Practica Tincion de Gram

Introducción:
La tinción de Gram nos ayuda a distinguir entre un 95-98% de las bacterias del
mundo, se usa sobre todo para bacterias.
Una característica taxonómica importante de las bacterias es su respuesta a la
tinción de Gram. El color del cual se tiñen depende de la estructura de su pared
celular. Para la tinción se utilizan dos colorantes diferentes y un estabilizador.
Los procedimientos de tinción de Gram inician con la aplicación de un colorante
básico, violeta de genciana. A continuación se aplica una solución de yodo;
todas las bacterias se tiñen de color azul en este momento. Luego se trata con
alcohol. Las bacterias grampositivas que conservan el complejo de violeta de
genciana-yodo adquieren un color azul y las células gramnegativas se
decoloran por completo con la adición de alcohol. Como ultimo paso se aplica
otro colorante de forma que las bacterias gramnegativas decoloradas
adquieren un color contraste; las células grampositivas adquieren un color
violáceo. La base de la reacción es la estructura de la pared celular. A mayor
cantidad de peptidoglicano mayor cantidad de cristales se forman con el cristal
violeta.
La tinción de Gram nos puede proporcionar una información rápida para
diagnosticar infecciones, hace posible distinguir entre contaminación de la
muestra y una verdadera infección.
Objetivos:
1. Realizar correctamente un frotis y teñirlo por el método de Gram.
2. Explicar la utilidad e importancia de la tinción de Gram.
Fundamento:
La tinción de Gram, descubierta hace poco más de 100 años por Hans
Christian Gram, es una de las tinciones diferenciales de mayor importancia en
los laboratorios de bacteriología. El cristal violeta (violeta de genciana) sirve
como tinción primaria, uniéndose a la pared celular bacteriana después del
tratamiento con una solución débil de yodo, lo cual sirve como mordiente para
la unión del colorante. Algunas especies bacteriana, debido a la naturaleza
química de su pared celular, tienen la capacidad de retener el cristal violeta aún
después del tratamiento con un decolorante orgánico, como la mezcla de
partes iguales de alcohol etílico al 95 % y acetona. Las bacterias que retienen
el colorante se ven azul/negro cuando se observan con el microscopio y se
denominan grampositivas. Ciertas bacterias pierden la tinción primaria con
cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante, quizá debido al alto
contenido lipídico de su pared celular. Estas bacterias decoloradas captan la
contra tinción con safranina y se ven de color rojo cuando se observan con el
microscopio y se denominan gramnegativas.
Material y reactivos:
1. Microscopio
2. Portaobjetos
3. Aceite de inmersión
4. Asa bacteriológica
5. Mechero
6. Reactivos para la coloración de Gram: Cristal violeta, Yodo de Gram, alcohol
acetona y safranina
7. Cultivos bacterianos (Staphylococcus sp y Escherichia coli).
Metodología:
1. Prepare un frotis bacteriano de los cultivos proporcionados de la siguiente
manera: cerca de uno de los extremos del portaobjetos prepare un pequeño
frotis de E. coli, en el otro extremo del portaobjetos prepare otro de
Staphylococcus sp.
2. Fijar al calor.
3. Colocar el portaobjetos sobre la bandeja de coloración.
4. Agregar cristal violeta, dejándolo por un minuto.
5. Descartar el exceso de colorante y lavar con agua brevemente y con
suavidad.
6. Aplicar el Yodo de Gram, dejándolo reaccionar por un minuto.
7. Descartar el reactivo y lavar con agua.
8. Agregar con mucho cuidado, gota a gota, la solución decolorante (alcohol-
acetona) hasta que las gotas de la solución ya no arrastren color.
9. Lavar con agua.
10. Finalmente cubra el portaobjetos con la solución de safranina (colorante de
contraste) dejándola reaccionar de 30 segundos.
11. Lavar con agua.
12. Secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
13. Hacer esquemas de lo observado para cada una de las cepas
proporcionadas
Cuestionario:
1. ¿Qué es una tinción diferencial? En esta tinción se utiliza mas de un tipo
de colorante y es utilizada para observar diferencias entre diferentes
bacterias o distinguir las estructuras dentro de una célula.
2. ¿Qué ventajas tiene esta sobre la tinción simple? En la tinción simple
solo podemos distinguir a las bacterias y clasificarlas de acuerdo a su
agrupación y forma (como cocos, bacilos, etc) en cambio en la tinción
diferencial podemos distinguir el tipo de bacteria, así como algunas de
sus estructuras.
3. ¿Por qué en la tinción de Gram se tiñen unas bacterias de color violeta y
otras de color rojo? La diferencia de tinciones se debe a la estructura de
las paredes celulares de ambos tipos de bacterias. Las bacterias Gram
positivas tienen una pared gruesa compuesta de peptidoglucanos y
polímeros, e impermeable, que hace que resista la decoloración. En
cambio, las bacterias Gram negativas tienen un capa delgada de
péptidoglucanos mas una bicapa de lipoproteínas que se pueden
deshacer con la decoloración.
4. ¿Cuál es el papel del yodo en la tinción de Gram? funciona como
mordiente para el cristal violeta.
5. ¿Señale en que casos se prefiere utilizar tinción simple y en cuales
tinciones diferenciales? La tinción simple nos ayuda en caso de que
quisiéramos observar si hay presencia de bacterias en un sitio y la
tinción diferencial ayuda a determinar cual es la bacteria que se
encuentra.
6. ¿Qué función tiene la safranina en la tinción de Gram? Ayuda a que las
bacterias Gramnegativas decoloradas adquieran un color contraste.
Conclusión:
 La tinción de Gram divide a las bacterias en dos; gran positivas y
negativas, las positivas se tiñen de azul y las negativas de rojo, esta
tinción nos ayuda a identificar que tipo de bacteria estamos observando.
 Las diferencias de coloración se deben a las diferencias que existen en
las paredes celulares de las bacterias.
 Casi todas las bacterias pueden ser identificadas por medio de esta
tinción con excepción por ejemplo los micoplasmas.
 Las tinciones diferenciales nos ayudan a identificar el tipo de bacteria
con la que estamos tratando a diferencia de las tinciones simples con las
cuales solo podemos observar que hay bacterias.

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