Analita Instrumental 2

INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS ELECTROANALÍTICAS
INTRODUCCIÓN
Técnica electroanalítica: técnica en la que se mide la respuesta
eléctrica de un sistema químico o muestra para obtener una
información química
 Pueden proporcionar límites de detección excepcionalmente bajos
 Dan información del sistema químico (estequiometria; constantes de
velocidad y de equilibrio de reacciones químicas)
 Dan parámetros específicamente electroquímicos (velocidades de
transferencia de carga y masa o el número de electrones).
 Algunas técnicas electroquímicas dan información sobre la especie
química en la que se encuentra un determinado elemento.
 Da información cuantitativa tanto de sustancias inorgánicas como
orgánicas.
 Son menos costosas que otras técnicas
 Son técnicas alternativas y complementarias a otras técnicas para
conseguir obtener la máxima información del sistema bajo estudio.
 Se puede acoplar fácilmente a sistemas cromatográficos.
Introducción
 Sólo se puede obtener información de compuestos que tienen

propiedades electroquímicas
 Requiere un mayor conocimiento de los procesos y la teoría
electroquímica para conseguir buenos resultados
Reacciones electroquímicas
a Ox1 + b Red2  a Red1 + b Ox2
𝟎 𝟎
𝟏 𝟐
E10 y E20 : potenciales normales de cada sistema redox; n el número de moles de

electrones intercambiados
Introducción
Una reacción electroquímica es una reacción redox en la que el

intercambio de electrones tiene lugar en un electrodo.
Proceso heterogéneo que se lleva a cabo en la interfase electrodo–
disolución
Ventaja: pueden evitarse todo tipo de procesos secundarios que pueden
producirse cuando la reacción redox se produce en disolución.
El flujo de electrones es fácilmente medible e incluso imponible.
Reacción electroquímica: transformación química que sufre una

sustancia en la interfase electrodo-disolución al paso de la
corriente eléctrica.
(Reacción de oxidación-reducción, con ganancia o cesión de
electrones entre la sustancia y el electrodo).
Introducción
Sistema experimental
Electrolito: sistema químico capaz de

conducir la corriente eléctrica y del
que se quiere obtener información.
Contiene el analito o analitos.
Circuito de medida: usado para

aplicar y medir señales eléctricas
(potencial o intensidad) del
electrolito.
Electrodos: conductores que sirven

como contacto entre el sistema de
medida y el electrolito
Célula electroquímica
Introducción
Electrodo indicador o de trabajo, electrodo cuyo potencial es sensible

a la concentración del analito.
Contraelectrodo, segundo electrodo que completa el circuito y

proporciona el potencial de referencia frente al que se mide el
potencial del electrodo de trabajo.
El contraelectrodo se puede sustituir por dos electrodos:
Electrodo de referencia, electrodo cuyo potencial permanece

constante, ya que no pasa corriente a través de él pues tiene una alta
resistencia, y frente al cual se puede medir exactamente el potencial
aplicado al electrodo de trabajo
Electrodo auxiliar, electrodo que completa el circuito, deja pasar la

corriente y permite así la medida de ésta.
Introducción
Ánodo electrodo donde tiene

lugar la oxidación.
Cátodo electrodo donde tiene
lugar la reducción
Znº (s)  Zn2+ + 2 e-

Ag+ + e-  Agº(s)
Célula electroquímica con puente salino.
Znº + 2 Ag+  Zn2+ + 2 Agº
Puente salino: Comunicación entre dos disoluciones compuesta por una

disolución de electrolito, que permite el paso de corriente en forma de carga iónica.
Zn(s) | ZnCl2 (aq, 0.0167 M) || AgNO3 (aq, 0.100 M) | Ag(s)

Introducción
Potencial de célula
cel c a
A 25 ºC (298 K) Zn(s) | ZnCl2 (aq, 0.0167 M) || AgNO3 (aq, 0.100 M) | Ag(s)
𝟎 𝟐 𝟎
𝒂 𝒁𝒏𝟐 ⁄𝒁𝒏𝟎 𝒄 𝑨𝒈 ⁄𝑨𝒈𝟎
𝟎 𝟎 𝟐
𝒄𝒆𝒍 𝑨𝒈 ⁄𝑨𝒈𝟎 𝒁𝒏𝟐 ⁄𝒁𝒏𝟎
𝑬𝒄𝒆𝒍 = 𝟎. 𝟕𝟗𝟗𝟔 + 𝟎. 𝟎𝟓𝟗𝟐 𝒍𝒐𝒈 𝟎. 𝟏𝟎𝟎 − −𝟎. 𝟕𝟔𝟏𝟖 + 𝟎. 𝟎𝟐𝟗𝟔 𝒍𝒐𝒈 𝟎. 𝟎𝟏𝟔𝟕 = 𝟏. 𝟓𝟓𝟓 𝑽
Introducción
En principio, midiendo el potencial de célula y conociendo la concentración en

una de las semicélulas puede determinarse la concentración en la otra
No es correcto porque:
- Los potenciales normales de las tablas son a 25 ºC, luego deberíamos

termostatizar.
- Los potenciales dependen de la composición de la célula, de la concentración
salina (en realidad la ecuación de Nernst es función de las actividades no de las
concentraciones)
- En la célula hay presencia de otros potenciales que no son de Nernst, como son
los potenciales de unión líquida.
Potencial de unión líquida es un potencial que se establece en la interfase

de dos disoluciones iónicas de distinta composición. Se debe a la distinta
movilidad de los iones que constituyen dichas disoluciones
Introducción
Potencial de unión líquida, Eul
HCl 0,1 M KCl 0,1 M Movilidades

H+
H+: 36,3x10-8 m2s-1V-1
K+
- + K+: 7,62x10-8 m2s-1V-1
Na+: 5,19x10-8 m2s-1V-1
Eul = + 27 mV
NaCl 0,1 M KCl 0,1 M

Na+
K+
+ -
E cel  E c  E a  E ul
Eul = - 6,4 m V
Clasificación de las técnicas electroanalíticas
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS ELECTROANALÍTICAS
 Técnicas de la totalidad:
miden propiedades de toda la disolución (como la
conductividad)
 Técnicas de interfase,
la señal depende de los fenómenos que se producen en
la interfase entre un electrodo y la disolución en contacto
con él.
Técnicas electroquímicas de interfase
Técnicas estáticas Técnicas dinámicas

(i = 0) (i ≠ 0)
Potenciometría Potencial Intensidad

controlado controlada
Culombimetría a
Potencial Potencial intensidad controlada
variable constante
Culombimetría a
Voltamperometría Amperometría potencial controlado
Voltamperometría
Disolución Disolución
Voltamperometría de
agitada estática
redisolución
Voltamperometría Polarografía y Polarografía y

hidrodinámica voltamperometría de voltamperometría
electrodo estático de impulsos
Voltamperometría
cíclica
Medida de la intensidad y el potencial
MEDIDA DE LA INTENSIDAD Y DEL POTENCIAL.

Potenciómetro: dispositivo para medir el potencial de una célula electroquímica sin
producir una corriente ni alterar la composición de dicha célula
𝑷𝑺
𝒔𝒖𝒑 EPS potencial aplicado por la fuente
𝒂𝒃 de alimentación
Rab resistencia entre los puntos a y b.
𝒄𝒆𝒍
Ecel diferencia de potencial entre los
𝒊𝒏𝒇
𝒄 electrodos de la célula
Rcb resistencia entre los puntos c y b.
𝒄
𝒄𝒆𝒍 𝑷𝑺
Diagrama esquemático de un potenciómetro. 𝒂𝒃
C = contraelectrodo; T = Electrodo de trabajo; AC =
alambre deslizante de resistencia; G = Interruptor
de tecleo; i = galvanómetro.
Galvanostato: dispositivo que se emplea para controlar la intensidad de corriente

eléctrica aplicada a una célula electroquímica
𝑷𝑺
Diagrama esquemático de un galvanostato.
R = resistencia; i = galvanómetro; A = electrodo

auxiliar; T = electrodo de trabajo; R = electrodo de
referencia; V = voltímetro o potenciómetro
Potenciostato: dispositivo utilizado para controlar el potencial del electrodo de

trabajo y permite medir la intensidad que fluye a través de una célula electroquímica
Diagrama esquemático de un potenciostato.

RV = resistencia variable; C = electrodo auxiliar; R
= electrodo de referencia; T = electrodo de trabajo;
V = voltímetro o potenciómetro; i = galvanómetro
Electrodos: clasificación y tipos
ELECTRODOS: CLASIFICACIÓN Y TIPOS
• Electrodos de referencia, que tienen un potencial constante y conocido

• Electrodos indicadores o de trabajo que son los que responden al
sistema químico de interés.
Electrodos de referencia
semicélula electroquímica que proporciona un potencial de referencia

conocido, constante e insensible a la composición de la solución bajo
estudio
 Convención: el electrodo de referencia es el ánodo:
Electrodo de referencia ║ electrodo indicador

ánodo cátodo
Ecel = Eind – Eref + Eul

Electrodos de referencia
• Electrodo normal de hidrógeno (NHE)
• Electrodo de calomelanos (SCE)
• Electrodo de Ag/AgCl.
• Electrodo Normal de Hidrógeno
2 H+ + 2 e-  H2
2
a 
Eeq  E 0  0,0296 log H
PH 2
• Electrodo de Calomelanos
Hg │ Hg2Cl2 sat, KCl (x, M) ║
Hg2Cl2 (s) + 2 e-  2 Hgº + 2 Cl-
𝟎
𝒆𝒒 𝟏 𝟐
E10 = 0,268 V
• Electrodo de Ag/AgCl
Ag | AgCl sat, KCl (x M) ||
AgCl(s) + e-  Ag° + Cl-.
𝟎
𝒆𝒒 𝟏
E10 = 0,222 V
Potenciales de referencia de los electrodos de referencia en

disoluciones acuosas
Potencial de electrodo, V vs. SHE

Temperatura Calomelanos Calomelanos Calomelanos Ag/AgCl 3,5 Ag/AgCl
ºC 0,1 M 3,5 M saturado M saturado
10 0.3362 0.256 0.2528 0.215 0.214
12 0.3362 0.254 0.2511 0.212 0.209
15 0.3359 0.252 0.2479 0.208 0.204
20 0.3356 0.250 0.2444 0.205 0.199
25 0.3351 0.248 0.2411 0.201 0.194
30 0.3344 0.246 0.2376 0.197 0.189
35 0.3338 0.244 0.2355 0.193 0.184
38 0.3338 0.2355
40 0.244 0.193 0.184
Electrodos indicadores o de trabajo

Electrodos cuya respuesta depende de la actividad del analito (medidas
potenciométricas) o bien sirve de vehículo para el intercambio de electrones
(medidas voltamperométricas y culombimétricas)
• Electrodos para intercambio de electrones
Material de electrodo Características
• Básicamente inerte
Platino • Se recubre con una capa de óxido en medio oxidante y de una película de
hidrógeno en medio reductor
• Más inerte que el platino

Oro
• Se observan oxidaciones a potenciales elevados
• Inerte, especialmente grafito y carbono vítreo

• Actualmente otras formas de carbono: nanotubos de carbono o grafeno,
Carbono
presentan respuestas mejores que el grafito.
• Puede trabajar a potenciales entre – 1 V y + 1 V
• Atacable. Tóxico
• No puede emplearse a potenciales mayores de 0,4 V en medidas de
Mercurio oxidación
• Presenta un sobrepotencial sobre la reducción del agua que permite
trabajar hasta potenciales de -2,0 V en reducción
TÉCNICAS POTENCIOMÉTRICAS
INTRODUCCIÓN
Potenciometría: técnica electroquímica en la que la concentración

del analito en la muestra se determina mediante la medida de un
potencial
El electrodo indicador debe dar una respuesta

Rápida
Reproducible a cambios en la actividad del ion
Selectiva
Tipos generales de electrodos indicadores potenciométricos:

metálicos
de membrana
Introducción
Electrodos metálicos
a) Electrodos de primera especie: se utilizan para medir la actividad

del ion derivado del electrodo
Ej. Electrodo de cobre: sensor de Cu2+
Reacción de electrodo Cu2+ + 2 e- Cu°
.
= +
Deben ser sistemas reversibles: Ag, Cu, Hg, Cd, Zn.

Introducción
b) Electrodos de segunda especie. Un electrodo metálico puede

dar respuesta a un anión que forma especies estables o insolubles
con el ión metálico
Ej. Electrodo de plata: sensor de Cl-, Br- o I-.
Reacción de electrodo: AgCl(s) + e- Ag0 + Cl- E0 = 0.222 V
Ag+ + e- Ag0 E0 = 0.799 V
= . + . = . + .
$!
= · = !. " × !
= . + . − . = . − .
Introducción
Ej. Electrodo de mercurio: sensor de AEDT
Reacción de electrodo: Hg2+ + 2 e- Hg0 E0 = 0.850 V
= ." + . & '
' )*
Hg2+ + Y4- HgY2- ( =
' * )+
HgY2- + 2 e- Hg0 + Y4- E0 = 0.210 V
' )
= ." + . ' = . ! + . &
),
= − . & ),
Introducción
c) Electrodos de tercera especie. Responden a un ion que

reacciona con la especie que forma una especie estable o
precipitado con el metal del electrodo
Ej. Electrodo de mercurio en presencia de una pequeña cantidad de HgY2-

para detectar iones que reaccionen con el EDTA: Ca2+
= − . & ),
)*
Ca2+ + Y4- CaY2- - =
* )+
)
= + . & = ′− . &
(
Introducción
d) Indicadores metálicos redox.

Electrodos inertes que sirven como electrodos indicadores para
sistemas de oxidación/reducción
Ej. Un electrodo de platino puede emplearse para seguir el potencial

del sistema Ce(IV)/Ce(III)
Ce4+ + e- Ce3+ E0 = 1.74 V
,
= !. , + .
/
Electrodos selectivos de iones
ELECTRODOS DE MEMBRANA
Electrodos selectivos de iones (ISE)
Consisten membrana, más o menos conductora, que separa dos disoluciones

del mismo ion pero de distintas actividades.
Al moverse los iones a través de la membrana, se establece una diferencia de
potencial entre ambos lados de la membrana
Potencial de membrana
0
Referencia interna 12
0 =
3-
Disolución interna zi es la carga del ion
.
Disolución externa
0
0 = +
Membrana 3
. 0
0 = +
3
En los electrodos de membrana no hay una reacción redox.

La membrana está diseñada para que deje migrar un solo ion
Funcionamiento general de los electrodos de membrana

Tipos de electrodos de membrana selectiva de iones
Electrodos de membrana cristalina.

1. Cristal único: LaF3 para F-.
2. Policristalina o mezcla de cristales. Ag2S para Ag+.
Electrodos de membrana no cristalina.
1. Vidrio: vidrios de silicato para Na+ y H+.
2. Líquido: líquidos intercambiadores de iones para Ca2+.
3. Líquido inmovilizado en un polímero rígido: PVC para Ca2+.
Propiedades
Mínima solubilidad o disociación.
Conductividad eléctrica.
Reactividad selectiva con el analito.
Interacciones: intercambio iónico, cristalización y complejación

Coeficientes de selectividad
• la mayoría de las membranas no son selectivas hacia un único

analito, es decir, responden en mayor o menor medida a otros
iones.
• El grado de selectividad suele expresarse mediante un coeficiente

de selectividad potenciométrico, kA,I
12 3 ⁄37
= ′ + + 45 ,7 7
3 -
9
A: analito; I: interferente ecuación de Nicolsky-Eisenman

Cálculo del coeficiente de selectividad
Método de las disoluciones separadas
• Medimos el potencial del ISE en una disolución del analito de

actividad aA
• Medimos el potencial del ISE sumergido en una disolución de
interferente de actividad aI
.
= ′ +
3
0.0592 3 ⁄3 7
= ′ + 45 ,7 7
3
9
Ejemplo 1. Los potenciales medidos con un electrodo selectivo de calcio en
varias disoluciones son los siguientes:
a) Solución aCa2+ = 0.01 M, Emed = 63.3 mV
b) Solución aZn2+ = 0.01 M, Emed = 113.6 mV
c) Solución aNa+ = 0.01 M, Emed = -70.4 mV
Calcular los coeficientes de selectividad del electrodo para Zn2+ y Na+.
.
= ′ +
3
0.0592 3 ⁄3 7
= ′ + 45 ,7 7
3
9
Cálculo del coeficiente de selectividad

Método de las disoluciones conjuntas
• Se preparan una serie de disoluciones que contienen la misma

actividad del interferente y actividades variables del ion analito.
• Se representa Ecel frente al logaritmo de la actividad del analito
5 ,7 3
>37
7
Donde (aA)e y (aI)e son las actividades

del analito e interferente que dan
idénticos potenciales.
Ejemplo 2. Para un electrodo selectivo a Pb2+, se obtiene el mismo potencial
para una disolución en el que la actividad de Pb2+ es 4.1 x 10-7 que para una
disolución en la que la actividad de Mg2+ es 0.01025. Calcular el valor del
coeficiente de selectividad kPb2+, Mg2+.
5 ,7 = 3
>37
7
Membrana no cristalina: Electrodo de vidrio
Electrodo combinado de vidrio y Ag/AgCl

H+dis + SiO-Na+vidrio SiO-H+vidrio + Na+dis
Vidrio Corning 015: 22% de Na2O,

6% de CaO y 72% de SiO2
potencial de superficie Es E1 –E2

0.0592 ′C 0.0592 ′E
C DC − E DE −
C E
J1 y J2 son constantes; a1 y a2 son las actividades de H+ en las disoluciones de los

lados externo e interno de la membrana, respectivamente; a’1 y a’2 son las actividades
de H+ en las superficies externa e interna del vidrio que constituye la membrana
!
= ! − = .
= + 0.0592 C = − 0.0592 F'
= + G (E + 0
Corning 015 obedece a la ecuación en un

rango de pH de aproximadamente 0.5 a 9
Si reemplazamos en la membrana Na2O y

CaO por Li2O y BaO se extiende el rango de
pH útil de los electrodos de membrana de
vidrio a niveles de pH superiores a 12
Ejemplo 3. El coeficiente de selectividad KH+/Na+ para el vidrio Corning 015 es de
alrededor de 10-11. ¿Qué error de pH es previsible con una solución de NaOH 0,05
M?
12 3 ⁄37
= ′ + + 45 ,7 7
3 -
9
Membrana cristalina
Se construyen a partir de un compuesto iónico o una mezcla
homogénea de compuestos iónicos.
monocristal o policristal.
Electrodo de fluoruro
Electrodo formado por un monocristal de LaF3 dopado con Eu2+
H -/, ⇌ H -K, ó + -$ = + 0.0592 F-

