Guia Alumno 129 2022

GUÍA DE LABORATORIO- QUI-129
QUÍMICO ORGÁNICA Y BIOQUÍMICA
La Guía de Laboratorio corresponde a un material de

apoyo a la docencia experimental del curso QUI-129
QUÍMICO ORGÁNICA Y BIOQUÍMICA, impartido a alumnos
de la carrera ING. EN ALIMENTOS, que tiene como
objetivo:
1. Entregar al alumno una visión general de la
importancia, características estructurales,
propiedades y usos de los compuestos orgánicos,
teniendo en cuenta la naturaleza de los grupos
funcionales.
2. Conocer la importancia de las reacciones de
moléculas simples en la construcción de otras más
complejas.
3. Familiarizar al alumno con las técnicas de uso
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO frecuente en el laboratorio.
INSTITUTO DE QUÍMICA
segundo semestre 2022
PROFESOR RESPONSABLE: Dr. Christian Mandiola

MAIL: [email protected]
TABLA DE CONTENIDOS
IDENTIFICACIÓN DE LA ASIGNATURA.............................................................................................. - 3 -
INSTRUMENTOS DE EVALUACIÓN ................................................................................................... - 4 -
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO ............................................................................. - 4 -
PROTECCIÓN PERSONAL ................................................................................................................. - 5 -
CLASIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS QUÍMICOS SEGÚN LA NORMA NFPA 704............................. - 6 -
PROTOCOLO DE URGENCIAS INSTITUTO DE QUÍMICA ................................................................... - 7 -
P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 -2-

IDENTIFICACIÓN DE LA ASIGNATURA
Nombre de la asignatura QUÍMICA ORGÁNICA-BIOQUÍMICA

Clave MIERCOLES 3-6
Créditos 6
Horas teóricas 6
Horas experimentales 4
Profesor responsable Laboratorio Dr. Christian Mandiola Q.

Mail [email protected]
Ayudante: Fernanda Olivares
1. Manejo de técnicas básicas de

laboratorio de química orgánica y
bioquímica
Resultados de aprendizaje
2. Conocimiento de normas básicas de
(Laboratorio)
seguridad de laboratorio de química
orgánica y bioquímica
1. Informe de Laboratorio (50%)

Instrumentos de Evaluación 2. Prueba de prelaboratorio (50%)
(Laboratorio)
1.- Sintesis de Jabon

2.- Extracción de Caseína de la Leche
3.- Determinación de Vitamina C
4.- Determinación de proteínas totales por
Prácticas a desarrollar espectrofotometría
5.- Determinación de Glc por método químico
y enzimológico
6.- Determinación de actividad enzimática
1.- Asistencia Obligatoria

Otros (Laboratorio)
2.- Retraso máximo permitido: 0 min

INSTRUMENTOS DE EVALUACIÓN
El laboratorio será evaluado de acuerdo a las siguientes consideraciones:
→ Pruebas de prelaboratorio: Corresponden a evaluaciones cortas que se realizarán al inicio

de cada sesión de laboratorio y que tienen como objetivo calificar el conocimiento
adquirido previo a cada práctica. Los contenidos a evaluar consideran el material
entregado en clases de prelaboratorio y lecturas complementarias sugeridas. Cada
evaluación dispone de 15 minutos. Su ponderación es de un 50 % del promedio de
laboratorio.
→ Evaluaciones de informes de laboratorio: Corresponden a las evaluaciones que se

realizarán de acuerdo al trabajo práctico en laboratorio, con una ponderación en el
promedio final de un 50 %.
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Por sus propias características, el trabajo en el laboratorio presenta una serie de riesgos de origen
y consecuencias muy variadas, relacionados básicamente con las instalaciones, los productos que
se manipulan y las operaciones que se realizan con ellos. Con respecto a los productos debe
tenerse en cuenta que suelen ser peligrosos, aunque normalmente se emplean en pequeñas
cantidades y de manera discontinua. En consecuencia, la prevención de los riesgos en el
laboratorio presenta características propias que la diferencian de otras áreas productivas.
Variaciones en los procedimientos, como el cambio de reactivos o las cantidades de éstos, son
peligrosas. Pregunte siempre al Profesor Responsable del Laboratorio, antes de hacer algún
cambio y recuerde:
“Realizar los procedimientos con seguridad no es solamente la manera correcta de trabajar, es

la única manera de hacerlo”.
Luego y antes de comenzar cualquier operación o hacer un experimento es importante

preguntarse: “¿Qué pasaría si...?”. La respuesta a esta pregunta requiere conocer los peligros de
las sustancias químicas y el equipo que se va a utilizar. La reactividad, inflamabilidad, corrosividad
y la toxicidad de los compuestos que van a utilizar son los que van a dictar las precauciones
necesarias a tener en cuenta. De este modo, la manera preferida de trabajar con sustancias
químicas, es aquella en la que se reduzca o minimice la probabilidad de que suceda un accidente o
exposiciones a compuestos tóxicos, aún a bajas concentraciones. Para reducir la probabilidad de
accidentes debe:
• Practicar el hábito de la prevención de accidentes.

• Utilizar equipo de protección personal (por ejemplo: lentes de protección y bata de
seguridad) todo el tiempo que se esté en el laboratorio.
• Seguir las instrucciones del Profesor del Laboratorio y consulte siempre en caso de duda.

• Anticipar las posibles consecuencias del trabajo que se va a realizar en el laboratorio.
Asimismo, debe seguir las siguientes reglas de seguridad:

• No jugar bromas en el laboratorio
• Familiarizarse con la ubicación y uso del equipo de seguridad (salidas de emergencia,
duchas y lavaojos)
• Antes de entrar al laboratorio debe estar familiarizado con los peligros de las sustancias
químicas a utilizar. Aprenda lo que se puede hacer y lo que debe evitar hacer.
• Siempre utilice los lentes de protección cuando se esté trabajando con sustancias químicas
o equipo, sea usted quien esté trabajando o algún compañero que se encuentre cerca.
• Use vestimenta apropiada: zapatos cerrados y bata de laboratorio.
• Recoja el pelo largo y la ropa muy suelta.
• Siempre lave las manos y los brazos con jabón al salir del laboratorio.
• Nunca trabaje solo en el laboratorio.
• No prepare o almacene bebidas o comida en el laboratorio.
• Nunca consuma ninguna bebida o alimento mientras está trabajando en el laboratorio.
• Nunca pipetee con la boca.
• No puede manipular los lentes de contacto en el laboratorio, a no ser que sea para
removerlos y poder usar el lavaojos en caso de una emergencia.
• Nunca debe hacer experimentos no autorizados.
• Cuando se mueva dentro del laboratorio anticipe el movimiento de sus compañeros. Si se
llega a tropezar o caer llevando material de vidrio o sustancias químicas trate de lanzarlas
lejos de usted y de los demás.
• Nunca debe sacar sustancias químicas del laboratorio sin autorización.
• Mantenga los compuestos químicos y los equipos de laboratorio, lejos del borde de la
mesa de trabajo.
• No juegue o haga bromas en el laboratorio.
• Reporte a su Profesor las violaciones de las normas de seguridad en el laboratorio. Con
esto puede estar salvando su propia vida y la de sus compañeros.
PROTECCIÓN PERSONAL
→ Protección de los ojos: Mientras permanezca en el laboratorio, debe utilizar lentes de
protección contra salpicaduras, sin importar que no esté realizando ninguna parte del
procedimiento. Los lentes de contacto no proveen ninguna protección contra una
salpicadura, por lo que debe, usar los lentes de protección aun cuando se utilicen lentes
de contacto.
→ Vestimenta: La ropa utilizada en el laboratorio debe proteger tanto de salpicaduras como
de derrames y debe ser fácilmente removible.
• Una bata de laboratorio, no debe tener botones sino cualquier tipo de broches fáciles de
abrir para que pueda ser removible fácilmente.
• En el laboratorio se debe utilizar zapatos totalmente cerrados. No se acepta el uso de
sandalias o cualquier zapato que deje piel al descubierto.
• Se deben usar pantalones largos. El uso de pantalones o faldas es un riesgo de exposición
a sustancias corrosivas innecesario.
• Debe utilizar el pelo largo recogido.

