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    Practica 5-A Purificacion y Cuantificacion de ADN

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    Gustavo LV
    Este documento describe un experimento realizado por el Equipo #3 para purificar y cuantificar ADN a partir de Bacillus subtilis. En primer lugar, se utilizó un buffer de lisis para eliminar la pared celular bacteriana y exponer el material genético. Luego, mediante lavados con etanol puro y al 70%, se precipitó el ADN en un tubo Eppendorf. Finalmente, se concluyó que el método del buffer de lisis es eficiente para obtener ADN puro, aunque no muy rendimiento, por lo que se deben explorar

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    Practica 5-A Purificacion y Cuantificacion de ADN

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    Este documento describe un experimento realizado por el Equipo #3 para purificar y cuantificar ADN a partir de Bacillus subtilis. En primer lugar, se utilizó un buffer de lisis para eliminar la pared celular bacteriana y exponer el material genético. Luego, mediante lavados con etanol puro y al 70%, se precipitó el ADN en un tubo Eppendorf. Finalmente, se concluyó que el método del buffer de lisis es eficiente para obtener ADN puro, aunque no muy rendimiento, por lo que se deben explorar

    Descripción original:

    problemas de agitación y mezclado

    Título original

    Practica 5-A Purificacion y cuantificacion de ADN

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    Practica 5-A Purificacion y Cuantificacion de ADN

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    Este documento describe un experimento realizado por el Equipo #3 para purificar y cuantificar ADN a partir de Bacillus subtilis. En primer lugar, se utilizó un buffer de lisis para eliminar la pared celular bacteriana y exponer el material genético. Luego, mediante lavados con etanol puro y al 70%, se precipitó el ADN en un tubo Eppendorf. Finalmente, se concluyó que el método del buffer de lisis es eficiente para obtener ADN puro, aunque no muy rendimiento, por lo que se deben explorar

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    Equipo #3

    30/10/2018
    Beltrán Rábago Luis Hernán
    Guerrero Guzmán Adrian
    Hernández Martínez Edher Daniel
    López Vargas Julia Edith.
    Valdivia Vázquez Jovana Ameyalli
    Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”

    I​ntroducción. de la pureza de la misma, la cual facilita el


    El descubrimiento de que la información análisis de la información codificada en
    genética está codificada a lo largo de una esa molécula de DNA en particular. Por
    molécula polimérica compuesta de solo consiguiente, el DNA puede secuenciarse
    cuatro tipos de unidades monoméricas fue y analizarse, además de expresarse para
    uno de los principales logros científicos permitir el estudio de su producto proteico.
    del siglo XX. Esta molécula polimérica, el Existe una gran variedad de métodos para
    ácido desoxirribonucleico (ADN), es la el aislamiento del DNA, estos métodos se
    base química de la herencia, y está diferencian en la pureza del producto final,
    organizada en genes, las unidades en el tiempo necesario para llevarlos a
    fundamentales de la información genética, cabo y en la posibilidad de aplicarlos en
    dirige la síntesis de RNA, y a su vez, aislamientos a pequeña o gran escala; sin
    sintesis de proteinas.⁷ embargo todos incluyen tres etapas
    En algunos organismos como bacterias comunes: crecimiento de las bacterias y
    contienen plásmidos que son moléculas amplificación del plásmido, cosecha y lisis
    de ADN circulares cerradas de las bacterias y purificación del ADN
    covalentemente que poseen los plasmídico. ⁹
    procariotas y se heredan de manera La lisis, o ruptura de las células, es el
    estable en estado extra cromosómico. primer paso para la extracción del ADN.
    Esta definición implica homogenización Esto se logra mediante el uso de una
    genética, tamaño constante de las solución buffer que contenga solución Tris
    unidades monoméricas y la capacidad de y EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético).
    replicarse independientemente del El EDTA se une a cationes divalentes
    cromosoma. Los genes existentes en los tales como el calcio y el magnesio. Dado
    plásmidos codifican para distintos que estos iones ayudan a mantener la
    caracteres fenotípicos como: resistencia a integridad de la membrana celular, la
    antibióticos, producción de antibióticos, eliminación de estos con EDTA
    resistencia a metales pesados, desestabiliza la membrana. La solución
    degradación de compuestos aromáticos, Tris es el principal componente buffer; su
    etc. Estos plásmidos pueden ser función principal es la de mantener el pH
    modificados para utilizarse como vectores del buffer en un punto estable, por lo
    de expresión (donde el fragmento de ADN general 8,0. Además, la solución Tris
    insertado codifica para alguna proteína de interactúa con el LPS (lipopolisacárido) de
    interés). ⁷ la membrana, lo cual sirve para
    Gran parte del análisis molecular de los desestabilizar la membrana aún más.
    genes y su función requieren de EL buffer de lisis ​es una solución de
    separación de segmentos específicos de tampón que se utiliza con el fin de romper
    DNA a partir de moléculas mucho más células abiertas para usar en
    grandes y de su amplificación selectiva.⁸ experimentos de biología molecular que
    El aislamiento de una cantidad de analizan los compuestos de las células
    una molécula de DNA individual depende (por ejemplo, Western Blot). La mayoría
    Equipo #3
    30/10/2018
    Beltrán Rábago Luis Hernán
    Guerrero Guzmán Adrian
    Hernández Martínez Edher Daniel
    López Vargas Julia Edith.
    Valdivia Vázquez Jovana Ameyalli
    Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”

    de los tampones de lisis contienen sales Metodología.


