Enferm Infecc Microbiol Clin.

2011;29(9):666–671

www.elsevier.es/eimc

Original

Diagnóstico diferencial de filariasis importada mediante técnicas moleculares

(2006-2009)
Maribel Jiménez a,∗ , Luis Miguel González a , Begoña Bailo a , Alejandra Blanco a , Luz García a ,
Francisco Pérez-González b , Isabel Fuentes a y Teresa Gárate a,∗
a
Servicio de Parasitología, Centro Nacional de Parasitología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, España
b
Unidad de Enfermedades Infecciosas, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, España

información del artículo r e s u m e n

Historia del artículo: Introducción: Durante los últimos años se ha registrado un aumento creciente de la población inmigrante
Recibido el 29 de diciembre de 2010 y de viajeros procedentes de áreas endémicas de filariasis producidas por Loa loa (L. loa), Mansonella pers-
Aceptado el 8 de junio de 2011 tans (M. perstans) y Wuchereria bancrofti (W. bancrofti). Esta situación epidemiológica ha hecho necesario
On-line el 8 de septiembre de 2011
el desarrollo de técnicas específicas de diagnóstico molecular, alternativas al método parasitológico clá-
sico. Por lo tanto, el objetivo planteado en este trabajo ha sido la utilización de las técnicas moleculares
Palabras clave: optimizadas en nuestro laboratorio, nested-PCR e ITS1-RFLP, en el diagnóstico de filariasis importadas, y
Loa loa
la comparación de los resultados obtenidos con los derivados del diagnóstico parasitológico.
Mansonella perstans
ITS1-RFLP
Material y métodos: Se ha estudiado mediante la técnica de concentración de Knott, nested-PCR e ITS1-
nested-PCR RFLP un total de 523 muestras (517 sangres, 5 helmintos adultos y un humor vítreo) que fueron remitidas
Diagnóstico diferencial al Servicio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología-Instituto de Salud Carlos III, entre los
años 2006 y 2009, por 47 centros sanitarios de las comunidades autónomas.
Resultados: Las técnicas moleculares utilizadas demostraron ser más sensibles que el método de concen-
tración de Knott, tanto en el diagnóstico de L. loa (n = 12 frente a n = 4) como en el de M. perstans (n = 57
frente a n = 25) en el total de muestras de sangre estudiadas.
Conclusión: Los métodos de PCR utilizados permiten un diagnóstico específico y más sensible de L. loa
y M. perstans en muestras clínicas de población inmigrante y viajeros procedentes de áreas endémicas,
donde estas especies de filarias son coendémicas. El método de concentración de Knott debe emplearse
como técnica complementaria siempre que sea posible.
© 2010 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.

Differential diagnosis of imported filariasis by molecular techniques

(2006-2009)

a b s t r a c t

Keywords: Introduction: The last few years has seen an increase in the number of immigrants and travellers from
Loa loa endemic areas where filariasis are mainly caused by Loa loa (L. loa), Mansonella perstans (M. perstans) and
Mansonella perstans Wuchereria bancrofti (W. bancrofti) species. These demographic changes has led to the need for better
ITS1-RFLP
filariae species-specific molecular diagnostic tests to solve problems, as alternatives to the more time
nested-PCR
consuming classic parasitology methods. Thus, the objective of the present work was the implementa-
Differential diagnosis
tion of optimised molecular protocols (nested-PCR and ITS1-RFLP) developed in our laboratory, for the
differential diagnosis of filarial parasites. The results obtained were compared with those obtained using
the conventional parasitological methods.
Material and methods: A total of 523 samples (517 peripheral blood, 5 adult worms and one vitreous body)
were sent to Parasitology Department of the National Microbiology Centre, Carlos II Research Institute
(ISCIII), from 47 Health Centres in the Autonomous Regions of Spain, from 2006 to 2009. The samples
were studied by the Knott technique, nested-PCR and ITS1-RFLP.
Results: The molecular techniques applied on blood samples showed to be more sensitive that Knott’s
concentration technique in the diagnosis of both L. loa (n = 12 versus n = 4) and M. perstans (n = 57 versus
n = 25) infections.