• No se debe usar accesorios de joyería, ésta puede ser dañada por alguna salpicadura o por
vapores corrosivos, además incrementa el riesgo de contacto con alguna fuente de
electricidad.
→ Guantes: Los guantes son una parte muy importante de la protección personal. El Profesor
de Laboratorio, indicará cuando su uso es apropiado o necesario. Utilice los guantes
correctamente; antes de usarlos debe revisar que no tengan agujeros. Para evitar
dispersar compuestos químicos inconscientemente, una vez terminado el trabajo debe
remover los guantes antes de abandonar el área de trabajo y antes de sostener cualquier
cosa tales como teléfonos, perillas de puertas, libros, cuadernos, etc. que puedan
contaminarse.
CLASIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS QUÍMICOS SEGÚN LA NORMA NFPA 704
La norma NFPA 704 es el código que explica el diamante del fuego, utilizado para comunicar los
peligros de los materiales peligrosos. Es importante tener en cuenta que el uso responsable de
este diamante o rombo implica que todos conozcamos, tanto los criterios de clasificación como el
significado de cada número sobre cada color.
El rombo de color azul, está asociado al

peligro a la salud.
El rombo de color rojo, está asociado al

peligro de inflamabilidad.
El rombo de color amarillo está

asociado al peligro de inestabilidad.
Grado de Peligro
A estas tres divisiones se les asigna un número de 0 (sin peligro) a 4 (peligro máximo).
Grado de Peligro
4 Mortal
3 Muy Peligroso
2 Peligroso
1 Poco Peligroso
0 Sin Riesgo

APARATOS Y MATERIALES DE LABORATORIO
1.-Cerciórese que el material que se le entregue esté en buen estado. El empleo de aparatos de
vidrio rotos o trizados pueden hacer fracasar un experimento y lo que es peor, producirle
heridas. Por lo tanto, descarte este tipo de material.
2.-Deben mantenerse limpios los aparatos y el área de trabajo. No deje equipo sucio sobre el
mesón.
3.-Si se daña algún aparato o se rompe algún material, comuníquese con el ayudante
inmediatamente.
4.-No tome aparatos prestados de otras mesas. Si necesita equipo adicional o algún reactivo del
que no se disponga, pídaselo al ayudante.
5.-Al finalizar el período de laboratorio debe asearse el área de trabajo y deben entregarse los
aparatos y materiales usados totalmente limpios y ordenados.
6.-Nunca deje un aparato, o equipo, funcionando sin vigilancia.
7.-Sólo deben estar sobre el mesón los aparatos que se estén usando.
8.-Desperdicios de vidrios, corcho, fósforos y otros materiales sólidos se arrojarán en el cubo

de la basura, nunca en el fregadero.
9.-Los aparatos deben instalarse en un lugar cómodo y desahogado. Nunca se ha de poner en

marcha un aparato o equipo sin asegurarse que esté completo o bien instalado o que queden
uniones sueltas, o mal hechas.
10.- Seque los materiales de vidrio por fuera, antes de calentar.
11.- Los mecheros Bunsen que no se estén usando deben apagarse o reducirse la llama al mínimo.
12.- Los aparatos y materiales calientes deben manejarse con cuidado y deben usarse para
ello pinzas.
13.- Nunca se deben utilizar tapones de goma en el montaje de aparatos en los que va a operar
con disolventes orgánicos. La mayoría de estos disolventes atacan la goma y originan una
contaminación del producto.
14.- Nunca se debe calentar un sistema completamente cerrado ni montar un aparato

completamente cerrado. Sobre todo si va a desprender algún gas; siempre se debe dejar un
orificio o salida del tamaño adecuado.
15.- Debe tenerse siempre en cuenta que la mayoría de los disolventes que se utilizan en química
orgánica son inflamables.
16.- Los disolventes inflamables de punto de ebullición inferior a 100°C se deben destilar, calentar
o evaporar sobre un baño de vapor, o con manta eléctrica, nunca con un mechero Bunsen. Entre

estos disolventes se encuentran, metanol, etanol, acetona, dietil éter, benceno, éter de petróleo,
ligroína, pentano, etc. Deben guardarse en matraces cerrados y mantenerse lejos de los mecheros
encendidos.
17.- Antes de usar un reactivo, compruebe mirando la etiqueta del reactivo si es el que
corresponde.
18.- Cuando use sustancias químicas corrosivas, compruebe si se encuentra húmedo el frasco que
lo contiene en la parte exterior. En caso de ser así, límpielo con un paño, esponja húmeda o toalla.
19.- El sodio y potasio en combustión reaccionan con fuerte explosión con el tetracloruro de
carbono. El sodio incendiado se apagará con arena seca o carbonato sódico.
20.- Jamás se deben arrojar cortezas de sodio en las papeleras o en los fregaderos, se echarán
en un frasco con querosene o benceno.
21.- Los reactivos corrosivos, deben manejarse con precaución, cuando estén concentrados y
calientes. Si por accidente, se salpica la piel o los ojos, lavarse con abundante agua y avisar
inmediatamente al profesor.
22.- El trabajo con bromo, tricloruro de fósforo, cloruro de tionilo, cloruro de acetilo, cloruro de
benzoilo y otros productos tóxicos, irritantes, mal oliente o simplemente molesto, se debe llevar a
cabo siempre bajo campana.
23.- Nunca se olerá directamente la fuente de un vapor. Si se desea oler una sustancia de la cual
tengamos sospecha de su toxicidad, se coloca el tubo en donde esté contenida, cerca de sí con
la mano ahuecada, llévese una pequeña muestra de vapor o se ventea atrayendo los vapores para
captar su olor.
24.- Los agentes oxidantes fuertes y los productos fácilmente oxidables (agentes reductores)
deben mezclarse con gran cuidado y en cantidades pequeñas. Nunca se debe añadir ácido nítrico
a un matraz que contenga alcohol o cualquier otro producto fácilmente oxidable. La reacción
entre el ácido nítrico y los agentes reductores orgánicos puede ser tan violenta que vaya
acompañada con una explosión peligrosa.
25.- No tome el gusto a ninguna sustancia química, si no le indican lo contrario.

PROTOCOLO DE URGENCIAS INSTITUTO DE QUÍMICA
Accidente
Encargado de Lab *
realiza evaluación
Informar a Ad. del Campus inicial
Tel: 32-2274693
Después de las
18:00 horas
Informar a Secretaria de Sí No Realizar asistencia y

Requiere
Dirección registrar accidente
asistencia
Tel: 32-2274910 en bitácora
Secretaria de Dirección Seguimiento

notifica Monitores de Encargada de
Primeros Auxilios Materiales
Monitores de Primeros Auxilios Requiere No

evalúan y trasladan a sala de traslado Informa para cierre de
observación 2º piso a hospital caso a CDE
Sí
Ad. del Campus informa Informa a
Seguimiento
a DAE y familiar directo Ad. del Campus para
P. de riesgos
accidentado traslado
Estudiante firma
consentimiento de
traslado
Secretaria de Dirección Instituto de Química: 32-2274910

Monitores de Prevención
Prevencionista de Riesgos Instituto de Química*: 32-2274935
Encargado de Materiales Instituto de Química*: 32-2274936
Administrador Campus: 32-2274693
*Oficina en piso -1 Edificio de Ciencias

