UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA

CARRERA DE BIOLOGÍA
Laboratorio de Biomoléculas

PRÁCTICA #1
CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES
Y CROMATOGRAFÍA DE CARBOHIDRATOS EN PAPEL

INTRODUCCIÓN

En los alimentos procesados es común encontrar diferentes tipos de carbohidratos

o azúcares adicionados para mejorar el sabor, uno de los ingredientes más utilizados es el
jarabe de maíz de alta fructosa. Éste es barato, más dulce que el azúcar y alarga la vida
de anaquel de los productos; está presente en refrescos, jugos, jaleas, pan, catsup,
comida para niños, galletas, etc. Sin embargo, se ha demostrado que el consumo
excesivo y desde temprana edad trae consecuencias negativas para la salud; como
obesidad, diabetes, acumulación de ácido úrico y enfermedades cardiovasculares.
Utilizando cromatografía en papel y cuantificación por el método Nelson-Somogy durante
esta práctica e investigando, responderemos a las siguientes preguntas: ¿Cuál es la
composición molecular del jarabe de maíz de alta fructosa? ¿Qué carbohidratos lo
componen principalmente? ¿En qué concentración se encuentran?

Los azúcares son moléculas con grupos carbonilo e hidroxilo (Figura 1) que pueden
experimentar diversas reacciones químicas entre las que se encuentran: la oxidación, la
reducción, la isomerización, la esterificación, la formación de glucósidos y la glucosilación.
La oxidación puede llevarse a cabo en presencia de agentes oxidantes modificando los
grupos funcionales de los carbohidratos; por ejemplo, al oxidarse el grupo aldehído se
forma un ácido aldónico, mientras que al oxidarse un grupo terminal CH2OH (pero no del
grupo aldehído) se forma ácido urónico. La oxidación de ambos grupos produce ácido
aldárico.

Figura 1. (a) Proyección de Fischer de una D-glucosa y (b) Proyección de Haworth de una
α-D-glucopiranosa

Los azúcares que pueden ser oxidados por agentes oxidantes débiles como lo son
algunos iones metálicos; como el Cu2+, se denominan azúcares reductores. Debido a que
la reacción sólo se produce con azúcares que pueden regresar a la forma de cadena
abierta, todos los monosacáridos son azúcares reductores. Entonces, ¿Qué parte de los
polisacáridos reaccionará con un agente oxidante como el Cu2+? ¿Qué crees que
suceda con un disacárido como la lactosa o la sacarosa? ¿Un polisacárido tendrá el
mismo comportamiento químico?

Uno de los métodos cuantitativos empleados para la determinación de la

concentración total de carbohidratos es el de Nelson-Somogy que consiste en hacer
reaccionar un azúcar reductor con el ión cúprico en medio alcalino, para formar óxido
cuproso de color rojo que es insoluble y por lo tanto, se precipita (como en el caso de la
prueba de Fehling). Como no puede valorarse directamente con metodologías simples, se
trata con el reactivo de arsenomolibdato, que lo solubiliza formando una solución verde
cuya intensidad de color es proporcional a la concentración del precipitado cuproso. La
intensidad del color es fácil de medir con un espectrofotómetro a 660 nm.

En este método el factor limitante es el agente reductor (glucosa) estando los

reactivos en exceso, por lo que puede usarse para medir la cantidad de Cu2O que es
proporcional a la cantidad de glucosa originalmente presente. La reacción se aplica con
buenos resultados a filtrados de sangre y otras soluciones, la sensibilidad es de 25 a
250 μg/ml.

El análisis de la composición cualitativa de carbohidratos de una muestra se puede

realizar por métodos cromatográficos. La cromatografía es un método eficaz para la
separación de mezclas de diferentes sustancias. Hay dos tipos de cromatografías;
ascendente y descendente. En la cromatografía en papel, a medida que un disolvente que
contiene una mezcla de diferentes sustancias asciende por capilaridad por el papel,
mantenido en posición vertical (o desciende en la cromatografía descendente), se
producen multitud de distribuciones microscópicas de las diferentes sustancias en estudio
entre la fase que fluye y la fase estacionaria acuosa, ligada a las fibras de papel. Al final
del proceso las diferentes sustancias han recorrido distancias diferentes desde su origen.
Entonces, ¿qué interacciones químicas permiten que el soluto sea arrastrado y
separado? ¿en la cromatografía en papel, cuál es la fase móvil, cuál la estacionaria?
¿qué grado de polaridad tiene cada parte de la solución que utilizarás para
desarrollar la cromatografía?