∗ Autor para correspondencia.

Correos electrónicos: [email protected] (M. Jiménez), [email protected] (T. Gárate).

0213-005X/$ – see front matter © 2010 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.eimc.2011.06.012
 M. Jiménez et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(9):666–671 667

Conclusions: The nested-PCR and ITS1-RFLP are potential diagnostic tools for daily routine laboratory
species-specific and sensitive detection of L. loa and M. perstans filarial species in immigrant population
and travellers from endemic areas where these filarial species are co-endemic. Knott’s concentration
technique was less sensitive than molecular methods and should be carried out as a complementary
diagnostic assay.
© 2010 Elsevier España, S.L. All rights reserved.

Introducción de población inmigrante (60%), así como de viajeros y cooperantes

(11%), aunque no se conocían los datos clínico-epidemiológicos de
Las filariasis humanas están restringidas a áreas endémicas tro- todos los pacientes (29%). La mayoría de los pacientes presentaban
picales y subtropicales, donde se calcula que más de 120 millones signos y síntomas compatibles con filariasis producida por L. loa y/o
de personas están infectadas1 . En los últimos años se ha registrado M. perstans, como eosinofilia, 20,8%; prurito y lesiones cutáneas,
un aumento creciente de población inmigrante, principalmente 7,1%; edema de Calabar, 4%; alteraciones oculares (fotofobia, dolor
subsahariana, procedente de zonas endémicas de filariasis, donde ocular y disminución de la agudeza visual con migración del adulto
coexisten Loa loa (L. loa), Mansonella perstans (M. perstans) y Wuche- a través de la conjuntiva), 2,2%. El 2,1% de los pacientes presen-
reria bancrofti (W. bancrofti), entre otras especies de filarias2–5 . taban anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia humana
Así mismo, el aumento de viajes de corta duración (< 1 mes) (VIH).
y, sobre todo, los de larga duración (> 6 meses) a zonas endé- El examen parasitológico de las muestras de sangre se efectuó
micas de filariasis, ya sea por turismo, por visitas a familiares utilizando la técnica de concentración por el método de Knott y
y amigos o por cooperación o actividades misioneras, ha incre- posterior tinción de Giemsa15 .
mentado el riesgo de que estos individuos vuelvan a sus países La extracción del ADN genómico (ADNg) de las muestras de san-
de origen con los parásitos y la sintomatología correspondiente6 . gre y del humor vítreo se llevó a cabo mediante el Kit QIAamp® DNA
Ante la nueva situación, se planteaba la necesidad del desarro- Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo las recomen-
llo de métodos diagnósticos eficaces para detectar estas filarias y daciones del fabricante.
métodos que reuniesen además alta especificidad y sensibilidad, El ADNg de los helmintos adultos se obtuvo por lisis celular con
mejorando así las dificultades del diagnóstico parasitológico tra- proteinasa K, purificación mediante extracción fenol-cloroformo y
dicional. Este último, basado en la observación microscópica de precipitación de los ácidos nucleicos con etanol16 . La cuantificación
frotis y gota gruesa preparados directamente o tras concentración y pureza del ADNg se determinó en un espectrofotómetro Nano-
de muestras sanguíneas teñidas por el método de Giemsa, pro- Drop ND-1000 (Nucliber, Madrid, España). El ADNg se conservó a
ceso que requiere personal muy cualificado y gran consumo de −20 ◦ C para su posterior análisis con los protocolos moleculares.
tiempo7 . Dificultades a las que hay que sumar la frecuencia de pro- Las herramientas moleculares empleadas fueron las siguientes:
cesos amicrofilarémicos descritos en las parasitaciones por L. loa y a) una nested-PCR específica para L. loa, con la que se obtiene un