Electrodos de membrana policristalina

Electrodo formado por policristales de sulfuros, seleniuros,
halogenuros, etc. de plata, cobre, plomo.
(a) con electrodo de referencia interno; (b) con contacto interno ohmico;
(c) combinado con contacto interno ohmico
Electrodos selectivos de membrana cristalina
Intervalo de Material de Intervalo de

Ion Interferentes
concentración, M membrana pH
F- 10-6 - 1 LaF3 5-8 OH- (0,1M)
Cl- 10-4 – 1 AgCl 2-11 CN-, S2-, I-, S2O32-,
Br-
Br- 10-5 – 1 AgBr 2-12 CN-, S2-, I-
I- 10-6 – 1 AgI 3-12 S2-
SCN- 10-5 – 1 AgSCN 2-12 CN-, S2-, I-, S2O32-,
Br
CN- 10-6 – 10-2 AgI 11-13 S2-, I-
S2- 10-5 - 1 Ag2S 13-14
Electrodo selectivos de membrana líquida
Electrodo formado por una membrana hidrofóbica que contiene un

agente complejante orgánico líquido que reacciona selectivamente
con el analito.
tipos de agentes complejantes orgánicos: intercambiadores
cationicos, intercambiadores de aniones e ionóforos neutros.
Existe un potencial de membrana si la actividad del analito es
diferente en los dos lados de la membrana.
La corriente es transportada a través de la membrana por el analito
Ionóforo: ligando cuyo exterior es hidrófobo y

cuyo interior es hidrofílico.
El éter de corona que se muestra aquí es un
ejemplo de un ionóforo neutro
15-corona-5
Electrodo selectivos de membrana líquida
.
= +
Electrodos selectivos de iones basados en un líquido
Intervalo Disolvente Intervalo

Ion Portador Interferentes
lineal, M del portador de pH
Dodecilfosfato de Fosfonato de Zn2+, Pb2+,
Ca2+ 10-5 – 1 6-10
calcio dioctilfenilo Fe2+, Cu2+
Sebacato de
K+ 10-6 – 1 Valinomicina 4-9 Rb+, Cs+, NH4+
dioctilo
Nitrato de
Octil-2- ClO4-, I-, ClO3-,
NO3- 10-5 – 1 tridodecilhexadecilamo 3-8
nitrofenil éter Br-, HS-, CN-
nio
Perclorato de hierro (II)
p-
ClO4- 10-5 – 1 tris(1,10-fenantrolina 4-10 I-, NO3-, Br-.
nitrocimeno
sustituída)
Tetrafluoborato de
p-
BF4- 10-5 – 1 níquel (II) tris(1,10- 2-12 NO3-.
nitrocimeno
fenentrolina sutituída)
Electrodo selectivos (sensibles) a gases
Electrodo formado por una membrana que permite el paso de un gas.

El gas reacciona con ´la disolución interna generándose una especie
química que se detecta con un electrodo selectivo a la especie
Sensor de CO2
Electrodos de membrana sensibles a los gases
Reacción de la solución Electrodo selectivo

Analito Disolución interna
interna de iones
CO2 NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,01 M CO2+2 H2O HCO3-+H3O+ de pH de vidrio
HCN KAg(CN)2 0,01 M HCN + H2O CN-+H3O+ membrana de Ag2S

HF H3O+ 1 M HF + H2O F-+H3O+ de fluoruro
H2S Tampón citrato, pH 5 H2S + H2O HS-+ H3O+ membrana de Ag2S
NH3 NH4Cl 0,01 M, KNO3 0,1 M NH3 +H2O NH4++ OH- de pH de vidrio
2NO2 +3 H2O NO3-+ NO2-
NO2 NaNO2 0,02 M, KNO3 0,1 M
+H3O+
de pH de vidrio
SO2 NaHSO3 0,01 M, pH 5 SO2+2 H2O HSO3-+H3O+ de pH de vidrio

Biosensores potenciométricos. Sensores enzimáticos

Electrodo formado por una membrana en la que se inmoviliza una
enzima.
La reacción enzimática enzima-sustrato genera una especie química
que se detecta con un electrodo selectivo a la especie
Biosensores potenciométricos
Ejemplos de biosensores potenciométricos
Analito Fase biológicamente activa Sustancia determinada

5’-adenosina AMP-desaminasa (E) NH3
monofosfato (5’-AMP)
L-arginina Arginasa + ureasa (E) NH3
asparagina Asparaginasa (E) NH4+
L-cisteína Proteus morganii (B) H2S
L-glutamato Calabaza amarilla (T) CO2
L-glutamina Sarcina flava (B) NH3
oxalato Oxalato descarboxilasa (E) CO2
penicilina Penicilinasa (E) H3O+
L-fenilalanina L-aminoácido oxidasa y I-
peroxidasa de rábano (E)
azúcares Bacterias de la placa dental H3O+
humana (B)
urea Ureasa (E) NH3 o H3O+
E, enzima; B, bacteria; T, tejido

Medidas cuantitativas
MEDIDAS CUANTITATIVAS
potenciometría directa
valoraciones potenciométricas
Potenciometria directa
0,0592
Ecel = k + log a i A 25ºC como ai = [iz] γi
zi
Ecel = k +
0,0592
logγ i +
0,0592
[]
log i z
zi zi
Medida en presencia de TISAB (Total ionic strength adjustment buffer)

que mantiene constante la fuerza iónica.
Pendientes de Nernst para diferentes tipos de electrodos a 25º C.

H+ 59,16 mV/década; Ag+, 59,16 mV/década; Ca2+, 29,58 mV/década;
F-, -59,15 mV/década
Calibrado
Generalmente se utiliza patrón externo: ajuste fuerza iónica TISAB.

En matrices complejas puede usarse adición estándar para calibrar
en condiciones de matriz
Ejemplo 4. Se han obtenido los siguientes datos usando un electrodo de pH y el
conjunto de patrones de pH que se recogen en la Tabla. Determinar el valor de pH
de las muestras: zumo de tomate, 167 mV; agua de grifo, -27 mV; café, 122 mV
pH potential (mV)
2.0 +300
3.0 +240
4.0 +168
5.0 +81
6.0 +35
8.0 –92
9.0 –168
10.0 –235
11.0 –279
400
300 y = -65,459x + 427,41

R² = 0,9978
200
100
E, mV
-100
-200
-300
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
pH
Ejemplo 5. La concentración de NO3- en una muestra de agua se
determinó mediante un método de adición estándar simple usando un
electrodo selectivo de iones de nitrato. Para la determinación, 25.00
mL de muestra se introducen en la célula, midiéndose un potencial de
0.102 V. A continuación, se añade a la célula 1.00 mL de un patrón de
nitrato de 200.0 mg/L obteniéndose un potencial de 0.089 V. Calcular
los mg NO3–/L en la muestra de agua.
• Propiedades analíticas
a) Intervalo lineal: alto, 4-6 órdenes de magnitud, desde 10-6-10-5 M hasta

0,1-1 M
b) Exactitud: determinada por el error de medida del potencial de célula
Factores de error
- Contribución de iones interferentes al potencial
- Variación de la fuerza iónica entre patrones y muestras: TISAB
- Variaciones del potencial de unión líquida/ de simetría.
- Alteraciones de la superficie de la membrana/electrodo
-Interacción del analito con interferentes presentes en la muestra
∆[A ] ∆E cel
% error relativo = × 100
[A] RT zF
c) Precisión: limitada por la variación de la temperatura y la sensibilidad-
ruido- del potenciómetro.
La precisión instrumental puede ser de ± 0,1 mV en aparatos
buenos: 0,4-0,8 % en concentración.
Relación entre el error de medida del potencial y el error relativo en concentración
Error relativo en la concentración, %

Error del potencial, ±mV Z=1 Z=2
0,1 ± 0,4 ± 0,8
0,5 ± 1,9 ± 3,9
1,0 ± 3,9 ± 7,8
1,5 ± 5,8 ± 11,1
2,0 ± 7,8 ± 15,6
d) sensibilidad: pendiente de la recta de calibrado. Es mayor cuanto

menor es la carga
∆[A ] ∆E cel
= × 100 = 0,017 Z Si ∆Ecel = ± 1 mV
[A] RT zF
e) Límites de detección: son muy variables. En general 10-6-10-5 M en
rutina. En medios tamponados puede rebajarse mucho el L.D.
Recta experimental realizada en el laboratorio

de Experimentación en Química Analítica
250
y = -59,312x - 126,54
200
R2 = 1
E, mV vs Ag/AgCl
150
100
50
-50
-8 -6 -4 -2 0
log F
Ventajas de la técnica Inconvenientes:

Amplia respuesta lineal Calibración frecuente
Posibilidad de trabajo en Gran número de posibles
soluciones turbias o coloreadas interferencias
Medida rápida Baja sensibilidad, en
Instrumentación barata y portátil general
Método no destructivo
Uso de volúmenes pequeños de
muestra
Calibrado
Generalmente se utiliza patrón externo: ajuste fuerza iónica TISAB.

En matrices complejas puede usarse adición estándar para calibrar
en condiciones de matriz
B. Valoraciones potenciométricas
Valoraciones ácido-base: electrodo de vidrio
Valoraciones redox: electrodos metálicos (Pt, Au)
Valoraciones formación de complejos: electrodos selectivos de iones
Valoración de 10,0 mL de cloruros 0,001 M con Ag+ 0,01 M empleando un

electrodo de plata como electrodo indicador
Curva derivada
0,9
0,8
0,15
E, mV
0,7
0,1
∆E/∆V
0,6
0,05
0,5
0 0,4
0 0,5 1 1,5 2 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00
Volumen Ag, mL Volumen Ag, mL
Valoración realizada con un electrodo selectivo de mercurio

ventajas de las valoraciones potenciométricas
• Trabajar a precisiones de 0.1-0.2 % a concentraciones bajas

(10-5 – 10-6 mol/L).
• Instrumentación barata, sencilla y fácil de automatizar.
• Trabajo en disoluciones turbias o coloreadas
• No dependencia de la habilidad del técnico en la detección
del punto final.
TÉCNICAS VOLTAMPEROMÉTRICAS
INTRODUCCIÓN
Voltamperometría: técnica electroquímica en la que se aplica un potencial
dependiente del tiempo a una célula electroquímica y se mide la corriente
eléctrica que pasa a través de ella con el cambio de potencial.
Voltamperograma: representación
gráfica de la intensidad de
corriente en función del potencial
aplicado al electrodo de trabajo
Voltamperograma cíclico
de benzofenona y tri-p-
tolilamina
Introducción
Polarografía: voltamperometría que se caracteriza por la utilización de un

microelectrodo de gotas de mercurio (DME).
Jaroslav Heyrovsky (1890-1967)

Introducción
Señales de excitación comúnmente utilizadas en voltamperometría

a) Barrido lineal
Voltamperometría/polarografía
de barrido lineal
b) Impulso diferencial Voltamperometría/polarografía

diferencial de impulsos
c) Onda cuadrada Voltamperometría/polarografía

de onda cuadrada
c) Barrido triangular
Voltamperometría cíclica
Introducción
Medida experimental
Célula electroquímica de tres

electrodos con su instrumentación
de control
Introducción
Materiales de electrodo
Microelectrodo Microelectrodos
sólido de mercurio
Gota
colgante Gotas Gota
(HMDE) (DME) estática
(SMDE)
Material electrodo: metal inerte (platino u oro); grafito pirolítico o carbono vítreo;
semiconductores (Sn u In2O3) o bien un metal o carbono vítreo recubierto por una película de
mercurio
Introducción
Procesos que generan paso de corriente

Procesos faradaicos
procesos en los que se transfiere carga (electrones) a través de la
interfase solución-electrodo. Se produce una oxidación o reducción de
la sustancia.
Ley de Faraday i = n F A Ji
i: intensidad de corriente
n: número de electrones intercambiados.
F: número de culombios involucrados en la oxidación/reducción de un
equivalente químico (96487 culombios/equivalente)
A: superficie del electrodo.
Ji: flujo de sustancia electroactiva.
Procesos no faradaicos
Procesos en los que no hay transferencia de carga pero se producen
fenómenos (adsorción de sustancias o cambios en la estructura de la
interfase solución-electrodo ) que provocan paso de corriente
Introducción
Interfase electrodo-disolución y corriente de carga
EA > EB
C: capacidad del condensador;

= q, carga en culombios;
E voltaje a través del capacitor, en voltios.
Etapas del proceso electródico
ETAPAS DEL PROCESO ELECTRÓDICO

Reducción electroquímica de un oxidante. Proceso simplificado
Etapas:
a) proceso de transferencia de masa (materia)

solución → superficie del electrodo
b) proceso de transferencia de carga (electrones).
c) Proceso de transferencia de masa,
superficie del electrodo → solución
ETAPAS DEL PROCESO ELECTRÓDICO

Reducción electroquímica de un oxidante. Proceso simplificado
Dos factores que contribuyen a la velocidad de la reacción

electroquímica:
• la velocidad a la que los reactivos y productos se transportan
hacia o desde el electrodo (velocidad de transferencia de masa)
• la velocidad a la que los electrones pasan entre el electrodo y
los reactivos y productos en disolución (velocidad de
transferencia de carga)
Reducción electroquímica de un oxidante. Proceso general
a) difusión; b) reacción química precedente; c) adsorción; d)

transferencia electrónica; e) desorción; f) reacción química
subsiguiente; g) difusión
La etapa más lenta (transferencia de carga, transferencia de masa, reacción

química, adsorción) es la que limita la velocidad a la que se produce la reacción
electródica.
Influencia del potencial aplicado sobre la intensidad de corriente faradaica

La velocidad de transferencia de carga sobre un determinado electrodo puede medirse
fácilmente, ya que ésta no es otra que el número de electrones intercambiados por
unidad de tiempo: la intensidad de corriente eléctrica
Red – ne- Ox Ox + ne- Red
+i Red Ox
+i
Ec
Ea E E
-i
-i Red Ox
Influencia del potencial aplicado sobre la intensidad de corriente faradaica

La velocidad de transferencia de carga sobre un determinado electrodo puede medirse
fácilmente, ya que ésta no es otra que el número de electrones intercambiados por
unidad de tiempo: la intensidad de corriente eléctrica
La forma de la curva intensidad-potencial varía con:

- la naturaleza del electrodo, su forma, dimensiones,...
- la cantidad (concentración) del oxidante o reductor,
- la velocidad de intercambio de electrones.
Sistema electroquímicamente rápido Sistema electroquímicamente lento
Ox + ne- Red
+i Red Ox +i
E1 Red Ox
Eeq
i1
i2 E1 E
Eeq
E Red Ox
-i -i
Red Ox
Eeq = E 0 +
RT
ln
[Ox ] = E 0 + 0,05916 log [Ox ] ( 25º C )
nF [Re d ] n [Re d ]
En ausencia de sustancias electroactivas, existen dos límites de

electroactividad del sistema:
• Límite de reducción: siempre lo fijará el disolvente.

• Límite de oxidación: el límite lo fijará el disolvente (electrodo inerte) o la
oxidación del electrodo (electrodo atacable, Hg, Fe, etc.)
Diagrama E-pH del agua
Sustancia electroactiva:
sustancia que se pueden oxidar o reducir sobre un electrodo en el intervalo
de electroactividad del sistema disolvente/electrodo
Ventanas de potencial de los electrodos

Influencia del transporte de masa sobre la intensidad de corriente faradaica
Procesos de transferencia de masa
Migración: movimiento de una especie cargada en un gradiente eléctrico

generado por la aplicación de un campo eléctrico.
Convección: desplazamiento de las sustancias bajo la influencia de
agitación o cualquier otra forma de transporte hidrodinámico
(diferencias de densidad, vibración, etc.)
Difusión: transporte natural o movimiento de una sustancia bajo la
influencia de un gradiente de potencial químico, esto es, un gradiente
de concentración
Ecuación de Nernst-Planck
∂C i ( x ) Z i F ∂φ ( x )
J i ( x ) = − Di − Di C i + C iV ( x )
∂x RT ∂x
difusión migración convección
Ji(x) : flujo de la especie i (mol s-1 cm-2) a una distancia x de la superficie del
electrodo.
Di : coeficiente de difusión (cm2/s)
∂C i ( x ) : es el gradiente de concentración a la distancia x.
∂x
∂φ ( x )
: gradiente de potencial que genera la migración
∂x
V(x): velocidad (cm/s) con la que un elemento de volumen de la disolución se
mueve a lo largo del eje X
Zi y Ci son la carga y concentración de la especie i, respectivamente
∂C i ( x )
J i ( x ) = − Di + C iV ( x )
∂x
a) Ausencia de convección
δ: capa de difusión
= −
 ∂C 
i = nFAJ i = nFAD 
Electrodo plano  ∂x  x =0
 ∂C  C∗
  =
 ∂x  x =0 πDt
∗ D1 / 2
i = nFAC = kt −1 / 2
π 1/ 2t1/ 2
Ecuación de Cotrell
Electrodo esférico
 ∂C  ∗ 1 1
  = C +
 πDt r 
 ∂x  x =0
(r es el radio del electrodo)
i = nFADC 
1 ∗
1
+  nFADC ∗
ilim =
 πDt r  r
b) Presencia de convección
∂C ∆C ∆C C∗ − C
Ji = D =D =D =D
∂x ∆x δ δ
Si E es suficientemente grande, Cx=0 = 0
C∗
J max = D
δ
D
id = nFAJ max = nFA C∗
δ
Medida de la curva intensidad-potencial
MEDIDA DE LA CURVA INTENSIDAD-POTENCIAL

a) Disolución agitada
Suponemos una solución de una sustancia electroactiva, a concentración 10-3 M y en
presencia de un electrolito soporte 0,1 M, que es agitada vigorosa y regularmente. Se
emplea un electrodo de pequeña superficie comparada con el volumen de la solución
D
Intensidad límite de difusión id = nFA C*
δ
Disolución agitada Electrodo rotatorio

b) Disolución estática
Suponemos una solución de una sustancia electroactiva, a concentración 10-3 M y
en presencia de un electrolito soporte 0,1 M, sin agitar. Se emplea un electrodo de
pequeña superficie comparada con el volumen de la solución
3 1 1
Intensidad de corriente de pico i p = kAn 2 D 2 v 2C *
• Información cualitativa:
potencial al cual se desarrolla la onda o
pico voltamperométricos.
voltamperometría hidrodinámica/polarografía:
potencial de semionda, E1/2, potencial al cual
la intensidad es la mitad de la corriente límite
de difusión.
voltamperometría estática: potencial de pico,
Ep.
• Información cuantitativa:
intensidad de corriente, proporcional a la
concentración de sustancia electroactiva.
voltamperometría hidrodinámica/polarografía:
intensidad (corriente) límite de difusión, Id.
voltamperometría estática: intensidad
(corriente) de pico, Ip.
.
= −
−
E, V i id-i log(i/id-i)
0,84 11,6 52,2 -0,653
0,85 17,4 46,9 -0,431
0,86 26,3 38,2 -0,162
0,87 37,6 27,1 0,142
0,88 50 14,9 0,526
0,89
0,88 y = 0,0338x + 0,8639

