ESCUELA SUPERIOR

POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS
PECUARIAS CARRERA DE
MEDICINA VETERINARIA

ENFERMEDADES CONTAGIOSAS

INMUNOHISTOQUÍMICA
INTEGRANTES:

o ERICKA MISHELL MORALES BOHORQUEZ

o MARIA FERNANDA NUÑEZ MUÑOZ
o TIRSA DIANEY ECHEVERRIA ZAMBRANO
o SANTIAGO ALEXANDER VASQUEZ CASTELLANOS
o KAREN DANIELA LAGUAQUIZA JAYA
o GENESIS DAYANA EUGENIO PINO
o JENNYFER PAMELA RODRIGUEZ ALVARADO
o ODALIS BELEN VIÑAÑ MURILLO

NIVEL:
5to “A”

DOCENTE:
DRA. LUCIA VANESSA CABASCANGO MARTINEZ

RIOBAMBA, 2022 1
 Tabla de Contenidos
Tabla de Contenidos ....................................................................................................................... II

Objetivos ......................................................................................................................................... 3

Objetivo General ......................................................................................................................... 3

Objetivos Específicos.................................................................................................................. 3

Introducción .................................................................................................................................... 4

Desarrollo ........................................................................................................................................ 6

1. Definicion ............................................................................................................................... 6

2. Utilidad ................................................................................................................................... 7

2.1. Enfermedades. .................................................................................................................. 7

3. Toma de muestra ..................................................................................................................... 8

4. Preparación ............................................................................................................................. 9

5. Interpretacion de resultados .................................................................................................. 16

Conclusiones ................................................................................................................................. 18

Bibliografía ................................................................................................................................... 19

Anexos .......................................................................................................................................... 22

2
II
 OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL

• Determinar en qué consiste la prueba de inmunohistoquímica

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Detallar cual es la utilidad de realizar esta prueba diagnóstica.

• Distinguir los pasos a seguir en la toma de muestras para realizar la prueba de

inmunohistoquímica.

• Describir como se prepara y se lee los resultados en la prueba de inmunohistoquímica

3
 INTRODUCCIÓN

Con el paso de los años y particularmente los de esta década, la práctica de la histopatología diagnóstica

ha experimentado muchos cambios fundamentales que han ayudado en la revolución de la especialidad

y han señalado nuevos rumbos con muy interesantes perspectivas (Duraiyan et al., 2012).

Anteriormente el diagnóstico de la histopatología diaria tenía una parte muy limitada al momento de

la interpretación en los hallazgos morfológicos y subjetiva en los encuentros histológicos y de la

histoquímica convencional, no obstante, resultaron de gran ayuda, aunque su inespecificidad constituía

como su más grande limitación (Cavanzo, 2012).

La llegada de las técnicas de inmunohistoquímica ha producido una revolución, debido a que estas

técnicas permiten identificar de forma absolutamente específica los componentes tisulares

(marcadores), los cuales atribuyen al estudio histopatológico a un carácter funcional y dinámico, lo

que permite mayor efectividad al momento del diagnóstico. Asimismo, han contribuido en la mejora

de la investigación biomédica y particularmente en patología, lo que ha contribuido a determinar

millones de enfermedades, en especial las neoplasias. Su disposición progresiva al diagnóstico

patológico rutinario ha ayudado a proporcionar una mayor fuente de información adicional sobre

factores pronóstico y predictivos, contribuyendo a mejorar la enfermedad de los pacientes (Archila &

Ricaurte, 2021) (Duraiyan et al., 2012).

La inmunohistoquímica es una técnica que es muy utilizada en el campo de patología, apoyada en el

uso de anticuerpos como reactivos enormemente específicos al momento de la identificar una

innumerable gama de macromoléculas denominados como marcadores en cortes histológicos o

preparaciones citológicas, con ayuda de la visualización en el microscopio de reacciones antígeno-

anticuerpo (Archila & Ricaurte, 2021).

En cuanto a lo que se basa en la sensibilidad de esta técnica fue mejorada significativamente con el

desarrollo de diversos métodos. Permitiendo un excelente detalle morfológico; las muestras tienen la

4
opción de ser contra teñidas y examinadas con un microscopio de óptico. El desarrollo de anticuerpos

para epítopos resistentes a la fijación de tejidos y la disponibilidad de un sistema de detección

altamente sensible hacen de la inmunohistoquímica una herramienta práctica para la patología

(Dubarry, 2017) (Ruiz Romero et al., 2017).

5
 1. Definición

La inmunohistoquímica es una prueba auxiliar en el campo de la patología la cual unifica la histología,

anatomía, inmunología y bioquímica. Esta prueba de diagnóstico tiene como fin detectar un antígeno

específico en el tejido que comúnmente es una proteína, proporcionando así su localización, cantidad

y distribución específica (Verma, 2022).

Los anticuerpos utilizados para encontrar la proteína son creados en una especie diferente a la

investigada y se marcan por un segundo grupo de anticuerpos marcados. