Diagnostico Molecular de Filariosis en España
Diagnostico Molecular de Filariosis en España
Diagnostico Molecular de Filariosis en España
2011;29(9):666–671
www.elsevier.es/eimc
Original
Historia del artículo: Introducción: Durante los últimos años se ha registrado un aumento creciente de la población inmigrante
Recibido el 29 de diciembre de 2010 y de viajeros procedentes de áreas endémicas de filariasis producidas por Loa loa (L. loa), Mansonella pers-
Aceptado el 8 de junio de 2011 tans (M. perstans) y Wuchereria bancrofti (W. bancrofti). Esta situación epidemiológica ha hecho necesario
On-line el 8 de septiembre de 2011
el desarrollo de técnicas específicas de diagnóstico molecular, alternativas al método parasitológico clá-
sico. Por lo tanto, el objetivo planteado en este trabajo ha sido la utilización de las técnicas moleculares
Palabras clave: optimizadas en nuestro laboratorio, nested-PCR e ITS1-RFLP, en el diagnóstico de filariasis importadas, y
Loa loa
la comparación de los resultados obtenidos con los derivados del diagnóstico parasitológico.
Mansonella perstans
ITS1-RFLP
Material y métodos: Se ha estudiado mediante la técnica de concentración de Knott, nested-PCR e ITS1-
nested-PCR RFLP un total de 523 muestras (517 sangres, 5 helmintos adultos y un humor vítreo) que fueron remitidas
Diagnóstico diferencial al Servicio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología-Instituto de Salud Carlos III, entre los
años 2006 y 2009, por 47 centros sanitarios de las comunidades autónomas.
Resultados: Las técnicas moleculares utilizadas demostraron ser más sensibles que el método de concen-
tración de Knott, tanto en el diagnóstico de L. loa (n = 12 frente a n = 4) como en el de M. perstans (n = 57
frente a n = 25) en el total de muestras de sangre estudiadas.
Conclusión: Los métodos de PCR utilizados permiten un diagnóstico específico y más sensible de L. loa
y M. perstans en muestras clínicas de población inmigrante y viajeros procedentes de áreas endémicas,
donde estas especies de filarias son coendémicas. El método de concentración de Knott debe emplearse
como técnica complementaria siempre que sea posible.
© 2010 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
a b s t r a c t
Keywords: Introduction: The last few years has seen an increase in the number of immigrants and travellers from
Loa loa endemic areas where filariasis are mainly caused by Loa loa (L. loa), Mansonella perstans (M. perstans) and
Mansonella perstans Wuchereria bancrofti (W. bancrofti) species. These demographic changes has led to the need for better
ITS1-RFLP
filariae species-specific molecular diagnostic tests to solve problems, as alternatives to the more time
nested-PCR
consuming classic parasitology methods. Thus, the objective of the present work was the implementa-
Differential diagnosis
tion of optimised molecular protocols (nested-PCR and ITS1-RFLP) developed in our laboratory, for the
differential diagnosis of filarial parasites. The results obtained were compared with those obtained using
the conventional parasitological methods.
Material and methods: A total of 523 samples (517 peripheral blood, 5 adult worms and one vitreous body)
were sent to Parasitology Department of the National Microbiology Centre, Carlos II Research Institute
(ISCIII), from 47 Health Centres in the Autonomous Regions of Spain, from 2006 to 2009. The samples
were studied by the Knott technique, nested-PCR and ITS1-RFLP.
Results: The molecular techniques applied on blood samples showed to be more sensitive that Knott’s
concentration technique in the diagnosis of both L. loa (n = 12 versus n = 4) and M. perstans (n = 57 versus
n = 25) infections.
0213-005X/$ – see front matter © 2010 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.eimc.2011.06.012
M. Jiménez et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(9):666–671 667
Conclusions: The nested-PCR and ITS1-RFLP are potential diagnostic tools for daily routine laboratory
species-specific and sensitive detection of L. loa and M. perstans filarial species in immigrant population
and travellers from endemic areas where these filarial species are co-endemic. Knott’s concentration
technique was less sensitive than molecular methods and should be carried out as a complementary
diagnostic assay.
© 2010 Elsevier España, S.L. All rights reserved.
Tabla 1
Técnica de reacción en cadena de la polimerasa, secuencia de los oligos y tamaño de las bandas diagnósticas esperadas
Técnica de PCR Nombre del oligo y secuencia Especie de filaria y bandas diagnósticas (pb)
Tabla 2
Datos correspondientes a algunas de las muestras clínicas estudiadas
Tabla 2 (Continuación)
Tabla 4
Sensibilidad y especificidad de las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa
Técnica de PCR Sensibilidad (%) (IC del 95%) Especificidad (%) (IC del 95%) CP + (IC del 95%) CP− (IC del 95%)
CP+: cociente de probabilidad positivo; CP−: cociente de probabilidad negativo; IC: intervalo de confianza.
que además se puede emplear también en muestras de sangre sangre procedentes de inmigrantes subsaharianos, aunque la sen-
recogidas en papel Whatman14 . Esta observación es de interés en sibilidad de esta PCR no parece ser lo suficientemente elevada para
el caso de llevar a cabo encuestas epidemiológicas en países endé- el diagnóstico de loasis oculta en individuos amicrofilarémicos. La
micos donde existen serias dificultades para la conservación y el positividad frente a L. loa obtenida en las muestras de 3 inmigrantes
transporte de las muestras a laboratorios de referencia. Así mismo, procedentes de Guinea Ecuatorial (#16 y #70) y Nigeria (#51),
los protocolos moleculares han sido aplicados con éxito a partir del respectivamente, confirma la mayor sensibilidad de la nested-PCR
ADNg obtenido tanto de helmintos adultos como de humor vítreo. frente a la ITS1-RFLP en el diagnóstico de loasis oculta. Esta nested-
Definitivamente, el diagnóstico molecular es más sensible y pre- PCR ha sido utilizada previamente con éxito en el diagnóstico de
ciso que el método de concentración de Knott. Además, hay que loasis oculta en Gabón y Guinea Ecuatorial13,17,26 . Aunque si bien
tener en cuenta, en la gran mayoría de los casos, la cantidad de en el caso de las muestras #47 y #68, correspondientes a inmigran-
sangre que se remite al analista es menor de 1 ml, cantidad insu- tes de Congo y Gabón respectivamente, la ITS1-RFLP resultó tener
ficiente para la realización del método de concentración de Knott, mayor o igual sensibilidad que la nested-PCR respectivamente.
siendo solo posible la extracción de ADNg, para la que únicamente Para terminar se debe indicar que con el fin de aumentar la sensi-
se necesitan 100-200 l que después se utiliza en las reacciones de bilidad de la ITS1-RFLP, se han desarrollado 3 nested-PCR diseñadas
PCR. En nuestro caso fueron un total de 108 muestras de sangre las a partir de esta PCR, específicas para cada una de las especies de fila-
que no pudieron ser analizadas por este motivo. rias, y que se encuentran en fase de validación para su incorporación
El número de muestras que resultaron positivas en el total de en el diagnóstico de rutina14 .
517 muestras de sangre estudiadas alcanzó un 13,5%, de las que 12 En conclusión, los métodos moleculares desarrollados deben ser
fueron positivas a L. loa (2,3%). Este resultado es algo superior al utilizados simultáneamente junto con la técnica de concentración
obtenido en un estudio de detección de loasis mediante microsco- de Knott en el diagnóstico y diferenciación de L. loa, M. perstans
pia realizado a 1.638 inmigrantes procedentes de zonas endémicas y W. bancrofti en muestras clínicas de individuos procedentes de
en los que 30 de ellos (1,83%) resultaron positivos2 . En un estudio áreas endémicas donde coexisten las 3 especies de filarias.
previo de 40 muestras de sangre de individuos subsaharianos se
encontró un 5% de parasitación por L. loa14 . Quizás las diferencias Conflicto de intereses
encontradas se puedan explicar por la sensibilidad de los protoco-
los de amplificación empleados o por las diferencias en el origen Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
geográfico de los pacientes analizados.