W. bancrofti8–10 . fragmento de 366 pb correspondiente a la tercera repetición del
Además, hay que constatar la falta de sensibilidad y especifi- gen que codifica la poliproteína de 15 kDa 13,17 , y b) una PCR-RFLP
cidad de los métodos serológicos disponibles en la detección de basada en la amplificación del espacio transcrito interno 1 de los
anticuerpos frente a filarias y la presencia de anticuerpos en indi- genes ribosomales (ITS-1) y posterior digestión con la enzima Ase I
viduos sin infección activa11,12 , razón por la cual el diagnóstico que resulta en un patrón de bandas diagnósticas que permiten dife-
serológico de las filariasis en inmigrantes procedentes de áreas renciar las especies de filarias L. loa, M. perstans y W. bancrofti14,18 .
endémicas no es un procedimiento apropiado para la diferenciación En la tabla 1 se muestran los oligos utilizados en cada uno de los
específica de las filariasis. protocolos de PCR, así como los tamaños esperados de las bandas
En los últimos años el Servicio de Parasitología del Centro diagnósticas en cada caso.
Nacional de Microbiología-Instituto de Salud Carlos III (CNM-
ISCIII) ha desarrollado y optimizado diferentes técnicas de reacción
Resultados
en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de L. loa,
M. perstans y W. bancrofti13,14 . Estas técnicas de PCR han sido
De las 517 muestras de sangre estudiadas, un total de 70 (13,5%)
implementadas como técnicas diagnósticas, y se realizan de forma
resultaron positivas por alguno de los 3 métodos diagnósticos
sistemática junto con el método de concentración de Knott en la
utilizados, de las cuales 12 fueron positivas a L. loa (2,3%), 58 a
identificación de las 3 especies de filarias.
M. perstans (11,2%) y 3 mixtas (L. loa/M. perstans) (0,58%). Estas
En este trabajo se presentan los resultados de un total de
3 últimas muestras, al ser inicialmente mixtas por la técnica de
523 muestras remitidas el Servicio Parasitología del CNM-ISCIII por
Knott, se trataron separadamente del resto de las muestras estu-
47 centros sanitarios de las comunidades autónomas durante el
diadas. Ninguna de las muestras fue positiva para W. bancrofti. En
periodo comprendido entre los años 2006 y 2009.
la tabla 2 se muestran los resultados correspondientes a las 70
muestras de sangre positivas, los 4 helmintos adultos y el humor
Material y métodos vítreo, así como algunas de las características de éstas. La eosinofi-
lia estuvo asociada a M. perstans en 12 casos, el prurito en 5 casos y
Se ha llevado a cabo el estudio de un total de 523 muestras la presencia de anticuerpos frente a VIH en uno solo. Las muestras
(517 muestras de sangre, 5 helmintos adultos extraídos de la con- positivas tanto para L. loa como las mixtas (L. loa/M. perstans) no
juntiva ocular y un humor vítreo) que fueron remitidas al Servicio pudieron asociarse a ningún signo clínico, o analítico, compatible
de Parasitología del CNM-ISCIII por un total de 47 centros sanita- con filariasis por falta de estos datos.
rios de las diferentes comunidades autónomas, durante los años En la tabla 3 se muestra un resumen de los resultados
2006 (n = 30), 2007 (n = 173), 2008 (n = 266) y 2009 (n = 54) para su obtenidos con las 517 muestras de sangre en función de la téc-
diagnóstico. No se pudo confirmar la precisión en la hora de reco- nica diagnóstica utilizada. La técnica de concentración de Knott
gida de las muestras de sangre y si ésta se realizó de acuerdo a la resultó ser menos sensible que los métodos moleculares tanto
periodicidad de la filaria. Las muestras procedían en su mayoría en el diagnóstico de L. loa (n = 4 frente a n = 12) como en el de
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Tabla 1
Técnica de reacción en cadena de la polimerasa, secuencia de los oligos y tamaño de las bandas diagnósticas esperadas