LABORATORIO Nº1
REACCIONES DE GRUPOS CARBOXILICOS
LABORATORIO DE GRASAS: FORMACION DE UN JABON
I. INTRODUCCION
Las grasas son ésteres de los ácidos grasos y glicerol. Los ácidos grasos son ácidos monobásicos de
cadena larga y lineal.
O
CH2 O C R
O
CH O C R
O
CH2 O C R
Estos ácidos grasos pueden ser saturados, ej. ácido palmítico C15H31CO2H, o insaturados como
por ejemplo el ácido oléico:
CH3 (CH2)7 CH CH (CH2)7 COOH
Si el contenido de ácidos grasos insaturados es grande, el glicérido es líquido a temperatura

ambiente y constituye un aceite. Los aceites grasos naturales, comúnmente no son glicéridos
simples, ya que los ácidos grasos que los forman varían en longitud y en el grado de insaturación.
La hidrólisis del triester en solución alcalina se denomina saponificación.
P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 - 10 -

O
O
CH2 O C (CH2)14 CH3
3CH3 (CH2)14 C O -K+
O
Jabon
CH O C (CH2)14 CH3 + 3KOH
O
CH2 O C (CH2)14 CH3 CH2 CH CH2
OH OH OH
Grasa
Glicerol
Tripalmitato de glicerina + 3 KOH ⎯⎯→ Palmitato de K (jabón) + Glicerol.
Los jabones son las sales alcalinas de los ácidos grasos. Ejercen su acción limpiadora debido a
que sus moléculas están formadas por una parte hidrofílica que atrae el agua y otra hidrófoba
que es atraída por las partículas de grasa que quedan suspendidas en el líquido (H2O) rodeadas
de moléculas de jabón, formando una emulsión.
II. PROCEDIMIENTO
a. En un vaso de precipitado de 200 ml caliente a baño maría 12gr. de manteca o mantequilla.

b. Agitando constantemente, añada 5,0 grs de NaOH disueltos en 15 ml de agua y luego, 10 ml de
Etanol. Agite hasta ebullición.
c. Agregue 50 ml de una solución que contenga agua/etanol (1:1) y continúe agitando.
d. Terminada la adición, continúe calentando, agitando durante 40 min.
e. La solución jabonosa se agrega en un vaso de 500 ml que contiene una solución saturada de
NaCl y agregar 50 mL de agua.
f. Filtrar a vacío y lavar con 5 porciones de agua fría.
g. Pesar el producto húmedo obtenido.
III. PRUEBAS DE ESPUMACIDAD
Preparar una solución al 1% p/p del jabón obtenido y realizar lo siguiente:
a. A 10 ml de la solución jabonosa agregar 1,0 gr NaCl y observa lo que ocurre.

b. Colocar 4 ml de solución jabonosa y 6 ml de agua en un tubo de ensayo, tapar y agitar
durante 30 segundos. Anotar el tiempo en que demora en desaparecer la espuma.
c. Colocar 2 ml de solución jabonosa, agitar vigorosamente y agregar gota a gota CaCl2 al
10%. Anotar cuanto volumen se necesita para que desaparezca la espuma.
d. A 10 ml de solución jabonosa agregar gota a gota HCl concentrado, calentar a baño
maría y observar que sucede.

LABORATORIO Nº2
QUÍMICA DE LA LECHE
EXTRACCIÓN DE CASEÍNA
I. INTRODUCCIÓN:
La leche es un alimento de interés excepcional. No solo es un excelente alimento para los más
jóvenes, sino que los hombres han adoptado la leche, específicamente la de vaca, como una
sustancia alimenticia para personas de todas las edades. Muchos productos contienen leche como
el queso, yogurt, mantequilla, etc.
La leche es el alimento más completo nutricionalmente que ha sido encontrado en la naturaleza.

Esta contiene vitaminas (principalmente la Tiamina, riboflavina, ácido pantoténico y vitaminas A, D
y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y trazas de metales), proteínas (incluyen todos los de
aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos (materia grasa).
La composición de la Leche de algunos mamíferos se resume en la tabla que se muestra a

continuación:
Composición Porcentual (%) de la Leche de varios Mamíferos.

VACA HOMBRE OVEJA CABALLO
Agua 87.1 87.4 82.6 90.6
Proteínas 3.4 1.4 5.5 2.0
Materia Grasa 3.9 4.0 6.5 1.1
Carbohidratos 4.9 7.0 4.5 5.9
Minerales 0.7 0.2 0.9 0.4
Las proteínas se casifican en dos grandes categorías, como: Fibrosas y Globulares. Las
proteínas de la Leche son globulares y de tres tipos: Caseína, Lactalbuminas y lactoglobulinas.
Actualmente la caseína, es una mezcla de tres proteínas similares, principalmente ,  y  caseína.

Estas tres proteínas difieren principalmente en el peso molecular de estas y en el número de
grupos fosfatos.
La caseína presente en la leche se encuentra como una Sal de Calcio, Caseinato de Calcio. La
estructura del caseinato de calcio es compleja, debido a la mezcla de estas tres proteínas;
formando una Micela. Una estructura propuesta para la micela de la caseína se muestra a
continuación.
O O
- +2 - ++
PROTEINA O P O + Ca PROTEINA O P O Ca
O
- O-
El pH de la leche es de 6.6 y a este pH se encuentra soluble la sal calcica. El caseinato de calcio
tiene un punto de neutralización a pH 4.6. Sin embargo, es insoluble en soluciones de pH bajo 4.6.
Si se añade ácido a la leche, los grupos fosfatos son protonados y la micela es neutralizada; por lo
tanto esta proteína neutra, precipita.

++
Ca Caseinato + 2 HCl Caseina + CaCl2
Hidrólisis:
Las proteínas pueden ser hidrolizadas en soluciones básicas o ácidas, o con enzimas. Durante la
hidrólisis los enlaces peptídicos se rompen para dar polipéptidos (polimeros cortos), los cuales se
degradan a aminoácidos. La hidrólisis total de las proteínas se realiza, refuyendo una solución de
HCl en un tiempo menor a 1 hora.
R O + R O
H
NH CH C n NH2 CH COH
Calor
n
PROTEINA AMINOACIDO
El compuesto Biuret forma un complejo coloreado rosado o violeta con el ión Cúprico, en solución
básica. Cuando el color rosado-violeta es obtenido, el test es Positivo; y este se obtiene con todo
los compuestos que podrían contener dos o más enlaces peptídicos (tripéptidos). Los aminoácidos
(exepto serina y treonina), dipeptidos y urea, no dan color violeta con el ión cúprico, por lo
tanto,el test da negativo. Los aminoácidos producen una solución azúl en presencia del ión
cúprico, esto nos indica que la reacción de hirólisis fue competada.
II. PROCEDIMIENTO:
1. Coloque 100 ml de leche descremada en un vaso precipitado de 250 ml. Caliente la Leche a
40º C.
2. Añada con una pipeta, 5 ml de Acido acético diluido al 10 y agite la caseína durante 10
minutos.
3. Deje decantar la solución que contiene la caseina sólida. Mientras tanto, arme el equipo de
reflujo para la hidrólisis.
4. Filtre por decantación, removiendo la mayor cantidad del líquido y luego filtre a vacío la masa
de caseína.
5. Presione suavemente con la espátula durante la filtración y coloque el producto entre papeles
absorbentes (los que sean necesarios), para ayudar al secado de la caseína.
6. Una vez seca; calcule el  de rendimiento en peso de la caseína obtenida de la Leche, si la
densidad es 1.03 gr/ml.
III. HIDRÓLISIS DE UNA PROTEÍNA: CASEÍNA
Test de biuret: Tome un trocito de caseína y colóquelo en un tubo de ensayo. Agréguele 10 gotas
de una solución de NaOH al 10 y 5 gotas de la solución de Súlfato de cobre al 2. Agite y
coloque este tubo de ensayo en un baño maria. Dejelo por el tiempo que requiere la hidrólisis de
la caseína. Observe el color.
1. Pese 0.5 grs de la caseína y agréguelo a un balón de 100 ml.

2. Agregue 20 ml de una solución de HCl al 19  al balón y un trocito de plato poroso.

3. Arme el equipo de Reflujo y caliente cuidadosamente usando una manta calefactora, hasta
ebullición.
4. Deje refluir por 30 min.
5. Después de completado el tiempo, deje enfriar un poco el balón y agregue una punta de
espátula de carbón activo y agite suavemente.
6. Filtre la mezcla hidrolizada usando un embudo de gravitación y papel filtro de pliegues, sobre
un matraz erlenmeyer de 50 ml. (El filtrado podría presentar coloración amarillo pálido)
7. Verifique si la hidrólisis fue completa mediante el Test de Biuret.
TEST DE BIURET:
1. Coloque 5 gotas de la solución de caseína hidrolizada en un tubo de ensayo.

2. Agregue 10 gotas de una solución de NaOH al 10 al tubo de ensayo y verifique con papel pH
si la solución está definitivamente alcalina, si no es así, añada más gotas de la solución de NaOH
3. Agregue 5 gotas de una solución de Súlfato Cúprico al 2 .
4. Agite la mezcla y observe el color. Un color azúl indica que la hidrólisis fue completada.

LABORATORIO 3
DETERMINACIÓN DE VITAMINA C
1.- INTRODUCCIÓN
Las vitaminas son sustancias indispensables para los procesos metabólicos del organismo,
hay distintos tipos que cumplen funciones diferenciadas. Ingresan al organismo mediante una
dieta equilibrada y variada. El cuerpo no produce por sí mismo estas sustancias, por lo que la
carencia en la alimentación se traduce siempre en una alteración en el metabolismo corporal.
Las vitaminas se dividen en dos grupos dependientes de su forma de absorción en el
organismo: las vitaminas hidrosolubles y liposolubles. Las hidrosolubles se disuelven en agua. Esta
característica hace que el consumo diario sea más estricto, ya que el lavado y la cocción de los
alimentos produce la pérdida de las vitaminas, siendo inferior la cantidad consumida de lo que
popularmente se cree, algunas vitaminas hidrosolubles son:
• Vitamina C
• Vitamina B1
• Vitamina B2
• Vitamina B3
• Vitamina B5
• Vitamina B6
• Vitamina B8
• Vitamina B9
• Vitamina B12
Las vitaminas liposolubles se disuelven en grasas y/o aceites. Suelen encontrarse en alimentos
grasos y son almacenados en los tejidos adiposos del cuerpo. También se acumulan en el hígado,
es decir que existe una reserva vitamínica corporal que permite periodos de tiempo sin ingreso de
las vitaminas, las Vitaminas Liposolubles son:
• Vitamina A
• Vitamina D
• Vitamina E
• Vitamina K
Las funciones de las vitaminas, son variadas dependiendo de la vitamina, por ejemplo, la vitamina
C produce colágeno, proteínas necesarias para la cicatrización y formación de los tejidos. La
vitamina B1 regula el sistema nervioso y las funciones cardíacas. También contribuye al

crecimiento. La vitamina B2 contribuye al mantenimiento de las membranas mucosas, la piel y el
transporte de oxígeno. La vitamina B3 mejora la circulación de la sangre y la producción de
neurotransmisores. La vitamina B5 contribuye a la desintoxicación del cuerpo. La vitamina B6
forma los glóbulos rojos indispensables para el transporte de oxígeno por el cuerpo. La vitamina
B8 interviene en la formación de glándulas que generan las hormonas y en la formación de la
dermis. La vitamina B9 permite la multiplicación celular, por lo que interviene en el desarrollo del
sistema nervioso. La vitamina B12 interviene en la síntesis de ADN y ARN, por lo que se relaciona
con el sistema nervioso y la genética. La vitamina A es antioxidante y participa en la formación de
hormonas entre las que se encuentran las segregadas por las glándulas suprarrenales. La vitamina
D permite la absorción intestinal de proteínas y calcio. La vitamina E interviene en la formación de
tejidos y en la fertilidad. La vitamina K se relaciona, principalmente, con la regulación de la
coagulación sanguínea.
En el caso de la Vitamina C - (ácido ascórbico), esta vitamina se encuentra casi

exclusivamente en los vegetales frescos. Su carencia produce el escorbuto, pero es muy poco
frecuente en la actualidad, ya que las necesidades diarias se cubren con un mínimo de vegetales
crudos que consumamos. Por ser una vitamina soluble en agua apenas se acumula en el
organismo, por lo que es importante un aporte diario. Actúa en el organismo como transportadora
de oxígeno e hidrógeno, pero también interviene en la asimilación de ciertos aminoácidos, del
ácido fólico y del hierro. Al igual que la vitamina E, tiene efectos antioxidantes. La vitamina C
participa también de forma decisiva en los procesos de desintoxicación que se producen en el
hígado y contrarresta los efectos de los nitratos (pesticidas) en el estómago. Es muy sensible a la
luz, a la temperatura y al oxígeno del aire. Un zumo de naranja natural pierde su contenido de
vitamina C a los 15 0 20 minutos de haberlo preparado, y también se pierde en las verduras
cuando las cocinamos. Cuando falta vitamina C, nos sentimos cansados, irritables y con dolores en
las articulaciones. Las necesidades de ácido ascórbico aumentan durante el embarazo, la lactancia,
en fumadores y en personas sometidas a situaciones de estrés.
La titulación volumétrica es un método de análisis cuantitativo en el que se mide el
volumen de una disolución de concentración conocida (disolución patrón o titulante patrón)
necesario para reaccionar completamente con un compuesto en disolución de concentración
desconocida. Para determinar cuándo se ha llegado al final de la titulación, en la disolución

problema se agrega un indicador que sufre un cambio físico apreciable, como por ejemplo cambio
de color, en el punto final de la reacción
En esta práctica determinaremos el contenido de vitamina C mediante una volumetría de
óxido-reducción, la vitamina C tiene carácter reductor y utilizaremos una disolución de yodo como
agente oxidante que constituye el titulante patrón.
Para que una sustancia se oxide es necesario que otra se reduzca y al revés (Reacción de
oxidación-reducción; REDOX). Por lo tanto cuando al ácido ascórbico reducido le añadimos yodo,
este se reducirá a yoduro a consta de que el ácido ascórbico se oxide.
2.- Determinación de Ácido Ascórbico

Kit HI3850 HANNA para Ácido Ascórbico
El Ácido Ascórbico (Vitamina C) se añade como agente saborizante y preservativo a las bebidas
basadas en jugos.
Este kit está especialmente diseñado para la determinación del contenido de Vitamina C de las
bebidas. Está basado en la titración por recuento de gotas y es práctico también con muestras
intensamente coloreadas. Las sustancias reductoras interfieren en la determinación de Ácido
Ascórbico con este Test Kit
Requiere:
• HI 3850A-0 Reactivo de Ácido Ascórbico, 1 botella (100 mL);
• HI 3850B-0 Reactivo de Ácido Ascórbico, 1 botella con dosificador (25 mL);
• HI 3850C-0 Reactivo de Ácido Ascórbico, 1 botella (100 mL);
• 2 vasos precipitados de 50 mL;
• 1 probeta 50 mL
• 1 pipeta graduada 5 mL;
• 1 pipetas de plástico 1 mL;
• Gotario o pipeta pasteur
• Propipeta

REACCION QUIMICA DEL KIT
El Ácido Ascórbico (C6H8O6) sufre una reacción de oxidación con el yodato de potasio en
condiciones ácidas. La cantidad de yodato de potasio consumida se determina entonces
yodométricamente.
• Con la probeta tome 10 mL con la muestra y viértalo en el vaso precipitado.

• Añada agua desionizada hasta la marca de 50 mL para que se diluya. Del mismo modo
prepare otra muestra usando el otro vaso calibrado y manténgalo como referencia para el
color inicial.
• Añada 1 mL de Reactivo HI 3850A-0 solo a una muestra. Hágalo girar para que se mezcle.
• Añada 4 gotas de reactivo. HI 3850B-0 y hágalo girar para que se mezcle.
• Añada gotas de reactivo HI 3850C-0, mientras lo hace girar contando las gotas, hasta que
se desarrolle un persistente color azul. Compare la solución con la muestra de referencia
para estar seguro del cambio de color.
• Cuente las gotas necesarias para obtener el cambio de color. Para calcular la
concentración de Ácido Ascórbico multiplique por 10 el número de gotas del reactivo de
titración usadas:
𝑁º 𝑔𝑜𝑡𝑎𝑠 ∗ 10 = 𝑝𝑝𝑚 𝐶6 𝐻8 𝑂6
Rango 10 a 200 ppm Ácido Ascórbico, Incremento Mínimo 10 ppm Ácido Ascórbico
Titulación con 2.6-dicloroindofenol (AOAC 967.21)

Este método está basado en la determinación por titulación con el indicador 2, 6-
diclorofenolindofenol, el cual es reducido por el ácido ascórbico a una forma incolora. Para llevar a
cabo esta prueba primero se prepara un estándar de ácido ascórbico y una solución de indofenol,
así como la estandarización de ésta solución.
La valoración con el 2,6-dicloroindofenol, requiere de:
• Estándar de ácido Ascórbico 1 mg/mL
• Solución de ácido metafosfórico/ácido acético
• Solución estándar de 2,6-dicloroindofenol
• 6 Matraces elermeyer 250 mL
• 1 bureta

• Embudo (para la bureta)
• Indicador de Azul de Timol al 0.04%
• Pipeta graduada de 5 mL
• Propipeta
Estandarización
1. Transferir 2 mL de estándar de ácido ascórbico a 2 matraces elermeyer (duplicado).
2. A los matraces anteriores adicionar 5 mL de la solución de ácido Metafosfórico/ácido
acético.
3. Titular rápidamente con la solución de 2,6-dicloroindofenol, hasta que aparezca un color
rosa ligero.
Blanco
4. Transferir a otros 2 matraces elermeyer (duplicado), 7 mL de solución de ácido
Metafosfórico/ácido acético más el volumen gastado en la estandarización en agua
destilada.
rosa ligero.
El valor (volumen gastado de 2,6-dicloindofenol) obtenido de la estandarización se resta
al blanco, y la concentración del indofenol se expresa como mg de ácido ascórbico
equivalentes a 1 mL de 2,6-dicloindofdenol
Muestra
6. Transferir 2 mL de la muestra a 2 matraces elermeyer (duplicado).
7. A los matraces anteriores adicionar 5 mL de la solución de ácido Metafosfórico/ácido
acético.
rosa ligero.
El volumen gastado en la titulación se resta con el blanco anterior, y la determinación de
ácido ascórbico en la muestra se realiza usando la siguiente expresión:
𝑣𝑜𝑙 𝑑 𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝑣𝑜𝑙 𝐵𝑐𝑜
𝑚𝑔 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑠𝑐ó𝑟𝑏𝑖𝑐𝑜 =
𝑣𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 − 𝑣𝑜𝑙 𝐵𝑐𝑜

LABORATORIO Nº4
ESPECTROFOTOMETRÍA: CUANTIFICACIÓN
I. INTRODUCCIÓN
La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede
ser utilizada para su identificación y cuantificación.
Todas las sustancias absorben luz en alguna región del espectro electromagnético (VIS, UV, IR,
etc.).
La absorción de luz depende de la estructura química del compuesto absorbente, y en especial de

ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las
características de su espectro de absorción.
A NAD+
NADH
260 300 340  (nm)
Figura 1: Espectros de absorción del NAD+ y del NADH.
Ley de Lambert-Beer
Lambert y Beer demostraron que la absorbancia (A), también llamada densidad óptica (D.O.) de
una sustancia es directamente proporcional a la concentración (c) de la sustancia absorbente, la
longitud del paso de luz (l) (espesor de la solución) y una constante denominada coeficiente de
extinción o coeficiente de absorción (a), que es característico para cada sustancia a una longitud
de onda () determinada.
A = a l c Ecuación 1.1
Para medir la absorbancia de una sustancia se utiliza el espectrofotómetro, instrumento destinado

a medir la absorción por especies inorgánicas y orgánicas de luz monocromática en la región
ultravioleta / visible del espectro.

Los espectrofotómetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de
transmitancia (%T). La relación entre ambos es:
A = 2 - log % T Ecuación 1.2
Análisis espectrofotométrico
Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una sustancia

de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se
conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar.
La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se

desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también
a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la
absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga
todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama
blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien,
con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisión.
Curva de Calibrado
Se obtiene la curva de calibrado midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de

concentraciones conocidas de una misma sustancia tratadas con un mismo método y medidas a
igual longitud de onda en el mismo instrumento. Para medir la concentración de una sustancia se
elige por lo general, la región de máxima absorción del espectro, denominada longitud de onda
analítica.
El resultado se expresa en una gráfica de la absorbancia (A) en función de la concentración (c). Si

el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se obtiene una línea recta que pasa cerca del origen; de
cuya pendiente se puede obtener el coeficiente de extinción (a) (Ecuación 1.3).
Es posible determinar gráficamente la concentración de una muestra desconocida (cx) midiendo la

absorbancia de la muestra (Ax) e interpolando en la curva de calibrado.
Normalmente la concentración se estima, a partir de la ecuación de la curva de calibrado.
A = a l c + Ao Ecuación 1.3
Donde, A es la variable dependiente (y), la pendiente es igual a (a • l), c es la variable controlada

(x) y Ao es el intercepto.
Las unidades del coeficiente de extinción dependen de las unidades de concentración y de

longitud del paso de luz. Generalmente la unidad de longitud es el centímetro y la longitud del
paso de luz es 1,0 cm.

Si las unidades de concentración son moles L-1 o milimoles L-1, se hace referencia al coeficiente de
extinción molar (ε o milimolar, respectivamente (Ecuación 1.4). Si la concentración está
expresada en g/100 mL (% peso / volumen) se obtiene el coeficiente de extinción específico (E1%).
A = ε l c + Ao Ecuación 1.4
Cuando la concentración de la sustancia y la longitud del paso de la luz se hacen iguales a la

unidad, la absorbancia corresponde al coeficiente de extinción. Si se midiera la absorbancia de una
solución 1,0 M de una sustancia colocada en una celda de 1,0 cm se obtendría el coeficiente de
extinción molar (). Si la concentración fuera 1,0 g/100 mL se obtendría el coeficiente de extinción
específico (E1%). Estos coeficientes son una propiedad específica de las partículas absorbentes y su
valor es referido a un determinado solvente y a una determinada longitud de onda.
Cuando se conoce por bibliografía el coeficiente de extinción de un compuesto (ε, E1%), o éste es
estimado experimentalmente, midiendo la absorbancia (AX) de una muestra del compuesto de
concentración desconocida (cX) se puede calcular su concentración (ecuación 1.5).
A X − Ao
c =
 l
x Ecuación 1.5
En esta forma se obtiene la concentración (cf) de la muestra problema en la cubeta, para obtener
la concentración original (ci) se debe considerar las diluciones correspondientes al ensayo usado
para cuantificar (Ecuación 1,6).
vi * ci = vf * cf Ecuación 1.6
Fórmula del Estándar
La concentración desconocida puede determinarse sobre la base de un sólo estándar, de acuerdo

a la siguiente ecuación:
 vi   vi 
AS cm p   m p AMP CS  
    =   Ecuación 1.7
 vf   vf  s
• As y Amp son las absorbancias del estándar y muestra problema, respectivamente.