Recientemente se han descrito trabajos en los que se valora
la asociación entre las infecciones por helmintos, entre ellos Agradecimientos
M. perstans y L. loa, con el VIH4,22 . En nuestro caso 11 de los
individuos (2,1%) presentaban anticuerpos frente al VIH, sin Trabajo financiado por RICET-FIS (RD06/0021/0019). Este tra-
embargo solo en uno de los individuos seropositivos se detectó bajo ha sido posible gracias a las muestras suministradas por los
M. perstans. También se ha descrito que existe una correlación clínicos de los diferentes centros sanitarios de las comunidades
entre la presencia de eosinofilia y las alteraciones cutáneas con autónomas.
infecciones por helmintos23,24 . En este sentido, aunque las infec-
ciones por M. perstans son a menudo asintomáticas, pueden Bibliografía
causar eosinofilia y prurito4 . Así, en 17 individuos con datos
clínicos, la eosinofilia estuvo asociada a M. perstans en 12 y el 1. World Health Organization. Lymphatic filariasis. WHO 2010 [consultado
10/2/2010]. Disponible en: www.who.int/lymphatic-filariasis/epidemiology.
prurito en 5 de ellos. En dos de las muestras positivas a L. loa los 2. Carrillo E, Iglesias B, Gómez J, Guinovart C, Cabezos J. Cribaje de microfilariasis
individuos refirieron el paso ocular del adulto. sanguínea (Loa loa) en la población inmigrante de zonas endémicas. Rev Esp
Es frecuente entre los habitantes de zonas endémicas la Salud Pública. 2004;78:623–30.
3. Pardo J, Carranza C, Muro A, Moreno A, Martín A, Martín T, et al. Helminto-
parasitación con varias especies de filarias como por ejemplo
related eosinophilia in african immigrants, Gran Canaria. Emerg Infect Dis.
L. loa/M. perstans25 . En nuestro caso se detectaron 3 infecciones 2006;12:1587–9.
mixtas por L. loa/M. perstans, que no pudieron asociarse a ningún 4. Simonsen PE, Onapa AW, Asio SM. Mansonella perstans filariasis in Africa. Acta
Trop. 2010, doi:10.1016/j.actatropica.201001.014.
signo clínico o analítico compatible con filariasis por falta de datos
5. Monge-Maillo B, Jiménez BC, Pérez-Molina JA, Norman F, Navarro M,
clínico-epidemiológicos. Una de las infecciones mixtas procedía de Pérez-Ayala A, et al. Imported infectious diseases in mobile populations, Spain.
un individuo de Guinea Ecuatorial. Emerg Infect Dis. 2009;15:1745–52.
Por otro lado, todas las muestras diagnosticadas procedentes de 6. Chen LH, Wilson ME, Davis X, Loutan L, Schwartz E, Keystone J, et al. Schlagen-
hauf P: GeoSentinel Surveillance Network. Emerg Infect Dis. 2009;15:1773–82.
viajeros y cooperantes de áreas endémicas fueron negativas, si bien
7. Nuchprayoon S. DNA-based diagnosis of lymphatic filariasis. Southeast Asian J
el número de no fue muy elevado respecto al total (11%). Recien- Trop Med Public Health. 2009;40:904–13.
temente se ha descrito un caso de loasis oculta en un individuo 8. Rosenblatt JE. Laboratory diagnosis of infections due to blood and tissue para-
japonés que tras un viaje a Camerún presentó sintomatología com- sites. Clin Infect Dis. 2009;49:1103–8.
9. Klion AD. Filarial infections in travelers and immigrants. Curr Infect Dis Rep.
patible con loasis y paso del parásito adulto por la conjuntiva ocular 2008;10:50–7.
sin microfilaremia; en este caso no se pudo llevar a cabo el diag- 10. Walther M, Muller R. Diagnosis of human filariases (Except Onchocerciasis).
nóstico mediante la nested-PCR utilizada en el presente trabajo11 . Adv Parasitol. 2003;53:149–93.
11. Yoshikawa M, Ouji Y, Hayashi N, Moriya K, Nishiofuku M, Ishizaka S, et al.
La ITS1-RFLP utilizada ha sido previamente evaluada en la detec- Diagnostic problems in a patient with amicrofilaremic Loa loa. J Travel Med.
ción y discriminación de las 3 especies de filarias en muestras de 2008;15:53–7.
M. Jiménez et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(9):666–671 671
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