Técnica de PCR Nombre del oligo y secuencia Especie de filaria y bandas diagnósticas (pb)

L. loa M. perstans W. bancrofti

Nested-L. loa 15r31 5′ -AATCAGGCAAATAATGGCACAAAA-3′ 366 - -

15r32 5′ -GCGTTTTCTTCTCACCAGCTGTCT-3′
15r33 5′ -GGCACAAAACACTGCAGCAGTCCT-3′
15r34 5′ -CAGCTGTCTCAAATCGAAGATTCT-3′
ITS1 ITS1-F 5′ -GGTGAACCTGCGGAAGGATC-3′ 457 484 482
ITS1-R 5′ -CTCAATGCGTCTGCAATTCGC-3′
ITS1-RFLP (AseI) 12, 122, 129, 194 17, 195, 272 12, 64, 100, 104, 202

Tabla 2
Datos correspondientes a algunas de las muestras clínicas estudiadas

N.◦ Hospital Origen Técnica de Knott Nested-PCR L. loa ITS1-RFLP

a
1 Móstoles, Madrid Guinea Ecuatorial NR L. loa NR
2 Móstoles, Madrid Guinea Ecuatorial N N M. perstans
3 Móstoles, Madrid Guinea Ecuatorial N N M. perstans
4 Móstoles, Madrid Guinea Ecuatorial N N M. perstans
5 Móstoles, Madrid Guinea Ecuatorial N N M. perstans
6 Móstoles, Madrid Camerún NRa L. loa NR
7 Móstoles, Madrid Gabón NR N M. perstans
8 Móstoles, Madrid Guinea Ecuatorial N N M. perstans
9 Getafe, Madrid Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
10 Getafe, Madrid Africano M. perstans N M. perstans
11 Getafe, Madrid Africano M. perstans N M. perstans
12 Getafe, Madrid - L. loa + M. perstans L. loa L. loa + M. perstans
13 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
14 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
15 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
16 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial M. perstans L. loa M. perstans
17 U. Central de Asturias Senegal N N M. perstans
18 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial N N M. perstans
19 U. Central de Asturias Área endémica N N M. perstans
20 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial NR N M. perstans
21 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial NR N M. perstans
22 U. Central de Asturias Cooperante N N M. perstans
23 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial N N M. perstans
24 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial N N M. perstans
25 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial NR N M. perstans
26 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial N N M. perstans
27 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
28 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
29 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
30 U. Central de Asturias Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
31 Poniente, Almería Senegal M. perstans N M. perstans
32 Poniente, Almería Senegal N N M. perstans
33 Poniente, Almería Senegal N N M. perstans
34 Poniente, Almería Senegal M. perstans N M. perstans
35 Poniente, Almería - M. perstans N M. perstans
36 Poniente, Almería - N N M. perstans
37 Poniente, Almería - NR N M. perstans
38 Poniente, Almería Guinea-Bissau M. perstans N M. perstans
39 Poniente, Almería - NR N M. perstans
40 Poniente, Almería - M. perstans N M. perstans
41 Poniente, Almería Guinea-Bissau N N M. perstans
42 Poniente, Almería - N N M. perstans
43 Poniente, Almería Senegal N N M. perstans
44 Poniente, Almería Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
45 Ramón y Cajal, Madrid - L. loa L. loa L. loa
46 Ramón y Cajal, Madrid - N N M. perstans
47 Ramón y Cajal, Madrid Congo N N L. loa
48 General de Elche, Alicante Mali M. perstans N M. perstans
49 U. Carlos Haya, Málaga Nigeria L. loa L. loa L. loa
50 Nuestra Señora Candelaria Guinea Ecuatorial L. loa L. loa L. loa
51 Virgen del Rocío, Sevilla Nigeria M. perstans L. loa M. perstans
52 U. Valencia Guinea Ecuatorial NR L. loa N
53 U. Valencia Guinea Ecuatorial N N M. perstans
54 Lab. BR Salud - NR L. loa L. loa
55 Fuenlabrada, Madrid - L. loa + M. perstans L. loa L. loa + M. perstans
56 Fuenlabrada, Madrid - M. perstans N M. perstans
57 Alcorcón, Madrid Guinea-Bissau M. perstans N M. perstans
58 Carlos III, Madrid Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
59 Severo Ochoa, Madrid Guinea Ecuatorial NR N M. perstans
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Tabla 2 (Continuación)