• vi corresponde al volumen de la solución estándar o de la muestra problema ocupado en el
ensayo para cuantificar.
• vf corresponde al volumen final del ensayo ocupado para cuantificar.
• cs y cmp corresponden a las concentraciones de las soluciones estándar y muestra problema
respectivamente. Ambas concentraciones se refieren a las originales sin la dilución propia del
ensayo ocupado para cuantificar.

Unidades
Absorbancia (A): Adimensional (sin unidades).
Longitud (l): cm.
Concentración (c): molar.

Milimolar.
g/100 mL
Coeficiente de extinción (a): molar () M-1 cm-1.

L moles-1 cm-1.
mL milimoles-1 cm-1.
Milimolar () mM -1 cm-1.

L mmoles-1 cm-1.
mL moles-1 cm-1.
Específico (E1%) dL g-1 cm -1.

(g/100mL) –1 cm-1.
Cuantificación de proteínas de solución
En general, no hay un método completamente satisfactorio para medir la concentración de

proteínas en una muestra. La elección del método depende de la naturaleza de la proteína, de los
otros componentes de la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad deseada. En este trabajo
práctico se verán dos de los métodos que se usan corrientemente para medir concentraciones de
proteínas, Biuret y Lowry.
Método Biuret
Los compuestos que tienen dos o más uniones peptídicas (péptidos y proteínas) dan color púrpura
característico cuando se tratan con una solución alcalina de sulfato de cobre diluida. El color se
debe aparentemente al complejo de coordinación del Cu con cuatro átomos de nitrógeno, que
participan en el enlace peptídico. Este método es reproducible, pero requiere una alta
concentración de proteínas para la formación de color. La sensibilidad del método es de 0,25-200
mg de proteínas por mL de solución.
Método de Lowry
Los aminoácidos pueden dar reacciones características con ciertos reactivos de acuerdo a la
naturaleza de sus cadenas laterales. Muchas reacciones de este tipo se caracterizan por la
formación de productos coloreados. La tirosina por ejemplo, debido a su grupo hidroxifenilo,
reacciona con una solución de ácido fosfomolíbdico tungstico en un medio cúprico alcalino,
produciendo una coloración azul, la cual absorbe a 650 nm.

Este método llamado originalmente Folín-Ciocalteau debido a sus estudios iniciales ha sido
desarrollado y transformado, por Lowry y colaboradores, en un procedimiento muy sensible que
ha sido ampliamente usado para la determinación cuantitativa de proteínas en una muestra.
En el método de Lowry la muestra se trata con el reactivo de Folin-Ciocalteau modificado. Si hay

proteínas presentes se produce una coloración azul debido principalmente a la presencia de
residuos de tirosina y triptofano en las proteínas.
Se mide la absorbancia a 650 nm y se compara con las medidas obtenidas de soluciones de

proteínas de concentración conocida (patrón), tratadas de forma idéntica.
Sin embargo, debido a las diferencias en el contenido aminoacídico de una proteína a otra,
cantidades iguales de proteínas distintas, producen coloración diferente con el reactivo de Lowry,
motivo por el cual no es posible obtener la concentración real de una muestra de proteína por
este método, aún así, cuando se requiere una estimación relativa de la concentración de
proteínas, este método es ampliamente satisfactorio, debido a su alta sensibilidad. Sensibilidad 1-
200 g de proteínas por ensayo.
II. PROCEDIMIENTO
Método de Biuret
De acuerdo a la tabla 1.1:
a. Prepare una batería de tubos enumerados.

b. Agregue el volumen indicado de la solución de ovoalbúmina estándar o muestra problema
con una pipeta graduada de 1 ml.
c. Agregue el volumen indicado de agua con una pipeta graduada de 1 ml.
d. Agregue 4,0 ml del reactivo de Biuret con una pipeta graduada de 5 ml.
TABLA 1.1
BSA [xx mg/mL]
R. BIURET Absorbancia Concentración
(mL)
TUBO H2O
XXXXX MP (mL) (mL) %
1B 0,0 --- 1,0 4,0
2S 0,1 --- 0,9 4,0
3S 0,3 --- 0,7 4,0
4S 0,6 --- 0,4 4,0
5S 1,0 --- 0,0 4,0
6 MP --- 1,0 MP1 0,0 4,0
7 MP --- 1,0 MP2 0,0 4,0
e. Agite y espere 20 minutos a temperatura ambiente para la formación del complejo

coloreado.
f. Mida la absorbancia de los tubos en un espectrofotómetro a 540 nm, previa calibración
del equipo con el blanco.

De acuerdo a los datos:
g. Calcule la concentración de la ovoalbúmina en los tubos (2S – 5S).

h. Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentración.
i. Obtenga la ecuación de la recta y el coeficiente de regresión por regresión lineal.
j. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las cubetas mediante la
ecuación 1.5.
k. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales
considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuación1.6). Recuerde que cx
(Ecuación 1.5) corresponde a cf (Ecuación 1.6).
Método de Lowry
a. Prepare una batería de tubos enumerados.
b. Agregue los volúmenes indicados de la solución de seroalbúmina de bovino (BSA) estándar
o muestra problema con una pipeta graduada de 1 ml.
c. Agregue los volúmenes indicados de agua con una pipeta graduada de 1 ml.
d. Agregue 1,0 ml del reactivo alcalino (RCA) con una pipeta de 1 ml. Espere 10 minutos
exactos.
e. Después de los 10 minutos, agregue 4,0 ml del reactivo de Folin con una pipeta de 5 ml y
mezcle.
f. Caliente los tubos por 5 minutos exactos a 55ºC en el baño termostatizado.
g. Enfríe y lea en el espectrofotómetro a 650 nm, previa calibración con el blanco.
TABLA 1.2
BSA
R.F. A Conc.
(mL) H2O R.C.A.
TUBO
xxxx mg/mL MP (mL) (mL) (mlL) mg/mL
1B ---- --- 1,0 1,0 4,0
2S 0,1 --- 0,9 1,0 4,0
3S 0,2 --- 0,8 1,0 4,0
4S 0,4 --- 0,6 1,0 4,0
5S 0,6 --- 0,4 1,0 4,0
6MP --- 0,5 MP1 0,5 1,0 4,0
7MP --- 0,5 MP2 0,5 1,0 4,0
l. Calcule la concentración de BSA en los tubos (2S – 6S).

m. Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentración.
n. Obtenga la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de regresión.
o. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en la cubeta mediante la ecuación
1.5.
p. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales
considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuación 1.6).

LABORATORIO Nº 5
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA POR MÉTODOS CUALITATIVOS Y CUANTITATIVOS

I. INTRODUCCCIÓN
La glucosa es la principal fuente de energía del organismo. Es obtenida fundamentalmente por la

ingesta de carbohidratos en la dieta regular y del glucógeno.
En estado de post-absorción la concentración de glucosa sanguínea en el hombre varía entre 70 -

110 mg/100 mL. Los niveles de glucosa se ven afectados por condiciones externas e internas
como, por ejemplo, la comida, el ayuno o el ejercicio intenso, niveles que son rápidamente
regulados en el organismo por la secreción de dos hormonas principalmente, la insulina y el
glucagón, y en menor medida la epinefrina, por lo que la importancia de un control de los niveles
de glucosa resulta relevante al considerar los diversos trastornos que surgen de un desbalance de
los niveles normales.
La mantención de valores estables de glucosa en la sangre es uno de los mecanismos más

finamente regulado. En esta regulación participan el hígado y varias hormonas.
Cuando la glucosa sanguínea alcanza valores relativamente altos, el riñón también ejerce un
efecto regulador. La glucosa filtrada continuamente por los glomérulos es habitualmente
reintegrada por completo a la sangre por el sistema de resorción de los túbulos renales. La
resorción de glucosa está enlazada con el aprovisionamiento de ATP en las células tubulares. La
capacidad del sistema tubular para absorber glucosa está limitada a una tasa aproximada de 350
mg/min. Cuando la cantidad de glucosa en la sangre sobrepasa la que puede ser reabsorbida el
exceso pasa a la orina produciéndose glucosuria.
En los individuos normales la glucosuria ocurre cuando la concentración de glucosa en la sangre

venosa es superior a 170-180 mg/100 mL.
[glucosa]normal en sangre 70-110 mg/dL ( 3,9-6,1 mmol/L).

