
el fluido criogénico y el conjunto de tanques se ubica en salas específicas
llamadas unidades de criogenia. En estas unidades hay también un
depósito de nitrógeno licuado que puede estar en la misma unidad de
criogenia o en una caseta de gases exterior.
En el interior del tanque, el nitrógeno se encuentra en dos estados:
líquido y gas. El nitrógeno en estado líquido es lo que llamamos
propiamente fase líquida. Hay que controlar periódicamente el nivel
de nitrógeno líquido porque es necesario un nivel mínimo para mantener
la temperatura, y hay que compensar las pérdidas: el nitrógeno hierve a
la temperatura a la que está (su punto de ebullición a la presión
UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

9
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

atmosférica es de -196ºC) y por ello se le ve humear cuando se abren los

tanques, lo que significa que se pierde nitrógeno.

Producto de este hervor es la acumulación y saturación de vapores

de nitrógeno en el espacio de cabecera del tanque, por encima del nivel de
nitrógeno líquido. Estos vapores constituyen lo que llamamos fase
gaseosa. La temperatura aquí es algo superior: alrededor de -178ºC, de
forma variable según las veces que se abra el tanque, el tiempo que esté
abierto y el nivel de nitrógeno líquido productor de vapores.
Los tanques de nitrógeno líquido son recipientes de acero
inoxidable, de doble pared. En el interior de esta doble pared se ha hecho
el vacío para aislar térmicamente y evitar el intercambio de calor. Los
materiales almacenados se organizan en cajas de congelación que quedan
colgadas dentro del tanque, sujetas por estructuras llamadas crioracks y
expuestas a la temperatura del vapor o del nitrógeno licuado, según la
fase en que se coloquen.
Los materiales para criogenización han de cumplir con las
características enumeradas para criopreservación y además, ser
materiales criogénicos, esto es diseñados específicamente para
soportar las bajas temperaturas del LN2. Pueden ser de plástico o de
vidrio (ampollas que hay que sellar a la llama).
En el almacenamiento, cuanto más baja sea la temperatura, más
largo es el tiempo de conservación. Las temperaturas más bajas se
obtienen en la fase líquida de los tanques de LN2. Pero la conservación
en la fase líquida comporta riesgos por la posible penetración del
nitrógeno líquido en los recipientes y por eso se prefiere la fase gaseosa.
Los riesgos son:
- Contaminación cruzada por virus a través del propio nitrógeno líquido
contaminado.
- Explosión de las ampollas mal selladas o salida de líquido a presión
del interior de los crioviales cuando se descongelan.

Seguridad en las unidades de criogenia: riesgos.

Los principales riesgos relacionados con el manejo y utilización del

nitrógeno líquido son las quemaduras por frío o por contacto directo con el
LN2 y la asfixia.

UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

10
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

Para proteger la piel de las quemaduras, el

equipo de protección individual (EPI) ha de
debe llevarse puesto todo el tiempo en que se
manipule el LN2.

Este equipo constará de:

- Bata de manga larga.
- Guantes criogénicos que cubran hasta el
antebrazo.
- Escudo facial que proteja la cara.
- Delantal de plástico.

En caso de exposición accidental se aplica agua tibia, nunca calor

directo que produciría una rápida vasodilatación, dolor y posible
hipotensión.
El almacenamiento en la fase líquida presenta un riesgo de
explosión cuando el nitrógeno en fase líquida penetra dentro de un
recipiente mal cerrado. Esto puede ocurrir por sellado incorrecto de las
ampollas de forma que quedan microcanales abiertos, por dejar flojos los
tapones de rosca de los crioviales, o por rotura del criovial. Cuando
extraemos el recipiente del tanque y se expone a temperatura ambiente,
el nitrógeno líquido rápidamente se vaporiza y provoca la explosión de la
ampolla por sobrepresión interior. En el caso de los recipientes de plástico
puede ser que no exploten, pero al abrirlos el contenido saldrá a presión
esparciendo materiales potencialmente peligrosos.
Las fugas de nitrógeno de los tanques representan riesgo de
asfixia. 1 litro de LN2 produce 680 litros de nitrógeno, gas incoloro e
inodoro. El gas frío es pesado y se acumula a nivel del suelo desplazando
el oxígeno hacia arriba. Los síntomas aparecen a concentraciones de
oxígeno inferiores al 18% produciendo una rápida pérdida de consciencia.
Por ello estas unidades han de cumplir una serie de requisitos:
- Han de estar en lugares bien ventilados y lejos de la luz solar.
- Han de disponer de alarmas de niveles bajos de oxígeno para evacuar la
unidad en caso de fuga.
UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

11
 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

- Deben disponer de un programa de mantenimiento de los tanques.

- Contar con señalización de prevención avisando del riesgo de asfixia
a la entrada de la unidad y de quemaduras y lesiones criogénicas en
tanques y depósitos de LN2.

Riesgo de asfixia Riesgo de quemaduras y lesiones criogénicas

6.5. Registro de células criopreservadas e importancia

de su trazabilidad.

En este apartado cabe destacar la importancia de la trazabilidad del material

biológico que se ha criopreservado mediante su registro. La ECACC (The
European Collection of Authenticated Cell Cultures) recomienda un protocolo
tanto de congelación de células, como de su adecuado registro para poder
seguir su trazabilidad (con copia local en formato pdf).

Los registros pueden ser tipo tabla Excel con unos datos mínimos
necesarios (fecha de congelación, pase, código, posición de almacenamiento,
etc), o plantillas de papel en las cajas de congelación, aunque lo ideal es utilizar
sistemas informatizados como por ejemplo: nSIBAI, BioeBank, noraybio, etc.
para la gestión de biobancos con alto nivel de seguridad asegurando la
privacidad y protección de los datos personales de donantes, su registro y
trazabilidad.

También es muy importante que se registren los viales una vez

descongelados para mantener los registros actualizados y no se tenga un falso
stock celular.

UD 6. CRIOPRESERVACIÓN

12