N.◦ Hospital Origen Técnica de Knott Nested-PCR L. loa ITS1-RFLP

60 Sabadell, Barcelona - N N M. perstans

61 Móstoles, Madrid Guinea Ecuatorial N N M. perstans
62 Guadalajara Subsahariano L. loa L. loa L. loa
63 General de Ciudad Real Guinea Ecuatorial NR N M. perstans
64 General de Ciudad Real Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
65 Germans Trias, Barcelona Africano NRb L. loa NR
66 Germans Trias, Barcelona Senegal M. perstans N N
67 Virgen del Camino, Navarra Camerún NRa L. loa NR
68 San Millán, Logroño Gabón N L. loa L. loa
69 San Millán, Logroño Gabón NRa L. loa NR
70 Institut Català de la Salut, Barcelona Guinea Ecuatorial N L. loa M. perstans
71 Institut Català de la Salut, Barcelona Guinea Ecuatorial M. perstans N M. perstans
72 Institut Català de la Salut, Barcelona Guinea Ecuatorial N N M. perstans
73 Institut Català de la Salut, Barcelona Guinea Ecuatorial L. loa + M. perstans L. loa L. loa + M. perstans
74 Institut Català de la Salut, Barcelona Guinea Ecuatorial N N M. perstans
75 U. Miguel Servet, Zaragoza Guinea Ecuatorial NR L. loa L. loa

N: negativo; NR: no realizado; -: sin datos.

a
Helminto adulto.
b
Humor vítreo.