    (por ejemplo, Tris-HCl o EDTA) para “Medición de la actividad enzimática
    regular la acidez y osmolaridad del lisado. de la muestra”
    A veces se agregan detergentes (como
    Triton X-100 o SDS) para romper las
    estructuras de la membrana.
    Para la extracción de ADN plasmídico se
    lisan las células por el agregado de un
    detergente. Las condiciones
    desnaturalizan y el ADN cromosómico
    estará mayoritariamente en forma
    fragmentada (múltiples moléculas
    lineales) y el plásmido que en relación es
    más pequeño, se mantendrá cerrado.
    Cuando el extracto celular es neutralizado
    (por ejemplo con ácido acético) bajo
    condiciones de alta concentración salina
    (acetato de sodio), el ADN cromosomal
    precipita; obedeciendo a la reasociación
    inespecífica de las largas cadenas de
    ADN simple cadena, que ocurre en
    múltiples sitios formando una masa
    insoluble.

    Objetivo.
    Se debe, extraer ADN a partir de
    Bacillus subtilis y cuantificar el ADN,
    extraído por un método
    espectrofotométrico.

    Materiales.
    1 micropipeta 20-200uL/ 2 puntas
    amarillas/ 1 micropipeta 100-1000 uL/
    2 puntas azules/ 1 piseta de agua/ 1
    piseta de etanol 70%/ 6 tubos
    eppendorf/ 2 tubos de ensayo / 1
    gradilla / 1 embudo / suspensión
    bacteriana/ Buffer de lisis/ H2O mili Q.
    Equipo #3
    30/10/2018
    Beltrán Rábago Luis Hernán
    Guerrero Guzmán Adrian
    Hernández Martínez Edher Daniel
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    Valdivia Vázquez Jovana Ameyalli
    Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”

    Discusión.
    En esta práctica, se obtuvieron las
    cantidades de ADN en una pastilla, en
    el tubo de Eppendorf. Se debe
    purificar y cuantificar ​“Bacillus
    Subtilis”,​ con ayuda de un cultivo
    (Buffer de Lisis) que se preparó para
    la clase, y de esa manera el lograr
    poder eliminar la pared celular (bicapa
    lipídica), es decir el peptidoglucano
    (moreira) ​B​-1-4 de la lisozima. Aunado
    a ello, se debe llevar a cabo un lavado
    de etanol puro y luego con etanol al
    70%, para así lograr precipitar el ADN,
    de la bacteria.
    En esta primer parte, se logró
    cumplir el objetivo de purificar la
    proteína, aunque se tuvieron que
    llevar a cabo más lavados de los
    esperados, para así poder lograr tener
    mas del ADN, en la pastilla que se
    pondrá para realizar las siguientes
    etapas de la misma.

    Resultados. Conclusiones.
    Se eliminó la pared celular La utilización del Buffer de lisis es un
    (peptidoglicano) y las membranas que método eficiente para la obtención de
    rodean a la bacteria, conformadas por ADN puro, lo que es útil para estudios
    fosfolípidos y proteínas, dejando cualitativos específicos. Por otro lado,
    expuesto el material genético. si se desea obtener una mayor
    Al final del procedimiento se cantidad de ADN, es recomendable
    obtuvo dentro del tubo Eppendorf un explorar otros métodos para su
    líquido transparente, pues el material obtención, ya que el método utilizado
    genético quedó hidratado en la práctica no tiene un rendimiento
    manteniéndolo en solución (agua Milli muy grande. Por ello, es importante
    Q). identificar primero el objetivo de la
    utilización del ADN para así elegir el
    Equipo #3
    30/10/2018
    Beltrán Rábago Luis Hernán
    Guerrero Guzmán Adrian
    Hernández Martínez Edher Daniel
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    Valdivia Vázquez Jovana Ameyalli
    Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”

    método más adecuado para las Editorial McGraw- Hill


    necesidades específicas. Companies, inc. 29° edición.
    Bibliografía. (2013). USA.
    8. Watson, J. D., Baker, T., Bell,
    1. Dill, K. A. & Shortle, D., S., Gann, A., Levine, M.
    estado de desnaturalización Biología Molecular del Gen,
    de proteínas. Annu. Rev. 7° edición., Editorial médica
    Bioquímica. 60, 795 (1991). panamericana S.A de C.V.
    2. LEHNINGER, A., NELSON, D., 9. Alberts B., Bray D., Lewis J.,
    COX, M., Principios de Raff M., Roberts K., Watson
    Bioquímica, 4º Edición, Ed. J.D. Biología molecular de la
    Omega, Barcelona, 2015, pp. célula (1996) Omega.
    190,
    3. Carrillo Wilman., (4 -
    DICIEMBRE
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    https://www.frro.utn.edu.ar/re
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    anio/biotecnologia/practico4.
    pdf
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    Bioquímica general:
    fundamentos y análisis de
    laboratorio. Machala, Ecuador
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    Machala.
    7. Murray, R., Bender, D.,
    Kennelly, P., & Rodwell, V.
    Harper Bioquímica Ilustrada.

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