Las moléculas separadas en la cromatografía se caracterizan por su Rf particular,

que es una relación de la distancia recorrida por el soluto entre la distancia del origen
hasta el frente del solvente:

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙í𝑛𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜 (𝑐𝑚)

𝑅𝑓 = 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙í𝑛𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜 ℎ𝑎𝑠𝑡𝑎 𝑒𝑙 𝑓𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 (𝑐𝑚)

Ésta relación nos permite la identificación de muestras desconocidas, incluso mezclas, si

comparamos el valor del Rf de cada especie desconocida con el Rf particular de
sustancias de referencia de identidad conocida. Así podremos determinar la identidad de
nuestras muestras problema, además de identificar las concentraciones de carbohidratos
reductores en el jarabe fructosado con el método de Nelson-Somogyi.

¿Será que la etiqueta del producto nos dice la verdad?

OBJETIVOS

1. Determinar la composición de azúcares de un producto rico en jarabe fructosado y

mezclas problema por cromatografía en papel.
2. Discutir los fundamentos fisicoquímicos que intervienen en la cromatografía en
papel.
3. Calcular la concentración de azúcares reductores de un jarabe fructosado utilizando
el método Nelson-Somogyi.

Material Reactivos
●1 cámara cromatográfica
● Patrón de glucosa 100 μg/ml
●1 pocillo + contenedor grande para
agua caliente y mechero ● N-propanol + acetato de etilo + agua (7:1:2)
●Tubos capilares ● Carbohidratos de referencia: sorbitol, ribosa,
●Papel Whatman del No. 3 dextrosa, fructosa, arabinosa, galactosa,
●Espectrofotómetro lactosa, sacarosa.
●1 vaso de precipitados de 100 ml ● Solución de AgNO 3 0.0025% en acetona
●1 gradilla para tubos de ensayo ● Solución de NaOH 0.5 % en etanol.
●1 piseta con agua destilada.
●1 pinza para tubos de ensayo. ● Muestra problema:
●10 tubos de ensayo de 13x100mm. Jarabe Karo Bebé, contenido según la etiqueta (una
porción de 15 g contiene: 47.12 kcal, 11.78g de
● Micropipetas: 20-200μl, 100-1000μl carbohidratos y 46 mg de sodio), marca ACH
●1 pipetas de 5 ml FOODS México, lote: 6284F034.
●1 propipetas
● Reactivo de arsenomolibdato:
Disolución de molibdato de amonio ((NH₄) ₆Mo₇O₂₄) en
Material que deberá traer el alumno.
ácido sulfúrico (H2SO4) con ortoarseniato disódico
● Papel aluminio. (NaHAsO4)
● Equipo de protección personal:
Bata de laboratorio, guantes de ● Reactivo de cobre en medio alcalino:
nitrilo y lentes de seguridad. Disolución de sulfato de cobre (CuSO4•5H2O) con
● Hilo blanco y aguja carbonato de sodio anhidro (Na2CO3) y ácido tartárico
● Regla y lápiz (C4H6O6)

MÉTODO
1. Separación de carbohidratos por cromatografía en papel.
1.1. Prepare la cámara cromatográfica (de preferencia al menos dos horas antes del
inicio de la práctica) colocando una capa de 1 cm de la mezcla de
N-propanol-acetato de etilo-agua (7:1:2). Cierre la cámara y deje saturar los
vapores por dos horas. Utilice guantes y máscara de solventes todo el
tiempo al manipular la cámara.
1.2. Tome una hoja de papel Whatman No. 1 de aproximadamente 25 cm de lado,
trace con lápiz una línea horizontal (lado más angosto de la hoja) a una
distancia de 3 cm de la base del cromatofolio (rectángulo del papel Whatman).
 Marque la línea trazada cada 2 cm (aproximadamente), dejando libres 1.5 cm en
cada borde lateral de la hoja como se muestra en la Figura 2. NOTA
IMPORTANTE: Este papel deberá manejarse todo el tiempo con guantes,
nunca utilice bolígrafo o cualquier tinta para rayar en el papel.
1.3. Numere los puntos anteriores del 1 al 9 con lápiz (puede marcar también los
nombres de las muestras que serán cargadas).
1.4. Con un tubo capilar deposite una gota de la solución patrón de carbohidratos en
su respectiva marca (Figura 2), procurando que el diámetro de la gota no sea
mayor de 0.5 cm. Utilice un tubo capilar diferente para cada muestra. El orden de
las aplicaciones será el siguiente:

1.- Ribosa
2.- Dextrosa
3.- Problema 1
4.- Fructosa
5.- Problema 2
6.- Arabinosa
7.- Galactosa
8.- Lactosa
9.- Sacarosa

Figura 2. Toma de muestra y sembrado en cromatofolio de las muestras patrón y problema de

carbohidratos.