M. perstans (n = 25 frente a n = 57) en el total de muestras positivas. Discusión

Sin embargo, se dieron ciertas discrepancias como en el caso de la
muestra #66 en la que solo la técnica de concentración de Knott En este trabajo se presentan los resultados del diagnóstico de
permitió la detección de M. perstans de aquí que el número total de filariasis mediante PCR, así como con el método de concentración
muestras positivas a esta filaria por todos los métodos diagnósticos de Knott, en 523 muestras clínicas remitidas al Servicio de Parasi-
utilizados sea de n = 58. Así mismo, el número total de muestras tología del CNM-ISCIII. Actualmente, el diagnóstico de filariasis en
positivas a L. loa fue de n = 12 y no n = 11, ya que la muestra #47 el ámbito hospitalario se basa en la sospecha clínica y la presen-
solo pudo ser detectada mediante la ITS1-RFLP. Hay que tener en cia de eosinofilia. Además, el diagnóstico de certeza que se realiza
cuenta que en 11 muestras que resultaron positivas por los méto- a través de la observación al microscopio de las microfilarias en
dos moleculares fue imposible realizar la técnica de concentración sangre, en frotis realizados directamente y teñidos con Giemsa
de Knott por falta de material. Estas pudieron ser diagnosticadas o tras un método de concentración como el de Knott, tiene una
por alguna de las técnicas de PCR resultando ser 3 positivas a L. loa sensibilidad baja; en este sentido hay que destacar que en áreas
y 8 a M. perstans. Por otro lado, las muestras #16 y #51 única- endémicas el 70% de los individuos son amicrofilarémicos (por
mente fueron positivas a M. perstans por la técnica de Knott y ejemplo, loasis oculta)10,17 . A pesar de que la microscopia conti-
por PCR (ITS1-RFLP) y positivas a L. loa mediante la nested-PCR. núa siendo la piedra angular en el diagnóstico de estas especies
Además, las muestras #68 y #70 fueron negativas por la técnica de filarias, esta metodología requiere además personal muy cuali-
de Knott, sin embargo, L. loa se detectó en ambas muestras por la ficado. Así mismo, la detección de anticuerpos del tipo IgG4 que se
nested-PCR. En estas muestras, #68 y #70, se determinó la presen- lleva a cabo con diferentes tests serológicos presenta como desven-
cia de L. loa y M. perstans, respectivamente, mediante ITS1-RFLP. taja la falta de sensibilidad (del 56 al 98%) y especificidad (del 78
Por lo tanto, estos individuos presentaban loasis oculta ya que las al 98%) para establecer un diagnóstico certero debido a la ausencia
microfilarias de L. loa no pudieron ser detectadas en sangre por los de infección activa y a las reacciones cruzadas con otros helmintos,
métodos tradicionales. Finalmente, las 3 infecciones mixtas fue- respectivamente19,20 . Únicamente la detección de antígenos circu-
ron detectadas tanto por la técnica de Knott como por la ITS-RFLP lantes de filarias es un método útil en el diagnóstico de W. bancrofti,
(tablas 2 y 3). relacionándose las cantidades de antígeno Og4C3 con la intensidad
La sensibilidad y especificidad, así como los cocientes de proba- de la parasitación21 .
bilidad positivos y negativos de cada una de las técnicas de PCR, se Por el contrario, el análisis de las muestras mediante las téc-
muestran en la tabla 4. nicas moleculares, nested-PCR e ITS-RFLP, optimizadas en nuestro
De los 5 helmintos adultos, solo se pudo realizar la extracción de laboratorio, permiten la detección diferencial y específica de L. loa
ADNg con éxito en 4 casos ya que las condiciones de conservación y M. perstans en la población inmigrante, así como en viajeros y
en formol de uno de ellos impidió la obtención de ADN de calidad cooperantes procedentes de áreas endémicas con gran sensibili-
para llevar a cabo su amplificación. Las 4 muestras fueron positi- dad y especificidad como queda reflejado en la tabla 4. Además,
vas mediante nested-PCR y además 2 de ellas fueron identificadas el cálculo de los valores de los cocientes de probabilidad positivos
también por la ITS1-RFLP. Hay que resaltar, además, que la muestra (CP+) y del cociente de probabilidad negativo (CP−), que depen-
de humor vítreo de un paciente con filariasis ocular resultó posi- den de los valores de sensibilidad y especificidad de las técnicas
tiva mediante la nested-PCR (tabla 2), confirmando la presencia de de PCR, resultó en unos valores elevados de CP+ que indican una
material nucleico parasitario en dicha muestra. mejor capacidad para diagnosticar la presencia de enfermedad y
valores bajos de CP− indicando una mejor capacidad diagnóstica
de la prueba en relación con la técnica de Knott (tabla 4).
Tabla 3 La ITS-RFLP, además, posibilita la detección y discriminación
Resumen de los resultados obtenidos con las 517 muestras de sangre específica de estas 2 especies de filarias de W. bancrofti. Aunque
Especie de filaria Técnica de Knott Nested-PCR L. loa ITS1-RFLP en las 517 sangres analizadas no se detectó ningún caso de para-
sitación por esta especie de filaria, la utilidad de esta técnica en el
Loa loa 4 11 8
Mansonella perstans 25 0 57 diagnóstico diferencial de W. bancrofti se ha podido validar en un
L. loa + M. perstans 3 3 3 trabajo publicado previamente14 .
Negativo 377 503 449 Hay que destacar también que el diagnóstico molecular no sólo
No determinado 108 0 0
se puede realizar a partir de sangre conservada con EDTA, sino
670 M. Jiménez et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(9):666–671