[glucosa]normal en orina 1-15 mg/dL ( 0,06-0,8 mmol/L).
Métodos Cuantitativos
Método Químico: O-toluidina.
En una solución de ácido caliente, la O-Toluidina se condensa inicialmente con el grupo aldehído
de la glucosa para formar un equilibrio mixto de glicosilamina y su correspondiente base de schiff,
ordenamientos y reacciones posteriores producen una mezcla de cromógenos verde-azulados, con
una densidad óptica máxima a 630 nm.
O-Toluidina + Glucosa Ácido Complejo Coloreado

Caliente (verde-azulado)

Las dificultades de este método surgen de su inespecificidad ya que otros carbohidratos pueden
producir niveles variables de colores en la reacción, por ejemplo, la fructosa tiene un pequeño
efecto, pero la galactosa produce una fuerte reacción, y a pesar de estar presentes a bajas
concentraciones en la sangre, bajo ciertas condiciones pueden interferir con las mediciones de
glucosa.
Método Enzimático: Winkler
La glucosa reacciona con el reactivo enzimático que contiene una mezcla de las enzimas Glucosa
Oxidasa (GOD) y Peroxidasa (POD). En la primera etapa la Glucosa es oxidada a Ac. Glucónico por
la acción de la enzima GOD, liberándose como producto H2O2, el cual en una reacción mediada
por la enzima POD, reacciona con el Ac. p-Hidroxibenzoico y 4-Aminoantipirina produciendose un
compuesto coloreado con un máximo de absorción a 505 nm., en cantidad proporcional a la
cantidad de Glucosa presente en la muestra.
GOD
D-Glucosa Acido D-Glucónico + H2O2
POD
H2O2 + p-HBA + 4-AAP H2O + Complejo Coloreado
II. PROCEDIMIENTO.
II. 1. Método Químico: O-toluidina.
a. De acuerdo a la tabla 2.1:
b. Prepare una batería de tubos rotulados.
c. Agregue el volumen indicado de la solución estándar de glucosa (16 mg/dL) a los tubos 2S-
6S.
d. Agregue 0,5 ml de las diferentes muestras problemas a los tubos 7MP-8MP.
e. Complete el volumen de los tubos a 0,5 ml agregando el volumen indicado de agua
destilada.
f. Agregue 3,0 ml de la o-toluidina con una pipeta graduada de 5 ml. Tape los tubos con
bulbos de vidrio.
g. Homogenice y lleve los tubos a un baño de ebullición por 10 minutos.
h. Enfríe y lea la absorbancia a 630 nm. El color es estable por 30 minutos.
TABLA
Glucosa (mL) Glucosa Volumen H2O o-Toluidina
TUBO
16 mg/dL M. P. (mL) (mL) (mL)
1B 0,0 --- 0,5 3,0
2S 0,1 --- 0,4 3,0
3S 0,2 --- 0,3 3,0
4S 0,3 --- 0,2 3,0
5S 0,4 --- 0,1 3,0
6S 0,5 --- 0,0 3,0
7MP --- 0,5 MP1 0,0 3,0
8MP --- 0,5 MP2 0,0 3,0

i. Calcule la concentración de glucosa en los tubos (2S-6S).

j. Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentración.
k. Obtenga la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de regresión.
l. Calcule las concentraciones de las muestras problemas (tubos 7MP-8MP) mediante la
Ecuación 1.5.
m. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales
considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuación 1.6).
II.2 Método Enzimático: Winkler.
a. Prepare una batería de tubos de ensayo marcados, B (blanco), S (estándar), MP1, MP2 y
MP3.
b. Agregue con una micropipeta el volumen indicado de la solución estándar de glucosa (100
mg/dL) al tubo S.
c. Agregue con una micropipeta el volumen indicado de las diferentes muestras problemas a
los tubos correspondientes.
d. Agregue el reactivo de trabajo con una pipeta aforada de 2 ml.
e. Homogenice e incube los tubos por 5 minutos en un baño termostatizado a 37ºC.
f. Lea la absorbancia a 505 nm, llevando el equipo a absorbancia cero con el blanco.
TABLA 2.2
B S MP1 MP2 MP3
Estándar (160 mg/mL) (l) ---- 20 ---- ---- ----
Muestra problema (l) --- --- 20 20 20
Reactivo de trabajo (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
• Calcule la concentración de glucosa en las muestras problemas de acuerdo a la Ecuación 2.1.
Ecuación 2.1
Nota: PM Glucosa = 180 g/mol

1 dL = 0,1 L = 100 mL

LABORATORIO Nº 6
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
1. Aspectos teóricos.
Las enzimas son proteínas que presentan actividad catalítica específica, esto es, aumentan
la velocidad de reacciones específicas. La actividad catalítica de una enzima es una propiedad que
se mide por el aumento de la velocidad de reacción en presencia de la enzima con relación a la
reacción no catalizada en un sistema químico dado.
La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la concentración
del producto o la disminución de la concentración del sustrato de la reacción en el tiempo.
v = - d[S]/dt = + d[P]/dt
Existen diferentes métodos que permiten cuantificar la concentración de reactantes y/o

productos. Entre los métodos analíticos físicos destacan los ópticos, que se basan en la absorción de
radiación electromagnética en la región visible y ultravioleta. Determinando el coeficiente de
extinción de un compuesto se estima la velocidad sobre la base de las medidas experimentales de
absorbancia a un tiempo dado.
Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores más importantes
son: concentración de enzima, concentración de ligandos (sustratos, productos, inhibidores y
activadores), pH, fuerza iónica y temperatura.
La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En general, son
sólo activas en un rango limitado de éste, observándose en la mayoría de los casos una zona de pH
óptimo y una disminución de la actividad a ambos lados del pH “óptimo”. El efecto del pH en la
actividad enzimática se debe fundamentalmente a cambios en el estado de ionización de los
componentes del sistema; esto puede darse en la enzima libre, en el complejo E-S o en el sustrato. En
la zona de pH óptimo predomina la forma iónica activa, a valores de pH menores y mayores su
proporción disminuye, aumentando la proporción de formas iónicas no activas; a causa de ello la
curva de velocidad versus pH tiene aproximadamente la forma de una campana. El pH no sólo afecta
la actividad de las enzimas, sino que también la estabilidad, lo que contribuye a la disminución de la
actividad generalmente a valores extremos de pH.
Las reacciones enzimáticas están fuertemente afectadas por la temperatura. Hay dos factores
determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes de velocidad de la reacción y el efecto
de la temperatura en la estabilidad de la enzima. Como es de esperar, un aumento de la temperatura
aumenta la velocidad de la reacción; sin embargo, sobre cierta temperatura hay inactivación de la
enzima que lleva a una disminución en la velocidad. La zona de temperatura en la cual se observa
mayor actividad se conoce como “temperatura óptima”, ésta tiene sólo valor operativo, ya que
depende de una serie de factores, como el pH y el tiempo de reacción.
En este práctico se verá el efecto que produce en la actividad de la enzima -glucosidasa
de almendra dulce los cambios de pH y temperatura. Se determinará la velocidad de la hidrólisis
de un sustrato artificial, el p-nitrofenil--D-glucopiranósido (pNPG), midiendo la formación de un
producto de la reacción, el p-nitrofenolato, que en un medio alcalino es de color amarillo y
presenta un máximo de absorción alrededor de 405 nm.
A − Co 1 V
v =    fd fe ( UI/ml) Ecuación 6.1
  t v

A = Absorbancia
Co = absorbancia del ensayo control
· = pendiente curva de calibrado
t = tiempo (minutos)
V = volumen de ensayo (ml)
v = volumen de enzima (ml)
fd = factor dilución en el ensayo enzimático (en ensayos discontinuos)
fe = factor de dilución de la enzima previo al ensayo enzimático.
Una unidad internacional (UI) de enzima se define como la cantidad que cataliza la formación
de 1 mol de producto por minuto en condiciones definidas de ensayo.
2. Objetivos.
Estudiar el efecto del pH y de la temperatura en la velocidad de la hidrólisis del p-nitrofenil--D-

glucopiranósido catalizada por la -glucosidasa. Establecer condiciones adecuadas de ensayo.
3. Parte experimental.
3.1 Materiales
• espectrofotómetro / celdas
• 1 cronómetro
• 1 trípode / rejilla/ mechero
• 1 termómetro
• 1 baño termostatizado
• 1 vaso precipitado de 500 ml
• 1 vaso precipitado de 250 ml
• 2 gradillas
• 20 tubos de ensayo
• 1 pizeta
• 1 pipeta graduada de 1 ml
• plato poroso.
Reactivos
• p-nitrofenolato 0,2 mM.