R² = 0,9893
0,87
E,V
0,86
0,85
0,84
0,83
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6
log(i/id-i)
Corriente de difusión y corriente residual
itot = ia + ir.
Itot: intensidad de corriente registrada. ia: corriente faradaica producida por la
oxidación o reducción del analito; ir, corriente fondo o residual.
Fuentes de la corriente residual

• Corriente faradaica fondo debida a la oxidación o reducción de impurezas
presentes en la muestra, ii,
• Corriente de carga, ic
ir = ii + ic
Polarograma disolución acuosa

TÉCNICAS VOLTAMPEROMÉTRICAS DE ANÁLISIS
Polarografía.
técnica que emplea un electrodo de gotas de mercurio (DME) como
electrodo de trabajo.
Polarogramas de (A) una solución 5x10-4 M de
Cd2+ en 1 M de HCl y (B) una solución 1 M de HCl
(id)max = 706 nD1/2m2/3t1/6C*
t, tiempo de vida de la gota (s)

m, flujo de mercurio a través del capilar (mg/s) (ecuación de Ilkovic)
Técnicas voltamperométricas de análisis
Ventajas del electrodo de gotas de mercurio
La superficie se renueva en cada gota, evitando contaminaciones

constantes en el electrodo.
El mercurio presenta una gran sobretensión en la reducción del agua,
obteniéndose potenciales de reducción menores que con otros electrodos.
Se obtiene una intensidad de corriente límite de difusión, aunque la
disolución no está agitada
Inconvenientes del electrodo de mercurio
La oxidación del mercurio a Hg22+ a potenciales por encima de 0 V (0,4 V

en medio ácido) limita su uso como ánodo.
Presenta límites de detección superiores a 10-5 M debido a la corriente de
carga que se genera durante el crecimiento de la gota.
La reducción de muchos compuestos presenta máximos polarográficos,
debidos principalmente a procesos de adsorción.
El mercurio es tóxico
Técnicas voltamperométricas impulsionales
Polarografía en escalera (CCP).

Electrodo gotas de mercurio
Voltamperometría de barrido lineal Electrodo sólido
disolución estática
Ep
disolución agitada
benzofenona
Tri-p-tolylamine
Thimerosal: sal sódica del tiosalicilato de etilmercurio

Voltamperometría normal de impulsos (NPV, normal pulse

voltammetry)
Voltamperometría diferencial de impulsos (DPV, differential pulse

voltammetry).
Polarogramas obtenidos para el clorhidrato de tetraciclina (en acetato amónico

0,1 M y pH 4) usando polarografía de escalera (derecha) y polarografía diferencial
de impulsos (izq)
DPV, 0,360 µg/mL CCV, 180 µg/mL

Voltamperometría de redisolución (SV, stripping voltammetry).

Análisis simultáneo de Zn, Cd, Pb y Cu mediante DPASV

Voltamperometría de redisolución adsortiva del alprazolam
fosfato 0,1 M, pH 7
E acu = -0,625 V
DE -60 mV L.D. = 0,07 µg L-1
v.b. 30 mV/s
Tacu 240 s
Amperometría.
MEDIDAS CUANTITATIVAS
Métodos de calibrado
Generalmente se utiliza patrón externo.
En matrices complejas puede usarse adición estándar para calibrar en
condiciones de matriz
Permite el análisis multielemental, por lo que puede emplearse el método de
patrón interno para mejorar la precisión
Propiedades analíticas
a) Intervalo lineal: medio, 2-3 órdenes de magnitud, en medidas
voltamperométricas, y corto 1-2 órdenes de magnitud, en medidas de
redisolución (puede ampliarse cambiando tiempo de acumulación)
b) Exactitud: determinada por el error de medida de la intensidad de

corriente. Suele ser buena, alcanzándose inexactitudes del 1-3 %
La selectividad depende de la diferencia de los potenciales de
semionda o de pico en el electrolito empleado.
Selectividad bastante alta debido a que muchos compuestos no son
electroactivos.
Factores de error principales

• Contribución de impurezas a la corriente residual.
• Alteraciones de la superficie del electrodo
• Sustancias que reaccionan con el analito desplazando su
potencial de semionda o impidiendo su reacción sobre el
electrodo.
c) Precisión: limitada por la incertidumbre en la medida de la corriente

límite o de máxima de pico. Suele ser buena, alcanzándose
imprecisiones del 1-3 %
d) Límites de detección: son variables. Depende de la técnica, de la

facilidad de oxidarse o reducirse del analito, el número de electrones
involucrados y el potencial de aparición de la onda.
Tabla de L.Q. de algunas técnicas electroanalíticas, en µg/l

Elemento DCV DPV SV SV ad
Ag 200 0,01
Al 100 0,1 2
As 100 4 2
Bi 500 5 0,01
Cd 200 2 0,01
Co 100 3 0,1 0,02
Cu 200 2 0,02
Fe 100 3 0,2
Ni 100 3 20 0,02
Pb 400 3 0,02
Sb 4 0,04
Sn 200 3 0,04
Tl 1000 10 0,02
Zn 500 3 0,03
DCV: voltamperometría de corriente continua; DPV: voltamperometría diferencial de impulsos.
SV: voltamperometría inversa (ad: adsortiva) (stripping voltammetry)
Límites de cuantificación para diversos compuestos orgánicos mediante DPV
Compuesto L.Q. Compuesto L.Q.
Nitrobenceno 5 x 10-8 M Compuestos farmacéuticos

Nitrosaminas 8 x 10-8 M Benzodiacepinas 0,01-0,1 µg/ml
Fenol 10-8 M Vitaminas: B2, C, K1, K2 8 x 10-8-3 x 10-6 M
Compuestos 10-9 M
carbonílicos Fenobarbital, 4 x 10-6
Difenilhidantroina
Tioles 10-7 M
Gliobormerina 5 x 10-8
Pesticidas
Trimetroprim 4 x 10-7
Triazinas 10-8 M
Tioureas 10-7-10-8 M
Disulfiran 1,7 x 10-8 M
Carbaril 0,2 µg/ml
Diquat y paraquat 5 x 10-8 M
2,4 D; MCPA 0,03 µg/ml
Aminocarb, zertram 0,03 µg/ml
Paration, praoxon 5 x 10-8 M

Límites de cuantificación para diversos compuestos orgánicos mediante Voltamperometría de

Redisolución Adsortiva (ad SV)
Compuesto L.Q., mol/L
ADN 1 x 10-5
Monensin 1 x 10-7
Polietilenglicoles 5 x 10-8
Dopamina 5 x 10-8
Triclorobifenilo 4 x 10-8
Hidroxianisol butilado 2 x 10-8
Adriamicina 1 x 10-8
Codeína, cocaína, papaverina 1 x 10-8
Cloropromacina, otras fenotiacinas 5 x 10-9
Diazepam, nitrazepam 5 x 10-9
Cimetidina 4 x 10-9
Fenantrenoquinina 1 x 10-9
Bilirrubina 5 x 10-10
Pesticidas conteniendo grupos nitro 5 x 10-10
Progesterona 2 x 10-10
Digoxin, digotoxin 2 x 10-10
Riboflavina 2,5 x 10-11
Biosensores amperométricos representativos
Analito Enzima Especie

detectada
colina Colina oxidasa H2O2
etanol Etanol oxidasa H2O2
formaldehído Formaldehido deshidrogenasa NADH
glucosa Glucosa oxidasa H2O2
glutamina glutaminasa, glutamato oxidasa H2O2
glicerol glicerol deshidrogenasa NADH, O2
lactato lactato oxidasa H2O2
fenol Fenol oxidasa quinona
Fósforo inorgánico nucleósido fosforilasa O2
1. La concentración de As (III) en agua puede determinarse mediante
polarografía diferencial de impulsos en HCl 1 mol/l. El potencial inicial se
establece en -0.1 V vs. ECS y se desplaza hacia potenciales negativos a
una velocidad de 5 mV/s. La reducción de As (III) a As (0) se produce
hacia -0.44 V vs ECS. Las intensidades de pico obtenidas para distintos
patrones de arsénico son
As (III), µM ip, µA
1.00 0.298
3.00 0.947
6.00 1.83
9.00 2.72
¿Cuál será la concentración de As (III) en una muestra de agua si la
intensidad máxima de pico es, en las mismas condiciones, 1.37 µA?
3
y = 0,3013x + 0,0176
2,5 R² = 0,9996
ip, µA 1,5
0,5
0
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
As(III), µM
2.-. La concentración de cobre en una muestra de agua marina se realiza
mediante voltamperometría de redisolución anódica usando un método
de adición patrón. Al analizar una muestra de 50.0 mL, la intensidad de
pico máxima fue de 0.886 µA. Se hace una adición patrón de 5.00 µL de
Cu2+ 10.0 µg/mL, con lo que la intensidad de pico máxima pasa a 2.52 µA.
Calcular la concentración de cobre en la muestra.
3.- En la determinación de Pb2+ por polarografía de onda cuadrada se
utiliza el Cd2+ como patrón interno. La onda de reducción del Cd2+ se
obtiene a un potencial de -0.60 V, mientras que la onda de reducción del
Pb2+ se obtiene a un potencial de -0.40 V.
Una disolución (conocida) que contiene Cd2+ en concentración 3.23×10-5
mol/L y Pb2+ en concentración 4.18×10-5 mol/L presenta unas
intensidades de corriente de 1.64 µA y 1.58 µA a un potencial de -0.60 V y
-0.40 V respectivamente.
Se prepara una disolución (desconocida) mezclando 25.00 mL de la una
muestra problema que sólo contiene Pb2+ con 10.0 mL de Cd2+ de
concentración 3.23×10-4 mol/L, diluyendo a 50.00 mL. Las intensidades
de corriente obtenidas para esta disolución desconocida son 2.00 µA a -
0.60 V y 3.00 µA a -0.40 V.
Determinar la concentración de Pb2+ en la muestra problema.
Constantes de equilibrio
Determinación de las constantes de equilibrio para reacciones acopladas.

Constantes de equilibrio
Determinación de las constantes de equilibrio para reacciones acopladas.
.
O+n e- R = ⁄ + ⁄ = ⁄
"
O + pL OLp = .
= ⁄ +
.
⁄ "
= ⁄ −
∆ ⁄ = ⁄ "
− ⁄ "
. .
∆ ⁄ =− −
4.- Un voltamperograma para la reducción de dos electrones de M tiene
un potencial de semionda de -0.226 V vs. ECS. En presencia de un
exceso de ligando L, se registran los siguientes potenciales de
semionda:
[L], mol/L E1/2, V vs. ECS

0.020 -0.494
0.040 -0.512
0.060 -0.523
0.080 -0.530
0.100 -0.536
Determinar los valores para la estequiometría del complejo y su

constante de formación
INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Separación pigmentos de las

hojas (1906)
Columna: carbonato cálcico,

alúmina y sacarosa
Eluente: ligroína y etanol
Michael Tswett
(1872-1919)
Acuñó el término cromatografía del griego “chroma”

(color) y “graphein” (escribir)
Introducción
Cromatografía
método utilizado inicialmente para la separación de los componentes de una
mezcla en el cual dichos componentes se distribuyen entre dos fases, una de
las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase
estacionaria puede ser un sólido, un líquido sobre un soporte sólido o un gel.
La fase estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en
forma de capa o dispuesta en forma de película. La fase móvil puede ser un
gas, un líquido o un fluido supercrítico
Proceso cromatográfico: ocurre como resultado de repetidos equilibrios de

distribución de los componentes de la muestra entre las dos fases no
miscibles entre sí.
Constante o coeficiente de distribución
Cs,e cantidad de soluto en la
Sm  Se fase estacionaria
Cs,m la concentración de soluto
en la fase móvil
Introducción
A > KD > afinidad < velocidad de migración
cromatograma: registro del perfil de concentración o

de masa como una función del movimiento de la fase
móvil: volumen eluído o tiempo transcurrido desde la
introducción de la muestra
Introducción
Esquema básico de un cromatógrafo
1. Fuente de fase móvil (su naturaleza depende fundamentalmente del fluido que se utilice).
2. Sistema de regulación y medida del caudal o la presión de la fase móvil.
3. Sistema de introducción (inyección) de la muestra.
4. Columna.
5. Recipiente termostatizado para controlar la temperatura de la columna
6. Sistema de detección (transforma propiedad física f. m. en señal eléctrica)
7. Sistema de amplificación y tratamiento de la señal eléctrica generada por el detector
Clasificación de las técnicas cromatográficas
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

 según el estado físico de las fases móviles y estacionarias
 según el proceso físico o principio cromatográfico (mecanismo de
separación)
 según la disposición/configuración de la fase estacionaria
 según el procedimiento de desarrollo cromatográfico
 Según el estado físico de las fases móviles y estacionarias
Fase móvil Fase estacionaria Técnica cromatográfica

sólido C. líquido-sólido
Líquido
líquido C. líquido-líquido
sólido C. gas-sólido
Gas
líquido C. gas-líquido
Fluido supercrítico sólido C de fluidos supercríticos

 según el proceso físico o principio cromatográfico (mecanismo de
separación)
 Cromatografía de adsorción
 Cromatografía de reparto
 Cromatografía de intercambio iónico
 Cromatografía de exclusión molecular
 Cromatografía de afinidad
Mecanismos de separación
a) adsorción
b) reparto
c) intercambio iónico
d) exclusión molecular
e) afinidad

 según la disposición/configuración de la fase estacionaria
 Cromatografía en columna
 Cromatografía plana  Cromatografía en capa fina

 Cromatografía en papel
Cromatogafía en papel Cromatogafía en capa fina Cromatogafía en columna

Principio Tipo de Fase Disposición de la
cromatográfico Móvil fase estacionaria Tipo de cromatografía
C. de adsorción Gas Columna Cromatografía gas-sólido (GC)

Competencia entre
Fluido Columna Cromatografía de fluidos supercríticos
un adsorbente sólido
supercrítico (SFC)
y la fase móvil
C Líquido Columna Cromatografía líquida (LC, HPLC)
r Plana Cromatografía en capa fina (TLC)
o Cromatografía en papel (PC)
m Columna Cromatografía gas-líquido (GC)
C. de reparto Gas
a Competencia entre
t una fase estacionaria Fluido Columna Cromatografía de fluidos supercríticos
supercrítico (SFC)
o líquida y la fase móvil Columna Cromatografía líquida (LC, HPLC)
g Líquido
Plana Cromatografía en capa fina (TLC)
r
Cromatografía en papel (PC)
a
C. de cambio iónico Líquido Columna Cromatografía de intercambio iónico
f Competencia entre (IEC)
í una fase estacionaria
a cambiadora de iones y
la fase móvil líquida
C. de permeación Líquido Columna Cromatografía de permeación sobre
Competencia entre geles (GPC)
una matriz porosa y
una fase móvil líquida

 según el procedimiento de desarrollo cromatográfico
 Cromatografía de elución
 Cromatografía de análisis frontal
 Cromatografía por desplazamiento

 Cromatografía de elución.
• se introduce la mezcla a separar en la columna o superficie
• La mezcla es arrastrada con una fase móvil que tenga menor afinidad por
la fase estacionaria que los componentes de la mezcla

 Cromatografía de elución.
información que nos reporta el cromatograma
 Nos indica la complejidad de la muestra, a partir del número de

picos que aparecen en él.
 Nos permite la identificación de los mismos (información
cualitativa) mediante la medida precisa de la posición del pico.
 Nos permite la determinación cuantitativa de la concentración del
compuesto, a partir del área o de la altura de pico.
 Nos da una indicación del funcionamiento de la columna.

 Cromatografía análisis frontal.
• La disolución que contiene la muestra se añade continuamente a la columna.
• El componente con menor afinidad por la fase estacionaria es eluido en primer
lugar, en forma pura, emergiendo a continuación una mezcla de compuestos.
• Obtención de datos termodinámicos, separación analito menor afinidad,
purificación disolventes.

 Cromatografía por desplazamiento.
• Se introduce una pequeña cantidad de la mezcla en la columna
• Se introduce un disolvente que contiene un desplazador (D) con mayor afinidad
por la fase estacionaria que los componentes de la mezcla.
• La mezcla se desplaza a lo largo de la columna a la misma velocidad que el
desplazador obteniendo bandas de compuestos puros.
• Los solutos eluiran con un determinado orden dependiendo de la fuerza de
interacción relativa Soluto/ Desplazador,
Teoría general de la cromatografía en columna
TEORÍA GENERAL DE LA CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA:

CROMATOGRAFÍA DE ELUCIÓN
Definiciones
Fase estacionaria (lecho cromatográfico o sorbente): material sobre el
que se retienen los solutos y provocan su separación. Puede ser un
sólido, un líquido o un gel.
Fase móvil: líquido, gas (gas portador) o fluido supercrítico que se mueve
a través de la fase estacionaria en una dirección definida y arrastra los
compuestos a lo largo del sistema.
Elución: proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase
estacionaria transportando los componentes a separar.
Eluente o eluyente: disolvente o disolución utilizado en el proceso de
elución y que interacciona con la fase estacionaria para eluir los
componentes de la mezcla.
Eluato: disolución o sustancia obtenida mediante un proceso de elución.
Proceso cromatográfico:
ocurre como resultado de repetidos equilibrios de distribución de los
componentes de la muestra entre las dos fases no miscibles entre sí.
Constante o coeficiente de distribución
Cs,e cantidad de soluto en la
Sm  Se fase estacionaria
Cs,m la concentración de soluto
en la fase móvil
𝟏
.
𝑲𝑫
A mayor KD mayor lentitud de salida del lecho cromatográfico.