Tabla 4
Sensibilidad y especificidad de las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa

Técnica de PCR Sensibilidad (%) (IC del 95%) Especificidad (%) (IC del 95%) CP + (IC del 95%) CP− (IC del 95%)

Nested-PCR Loa loa 100 (59-100) 98,9 (97,3-99,7) 94,2 (35,5-249) 0

ITS1-RFLP L. loa 100 (59-100) 99,5 (98,1-99,9) 188,5 (47,3-750,9) 0
ITS1-RFLP M. perstans 96,4 (81,6-99,9) 93,3 (90,4-95,6) 14,5 (9,8-21,3) 0,04 (0,01-0,26)

CP+: cociente de probabilidad positivo; CP−: cociente de probabilidad negativo; IC: intervalo de confianza.

que además se puede emplear también en muestras de sangre sangre procedentes de inmigrantes subsaharianos, aunque la sen-
recogidas en papel Whatman14 . Esta observación es de interés en sibilidad de esta PCR no parece ser lo suficientemente elevada para
el caso de llevar a cabo encuestas epidemiológicas en países endé- el diagnóstico de loasis oculta en individuos amicrofilarémicos. La
micos donde existen serias dificultades para la conservación y el positividad frente a L. loa obtenida en las muestras de 3 inmigrantes
transporte de las muestras a laboratorios de referencia. Así mismo, procedentes de Guinea Ecuatorial (#16 y #70) y Nigeria (#51),
los protocolos moleculares han sido aplicados con éxito a partir del respectivamente, confirma la mayor sensibilidad de la nested-PCR
ADNg obtenido tanto de helmintos adultos como de humor vítreo. frente a la ITS1-RFLP en el diagnóstico de loasis oculta. Esta nested-
Definitivamente, el diagnóstico molecular es más sensible y pre- PCR ha sido utilizada previamente con éxito en el diagnóstico de
ciso que el método de concentración de Knott. Además, hay que loasis oculta en Gabón y Guinea Ecuatorial13,17,26 . Aunque si bien
tener en cuenta, en la gran mayoría de los casos, la cantidad de en el caso de las muestras #47 y #68, correspondientes a inmigran-
sangre que se remite al analista es menor de 1 ml, cantidad insu- tes de Congo y Gabón respectivamente, la ITS1-RFLP resultó tener
ficiente para la realización del método de concentración de Knott, mayor o igual sensibilidad que la nested-PCR respectivamente.
siendo solo posible la extracción de ADNg, para la que únicamente Para terminar se debe indicar que con el fin de aumentar la sensi-
se necesitan 100-200 ␮l que después se utiliza en las reacciones de bilidad de la ITS1-RFLP, se han desarrollado 3 nested-PCR diseñadas
PCR. En nuestro caso fueron un total de 108 muestras de sangre las a partir de esta PCR, específicas para cada una de las especies de fila-
que no pudieron ser analizadas por este motivo. rias, y que se encuentran en fase de validación para su incorporación
El número de muestras que resultaron positivas en el total de en el diagnóstico de rutina14 .
517 muestras de sangre estudiadas alcanzó un 13,5%, de las que 12 En conclusión, los métodos moleculares desarrollados deben ser
fueron positivas a L. loa (2,3%). Este resultado es algo superior al utilizados simultáneamente junto con la técnica de concentración
obtenido en un estudio de detección de loasis mediante microsco- de Knott en el diagnóstico y diferenciación de L. loa, M. perstans
pia realizado a 1.638 inmigrantes procedentes de zonas endémicas y W. bancrofti en muestras clínicas de individuos procedentes de
en los que 30 de ellos (1,83%) resultaron positivos2 . En un estudio áreas endémicas donde coexisten las 3 especies de filarias.
previo de 40 muestras de sangre de individuos subsaharianos se
encontró un 5% de parasitación por L. loa14 . Quizás las diferencias Conflicto de intereses