• tampón acetato 50 mM, pH 4,0; 5,0 y 6,0.
• tampón fosfato 50 mM, pH 7,0.
• p-nitrofenil--D-glucopiranósido 2 mM / tampón.
• -glucosidasa (baño agua / hielo).
• Na2CO3 1.0 M.

4. Procedimiento.
Obtención del coeficiente de extinción milimolar del p-nitrofenolato (pNF).

• Prepare una batería de tubos rotulados.
• Agregue el volumen indicado de la solución de p-nitrofenol (0,2 mM) a los tubos 2S ➔
7S.
• Complete el volumen a 1,0 ml a cada tubo (1B, 2S ➔ 7S) agregando tampón acetato
pH 5,0.
• Agregue a cada tubo 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M. Homogenice la solución.
• Mida la absorbancia de los tubos 2S ➔ 7S ocupando el blanco (1B) para calibrar el
equipo y anótela en la tabla.
• Calcule y anote en la tabla la concentración del pNF en el volumen final de 3,0 ml.
TABLA 6.1
TUBO pNF Tampón Na2CO3 pNF A405nm
(ml) (ml) (ml) (mM)
1B ------ 1,0 2,0
2S 0,1 0,9 2,0
3S 0,2 0,8 2,0
4S 0,3 0,7 2,0
5S 0,6 0,4 2,0
6S 0,6 0,4 2,0
De acuerdo a los datos.

• Construya el gráfico absorbancia versus [pNF].
• Determine la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de regresión.
• Calcule el coeficiente de extinción milimolar.
Obtención de la velocidad de la reacción catalizada por la -glucosidasa (Método discontinuo).

• Preincube 0,9 ml del sustrato (pNPG) 2,0 mM al pH dado durante 3 minutos a la
temperatura indicada.
• Inicie la reacción mediante la adición de 0,1 ml de la enzima, inmediatamente,
homogenice la solución y colóquela en el baño de agua termostatizado a la
temperatura correspondiente. Al mismo momento inicie el cronómetro.
• Detenga la reacción a los 5,0 minutos con 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M.
• Cuantifique el p-nitrofenolato, producto de la reacción, por absorbancia a 405 nm.
• Calcule la velocidad de la reacción de acuerdo a la ecuación 5.1.

Blanco.
• Prepare el blanco (control tiempo 0 o tubo tiempo 0, t0) con todos los componentes
del ensayo mezclados en tal forma que no haya reacción.
o Preincube 0,9 ml del sustrato al pH dado durante 3 minutos a la temperatura
indicada.
o Inmediatamente, detenga la posible reacción no enzimática agregando 2,0 ml de
Na2CO3
o Agregue 0,1 ml de la enzima.
Control.
• Prepare el control incubando a la temperatura definida todos los componentes del
ensayo, menos la enzima, de modo que no haya reacción enzimática.
o Incube 0,9 ml de pNPG durante 8 minutos (3,0 min de preincubación y 5,0 min de
ensayo),
o Inmediatamente, detenga la posible reacción no enzimática agregando 2,0 ml de
Na2CO3,
o Agregue 0,1 ml de la enzima.
Ocupe el blanco para calibrar el espectrofotómetro y el control para detectar una reacción no
enzimática, reste esta lectura a la del ensayo enzimático correspondiente (Ecuación 6.1).

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GUÍA DE LABORATORIO- QUI-129

QUÍMICO ORGÁNICA Y BIOQUÍMICA

La Guía de Laboratorio corresponde a un material de

PROFESOR RESPONSABLE: Dr. Christian Mandiola

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 -2-

Nombre de la asignatura QUÍMICA ORGÁNICA-BIOQUÍMICA

Profesor responsable Laboratorio Dr. Christian Mandiola Q.

1. Manejo de técnicas básicas de

1. Informe de Laboratorio (50%)

1.- Sintesis de Jabon

1.- Asistencia Obligatoria

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 -3-

El laboratorio será evaluado de acuerdo a las siguientes consideraciones:

→ Pruebas de prelaboratorio: Corresponden a evaluaciones cortas que se realizarán al inicio

→ Evaluaciones de informes de laboratorio: Corresponden a las evaluaciones que se

MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

“Realizar los procedimientos con seguridad no es solamente la manera correcta de trabajar, es

Luego y antes de comenzar cualquier operación o hacer un experimento es importante

• Practicar el hábito de la prevención de accidentes.

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 -4-

Asimismo, debe seguir las siguientes reglas de seguridad:

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 -5-

CLASIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS QUÍMICOS SEGÚN LA NORMA NFPA 704

El rombo de color azul, está asociado al

El rombo de color rojo, está asociado al

El rombo de color amarillo está

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 -6-

6.-Nunca deje un aparato, o equipo, funcionando sin vigilancia.

8.-Desperdicios de vidrios, corcho, fósforos y otros materiales sólidos se arrojarán en el cubo

9.-Los aparatos deben instalarse en un lugar cómodo y desahogado. Nunca se ha de poner en

10.- Seque los materiales de vidrio por fuera, antes de calentar.

14.- Nunca se debe calentar un sistema completamente cerrado ni montar un aparato

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 -7-

25.- No tome el gusto a ninguna sustancia química, si no le indican lo contrario.

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 -8-

Informar a Secretaria de Sí No Realizar asistencia y

Secretaria de Dirección Seguimiento

Monitores de Primeros Auxilios Requiere No

Secretaria de Dirección Instituto de Química: 32-2274910

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 -9-

REACCIONES DE GRUPOS CARBOXILICOS

LABORATORIO DE GRASAS: FORMACION DE UN JABON

CH3 (CH2)7 CH CH (CH2)7 COOH

Si el contenido de ácidos grasos insaturados es grande, el glicérido es líquido a temperatura

La hidrólisis del triester en solución alcalina se denomina saponificación.

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 - 10 -

Tripalmitato de glicerina + 3 KOH ⎯⎯→ Palmitato de K (jabón) + Glicerol.

a. En un vaso de precipitado de 200 ml caliente a baño maría 12gr. de manteca o mantequilla.

III. PRUEBAS DE ESPUMACIDAD

Preparar una solución al 1% p/p del jabón obtenido y realizar lo siguiente:

a. A 10 ml de la solución jabonosa agregar 1,0 gr NaCl y observa lo que ocurre.

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 - 11 -

La leche es el alimento más completo nutricionalmente que ha sido encontrado en la naturaleza.

La composición de la Leche de algunos mamíferos se resume en la tabla que se muestra a

Composición Porcentual (%) de la Leche de varios Mamíferos.

Actualmente la caseína, es una mezcla de tres proteínas similares, principalmente ,  y  caseína.

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 - 12 -

1. Pese 0.5 grs de la caseína y agréguelo a un balón de 100 ml.

P. UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO | segundo semestre 2022 - 13 -