KD es una constante termodinámica y depende de
 la composición de la fase móvil,
 la naturaleza de la fase estacionaria,
 la naturaleza del soluto
 la temperatura
Parámetros cromatográficos.
 Se introduce la mezcla a separar al principio de la

columna
 Inicialmente la columna está rellena de fase móvil.
 Cuando el soluto está en la fase móvil, se mueve a
la misma velocidad lineal que ésta, u.
 Cuando el soluto está en la fase estacionaria, se
para
 La fase móvil que rellena la columna que tendrá
que salir antes de que salga un soluto no retenido
Cromatograma de un
componente
• Tiempo muerto, tM: tiempo requerido para que una especie no retenida alcance
el detector
• Volumen muerto, VM: volumen de fase móvil que se requiere para eluir una
especie no retenida
• Tiempo de retención, tR: tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra
hasta que el componente alcanza el detector.
• Volumen de retención, VR : volumen de fase móvil que se requiere para eluir un
soluto de la columna cromatográfica.
• Tiempo de retención corregido, t’R : tiempo que realmente se invierte en
la retención de un soluto por la fase estacionaria
• Factor de retención, k: relación entre el tiempo que el soluto pasa en la

fase estacionaria, t’R, al tiempo empleado por la fase móvil, tM.
L, longitud de la columna y u, la velocidad lineal media de la fase móvil

la relación Ve/Vm se denomina relación de fases, β
el tiempo de retención de un soluto depende de:
 Las dimensiones de la columna: L y b.

 Las condiciones de trabajo, u.
 El coeficiente de distribución, magnitud termodinámica
independiente de las condiciones de trabajo
• Selectividad, Factor de separación: capacidad de una determinada fase
estacionaria para separar dos componentes A y B
Cromatograma de dos componentes
 si α > 1.14 se considera que la separación es fácil, si α < 1.01 se considera

una separación difícil
 α depende de: • Naturaleza de los solutos
• Naturaleza de las fases estacionaria y móvil
• Temperatura
Características del pico cromatográfico.
 Anchura: relacionada con el

tiempo de residencia y la
eficacia.
 Área: proporcional a la
concentración de soluto:
análisis cuantitativo.
 Altura: corresponde a la zona
de máxima concentración.
Donde se mide el tiempo de
retención.
 Anchura de pico en la base, Wb, igual a 4 σ.

 Anchura de pico a media altura, Wh, medida a la mitad de la altura de
pico.
 Anchura de pico en los puntos de inflexión, Wi, corresponde a 2σ.
Eficacia de la columna.
La eficacia de la columna nos da una medida cuantitativa de la

extensión del ensanchado de banda
Modelos teóricos:  teoría de platos

 teoría cinética.
 Teoría de platos
 La columna puede visualizarse como dividida en un número de

discretas secciones, denominadas platos teóricos.
 Se considera que en cada plato teórico se establece un equilibrio del
componente entre la fase móvil y la fase estacionaria, y el
desplazamiento del componente a través de la columna se trata
como una transferencia de la fase móvil desde un plato al siguiente.
 La eficacia de la columna aumenta al hacerlo el número de estas
transferencias, es decir, al aumentar el número de platos teóricos, N.
 El coeficiente de distribución del soluto es constante en todos los
platos e independiente de la concentración de soluto.
 La difusión del soluto en la dirección axial es despreciable.
 Teoría de platos
El número de platos teóricos se define como
Donde tR es el tiempo de retención del compuesto y σ la desviación estándar del pico

gaussiano
El número de platos teóricos será directamente proporcional a la longitud de la

columna
Donde L es la longitud de la columna y H es la altura equivalente a un plato teórico

Picos asimétricos.
Pico con cola Pico con frente
factor de asimetría a un décimo de la 𝑹 𝑹

altura máxima de pico .
Donde W0.1 es la anchura de pico a un décimo de la

altura
La teoría de platos explica satisfactoriamente la forma de los picos

cromatográficos, pero falla al intentar justificar el ensanchamiento de los
mismos.
 La difusión axial contribuye significativamente al ensanchado de

banda
 La constante de distribución es independiente de la concentración
de soluto en un intervalo de concentraciones estrecho
 La suposición de que el flujo se produce de manera discontinua es
falsa
 La teoría falla al relacionar el proceso de ensanchado de banda con
parámetros experimentales que puede modificar el analista: tamaño
de partícula, velocidad de la fase móvil, etc.
 Teoría cinética
La teoría cinética considera que el ensanchado de las bandas o picos
cromatográficos se produce como consecuencia de que los distintos
procesos de transferencia de masas, durante el desplazamiento de un
compuesto a lo largo de la columna, se producen a distintas velocidades
finitas
 Dispersión en la fase móvil.

 Difusión longitudinal del soluto a lo largo de la columna
 Resistencia a la transferencia de masas
 Dispersión en la fase móvil.
La contribución de la dispersión en fase móvil

a la altura equivalente a un plato teórico es
Donde λ es una constante de proporcionalidad (depende de las dimensiones, geometría y uniformidad del
empaquetamiento de la columna) dp es el tamaño medio de partícula de la fase estacionaria.
 Difusión longitudinal del soluto a lo largo de la columna
La contribución de la difusión longitudinal a la

altura equivalente a un plato teórico es
γ es un factor de obstrucción, DM el coeficiente de difusión del compuesto en la fase

móvil, u la velocidad lineal de la fase móvil (u = L/tm)
 Resistencia a la transferencia de masas
 Resistencia a la transferencia de masas
Las contribuciones de la transferencia de masa en

la fase estacionaria, He, y la transferencia de masa
en la fase móvil, Hm, a la altura equivalente a un
plato teórico son
df es el espesor de la fase estacionaria, dc el diámetro de la columna, dp el tamaño

de partícula del relleno; De y Dm coeficientes de difusión del soluto en la fase
estacionaria y en la fase móvil; k factor de retención del soluto; y q es una
constante relacionada con el material de relleno de la columna
 Curvas HETP. Ecuación de Van Deemter
Ecuación de Van Deemter

Relación entre la altura equivalente a un plato teórico y la velocidad lineal de la fase móvil
Resolución.
• medida cuantitativa de la capacidad de una columna cromatográfica
para separar dos analitos
 Si R = 1.5, los picos sólo se superponen un

0,3 %,
 Si R = 1.0, los picos se superponen un 2%.
Esta resolución es adecuada para la
mayoría de los análisis
Resolución.
R = ƒ (selectividad, eficacia, factor de retención)
𝒂𝒗 𝑨 𝑩
𝒂𝒗 𝒂𝒗
Variación de R con el factor de selectividad (α) Variación de R con el factor de retención (k)
para valores de N y k fijos para valores de N y α fijos
Resolución.
Número de platos teóricos requeridos para

una cierta separación con diferentes valores
del factor de separación (k = 3 y R = 1.0)
Factor de N requeridos
separación, α
1.005 1 150 000
1.01 290 000
1.015 130 000
1.02 74 000
1.05 12 500
1.10 3 400
1.20 1 020
1.50 260
Optimización de las separaciones cromatográficas
Optimización de las separaciones cromatográficas.
 Aumento del número de platos (N, disminución de H) esto se consigue

- Cambiando las dimensiones de la columna (Longitud o diámetro
interno)
- Reduciendo el tamaño de partícula del relleno.
- Reduciendo la velocidad de la fase móvil (o el caudal)
 Aumentar la retención (k)
- Modificando la composición de la fase móvil (LC)
- Modificando la temperatura (GC)
 Aumentar la selectividad (α)
- Modificando la composición de la fase móvil (LC) uso de
gradientes.
- Modificando la temperatura (GC) uso de gradientes.
- Modificando la fase estacionaria, cuando lo anterior no de
resultado.
Aplicación al análisis cualitativo y cuantitativo
Aplicaciones de la cromatografía.
 Separar compuestos: purificación, preparativa

 Análisis cualitativo
 Análisis cuantitativo
 Análisis cualitativo
• Más limitado que el de otras técnicas (TFIR, RMN o MS).

• Cromatografía en superficie: posición del pico en relación con el
frente del disolvente.
• Cromatografía en columna: tiempo de retención o, mejor, el factor
de selectividad relativo a un patrón interno.
 Análisis cualitativo
Cromatografía en
columna
Cromatografía plana
PAH
Muestras de Pan tostado
Analyst, 2001, 126, 1326–1331

 Análisis cuantitativo
 Altura de pico, h
 Área de pico, A
Menos influenciada por

cambios en las condiciones
de separación
Integración de picos no resueltos
Integración de picos en cola de un pico mayoritario

Métodos de calibración
 patrón externo,
 patrón interno,
 adición estándar (en mucha menor medida)
 normalización de áreas
• Eluir todos los componentes de la muestra,
• Medir las áreas de todos los picos eluidos y
• Obtener las correspondientes áreas de pico corregidas (mediante los
correspondientes factores de respuesta del detector)
𝒄𝒐𝒓𝒓𝒆𝒈𝒊𝒅𝒂
𝒄𝒐𝒓𝒓𝒆𝒈𝒊𝒅𝒂𝒔
• útil para mezclas que contienen una serie de compuestos conocidos.

 una mezcla de reacción, para conocer el progreso de la reacción,
 una mezcla de isómeros, para conocer su relación de concentración
 un compuesto comercial para conocer su grado de pureza.
• El método asume que todas las sustancias de la muestra aparecen en el cromatograma
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA
Cromatografía líquida clásica
columnas abiertas, generalmente de

vidrio (20-50 cm longitud, 1-5 cm
diámetro) donde
la fase móvil fluye por gravedad o
mediante la aplicación de un vacío para
acelerar la separación.
El tamaño de las partículas del relleno
debe ser grande (60-250 µm)
Introducción
Aunque útil a nivel preparativo, la CL clásica presenta varias desventajas:

- El procedimiento de empaquetado es tedioso y poco reproducible
- La columna se usa una sola vez
- Tiene un elevado gasto de fase móvil.
- La eficacia es relativamente baja, pues usa tamaños de partículas
grandes, lo que provoca el uso de columnas grandes.
- El tiempo de análisis es alto, incluso para separar mezclas sencillas
- La técnica es muy sensible al operador.
- La detección y caracterización de los solutos se realiza en discontinuo, lo
que requiere tiempo y volúmenes grandes de eluato.
Reducir tamaño de partícula Aumento de la presión
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Introducción
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Características
• La columna puede usarse un gran número de veces sin regenerar.
• Presenta una alta resolución, por el pequeño tamaño de partícula.
• Depende poco del operador, siendo altamente reproducible.
• La instrumentación tiende a la automatización y a la cuantificación.
• Presenta tiempos de análisis cortos, apenas unos pocos minutos, aunque
se amplía en mezclas complejas.
• Muy versátil: se pueden emplear diversos tipos de interacción soluto-
fase estacionaria.
• Permite el uso de detectores selectivos en línea.
• Aumento de presión: uso de columnas más cortas y de menor calibre

• Menor tamaño de muestra: necesidad de detectores sensibles
Instrumentación
Instrumentación.
Sistema de bombeo a alta presión, que incluye el depósito de fase móvil.

Sistema de introducción de muestra
Columnas cortas, de calibre relativamente estrecho, con fase
estacionaria de pequeño tamaño de partícula.
Sistema de detección altamente sensible, en línea, equipado con un
registrador-integrador y un sistema de tratamiento de datos
Aproximaciones: modular o integrada

Materiales resistentes: acero, PEEK, especiales (titanio, fluoropolímeros)
Instrumentación
Depósito de fase móvil

Material inerte: vidrio, plástico, acero inoxidable
Requisitos de las fases móviles:

Espectroscópicamente puros
Libres de gases
Libres de partículas
Desgasificación.
Problemas en el detector
calentar hasta ebullición la fase móvil
usar ultrasonidos (baño o sonda)
aplicación de vacío con agitación magnética
purga de gas inerte (helio)
sistemas de membranas semipermeables en flujo
Instrumentación
Filtración.
Se usan filtros de membrana de poro controlado (0.45-0.22 µm)
El material de filtrado seleccionado en base a:
- Compatibilidad química.
- Tasa de materiales extraíbles
- Facilidad de manejo
Instrumentación
Filtrado de las muestras: las muestras a introducir en el sistema deben

filtrarse
Selección del material

Soluciones acuosas: acetato o nitrato de celulosa
Orgánicos puros (ACN, THF, hexano): PTFE (politetrafluoroetileno)
Mezclas: nylon o fluoruro de polivinilideno.
Instrumentación
Sistema de bombeo a alta presión

proporcionar a la columna un flujo controlado de fase móvil, reproducible y
constante para conseguir una buena reproducción de los tiempos de
retención
Requisitos:
• Estar construidas con un material inerte a la fase móvil
• Poder trabajar a presiones elevadas (hasta 6000 psi)
• Suministrar flujos libre de pulsaciones adecuados al diámetro de la
columna empleada (0.01-10 mL/min)
• Pequeños volúmenes de cabezales.
Relación entre flujo y caída de presión (Ley de Darcy)

∈
=
S, sección de la columna; ε, porosidad total; η, viscosidad de la fase móvil;

φ, resistencia al flujo; L, longitud de la columna; dp, tamaño de partícula.
Instrumentación
Tipos de bombas
Presión constante: neumáticas de desplazamiento directo y amplificadoras
de aire
Flujo constante: de jeringa y alternantes
Presión constante
Sensibles a cambios en la viscosidad de la fase
móvil y a la permeabilidad del sistema
neumáticas de desplazamiento directo:

• alcanzan 200 atm
• volumen limitado a 200-500 mL
Amplificadoras de aire:
• alcanzan altas presiones
• volumen limitado a 200-500 mL
Instrumentación
Flujo constante
• Controlan el caudal cambiando la caída de presión

• Están menos influenciadas por la viscosidad y permeabilidad
• Dan caudales más precisos
Bombas de tipo jeringa:

• No presenta pulsos
• Capacidad limitada : Se necesitan dos
para flujo constante
• Útil para columnas de calibre
pequeño
Instrumentación
Bombas alternantes:
• Cámaras de pequeño volumen, provistas de
válvulas antirretorno
• Suministro de caudal de fase móvil continuo
• Cambios rápidos de fase móvil
• Posibilidad trabajar en gradiente
Instrumentación

Sistema que permite introducir un volumen conocido de muestra dentro del
sistema a alta presión.
Requisitos:
• Debe introducir la muestra a alta presión sin interrumpir el flujo de
fase móvil.
• El volumen inyectado debe ser reproducible.
• Debe permitir introducir pequeños volúmenes de muestra (µL) y
poder variarlos
• No debe cambiar la resolución del sistema.
• Debe trabajar a altas presiones sin fugas.
Tipos de inyectores
• Inyectores de jeringa
• Válvulas de inyección
• Inyectores automáticos
Instrumentación
Inyectores de jeringa:
Depositan en cabecera de columna un pequeño volumen de muestra

mediante una jeringa que atraviesa una membrana de caucho que hace de
sello (septum)
Ventajas:
• Baratos
• Fáciles de construir
• Muy buenas eficacias
Inconvenientes:
• Bajas reproducibilidades
• Fugas a presiones elevadas
• Sobrepresión por acumulación
de fragmentos septum
• Cambio frecuente del septum
• Adsorción de solutos
• Disolución del septum
Instrumentación
Válvulas de inyección:
Es el sistema de inyección más generalizado. El sistema generalmente es una

válvula de seis vías
Varios diseños:
• Espira externa: volúmenes de 5µL – 100 mL
• Espira interna: volúmenes 100-1000 nL
Instrumentación
Válvulas de inyección:
Características:
• Permite trabajar a altas presiones
• Da inyecciones muy reproducibles.
• Fácil cambio del volumen de muestra, cambiando espira (bucle)
Instrumentación
Inyectores automáticos.
• Basados en una válvula de inyección actuado por un sistema robótico

• Son mucho más caros: uso en análisis de rutina con elevado número de
muestras o sistemas automatizados de optimización de procesos
Características:
• Elevada repetibilidad y facilidad de uso
• Adición automática de reactivos.
• Extracción on line
• Control de la temperatura de inyección
Instrumentación
Consideraciones prácticas
• Para alta reproducibilidad, cargar la espira a rebosamiento (al menos 2-3

veces el volumen nominal) o con un volumen inferior a ½ del volumen
nominal.
• La muestra se diluye en fase móvil al inyectarla. Supone una inyección
exponencial más que en forma de tapón. No es importante si el volumen
de inyección es menor que el 20% del volumen de elución del pico. No
suele haber problemas en columnas convencionales, pero sí en las
nanobore.
• Conviene inyectar las muestras en fase móvil o en un disolvente con
menor fuerza que ésta y miscible con ella. Así se acumula en cabecera
de columna, reduciendo la anchura de pico. En caso contrario, se
producen variaciones del tiempo de retención, ensanchado de picos y
dobles picos a volúmenes de inyección altos.
Instrumentación
Columnas
Es la parte esencial del cromatógrafo de líquidos ya que en ella, a través de
los diferentes mecanismos, tiene lugar la separación o discriminación entre
analitos e interferentes.
Rellenos de la columna
Relleno clásico Relleno pelicular

Instrumentación
Efecto del tamaño de

partícula sobre la
resolución
Efecto del tamaño de partícula

sobre la altura equivalente a
un plato teórico
Instrumentación
Eficiencia teórica y presión de operación relativa para columnas de

cromatografía de líquidos convencionales
Longitud de Diámetro de Número de Platos por Presión de

columna, cm partícula, µm platos metro operación relativa
50 20 12 500 25 000 0.5
25 10 12 500 50 000 1.0
10 10 5 000 100 000 0.25
25 5 25 000 100 000 4.0
15 5 15 000 100 000 2.4
5 5 5 000 167 000 0.8
15 3 25 000 167 000 6.7
10 3 16 700 167 000 4.4
5 3 8 300 167 000 2.2
3 3 5 000 167 000 1.3
3 2 7 500 250 000 3.0
Instrumentación
Componentes de la columna
Tubo, sistemas de conexión, fritados y

relleno cromatográfico
Características tubo:
• Químicamente inerte
• Mecánicamente resistente
• Diámetro interno homogéneo
• Material : acero inox o PEEK
Características de los filtros

• Espesor y porosidad adecuados para no
producir ensanchamientos excesivos de la
banda cromatográfica
• Material químicamente inerte: titanio, acero
inox o PEEK
Instrumentación
Conexiones:
• Deben evitar cambios bruscos de sección.
• Poderse desmontar fácilmente para cambio de columna
• Tener un volumen muerto nulo.
Conexión de volumen muerto cero

Instrumentación
Dimensiones de las columnas.