encontradas se puedan explicar por la sensibilidad de los protoco-
los de amplificación empleados o por las diferencias en el origen Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
geográfico de los pacientes analizados.
Recientemente se han descrito trabajos en los que se valora
la asociación entre las infecciones por helmintos, entre ellos Agradecimientos
M. perstans y L. loa, con el VIH4,22 . En nuestro caso 11 de los
individuos (2,1%) presentaban anticuerpos frente al VIH, sin Trabajo financiado por RICET-FIS (RD06/0021/0019). Este tra-
embargo solo en uno de los individuos seropositivos se detectó bajo ha sido posible gracias a las muestras suministradas por los
M. perstans. También se ha descrito que existe una correlación clínicos de los diferentes centros sanitarios de las comunidades
entre la presencia de eosinofilia y las alteraciones cutáneas con autónomas.
infecciones por helmintos23,24 . En este sentido, aunque las infec-
ciones por M. perstans son a menudo asintomáticas, pueden Bibliografía
causar eosinofilia y prurito4 . Así, en 17 individuos con datos
clínicos, la eosinofilia estuvo asociada a M. perstans en 12 y el 1. World Health Organization. Lymphatic filariasis. WHO 2010 [consultado
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parasitación con varias especies de filarias como por ejemplo
related eosinophilia in african immigrants, Gran Canaria. Emerg Infect Dis.
L. loa/M. perstans25 . En nuestro caso se detectaron 3 infecciones 2006;12:1587–9.
mixtas por L. loa/M. perstans, que no pudieron asociarse a ningún 4. Simonsen PE, Onapa AW, Asio SM. Mansonella perstans filariasis in Africa. Acta
Trop. 2010, doi:10.1016/j.actatropica.201001.014.
signo clínico o analítico compatible con filariasis por falta de datos
5. Monge-Maillo B, Jiménez BC, Pérez-Molina JA, Norman F, Navarro M,
clínico-epidemiológicos. Una de las infecciones mixtas procedía de Pérez-Ayala A, et al. Imported infectious diseases in mobile populations, Spain.
un individuo de Guinea Ecuatorial. Emerg Infect Dis. 2009;15:1745–52.
Por otro lado, todas las muestras diagnosticadas procedentes de 6. Chen LH, Wilson ME, Davis X, Loutan L, Schwartz E, Keystone J, et al. Schlagen-
hauf P: GeoSentinel Surveillance Network. Emerg Infect Dis. 2009;15:1773–82.
viajeros y cooperantes de áreas endémicas fueron negativas, si bien
7. Nuchprayoon S. DNA-based diagnosis of lymphatic filariasis. Southeast Asian J
el número de no fue muy elevado respecto al total (11%). Recien- Trop Med Public Health. 2009;40:904–13.
temente se ha descrito un caso de loasis oculta en un individuo 8. Rosenblatt JE. Laboratory diagnosis of infections due to blood and tissue para-
japonés que tras un viaje a Camerún presentó sintomatología com- sites. Clin Infect Dis. 2009;49:1103–8.
9. Klion AD. Filarial infections in travelers and immigrants. Curr Infect Dis Rep.
patible con loasis y paso del parásito adulto por la conjuntiva ocular 2008;10:50–7.
sin microfilaremia; en este caso no se pudo llevar a cabo el diag- 10. Walther M, Muller R. Diagnosis of human filariases (Except Onchocerciasis).
nóstico mediante la nested-PCR utilizada en el presente trabajo11 . Adv Parasitol. 2003;53:149–93.
11. Yoshikawa M, Ouji Y, Hayashi N, Moriya K, Nishiofuku M, Ishizaka S, et al.
La ITS1-RFLP utilizada ha sido previamente evaluada en la detec- Diagnostic problems in a patient with amicrofilaremic Loa loa. J Travel Med.
ción y discriminación de las 3 especies de filarias en muestras de 2008;15:53–7.
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