1.5. Permita el secado de la primera aplicación y en el mismo orden aplique una

segunda vez cada muestra, de la misma manera que en el punto anterior.
1.6. Una vez secas las muestras en el cromatofolio, haga un cilindro dejando las
muestras al interior. Utilizando hilo blanco y aguja, zurza el cilindro haciendo
puntadas a lo largo de las dos orillas, sin que estas se toquen entre sí (Figura 3).
 1.7. Introduzca los cromatofolios en la cámara dentro del recipiente con el solvente
de corrida, quedando las muestras en la parte inferior para desarrollar
cromatografía ascendente (Figura 3).
1.8. Espere de 12 a 15 horas a 25°C para que suba el solvente y retire el
cromatograma cuando el frente del solvente llegue a 1 ó 2 cm del borde superior.

1.9. Con cuidado, marque con lápiz hasta donde llegó el frente del solvente en el
cromatofolio y déjelo secar a temperatura ambiente en la campana de extracción
de vapores.
1.10. Utilizando guantes, lentes de seguridad y tapabocas, impregne el cromatograma
dentro de la campana de extracción de vapores con una solución de nitrato de
plata (AgNO3) 0.0025% en acetona.
1.11. Deje secar el cromatograma al aire dentro de la campana de extracción de
vapores. Una vez seco, utilizando su equipo de protección personal, sumerja el
cromatograma en una solución de hidróxido de sodio NaOH 0.5% en etanol.
 1.12. Deje secar el cromatograma al aire dentro de la campana de extracción de
vapores. Una vez seco el cromatograma, con mucho cuidado utilizando un lápiz
o marcador, marque las manchas reveladas, su contorno, centro y diámetros.
1.13. Mida el desplazamiento desde la línea de sembrado hasta el centro de cada una
de las manchas y obtenga los valores de Rf comparando éste, con el
desplazamiento del solvente. Construya una tabla de valores de Rf, para los
diferentes azúcares conocidos (patrones).
1.14. Determine los valores de Rf de las muestras problema e identifique los
carbohidratos presentes comparando con los Rf de los patrones.

2. Cuantificación de azúcares reductores por el método de Nelson-Somogyi.

2.1. Etiquete con un marcador indeleble los tubos de ensayo (10x100 mm) del 1 al 8.
2.2. Agregue los siguientes reactivos a cada tubo, para esto utilice su equipo de
protección personal en todo momento:

Tubo
Reactivo 1 2 3 4 5 6 7 8
Patrón de glucosa 100 μg/ml - 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 - -
Muestra problema (ml)
(Jarabe Karo Bebé: 0.4 mg de - - - - - - 0.10 0.20
jarabe x ml)
Agua destilada (ml) 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.40 0.30
Reactivo de cobre (ml)
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(agregue con pipeta de vidrio)

2.3. Tape cada tubo con papel aluminio e incúbelos usando su pocillo, en baño
María, en ebullición durante 20 minutos. Enfríelos a temperatura ambiente.
2.4. Con una pipeta de vidrio agregue con cuidado a cada tubo 0.5 ml de reactivo de
arsenomolibdato y agite vigorosamente hasta que ya no salgan más burbujas de
gas (la reacción concluye por completo). NOTA: En este paso se genera
efervescencia, tenga cuidado al agregar el reactivo de arsenomolibdato ya
que se libera gas (CO2). Agréguelo lentamente para evitar derrames.
2.5. Agregue a cada tubo 3.5 ml de agua destilada.
2.6. Mezcle por inversión (o con ayuda de un vórtex) cada tubo asegurándose que el
contenido quede homogéneo y compruebe que ya no se desprenda gas (no
 debería haber burbujas en la solución). A continuación, vacíe el contenido a
cubetas para espectrofotómetro.
2.7. Calibre el espectrofotómetro utilizando el tubo 1 como blanco de reactivos a una
longitud de onda de 660 nm (A660) y mida la absorbancia del resto de tubos.
2.8. Realice la gráfica de la curva patrón de glucosa con los datos de los tubos 1 a 6
(concentraciones conocidas de glucosa) utilizando la abscisa (x) para la
concentración de glucosa y la ordenada (y) para la absorbancia.
2.9. Realice una regresión lineal con los datos obtenidos para la curva patrón,
obtenga la ecuación de la recta, despeje y determine la concentración de
azúcares en la muestra problema con los datos de absorbancia a 660 nm para
los tubos 7 y 8.
2.10. Incorpore los datos obtenidos y calculados, además de las respuestas de su
cuestionario en su informe de práctica de laboratorio, según las instrucciones de
su profesor.

CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el valor de Rf para los carbohidratos y la muestra problema?

Rf = distancia de migración del carbohidrato / distancia de migración del solvente

Distancia de migración: Rf
Solvente

1. Ribosa

2. Dextrosa

3. Problema 1 (jarabe Karo Bebé)

4. Fructosa

5. Problema 2 (mezcla de azúcares)

6. Arabinosa

7. Galactosa

8. Lactosa

9. Sacarosa
2. ¿A qué se deben los valores de Rf para cada carbohidrato?
3. ¿Qué carbohidratos están presentes en la muestra problema 1 y en la muestra
problema 2?
4. ¿Corresponde el contenido de carbohidratos (identidad y concentración) encontrado en
la muestra problema del jarabe con lo reportado en la etiqueta del producto?
5. ¿Qué sucede con los carbohidratos al reaccionar con el nitrato de plata?
6. ¿Todos los carbohidratos reaccionan con el nitrato de plata? ¿Por qué?
7. En términos legales, asociaciones civiles han propuesto un nuevo etiquetado de
alimentos para la regulación de los productos que contienen jarabes fructosados en
México, ¿Con base en lo identificado en esta actividad, consideras que puede ser
importante?

BIBLIOGRAFÍA
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reforman y adicionan diversas disposiciones de la Ley General de Salud, en materia de sobrepeso,
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● González M.S., Peñalosa C. I., Perales V. H., Salcedo A. M., Sánchez C. S., Vázquez M. J., Flores
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children and adolescents: reanalyses of a meta-analysis, The American Journal of Clinical Nutrition.
89 (1): 438–439.
APÉNDICE 1: PREPARACIÓN DE REACTIVOS
● Reactivo de cobre estabilizado en medio alcalino.
En 400 ml de agua destilada disolver poco a poco 40 g de carbonato de sodio anhidro, añadir 7.5 g de
ácido tartárico y disolver; enfriar si es necesario. Agregar 4.5 g de sulfato de cobre (CuSO4•5H2O) y
disolver, aforar a 1 L con agua destilada. Envasar en frasco ámbar y dejar reposar 2 semanas antes de
usar. Almacene a temperatura ambiente.

● Ortoarseniato disódico 12%

En 50 ml de agua destilada disolver 12 g de NaHAsO4, aforar a 100 ml con agua destilada. Almacenar
a temperatura ambiente.

● Reactivo de Arsenomolibdato
Disuelva 50 g de molibdato de amonio en 900 ml de agua destilada, lentamente, añadir 42 ml de ácido
sulfúrico H2SO4 concentrado y agregar 50 ml de solución de ortoarseniato disódico al 12% (NaHAsO4).
Mezclar bien e incubar a 37°C durante 24 a 48 h antes de su uso. Almacene en frasco ámbar a
temperatura ambiente.

● Patrón de glucosa 100 μg/ml

Pesar 0.01 g de glucosa, disolver y aforar a 100 ml con agua destilada. Almacene en refrigeración.

● Mezcla de n-propanol-acetato de etilo-agua (7:1:2)

Mezclar 7 partes de N-propanol con 1 parte de acetato de etilo y 2 partes de agua destilada.

● Hidróxido de Sodio (NaOH) 0.5% en etanol

Disolver 0.5 g de hidróxido de sodio (NaOH) en etanol 96% y aforar con etanol 96% a 100 ml

● Solución acuosa saturada de nitrato de plata (AgNO3)

Disuelva 9 g de nitrato de plata (AgNO3) en 10 ml de agua destilada. La solución precipitará cuando
esté saturada, indicando así que está lista para su uso. Si no precipitara, agregar poco a poco
pequeñas cantidades de AgNO 3, hasta que la solución quede saturada.

● Revelador de nitrato de plata (AgNO3) en acetona

Mezclar 1 ml de la solución acuosa saturada de nitrato de plata (AgNO3), en 200 ml de acetona.

● Carbohidratos de referencia
Pesar 20 mg de Ribosa, Dextrosa, Fructosa, Arabinosa, Galactosa, Lactosa y Sacarosa. Disolver por
separado en 5 ml de agua destilada. Almacene en refrigeración. Hacer alícuotas de 400 μl de cada uno
por grupo.

● Preparación de muestra problema (Jarabe Fructosado, Miel Karo) 4mg/ml

Pesar 4 g de Jarabe y aforar a 200 ml (Solución Stock). Tomar 4 ml de la solución stock y aforar a 200
ml.