• Diámetros internos típicos de 4.6 – 5 mm
• Longitud de 5 a 30 cm
• Empaquetadas con partículas microporosas o poliméricas
de 3, 5, 7, 10 o 20 µm de diámetro.
• Flujo: 0.5 – 1.5 ml/min
Tipos de columnas:
Columnas Preparativas (dc >10 mm)
Columnas Semipreparativas (5 mm < dc < 10 mm)
Columnas Analíticas (2 mm < dc < 5 mm)
Microcolumnas
• Columnas de pequeño diámetro o “microbore” (0.5 mm < dc < 2 mm)
• Columnas capilares rellenas (dc < 0.5 mm)
• Columnas capilares abiertas (dc ≈ 3-10 µm)
Instrumentación
Termostatización.
• La temperatura no es una variable clave para la resolución cromatográfica
en HPLC.
• La temperatura afecta a la solubilidad de los solutos en la fase móvil, a la
difusión de los mismos y a la viscosidad de la fase móvil.
• El tiempo de retención cambia: un incremento de 5-6° C puede originar
una reducción del 25-30% en los tiempos de retención.
• Conveniente el control de la temperatura, en especial en la columna
cromatográfica, al objeto de obtener resultados reproducibles
Precolumnas.
• Columnas cortas, de relleno similar a la columna.
• Protege la columna analítica: evita su disolución y acumulación de
material absorbido.
Instrumentación
Detectores
dispositivo que permite medir en todo momento, a la salida de la columna,
una propiedad física del efluente que depende de su composición.
Clasificación.
Detectores que monitorizan una propiedad específica del soluto no
compartida por el disolvente (p. ej. absorbancia o fluorescencia)
Detectores que monitorizan una propiedad global del efluente (p. ej.
índice de refracción, conductividad)
Detectores que funcionan separando el soluto del efluente, permitiendo
la detección por técnicas como la Espectrometría de Masas.
La elección del detector viene dictada por

las propiedades de los solutos
la información requerida
la sensibilidad requerida en el análisis.
Instrumentación
Características de los detectores

a) Características del detector que no afectan a la eficacia de la columna
Respuesta: es la señal producida por el detector a una determinada
variación de la propiedad física del eluente que puede ser medida. Es
proporcional a la variación de la masa del soluto por unidad de tiempo a
la salida de la columna o a su concentración.
Ruido del detector: es cualquier perturbación de la señal producida en el
detector no provocada por la salida de un soluto de la columna.
Ruido : perturbación de la línea base cuya frecuencia es mayor o igual
que la inversa del ancho de pico del soluto expresada en segundos.
Deriva: es una perturbación de la línea base cuya frecuencia es menor
que la inversa del ancho de pico del soluto expresada en segundos.
Instrumentación
Línea base con ruido y deriva
Sensibilidad: variación de respuesta del detector ante un cambio en la

cantidad de soluto que llega a este.
Se define como la razón entre la variación de la señal y la variación de la
concentración del componente que lo originó
=

Se expresa en = o en función de la señal que se genera
. .

Instrumentación
Intervalo dinámico del detector: intervalo de concentraciones de soluto

entre las cuales se produce respuesta dependiente de la concentración de
soluto a la salida de la columna.
Límite de detección
• Es la menor cantidad de soluto que se puede detectar
• El límite inferior del intervalo dinámico lineal
• Se define como la concentración de sustancia que da una señal 3
veces el ruido de fondo.
• El valor exacto del LOD depende de la señal fondo y de la sensibilidad:
!" .#. ! × %& ' ( ' #

= =
' ' ' ' '% ' % (
Instrumentación
b) Características del detector que pueden modificar a la eficacia de la

columna
Volumen de célula: si el volumen de la célula de medida es demasiado
elevado el pico se ensancha. Columnas analíticas, 8 µL; columnas
microbore, < 1 µL.
Constante de tiempo: velocidad de respuesta del detector. Si es lento,
ensancha picos. Columnas analíticas, 100 ms; columnas microbore, 10-20
ms.
Célula UV en Z
Instrumentación
Características de un detector continuo empleado en HPLC

Alta sensibilidad (del orden de 10-12 -10-11 g/mL) lo que implica un bajo
ruido fondo.
Respuesta universal a todos los solutos, a no ser que se requiera una
selectividad hacia determinadas sustancias.
Amplio intervalo lineal (unos 5 ó 6 órdenes de magnitud)
Volumen adecuado de célula.
No destructivo, en caso que se requiera recoger fracciones.
Insensible a cambios ambientales: presión, caudal, temperatura, etc. Es
importante que sea insensible al cambio en la composición de la fase
móvil en la modalidad gradiente.
Operar continuamente a lo largo del tiempo y su empleo debe ser fácil y
cómodo para el analista.
Posibilidad de automatizar para incorporarlo a los instrumentos HPLC
comandados por un microprocesador
Instrumentación
(1). Detectores espectrofotométricos
• Basados en la absorción UV-visible por las moléculas del soluto. Por

tanto, monitorizan una propiedad del soluto.
• Son los más frecuentemente usados.
• No son universales, pero hay un gran número de sustancias que
absorben esta radiación.
• Célula con un volumen mínimo (unos pocos µL) y l paso óptico largo para
conseguir la máxima sensibilidad. Un diseño muy utilizado es la
diseñada en forma de Z.
Tipos:
• Detector de longitud de onda fija
• Detector de longitud de onda variable
• Detector de matriz de fotodiodos (Diode
array detector)
Instrumentación
Detector espectrofotométrico UV de longitud de onda variable

Características
• Posibilidad trabajar dos λs

• Posibilidad de realizar un barrido
espectral rápido del soluto.
• Amplio intervalo de respuesta
lineal.
• Baja sensibilidad a la temperatura
y a los cambios de flujo.
Instrumentación
Detector espectrofotométrico UV de matriz de fotodiodos (Diode array

detector)
Características
• Posibilidad realizar cromatogramas

a varias longitudes de onda
• Realiza espectros del compuesto a
lo largo del pico.
• Obtención de un registro
tridimensional de la muestra
Instrumentación
Detector espectrofotométrico UV de matriz de fotodiodos (Diode array

detector)
Ventajas
• Comprobar la presencia del compuesto.
• Detectar cada compuesto a su longitud de onda máxima en una sola
inyección (máxima sensibilidad)
• Ampliación intervalo dinámico de trabajo (calibrando a distintas
longitudes de onda)
• Comprobar pureza espectral de los picos cromatográficos.
Instrumentación
(2). Detectores de fluorescencia molecular.

• Un cierto número de compuestos químicos presentan fluorescencia: pueden
absorber la radiación a una determinada longitud de onda y emitir radiación
fluorescente a una longitud de onda más larga
• Las especies más fluorescentes son sistemas cíclicos con un alto grado de
conjugación: hidrocarburos poliaromáticos, quinoleínas, esteroides, alcaloides, etc.
• Límites de detección bajos
• Posibilidad de derivatización para aumentar la aplicabilidad.
Instrumentación
(3). Detectores electroquímicos.
Se basan en la medida de una propiedad eléctrica del eluato o del

efluente, mediante el uso de electrodos de diferente naturaleza.
Tipos: amperométricos y conductimétricos
(a) Detectores amperométricos y culombimétricos

• Se basan en la medida de la intensidad de corriente eléctrica generada
al paso del soluto por la célula del detector donde se le aplica un
potencial dado a través de un electrodo (denominado de trabajo)
• La técnica es sensible y selectiva, pudiéndose aplicar sólo a sustancias
que pueden oxidarse o reducirse sobre un electrodo (sustancias
electroactiva)
thin layer Wall jet

Instrumentación
Ejemplos de sustancias que pueden detectarse amperométricamente
Reducción Oxidación
Aminas aromáticas Cetonas
Oximas Fenoles y polifenoles
Mercaptanos Nitrilos y alquenos
Peróxidos Catecolaminas
Carbohidratos Aldehídos
Alcoholes
Sustancias con grupos nitro
Ventajas
- Volumen pequeño de la célula de detección (0.1-1 µL)
- Alta sensibilidad, comparada a la de la detección espectrofotométrica (10
veces superiores).
- Alta selectividad: bajo número de sustancias electroactivas, selección del
potencial de trabajo.
Instrumentación
Limitaciones
- Necesidad de una fase móvil conductora de la electricidad por la
presencia de tampones electrolíticos.
- Sensibilidad a cambios en el caudal, pH, fuerza iónica, temperatura, etc.
No es por tanto recomendable en gradiente.
- Dependencia de la señal del estado de la superficie del electrodo de
trabajo (adsorciones, pasivaciones, deterioro físico)
Detector culombimétrico
• Puede alcanzar sensibilidades comparables a la detección fluorescente

(10-100 veces mejores que los amperométricos)
Instrumentación
(b) Detectores conductimétricos

• Se basan el registro continuo de la conductividad eléctrica del efluente
puede usarse para detectar las especies que se eluyen.
• Monitoriza una propiedad del efluente
Ventajas
• Volumen pequeño de la célula de detección (1 µL)
• Se pueden detectar tanto cationes como aniones inorgánicos u orgánicos
Inconvenientes
• Fases móviles acuosas de electrolitos: alta conductividad, reduce
sensibilidad.
• Sensible a la temperatura: termostatizar.
Instrumentación
(4) Detectores refractométricos.
• El fundamento de estos detectores es la medida en continuo y de forma

diferencial (en relación a un líquido usado como referencia, que
normalmente es el propio eluente) del índice de refracción del efluente.
• Este permanecerá constante mientras que salga sólo eluente de la
columna, pero sufrirá una modificación cuando se eluye un soluto junto
con él.
• Monitoriza una propiedad del efluente.
Instrumentación
Ventajas
• Son universales: detectan casi todas las sustancias
Inconvenientes
• Poco sensible (µg) y no trabaja en gradiente
• Sensible a la temperatura y presión: exige una estabilización perfecta de la
temperatura del detector y de la columna
Instrumentación
(5) Cromatografía de líquidos espectrometría de masas (LC-MS) .

• Permite resolver con suficientes garantías los problemas de identificación
y cuantificación de sustancia orgánicas y organometálicas
• La detección cromatográfica mediante espectrometría de masas se basa
en la separación de los fragmentos de masa formados en el detector de
los analitos separados en la columna.
• La interfaz del espectrómetro de masas convierte el efluente líquido
procedente del sistema hplc en un haz de iones en estado gaseoso.
ventajas:
Estima masas mejor que cualquier otra técnica.
Es muy sensible.
Proporciona información estructural de los analitos.
Da confirmación cualitativa del compuesto eluido.
Inconveniente
Es destructivo.
Instrumentación
ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS)
El espectro de masas se obtiene convirtiendo los compuestos que integran la muestra

en iones, y resolviéndolos en base a su relación masa/carga, m/e
Sistema de Fuente de Analizador

Detector
entrada iones de masas
Sistema de Sistema de Sistema de

vacío vacío vacío
Procesador
de señales
Sistema de
lectura
Instrumentación
Fuente de iones
Fuente de iones de impacto electrónico
Instrumentación
Analizadores de masas
Analizador de Sector magnético Analizador cuadrupolar
Analizador de tiempo de vuelo (TOF)

Instrumentación
Detector
Detector multiplicador de electrones
Ganancias: 105-107 electrones/Ión

Instrumentación
Acoplamiento LC-MS
Flujo de fase móvil:
Flujo de líquido LC: 1 mL/min

equivale a 100-200 mL/min de Flujo entrada MS: 1 mL/min
gases
Características de la fase móvil:

disolvente orgánicos y agua, compuestos inorgánicos no
volátiles.
Características de los compuestos eluídos:

moléculas complejas de baja volatilidad, elevada polaridad y
termolábiles, difíciles de analizar mediante sistema
convencionales de MS
De introducción
Interfases
De introducción e ionización
Instrumentación
Interfaces de introducción
Haz de partículas (particle bean interface, PB)
Instrumentación
Enriquecimiento en la aproximación de haz molecular (PB)

Instrumentación
Interfaces de introducción e ionización
Ionización a presión atmosférica electrospray (atmospheric pressure ionization,

API-ES)
• Trabaja a flujos convencionales de LC: 1-2 mL/min

• Aplicable a analitos volátiles y no volátiles: Necesidad de ionizarse
• Puede crear iones de carga múltiple: Puede analizar moléculas de alto peso
molecular
• Ionización suave: no espectros
Instrumentación
Interfaces de introducción e ionización

Ionización química a presión atmosférica (atmosferic pressure chemical
ionization, APCI)
• Se produce la ionización química a presión atmosférica

• El efluente es vaporizado mediante un nebulizador calentado
• El vapor del disolvente actúa como reactivo de ionización
• Los analitos deben tener una afinidad protónica suficiente.
• Puede trabajar a flujos entre 0.2 y 2.0 mL/min
Instrumentación
Modos de operación
• Modo barrido (SCAN): se captura todo el espectro, pudiendo caracterizar

el compuesto eluido
• Modo selección de masas (SIM, selected ion cromatogram): sólo se
seleccionan masas características del analito.
La medida es más sensible
eliminan interferencias coeluidas, si los interferentes salen a masas
distintas
Cromatografía de adsorción
Cromatografía de reparto
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de exclusión molecular
Cromatografía de adsorción
• La fase estacionaria es un sólido adsorbente polar de gran área
superficial.
• Los centros activos polares situados sobre la superficie del sólido
interaccionan con los grupos funcionales polares de los compuestos a
separar.
• Cuanto mayor es la polaridad del compuesto, mayor es su interacción con
la fase estacionaria.
TEORÍA DE RETENCIÓN
Mecanismo de desplazamiento
competencia, entre soluto y fase móvil, por los puntos activos de la
superficie de la fase estacionaria
Factores que afectan al equilibrio
Cantidad de puntos activos sobre la superficie de la fase estacionaria.

La fuerza eleutrópica (ε⁰) de la fase móvil (fuerza de adsorción del
eluyente sobre la fase estacionaria)
Relación de fases: fase móvil adsorbida/fase móvil sin adsorber.
El soluto.
FASES ESTACIONARIAS
Sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3.x H2O)
superficie específica • Número de puntos activos presentes en la

tamaño de poro de la superficie de la fase estacionaria
partícula. • Puntos activos al alcance de las moléculas
del soluto
Gel de sílice
• Superficie altamente activa de grupos silanoles (Si-O-H).
• Los grupos silanoles pueden desactivarse lentamente por adsorción de agua
superficial. Activación: calefacción a unos 200 °C. Una calefacción a 400 °C:
deshidratación con formación de un enlace siloxano, cromatográficamente inactivo
• Orden en los tiempos de retención en los solutos: alquenos < hidrocarburos

aromáticos < haluros, sulfuros < éteres < nitroderivados < ésteres ≈ aldehídos ≈
cetonas < alcoholes ≈ aminas < sulfonas < sulfóxidos < amidas < ácidos
carboxílicos
FASES MÓVILES
• En CLS el disolvente compite con los solutos por los centros activos de la
fase estacionaria
• La elución puede describirse como un desplazamiento del soluto por el
disolvente.
• Cuanto más intensa sea la interacción disolvente-fase estacionaria, más
tiempo pasará el soluto en la fase móvil y, en consecuencia, más
rápidamente será eluido.
• La capacidad eludora de los distintos disolventes es casi independiente
de la naturaleza del soluto.
• La variable a controlar en cromatografía de adsorción, es el disolvente.
serie eleutrópica
agua > metanol > etanol > acetona > acetato de etilo > cloroformo > benceno
> tolueno > tetracloruro de carbono > ciclohexano > hexano
Propiedades de los disolventes empleados en cromatografía de adsorción

Fuerza eleutrópica (ε⁰) de varias mezclas de dos disolventes

Limitaciones de la cromatografía de adsorción

Necesidad de control estricto de la composición fase móvil, en especial
trazas de agua
Necesidad de mantenimiento de nivel de hidratación constante de la fase
estacionaria
Fenómenos de retenciones irreversibles o semiirreversibles con solutos
de elevada polaridad
Picos con asimetrías en cola por las altas retenciones.
APLICACIONES
Separación de moléculas que difieren en la naturaleza química o en el
número de grupos activos
Capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas
Cromatografía de reparto
• El tipo de cromatografía más usado en HPLC

• La fase estacionaria es un segundo líquido inmiscible con la fase móvil
líquida.
• Soportes sólidos: gel de sílice, tierra de diatomeas y celulosa.
• Problema: arrastre fase estacionaria por la fase móvil
FASES ENLAZADAS QUÍMICAMENTE

Preparación: reacción de un compuesto órgano clorosilano con los grupos –

OH formados en la superficie de partículas de sílice, por hidrólisis en ácido
clorhídrico diluido caliente.
Tipos de cromatografías en fase enlazada
• Cromatografía en fase normal:

la fase estacionaria polar y la fase móvil es relativamente no polar
(hexano o i-propil éter)
• Cromatografía en fase inversa:
la fase estacionaria es apolar, en muchos casos hidrocarburos, mientras
que la fase móvil es un disolvente polar (agua, metanol, acetonitrilo,
tetrahidrofurano)
Cromatografía en fase normal

FASES ESTACIONARIAS • grupo ciano (-C2H4CN),
• diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH),
• amino (-C3H6NH2)
• dimetilamino [-C3H6N(CH3)2].
mecanismo de separación:
• adsorción del soluto en la fase estacionaria.
• interacción del soluto con el grupo funcional de la molécula orgánica
ligada al soporte
FASES MÓVILES n-hexano, etiléter, cloroformo y cloruro de metileno
el componente menos polar eluye primero

al aumentar la polaridad de la fase móvil disminuye el tiempo de elución
Cromatografía en fase inversa

FASES ESTACIONARIAS • Fenol (-C6H5)
• Octil (-C8H17)
• Octadecil (-C18H37)
FASES MÓVILES Agua con modificadores orgánicos (metanol,
acetonitrilo) y tampones para controlar el pH y la
retención.
el componente más polar se retiene menos
al disminuir la polaridad de la fase móvil disminuye el tiempo de elución
A mayor longitud de la cadena hidrocarbonada, mayor retención
mecanismo de separación:
• reparto entre dos fases líquidas
• adsorción del soluto en la fase estacionaria.
Mecanismo de reparto
• La molécula orgánica ligada al relleno se comporta como un líquido o un
cuasi-líquido
• El soluto experimentará un reparto entre la fase móvil y la estacionaria
atendiendo exclusivamente a la polaridad de las fases en juego.
Mecanismo de adsorción
• Adsorción del soluto sobre las moléculas orgánicas sobre la superficie
del soporte
• Interacciones de tipo inespecífico: solvóforo.
• El soluto es expulsado de la fase móvil contra la fase estacionaria,
formándose el complejo soluto - fase estacionaria.
Evitar interacciones específicas del soluto sobre posiciones activas del

soporte no desactivadas: controlar por la fase estacionaria o desactivarlas
Limitación: en fases enlazadas con base silícea el pH del eluyente 2 <pH < 8
Reducción del volumen libre
Fuerzas de van der Waals entre especies

químicas
Interacción electrostática con el

disolvente
Interacción de van der Waals con el

disolvente
Reducción de la cavidad en el disolvente

Efecto de la longitud de la cadena hidrocarbonada
Tamaño de partícula: μm.

Fase móvil: 50/50 metanol/agua. Caudal 1 mL/min
Efecto de la desactivación (capped) de la sílice sobre el cromatograma

APLICACIONES
Como norma, las separaciones cromatográficas se realizan haciendo coincidir
la polaridad del analito con la de la fase estacionaria, para luego emplear
una fase móvil de polaridad muy distinta
Campo Mezclas habitualmente separadas

Farmacéutico Antibióticos, sedantes, esteroides y analgésicos
Bioquímica Aminoácidos, proteínas, carbohidratos y lípidos
Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas y
Alimentos
aditivos
Aromáticos condensados, agentes tensoactivos,
Compuestos industriales
agentes propulsores y colorantes
Contaminantes Plaguicidas, herbicidas, fenoles, PAHs y PCBs
Química forense Drogas, venenos, alcohol en sangre y narcóticos
Sales biliares, metabolitos de medicamentos, extractos
Medicina clínica
de orina y estrógenos.
Cromatografía de sustancias iónicas o ionizables

Cromatografía de supresión iónica
Cromatografía de par iónico
Cromatografía de supresión iónica
• Se separan así compuestos ácidos o básicos que, en las condiciones
de pH de la fase móvil, forman la especie neutra del sistema ácido
base en el que están involucrados
Cromatografía de par iónico
• Se agrega a la fase móvil una sal orgánica que contiene un contra-ion
orgánico grande, como un ion de amonio cuaternario o alquilo
sulfonato, como un reactivo de emparejamiento iónico
• Mecanismos
• el contra-ion forma un par iónico sin carga con el ion del soluto
de carga opuesta en la fase móvil.
• la fase estacionaria retiene con fuerza al contra-ion que imparte
su carga a la fase estacionaria
I TSA
II TMS
III DTDBA
Columna: Spherisorb C18, 5µm

150 × 4 mm
Supresión iónicaI:
60:40 MeOH:H2O, HAc 0,02 M
Pares iónicos:
50:40 MeOH:H2O,
TEAP 0,002 M pH 4,8 (HClO4)
Cromatografía de cambio iónico
Se basa en el equilibrio de los iones de soluto entre el disolvente y los

sitios cargados en la fase estacionaria
Esta consta de una matriz (R) con grupos funcionales cargados (A) y
contraiones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse con
especies de la misma carga contenidas en la fase móvil (X)
R–A– M+ + X+ R–A– X+ + M+ (intercambio catiónico)

R–A+ M– + Y– R–A+ Y– + M– (intercambio aniónico)
FASES ESTACIONARIAS
Resinas de cambio iónico

Sílice modificada
• Estructura tridimensional de carácter poroso.

• Partículas esféricas
• Grado de entrecruzamiento varía con la proporción de divinilbenceno,
le da mayor rigidez, tamaño de poro pequeño, mayor selectividad.
Cambiadores catiónicos
- Fuertes: ácido sulfónico, -SO3-H+. Todo el margen de pH
- Débiles: ácidos carboxílicos – CO2-H+ pH 5-14
Cambiadores aniónicos
- Fuertes : sales de amonio cuaternario, -R3N+Cl-.
- Débiles : aminas ternarias: -R2NH+Cl-
FASES MOVILES
Mecanismo de la separación
* , *
+
Mn+ + n R-X+ R-M + n X+ ) = * ,* +
Disolución un ácido u otro catión que interaccione con la fase estacionaria y

desplace al ion del analito.
La velocidad de desplazamiento de iones M+ depende del pH del eluyente y
del valor de Kd.
Iones con diferentes afinidades por la resina (diferentes valores de Kd) se
desplazarán a diferente velocidad.
A mayor Kd, mayor retención
• Solubilizar la muestra
• Tener fuerza disolvente que conduzca a tiempos de retención
razonables
• Interaccionar con los solutos de forma que favorezca la selectividad
(uso de modificadores orgánicos)
CROMATOGRAFÍA IÓNICA
Usa un detector de conductividad
Responde de manera universal a especies cargadas, sensible,
responden de manera predecible a los cambios de concentración
Problema: alta conductividad de las fases móviles enmascara la
señal del analito.
• Cromatografía iónica basada en supresores
Columna a supresora de la conductividad del eluyente, que se coloca

inmediatamente después de la columna de intercambio
• Cromatografía iónica en columna única
fases móviles de baja concentración iónica que tienen baja conductividad

que permiten la medida de la conductividad de los analitos.
Cambiadores iónicos de baja capacidad
Desionizador en continuo
(a) Separación de aniones en una

columna de intercambio aniónico.
Eluyente NaHCO3 0.0028M / Na2CO3
0.0023M. Tamaño de muestra 50 μL.
(a) Separación de iones alcalinos en una

columna de intercambio catiónico.
Eluyente: Diclorhidrato de
fenilendiamina 0.025 M / HCl 0.0025
M. Tamaño de muestra 100 μL
Cromatografía de exclusión molecular

cromatografía de filtración en geles: disolventes acuosos y geles
hidrofílicos.
cromatografía de permeación en geles: disolventes no polares y rellenos
hidrófobos
separación y caracterización de sustancias de peso molecular elevado
Las moléculas mas pequeñas

pasan mas tiempo en los poros y
tardan mas en eluirse
Las moléculas mas grandes

pasan menos tiempo en los
poros y eluyen antes
Relación entre el volumen de retención y los volúmenes de la fase estacionaria

y de la fase móvil dentro de la columna
VR = VM + K Ve
VR es el volumen de retención, VM el volumen muerto, Ve el volumen de fase
estacionaria y K la constante de distribución
En cromatografía de exclusión molecular:

• VM se denomina generalmente volumen intersticial, V0, volumen de fase
móvil que está en el exterior de la matriz porosa,
• Ve es el volumen de fluido contenido en los poros de la matriz, y suele
representarse por Vi.
+ − + − .
)= =
'
Límite de exclusión: peso

molecular de una especie por
encima del cual no existe
retención, es excluida.
Límite de permeabilidad: peso

molecular por debajo del cual las
moléculas del soluto pueden
penetrar completamente en los
poros, salen todas juntas.
Curva de calibrado y cromatograma de exclusión molecular

Curvas de calibracion
obtenidas representando
el tiempo de retencion
frente al peso molecular
Tipos de geles
Sustancia químicamente inerte
mecánicamente estable
tamaño de partícula uniforme
estructura de poros perfectamente reproducible
Geles de dextrano
• Insoluble en agua
• Hidrofílico
Geles de poliacrilamida
• Insoluble en agua
• Hidrofílico
• menos resistentes a los álcalis
• Desnaturalización grupos amida
Gel de estirenodivinilbenceno
• Hidrofobos
• Uso con disolventes orgánicos
Gel de sílice
• gran rigidez, estabilidad frente mayoría disolventes (incluso acuoso).

• retención de solutos por adsorción, capacidad de catalizar degradación
de proteínas
Tipo Tamaño de Tamaño medio de poro, Límite de exclusión
partícula, µm Å
Poliestirenodivinilbenceno 10 102 700
103 (1 a 20)×104
104 (1 a 20)×104
105 (1 a 20)×105
106 (5 a >10)×106
Sílice 10 125 (1 a 5)×104
300 (0.03 a 1)×105
500 (0.05 a 5)×105
1000 (5 a 20)×105
Aplicaciones
• Separación de dos grupos de sustancias con pesos moleculares muy diferentes
(desalinización).
• Fraccionamiento de mezclas más o menos complejas de diferentes materiales,
como péptidos, ácidos nucleicos, enzimas, polisacáridos, etc.
• determinación de pesos moleculares
(a) Separación de ácidos grasos. Columna de (b) Análisis de una resina epoxi comercial (n=
poliestireno 7.5 x 600 mm con un límite de número de unidades monoméricas en el
exclusión de 1000. Fase móvil tetrahidrofurano. polímero). Columna de sílice porosa 6.2 x 250
Caudal 1.2 mL/min. Detector: índice de mm. Fase móvil tetrahidrofurano. Caudal 1.3
refracción mL/min
Cromatografía quiral.
Diferenciación de enantiómeros
Metodologías
Transformación, mediante un reactivo quiral, en diasteroisómeros:

separación por fase inversa
problemas: reacciones laterales, disponibilidad de reactivos quirales de pureza
controlada, procedimiento largo y laborioso
Utilización de una fase estacionaria quiral.
Inmovilización de un enantiomero particular en la fase estacionaria
Uso de aditivos quirales en la fase móvil.

Permite la utilización de columnas estándares
Cromatografía quiral.
Columna: Chirobiotic™ T
Glicoproteína enlazada
sobre sílice.
Fase móvil: 1:1 Etanol :

agua
Cromatografía de afinidad.
• Se basa en la interacción específica entre una molécula, o grupo de
moléculas, y un ligando que se fija a la fase estacionaria para
interaccionar con las del soluto.
• Esta interacción específica es la base de la separación.
• Cromatografía de bioafinidad
La retención en cromatografía de bioafinidad se debe a uniones

complejas que incluyen: fuerzas de van der Waals, puentes de
hidrógeno, fuerzas hidrofóbicas, dipolo-dipolo, de transferencia de
carga o electrostáticas.
La orientación espacial adecuada de los grupos facilita una elevada
combinación de fuerzas, lo que constituye la base de su elevada
selectividad y especificidad del enlace
Cromatografía de inmunoafinidad, basada en el reconocimiento entre

antígenos y anticuerpos
Esquema de la cromatografía de inmunoafinidad

Técnicas de impresión molecular (molecular imprinting)

preparación sintética de rellenos cromatográficos para el reconocimiento
y análisis selectivo de una o varias sustancias.
CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE UN MODO DE SEPARACIÓN

CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE UN MODO DE SEPARACIÓN

SEPARACIÓN EN RÉGIMEN ISOCRÁTICO Y EN GRADIENTE

Fuerza eluyente o poder de elución de una fase móvil a su capacidad de eluir
un soluto dado desde una fase estacionaria determinada.
Un disolvente B tendrá mayor poder eluyente que otro disolvente A si el
soluto tiene un factor de retención menor en la misma columna cuando
se emplea B que cuando se emplea A.
• Eluyentes fuertes: fuerza eludora alta
• Eluyentes débiles: fuerza eludora baja
Modificando la fuerza del eluyente, podemos modificar de forma
considerable la retención de las sustancias y también la duración del
análisis
Tipos de elución
Elución isocrática: la fuerza eludora de la fase móvil permanece constante durante la
separación.
Elución en gradiente: se hace variar el poder de elución de la fase móvil a lo largo
del análisis cambiando la composición de la fase móvil que entra en la columna, de
acuerdo a un programa establecido
Separación isocrática en HPLC de una mezcla de compuestos aromático
1. alcohol bencílico,
2. Fenol
3. Dimetoxiacetofenona
4. Benzoína
5. benzoato de etilo
6. Tolueno
7. Dimetoxitolueno
8. o-metoxibifenilo.
columna Hypersil ODS (5 µm), 0.46x25 cm, caudal de 1.0 ml/min a temperatura ambiente
Fase móvil: tampón KH2PO4 25mM+0.1 g/l azida sódica a pH 3.5 con HCl (A) y acetonitrilo (B)
Separación en gradientede una mezcla de compuestos aromático
Programa del
gradiente
Sistemas de generación de gradientes
Alta presión Baja presión

CROMATOGRAFÍA DE GASES
La cromatografía de gases (CG) incluye todos los sistemas cromatográficos en
los que la fase móvil es un gas
Uso • Compuestos volátiles.

• Estables térmicamente
Cromatografía gas-sólido (GSC)

• Se basa en una fase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los
analitos como consecuencia de la adsorción física
• Aplicación limitada: retención semipermanente de las moléculas activas o polares y
a la obtención de picos de elución con colas
• Aplicación separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular.
Cromatografía gas-líquido (GLC)

• se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida
inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte.
Introducción
Principios básicos
Comparación CG-CL
• Las interacciones entre las moléculas de los gases son débiles. La fase móvil no
interacciona con las moléculas de analito, siendo su función únicamente el
transporte del analito a través de la columna.
• Los gases difunden entre sí mucho mejor que los líquidos, lo cual influye en la
resolución y en la velocidad de separación. Por otra parte, y como consecuencia de
la mayor difusividad de los gases, el equilibrio de separación se alcanza más
rápidamente.
• Las propiedades superficiales de los líquidos también influyen sobre sus
características cromatográficas. Esto no ocurre en cromatografía de gases.
• La mayor densidad de los líquidos respecto a los gases permite usar la gravedad o
la fuerza centrífuga como fuerza motriz de la fase móvil, mientras que la pequeña
viscosidad de los gases, hace posible el empleo de columnas más largas.
Introducción
Principios básicos
• Debido a la compresibilidad de los gases, es más aconsejable utilizar volúmenes de
retención en lugar de tiempos de retención
= =
Donde F es el flujo promedio de la fase móvil
−
=
F , caudal promedio; Fm , caudal medido; Tc , temperatura de la columna (K); Ta ,

temperatura en el medidor (K); P : presión del gas a la salida de la columna;
PH2O: presión de vapor del agua a la temperatura Ta
• VR y VM, dependen de la presión media en el interior de la columna
volúmenes de retención corregidos,
= =
Introducción
j es el llamado factor de compresibilidad
⁄ − Pi y P0 la presión en el interior y en el exterior de la

= columna
⁄ −
volumen neto, VN = −
volumen de retención específico, Vg,

=
Tc es la temperatura de la columna, m la masa, en gramos, de la fase estacionaria
Ρs, densidad del líquido en la fase estacionaria.

=
El factor 273/Tc corrige Vg a la temperatura de
referencia de 273 K
• parámetro característico con fines de identificación.

• la constante de distribución depende marcadamente de las presiones
de vapor de los componentes, y éstas, a su vez, de la temperatura
Introducción
Requisitos que deben cumplir las muestra para su análisis directo por CG:
• Compuestos en estado gaseoso, o bien en estado líquido y sólido con presiones de
vapor de por lo menos 0.3 mm de mercurio a la temperatura máxima de la fase
estacionaria empleada.
• No descomponibles por el calor a la temperatura de la separación.
• No adsorbibles o descomponibles en el soporte sólido de la columna
• Detectables a la salida.
Se pueden analizar muestras que no cumplen estos requisitos si:

• Obtención de derivados volátiles mediante reacciones apropiadas (aminoácidos y
azúcares)
• Muestreo de productos por descomposición pirolítica
• Derivatización de los solutos para hacer posible su detección
Instrumentación
Descripción del cromatógrafo de gases
• Fuente de gas inerte.

• Sistema de introducción de muestra
• Columna cromatográfica, dentro de un horno termostatizado por aire
• Sistema de detección
• Sistema de adquisición y registro.
Instrumentación
Fuente de gas inerte

• Función: arrastrar a los solutos a lo largo del sistema cromatográfico.
• No tienen influencia en los procesos de adsorción-desorción o de partición: no
afecta a la selectividad.
• Los términos de difusión en la fase móvil de la ecuación de van Deemter sí
dependen de la naturaleza del gas portador
• He, N2, H2, Ar: la elección dependerá fundamentalmente del detector empleado
Instrumentación
• Fuentes de gas: cilindros de gas comprimido de elevada pureza, capaces de

suministrar una presión de gas adecuada y constante.
• Se debe eliminar las trazas de impurezas que puede llevar el gas.
• Control de la velocidad del gas portador a lo largo de la columna se realiza
mediante válvulas que mantienen el gas constante (columnas rellenas) o que
mantienen constante la presión en cabecera de columna (columnas capilares)
Instrumentación
Función: vaporizar la muestra a analizar e incorporarla en la corriente de gas

portador que se dirige hacia la columna
Requisitos
• La vaporización de la muestra debe realizarse en el menor tiempo posible.
• La vaporización debe realizarse sin discriminar los componentes de la mezcla.
• La muestra debe llegar a la columna como una banda lo más fina posible.
Inyección en columnas empaquetadas

• Admite cantidades relativamente grandes de muestra
• Volumen de inyección: 1-20 µL líquidos.
Instrumentación
• Septum: diafragma perforable de goma de silicona autosellante.

• se calienta a una temperatura suficientemente alta (hasta 300 °C) para
convertir, prácticamente de forma instantánea, la muestra líquida en vapor
Inconvenientes del septum:

• Tiempo de vida limitado: pérdida de flexibilidad y degradación del septum, debido
a la temperatura del inyector y múltiples inyecciónes.
• Degradación del septum que pueden dar lugar a picos falsos o fluctuaciones en la
línea base.
• Efectos de memoria debido su capacidad de adsorción
Instrumentación
Diseño de la cámara
• El volumen de la cámara proporcionado con el tipo de
columna: evita mezclas incompletas o bandas de
muestra excesivamente anchas.
• Necesario evitar la formación de turbulencias en el
paso de la cámara del inyector a la columna.
• Se debe evitar la presencia de volúmenes muertos, no
barridos por el gas portador, para evitar
deformaciones de la banda de muestra.
• El volumen existente entre la cámara del inyector y la
columna debe ser el menor posible, para evitar
ensanchamientos de la banda.
• La temperatura de la cámara debe ser homogénea
para evitar que algún componente sea discriminado.
Inyector on column
Instrumentación
Inyección en columnas capilares

• Admite cantidades pequeñas de muestra
• Volumen de inyección: < 1 µL.
inyector con divisor de muestra

(inyección en Split)
Instrumentación
Inconvenientes sistema split:

• se introduce muy poca cantidad de muestra: aumento del límite de detección
• puede discriminar la muestra: pérdida de parte de los analitos más volátiles
Solución: trabajar en forma splitless

1. La totalidad de la muestra es dirigida hacia la columna que está a una
temperatura inferior al punto de ebullición del componente más volátil de la
muestra.
2. La muestra se condensará en cabecera de columna, actuando el disolvente
condensado en la columna como una trampa donde se concentran todos los
componentes de la mezcla (efecto solvente).
3. Se abre a la atmósfera una válvula de purga que elimina el disolvente vaporizado
y se comienza el programa de temperaturas para realizar el análisis.
Ventajas sistema splitless:

• no hay división de la muestra, se incrementa mucho la sensibilidad de la medida,
adecuado para análisis de trazas
• la acumulación de la muestra en cabecera de columna reduce la pérdida de
eficacia.
Instrumentación
Inyector automático
• Más precisos que la inyección manuela: tienen reproducibidad mecánica

• La operación que no requiere atención personal, libera al operador para otras
actividades
• Encarece el equipo.
Instrumentación
Válvula de inyección de gases
• Muestreo de gases en sistemas dinámicos

Instrumentación
Desorción térmica. Sistemas de pulga y trampa

Instrumentación
Inyectores de espacio de cabeza (headspace)

• Análisis directo de compuestos volátiles en muestras sólidas o líquidas.
• Fundamento: analizar una alícuota de la atmósfera que se encuentra en contacto
con la muestra.
• Se determina la fracción vaporizada de componentes que se encuentra en
equilibrio con la muestra
Instrumentación
Instrumentación
Columnas y hornos
• Columnas empaquetadas o de relleno

Longitud: 1-6 m; diámetro interno 2-6 mm, fabricadas en acero inoxidable o vidrio
• Columnas tubulares abiertas o capilares
Longitud: 10-100 m; diámetro interno 0.1-0.6 mm, fabricadas actualmente en sílice fundida.
Más eficaces y rápidas, más empleadas
Necesidad de termostatizar
• La temperatura variable importante en cromatografía de gases

• Las columnas cromatográficas suelen disponerse en rollos de 10 a 30 cm de diámetro, con el
fin de poder colocarlas en el interior de un horno termostatizado.
• Debe operar a temperaturas entre unos 10 ⁰C por encima de la temperatura ambiente y unos
450 ⁰C, con una precisión de 0.1 ⁰C.
• Suelen emplearse temperaturas ligeramente superiores al punto de ebullición medio de la
muestra, para obtener tiempos de elución razonables
• Cuando la diferencias en volatilidad es grande: trabajo en gradiente
Instrumentación
Isoterma a 45 °C
Isoterma a 145 °C
Gradiente 30-180 °C
Instrumentación
Detectores
Son de tipo diferencial: no dan señal cuando pasa por ellos sólo el gas portador, y
responden ante alguna propiedad que puede variar cuando éste se encuentra
mezclado con alguna sustancia que sale de la columna
Características a cumplir
• Adecuada sensibilidad: las sensibilidades de los detectores actuales se
encuentran en el intervalo de 10-8 a 10-15 g de analito/s.
• Buena estabilidad y reproducibilidad.
• Una respuesta lineal de varios órdenes de magnitud.
• Un intervalo de temperaturas de trabajo: temperatura ambiente hasta, al menos,
400 °C.
• Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal.
• Alta fiabilidad y manejo sencillo.
• Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta
selectiva y altamente predecible para una o más clases de analitos.
• No destructivo de la muestra.
• Universales
Tipos
• selectivos
Instrumentación
1. Detector de conductividad térmica (TCD).

• Responde a la diferencia de conductividad térmica existente entre el gas portador
puro y el gas portador mezclado con alguna sustancia.
• La magnitud de la respuesta dependerá de la diferencia de conductividad térmica
entre el compuesto que eluye de la columna y el gas portador
Instrumentación
Detector de conductividad térmica (TCD).

• Gas portador: He o H2 (conductividad unas 10 veces superior a los compuestos
orgánicos)
• El detector universal: responde a compuestos orgánicos e inorgánicos
• No destructivo,
• Sensibilidad: entre 10-6 y 10-8 g/mL
• Intervalo dinámico lineal: aproximadamente 4 órdenes de magnitud
• Sencillo y barato
• Se emplea para el análisis de gases permanentes, hidrocarburos ligeros y otros
tipos de compuestos que dan respuestas poco sensibles en otros tipos de
detectores.
Instrumentación
2. Detector de ionización de llama (FID).

• Detector quizás más utilizado de todos los detectores de cromatografía de gases.
• En la práctica es un detector casi universal, ya que es un detector selectivo al
enlace C-H.
• Responde a los iones generados al quemarse en una llama los compuestos
Instrumentación
2. Detector de ionización de llama (FID).

• Detector es sensible a la masa (número de átomos de carbono en la muestra)
• Grupos funcionales como –C-OH, -C=O, -X, -NH2, originan pocos iones o
prácticamente ninguno. Es insensible al H2O, CO2, SO2 y NOx.
• Sensibilidad elevada: hasta 10-13 g/mL
• Intervalo dinámico lineal: hasta 7 órdenes de magnitud
• Es destructivo.
• Resistente y sencillo.
• Uso casi universal.
Instrumentación
3. Detector de captura electrónica (ECD).

• Detector de alta sensibilidad
• Muy utilizado en el análisis de compuestos a nivel traza.
• El analito captura los electrones emitidos por un emisor β (63Ni y en tritio
adsorbido sobre una lámina de platino o titanio), disminuyendo la corriente
eléctrica.
N2 + e- N2+ + 2 e- Ar + e- Ar+ + 2 e- M + e- M-
Instrumentación
3. Detector de captura electrónica (ECD).

• Gas portador: He, N2 o H2 (libres de agua y oxígeno)
• Respuesta selectiva a compuestos con grupos electronegativos: halógenos, grupos
nitro, peróxidos, quinonas. Respuesta frente a los hidrocarburos: 106 – 107 mayor.
• Muy sensible.
• No destructivos.
• Manejo no sencillo: cambios condiciones experimentales.
• Análisis de muestras de interés ambiental y toxicológico: disolventes clorados,
gases clorofluorocarbonos, pesticidas, herbicidas clorados, hidrocarburos
aromáticos polinucleares.
Instrumentación
4. Detector de nitrógeno-fósforo (NPD) Detector termoiónico de llama.

• La adición de una sal de iones alcalinos a la llama de un detector de ionización
aumenta la respuesta de éste hacia determinados elementos (nitrógeno, fósforo,
azufre)
• Su selectividad depende de parámetros como la temperatura, forma y tamaño de
la llama, la composición de la sal alcalina, geometría del detector, etc.
Instrumentación
4. Detector de nitrógeno-fósforo (NPD)

• Sensibilidad de aproximadamente 10-13 g/s de nitrógeno y 5×10-14 g/s para
fósforo
• Especificidad de 104 frente a compuestos que no presenten estos átomos
• Intervalo dinámico lineal de 4-5 órdenes de magnitud.
• El detector NPD es muy utilizado en medio ambiente, principalmente para la
determinación de plaguicidas, debido a su sensibilidad y especificidad, lo que
permite reducir la limpieza de las muestras.
• Problema: inestabilidad de la respuesta, que requiere calibrados frecuentes
Instrumentación
5. Detector fotométrico de llama (FPD)

• usa una llama de hidrógeno para excitar a un estado electrónico elevado a
fragmentos de moléculas que contienen azufre o fósforo.
• Las moléculas emiten radiación característica de cada uno de los elementos: 392
nm para azufre (S2) y 526 nm para fósforo (HPO).
• La intensidad de la radiación emitida es medida mediante un fotomultiplicador.
• Sensibilidad típica puede ser 10-13 g/s

para fósforo y 10-12 g/s para azufre.
• El intervalo dinámico lineal típico es
de 1000.
• La selectividad de estos detectores
oscila entre 5×105 para fósforo y 103
para azufre
Instrumentación
6. Detector de emisión atómica (AED)

• El eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido con microondas, que se
acopla a un espectrómetro de emisión con series de diodos.
• El plasma es suficientemente energético como para atomizar todos los elementos
de una muestra, excitarlos, y así obtener sus espectros de emisión característicos
Instrumentación
Instrumentación
Acoplamiento CG-MS
Es el caso más favorable de acoplamiento
• La fase móvil (gas inerte) no influye en el espectro de la muestra.

• Es en fase vapor, compatible con la mayoría de las fuentes de iones
El problema es la diferencia de presión de los dos instrumentos:

atmosférica en cromatografía de gases y 10-4-10-5 torr en MS.
Columnas capilares abiertas:

Masa eluida: 5 -100 ng Flujo de entrada de muestra
Anchura de pico: 1 s de un MS: < 1 mL/min
Flujo: 0.5-10 mL/min
Columnas rellenas:
Masa eluida: 0.1-10 µg
Anchura de pico: 5 s
Flujo: 20-40 mL/min
Instrumentación
Necesidad de la interfase GC-MS
proveer una adecuada caída de presión entre los dos

instrumentos.
maximizar la entrada de muestra en el instrumento,
manteniendo la presión adecuada a la fuente de iones
Columnas capilares diámetro < 0.3 mm
• Flujo < 1 mL/min

• Interfases de introducción
• Ionización en la cámara de ionización del
MS
Divisor de régimen abierto (open split)

Instrumentación
Columnas rellenas o capilares diámetro elevado (> 0.3 mm)
Eficacia de la interfaz se mide
Q MS
Rendimiento Y= × 100
QGC
QGC: cantidad de muestra que eluye de la columna
QMS: cantidad de muestra que alcanza el detector
C MS
Enriquecimiento E=
CGS
CMS: concentración de muestra en la cámara de ionización;

QGC: concentración de muestra en el gas portador a la salida de la columna
Instrumentación
Interfases GC-MS
Separador por efusión
Separador de haz molecular

(de jet)
Separador de
membrana
Instrumentación
Eficacias de las interfases
Interfase Rendimiento, % Enriquecimiento
Directo con división 5 1
Por efusión 20-30 4-7
Separador de jet 50-80 6-14
De membrana 30-80 10-30

Columnas y rellenos
Cromatografía Gas-Líquido
• columnas empaquetadas o de relleno,
• columnas tubulares abiertas o capilares.
columnas empaquetadas
• Tubos de vidrio o de acero inoxidable, con longitud de 1 a 15 m y diámetro interno
de 2-5 mm,
• Llenos con un soporte sólido de grano fino para conseguir una buena distribución
(0.25-0.15 mm) recubierto de una capa delgada (0.05-1 µm) de un líquido no
volátil que actúa de fase estacionaria.
• Puede contener entre 1000 y 2000 platos teóricos por metro.
Columnas y rellenos
columnas tubulares abiertas

• Tubo normalmente de vidrio o sílice fundida, de un diámetro comprendido entre
0.2 y 0.8 mm, en cuya pared interna se dispone la fase estacionaria.
• La permeabilidad a los gases es superior en las columnas capilares que en las
empaquetadas: tienen una longitud mayor (entre 10 y 100 m) sin provocar
presiones excesivamente elevadas en cabecera de columna.
• Alta eficacia: 30 000 a 50 000 platos
• Baja capacidad de carga.

Columnas y rellenos
Tipos de columnas tubulares abiertas
a) Columnas abierta de pared recubierta WCOT (wall coated open tubular): la fase
estacionaria se deposita formando una película líquida sobre la pared del tubo.
b) Columnas abiertas de capa porosa PLOT (porous layer open tubular): la pared
interna del tubo está recubierta por una capa de soporte adsorbente. Si el soporte
está impregnado de una fase estacionaria líquida, las columnas son denominadas
SCOT (support coated open tubular)
Columnas y rellenos
Comparación de propiedades de las columnas para cromatografía de gases
Tipo de columna
FSOT WCOT SCOT Rellena
Longitud, m 10-100 10-100 10-100 1-6
Diámetro interno, mm 0.1-0.53 0.25-0.75 0.5 2-4
Eficacia, platos/m 2000-4000 1000-4000 600-1200 500-1000
Platos totales (20-400) 103 (10-400) 103 (6-120) 103 (1-10) 103
Tamaño de muestra, ng 10-75 10-1000 10-1000 10-106
Presión relativa Baja Baja Baja Alta
Velocidad relativa Rápida Rápida Rápida Lenta
Estabilidad química Sí No No No
FSOT: columnas abiertas de sílice fundida
WCOT: columnas abiertas de pared recubierta
SCOT: columnas abiertas recubiertas con soporte
Columnas y rellenos
Soportes
Función: proporcionar una superficie donde poder depositar la fase estacionaria
líquida en forma de película uniforme
• Deben tener una superficie relativamente grande conseguir una película de fase
líquida fina y homogénea, para facilitar el rápido intercambio entre ambas fases.
• Debe ser un material relativamente duro.
• Debe ser estable térmicamente
• Debe ser poroso, para no producir una caída de presión excesiva.
• La superficie ha de ser químicamente inerte y no absorbente de los solutos: no
debe contribuir a la separación cromatográfica.
Materiales
tierra de diatomeas
Esqueletos de miles de especies de plantas unicelulares que habitaban antiguos
mares y lagos
Columnas y rellenos
Características de algunos soportes de diatomeas
Micro-bolas de vidrio
Soporte no poroso, de área superficial baja y muy duro. Tiene una figura geométrica muy
definida y tamaño uniforme. Admite cantidades muy pequeñas de fase estacionaria
Teflón
Poca interacción sobre los solutos. Poca capacidad de retención de líquidos sobre su
superficie. Separación de compuestos polares: agua, ácidos orgánicos, fenoles, aminas y
gases ácidos (HF, HCl, SO2 y NOx)
Micro-bolas de polímeros orgánicos
Estireno-divinilbenceno. Forma esférica con tamaño de poro controlado. Puede actuar como
soporte y como fase estacionaria.
Columnas y rellenos
Fases estacionarias
• Tener un intervalo de temperaturas de utilización lo más amplio posible (idealmente -60 –
400 ⁰C)
• Tener baja volatilidad a la temperatura de la columna (presión de vapor lo más baja posible).
• Tener estabilidad térmica a la temperatura de la columna.
• Tener inercia química.
• Debe tener baja viscosidad en las condiciones de trabajo.
• Debe mojar bien el soporte, presentando además una adherencia suficiente para no ser
arrastrada por la fase móvil.
Retención de los solutos: fuerzas intermoleculares

• Fuerzas de dispersión (fuerzas de London) debidas a los campos eléctricos producidos por
dipolos instantáneos debidos al movimientos relativos de núcleos y electrones.
• Fuerzas de inducción (fuerzas de Debye) debidas a la interacción electrostática entre dipolos
permanentes y dipolos instantáneos formados en moléculas no polares pero sí polarizables.
• Fuerzas de orientación (fuerzas de Keeson) debidas a interacciones entre dipolos
permanentes, tanto del soluto como de la fase estacionaria.
• Fuerzas donador-receptor. Debidas a interacciones químicas de carácter débil en las que se
produce una transferencia no completa de electrones por parte del donador al aceptor.
Columnas y rellenos
Fases estacionarias
Selección de la fase estacionaria
• Polaridad del soluto
• Debe poder disolver la muestra
Fases estacionarias en cromatografía de gases

Nombre Temperatura
Fase estacionaria Aplicaciones comunes
comercial máxima, ⁰C
Fase estacionaria no polar de uso general:
Polidimetilsilosano OV-1, SE-30 350 hidrocarburos, aromáticos polinucleares,
fármacos, esteroides, PCBs
Esteres metílicos de ácidos grasos,
Poli(fenilmetildimetil)silosano
OV-3, SE-52 350 alcaloides, fármacos, compuestos
(10% fenil) halogenados
Poli(fenilmetil)silosano
OV-17 250 Fármacos, esteroides, pesticidas, glicoles
(50% fenil)
Poli(trifluoropropildimetil)silo Aromáticos clorados, nitroaromáticos,
OV-210 200 bencenos alquilsustituidos
sano
Ácidos libres, alcoholes, éteres, aceites
Polietilenglicol Carbowax 20M 250 esenciales, glicoles
Ácidos grasos poliinsaturados, ácidos de la
Poli(dicianoalildimetil)silosano OV-275 240 colofonia, ácidos libres, alcoholes
Columnas y rellenos
polisilosanos
polietilenglicol
Grosor de la película de fase estacionaria

• Varía de 0.1 a 5 μm.
• Afecta a las características de retención y a la capacidad de la columna.
• Analitos muy volátiles: películas gruesas
• Analitos de baja volatilidad: películas delgadas
• Para columnas de 0.25 o 0.32 mm, se recomienda un grosor de película de 0.25 μm
Columnas y rellenos
Columnas y rellenos
Cromatografía Gas-Sólido
Se basa en una fase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los
analitos como consecuencia de la adsorción física
Dificultades
• Las isoterma de adsorción en cromatografía de gas-sólido no son lineales: el

tiempo de retención varía con la cantidad de soluto, picos asimétricos, retenciones
irreversibles.
• Tiempos de retención excesivamente largos.
• Los adsorbentes muestran propiedades de catálisis a temperaturas elevadas.
• Los adsorbentes son bastante difícil de estandarizar.
Columnas y rellenos
Fases estacionarias
Sílice porosa
• Disponible comercialmente en una gran variedad de áreas superficiales (185 a
100 m2/g) y diámetros de poro (15 y 30 nm).
• Se aplican fundamentalmente para la determinación de hidrocarburos saturados
y no saturados de bajo peso molecular
Alúmina
• Sustancia de polaridad elevada que interactúa fuertemente con moléculas polares,
tales como el agua.
• Área superficial típica es del orden de 250 m2/g
• Superficie puede modificarse por adición de sales inorgánicas
Tamices moleculares
• Suelen ser zeolitas preparadas artificialmente con sodio, potasio y alumino-
silicatos.
• Presentan una cavidad que retiene moléculas pequeñas que son parcialmente
retenidas.
• Uso: separar mezclas conteniendo O2, N2, CO2, H2, CH4, etc.
Columnas y rellenos
Fases estacionarias
Estructura de tamiz molecular
Polímeros microporosos
• co-polimerización de divinilbenceno con estireno u otros monómeros.
• Proceso de separación mixto: adsorción y reparto, si bien predomina adsorción,
especialmente a bajas temperaturas.
• Uso: separación de especies gaseosas polares, tales como óxidos de nitrógeno,
sulfuro de hidrógeno, dióxido de carbono, metanol y otras
Columnas y rellenos
Polímero poroso
Tamiz molecular
Análisis cualitativo y cuantitativo
Aplicaciones de la cromatografía gas-líquido

Análisis cualitativo
• Identificación de los compuestos de la muestra: tiempo o volumen de retención
• No es inequívoco
• Soluciones cromatográficas
Los tiempos de retención de los picos desconocidos se comparan con los
tiempos de retención de compuestos conocidos, separados en la misma
columna y en las mismas condiciones experimentales
Adición del patrón a la muestra.
Utilizar los factores de selectividad frente a un compuesto tomado como
referencia
índices de retención de Kóvats: relacionan el volumen de retención, VR (o el
tiempo de retención, tR) del compuesto desconocido con el de dos alcanos
lineales que eluyen inmediatamente antes y después del compuesto
problema.
Índice de los alcanos
n el número de átomos de carbono

=
del alcano
índice de retención del compuesto desconocido
"
! − !
= + "
! "# − ! "
VR = volumen de retención del compuesto desconocido.

VRx = volumen de retención del alcano eluido antes del compuesto desconocido.
VRx+1 = volumen de retención del alcano eluido después del compuesto desconocido.
x = número de átomos de carbono del alcano eluido antes del compuesto
desconocido
Análisis cuantitativo
• El parámetro cuantitativo es el área de pico

• Uso de patrón interno para mejorar la precisión
Ejemplos
• Análisis de alimentos
Determinación de especies volátiles responsables de olor o sabor (espacio de
cabeza).
Determinación de lípidos, ácidos grasos, proteínas e hidratos de carbono
(mediante derivatización)
• Análisis de drogas
• Industria
Caracterización de alquitranes, pinturas, películas , fibras sintéticas e incluso
material biológico
• Seguimiento y control de contaminantes en el medio ambiente
Análisis de derivados clorados, organofosforados, carbamatos, dibenzo-p-dioxinas
policloradas, hidrocarburos aromáticos
Derivatización
• Para que un compuesto que no se puede analizar mediante un método particular
resulte idóneo para el análisis.
• Para mejorar la eficacia analítica del compuesto.
• Para mejorar la detectabilidad del compuesto.
El procedimiento ideal de derivatización deberá

• Efectuar la modificación deseada
• Que sea cuantitativa, o, como mínimo, reproducible
• Producir productos que sean rápidamente distinguibles y separables de los
materiales iniciales.
• Proceder rápidamente con técnicas simples de laboratorio que deberán ser
selectivas y aplicables a compuestos similares.
• Usar reactivos y reacciones que no presenten riesgos inusuales.
Derivatización
Reacciones
• Sililación: sustitución átomo H activo por un grupo trialquilsilil (-Si(CH3)3) .

Disolvente piridina
R-OH + Cl-Si(CH3)3 R-O-Si(CH3)3 + HCl
• Esterificación: formación de ésteres metílicos. Reactivo trifluoruro de boro en

metanol
R-COOH + CH3OH/BF3 R-COOCH3
• Acilación: con anhídrido de ácido o con acil-imidazolas. Transforma alcoholes y
aminas primarias y secundarias en derivados estables
ELECTROFORESIS CAPILAR
Técnica de separación en la cual los analitos se separan por su habilidad de
moverse a través de un medio conductor (electrolito acuoso) en respuesta a la
aplicación de un campo eléctrico
ánodo cátodo
Electroforesis sobre capa de gel
gel poroso de agarosa o poliacrilamida

Introducción
Esquema de equipo de electroforesis capilar
Tiempo de migración
Introducción
Ecuación de Van Deemter
= + +
Dispersión en fase móvil Transferencia de masa

Difusión longitudinal
Introducción
TEORÍA DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR

Cuando aplicamos un campo eléctrico a través del tubo capilar, los
componentes de la mezcla migran como consecuencia de dos tipos de
acciones:
• movilidad electroforética
• movilidad electroomótica
Movilidad electroforética
Cuando un ion de carga q (culombios) se coloca en un campo eléctrico E
(V/m) la fuerza sobre el ion es q·E (N).
En disolución: fuerza de fricción de retardo es f·uef
donde uef es la velocidad (electroforética) del ion.
· = · = =
µef : movilidad electroforética

Introducción
Para partículas esféricas de radio r que se mueven a través de un fluido de

viscosidad η, el coeficiente de fricción vale
= (Ecuación de Stokes)
Introducción
Movilidad electroosmótica
Al aplicar un campo eléctrico, como el disolvente (agua) es neutro por lo que
permanecería estacionario. Sin embargo, lo que observamos bajo condiciones
normales es que la disolución se mueve hacia el cátodo.
Este fenómeno se denomina flujo electroosmótico.
Introducción
La constante de proporcionalidad entre la velocidad electroosmótica ,ueo, y

el campo aplicado se denomina movilidad electrosomótica, µeo,
= (m2 V-1 s-1)
Donde ε es la constante dieléctrica del tampón, ζ es el potencial zeta y η es la

viscosidad del electrolito soporte.
El potencial zeta es el potencial de la capa difusa a una distancia finita de la

pared del capilar.
La movilidad electroosmótica es directamente proporcional a la densidad de

carga superficial sobre la sílice, e inversamente proporcional a la raíz
cuadrada de la fuerza iónica.
Introducción
Diferencia del perfil de flujo por caída de presión o por flujo electroosmótico
calefacción o efecto Joule
I2·R (J·s)
I : corriente en amperios y R : resistencia de la disolución (en ohmios)
Introducción
Movilidad.
La movilidad aparente (u observada), , de un ion es la suma de la movilidad
electroforética del ion más la movilidad electroosmótica de la disolución
= +
Introducción
movilidad aparente
⁄
= =
⁄
Ld es la longitud de la columna capilar desde el inyector al detector,
Lt es la longitud total de la columna capilar de un extremo al otro,
V el voltaje aplicado entre los dos extremos y
t el tiempo necesario para que un soluto migre desde el extremo de inyección al detector
(tiempo de migración)
movilidad electroosmótica
⁄
= =
⁄
movilidad neta
= +
! > = ! <
Introducción
Eficacia.
%& &
$= = $=
%&
• longitud del capilar es la distancia del punto de inyección al detector, Ld
&
$= Sólo difusión longitudinal %& = 2(
%&
Donde D es el coeficiente de difusión y t el tiempo de migración.
= =
$=
2(
Introducción
Otras fuentes de ensanchado de zonas
• Anchura finita de la banda inyectada

• Perfil de flujo parabólico debido al calentamiento en el interior del capilar
• Absorción del soluto sobre la pared del capilar (que actuaría como fase
estacionaria)
• Longitud finita de la zona de detección
• Diferencia de movilidades entre los iones del soluto y del electrolito fondo,
que produce un comportamiento electroforético no ideal.
número de platos es independiente de la longitud del capilar

a mayor voltaje mayor es el número de platos
Introducción
Selectividad. ,+
)=
,&
Donde µef,1 y µef,2 son las movilidades electroforéticas de los dos solutos, elegidos de
manera que α ≥ 1.
Resolución.
La resolución de los picos adyacentes en un electroferograma es la diferencia entre
tiempos de migración (Δt) dividido por la anchura media de los picos (wm)
$ ,
,= (. − 0) .= =
,
3. 055( , − , )
2=
(( 6 + )
µav es la velocidad electroforética promedio para los dos solutos

Instrumentación
INSTRUMENTACIÓN
Instrumentación
Tubo capilar.
hechos de sílice fundida

recubiertos con una capa de 15-35 µm de poliimida para dar resistencia mecánica.
El diámetro interno es típicamente 25-75 µm
• Capilares de menor diámetro interno generan menos calentamiento Joule

• Capilares con diámetros externos mayores disipan mejor el calor.
• Si se usan camisas termostáticas, no es necesario un diámetro externo elevado.
Instrumentación
Inyección y composición de la muestra.

• Inyección hidrodinámica
• Inyección electrocinéticas
Inyección hidrodinámica
se sumerge el capilar en la disolución de la muestra y se le aplica presión al
vial o vacío desde el extremo del capilar
∆9
! 7 =
0:;
Donde ΔP es la diferencia de presión entre los extremos del capilar (Pa); d el
diámetro interno del capilar (m), t es el tiempo de inyección (s), η la
viscosidad de la muestra (Kg m-1 s-1) y L la longitud total del capilar (m).
Instrumentación
Inyección y composición de la muestra.

Inyección electrocinética
el capilar se sumerge en la muestra y se aplica un voltaje entre los extremos
del capilar.
< &
! 7 =
Donde r es el radio del capilar, t el tiempo de inyección y < el campo eléctrico
efectivo en la muestra.
El campo eléctrico efectivo en la muestra que depende del voltaje aplicado, E, y de la

relación de conductividades del electrolito (κb) y de la muestra (κ s)
<
=>
=
=?
Instrumentación
Apilamiento (stracking)
• Se inyecta la muestra en un electrolito que es 1/10 de la concentración del
electrolito fondo
• Muestra: máximo 1/500 concentración electrolito fondo
Instrumentación
Aplicación del campo eléctrico.
La migración en electroforesis se produce como respuesta a un campo eléctrico

aplicado.
La habilidad para aplicar el campo eléctrico es importante. Altos voltajes dan:
• menores tiempos de análisis,
• separaciones más eficaces
• mejores resoluciones
Instrumentación
Detectores.
Espectrofotometría UV.
El agua es transparente: > 185 nm.
El electrolito fondo debe ser suficientemente: electrolitos de ion borato.
Paso óptico anchura del capilar (25-75 µm)
Instrumentación
Detección espectrofotométrica indirecta

Instrumentación
Amperometría.
Instrumentación
Espectrometría de masas
espectro de masas de la vasotocina

Instrumentación
Características de los detectores para electroforesis capilar
Límite de detección
Detector Selectividad On column
Moles inyectados molaridad
Espectrofotometría UV- Selectivo Si
10-13-10-16 10-5 – 10-7
Vis
Fluorescencia Selectivo 10-15-10-17 10-7 – 10-9 Si
Fluorescencia láser Selectivo 10-18-10-20 10-13 – 10-16 Si
Universal (total ion)
Espectrometría de masas 10-16-10-17 10-8 – 10-10 No
Selectivo (ion simple)
Amperometría selectivo 10-18-10-19 10-7 – 10-10 No
conductividad universal 10-15-10-16 10-7 – 10-9 No
Métodos en electroforesis capilar
MÉTODOS EN ELECTROFORESIS CAPILAR
Electroforesis capilar de zona (CZE)
Generalmente, el final del capilar que contiene la muestra es el ánodo y los

solutos migran hacia el cátodo a una velocidad determinada por su movilidad
electroforética y el flujo electroosmótico.
• Los cationes eluyen primero, con los cationes más pequeños y más
ligeramente cargados eluyendo antes que los cationes grandes con menor
carga.
• Los solutos neutros eluyen como una única banda.
• Los aniones son las últimas especies en eluir, siendo los más pequeños y más
cargados los últimos en eluir
Se puede añadir un tensoactivo catiónico (bromuro de cetiltrimetilamonio) al

electrolito fondo para invertir la dirección del flujo electroosmótico.
• Los aniones del electrolito fondo crean un flujo electroosmótico del cátodo
al ánodo
Si recubrimos las paredes del capilar con un reactivo no iónico, eliminamos el flujo
electroosmótico.
• En esta forma de CZE los cationes migran del ánodo al cátodo, los aniones van
hacia el reservorio fuente y los compuestos neutros no se mueven
La electroforesis capilar de zona permite la separación de especies cargadas,

incluyendo aniones y cationes inorgánicos, ácidos y aminas orgánicas y
grandes biomoléculas, como proteínas.
No se puede separar una mezcla de especies neutras
Cromatografía electrocinética en fase micelar

(Micellar Electrokinetic Capillary Cromatography, MEKC)
modo de electroforesis capilar que permite la separación de especies neutras
Micelas de dodecilsulfato sódico

Orden de elución de las moléculas neutras en MEKC

• Moléculas neutras hidrofílicas, insolubles en las micelas, salen juntas en una
única banda, como en CZE.
• Los solutos neutros extremadamente hidrofóbicos se disuelven completamente
en la micela, eluyendo con las micelas en una única banda.
• Moléculas neutras en las que se establece un equilibrio entre la fase micelar y el
electrolito fondo, tienen tiempo de migración intermedio
• Cuanto más tiempo pase el compuesto dentro de la micela, mayor es su tiempo
de migración.
Variables que pueden afectar a la cromatografía electrocinética micelar:

• Tensoactivos aniónicos, catiónicos híbridos o neutros, para cambiar los
coeficientes de reparto de los analitos.
• Tensoactivos catiónicos pueden modificar la carga de la pared y la dirección del
flujo electroosmótico.
• Disolventes (como acetonitrilo y N-metilformamida) aumentanla solubilidad de
los analitos orgánicos y cambian el coeficiente de partición entre la disolución y
las micelas,
• Ciclodextrinas, para separar isómeros ópticos (enantiómeros)
La cromatografía electrocinética en fase micelar se ha empleado para separar una

gran variedad de muestras, incluyendo compuestos farmacéuticos, vitaminas y
explosivos
Electroforesis capilar en gel (Capillary Gel Electrophoresis, CGE)

• El tubo capilar se rellena con un gel polimérico.
• Un soluto migra a través del gel con una velocidad determinada tanto por su
movilidad electroforética como por su tamaño.
• Se usa cuando los solutos tienen movilidades electroforéticas similares.
• Las muestras se inyectan electrocinéticamente
• Aplicación: separación de biomoléculas grandes, incluyendo fragmentos de ADN,
proteínas y oligonucleóticos.
Electrocromatografía capilar (capillary electrochromatography, CEC)

• El tubo capilar se rellena con partículas de 1.5 a 5 µm recubiertas con una fase
estacionaria enlazada.
• Las especies neutras se separan en base a su reparto entre la fase estacionaria y el
electrolito fondo, el cual se mueve como consecuencia del flujo electroosmótico.
• Separación similar a HPLC, pero sin la necesidad de bombas de alta presión, por lo
que no existe caída de presión en partículas pequeñas.
• Eficacia en CEC es mejor que en HPLC y tiempo de análisis más cortos.
Electrocromatograma capilar de
hidrocarburos
Electrocromatograma capilar de hidrocarburos poliaromáticos (PAH)

Isoelectroenfoque (Isoelectric focusing, IEF)

• Se utiliza para la separación de especies anfóteras como aminoácidos y proteínas:
presentan en su estructura un grupo carboxilo (ácido débil) y un grupo amino
(base débil).
• Al disolverse en agua forman un ion bipolar (zwitterion)
Glicina NH2CH2COOH NH3+CH2COO-
• Dependiendo del valor del pH del medio, la molécula tendrá carga neta positiva,
negativa o cero (punto isoeléctrico, pI)
Isoelectroenfoque capilar de proteinas

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INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS ELECTROANALÍTICAS

 Sólo se puede obtener información de compuestos que tienen

a Ox1 + b Red2  a Red1 + b Ox2

E10 y E20 : potenciales normales de cada sistema redox; n el número de moles de

Una reacción electroquímica es una reacción redox en la que el

Reacción electroquímica: transformación química que sufre una

Electrolito: sistema químico capaz de

Circuito de medida: usado para

Electrodos: conductores que sirven

Electrodo indicador o de trabajo, electrodo cuyo potencial es sensible

Contraelectrodo, segundo electrodo que completa el circuito y

El contraelectrodo se puede sustituir por dos electrodos:

Electrodo de referencia, electrodo cuyo potencial permanece

Electrodo auxiliar, electrodo que completa el circuito, deja pasar la

Ánodo electrodo donde tiene

Znº (s)  Zn2+ + 2 e-

Puente salino: Comunicación entre dos disoluciones compuesta por una

Zn(s) | ZnCl2 (aq, 0.0167 M) || AgNO3 (aq, 0.100 M) | Ag(s)

A 25 ºC (298 K) Zn(s) | ZnCl2 (aq, 0.0167 M) || AgNO3 (aq, 0.100 M) | Ag(s)

En principio, midiendo el potencial de célula y conociendo la concentración en

- Los potenciales normales de las tablas son a 25 ºC, luego deberíamos

Potencial de unión líquida es un potencial que se establece en la interfase

Potencial de unión líquida, Eul

HCl 0,1 M KCl 0,1 M Movilidades

NaCl 0,1 M KCl 0,1 M

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS ELECTROANALÍTICAS

Técnicas electroquímicas de interfase

Técnicas estáticas Técnicas dinámicas

Potenciometría Potencial Intensidad

Voltamperometría Polarografía y Polarografía y

MEDIDA DE LA INTENSIDAD Y DEL POTENCIAL.

Galvanostato: dispositivo que se emplea para controlar la intensidad de corriente

Diagrama esquemático de un galvanostato.

R = resistencia; i = galvanómetro; A = electrodo

Potenciostato: dispositivo utilizado para controlar el potencial del electrodo de

Diagrama esquemático de un potenciostato.

ELECTRODOS: CLASIFICACIÓN Y TIPOS

• Electrodos de referencia, que tienen un potencial constante y conocido

semicélula electroquímica que proporciona un potencial de referencia

 Convención: el electrodo de referencia es el ánodo:

Electrodo de referencia ║ electrodo indicador

Ecel = Eind – Eref + Eul

• Electrodo Normal de Hidrógeno

Hg │ Hg2Cl2 sat, KCl (x, M) ║

Hg2Cl2 (s) + 2 e-  2 Hgº + 2 Cl-

Ag | AgCl sat, KCl (x M) ||

AgCl(s) + e-  Ag° + Cl-.

Potenciales de referencia de los electrodos de referencia en

Potencial de electrodo, V vs. SHE

Electrodos indicadores o de trabajo

• Electrodos para intercambio de electrones

Material de electrodo Características

• Más inerte que el platino

• Inerte, especialmente grafito y carbono vítreo

Potenciometría: técnica electroquímica en la que la concentración

El electrodo indicador debe dar una respuesta

Tipos generales de electrodos indicadores potenciométricos:

a) Electrodos de primera especie: se utilizan para medir la actividad

Ej. Electrodo de cobre: sensor de Cu2+

Reacción de electrodo Cu2+ + 2 e- Cu°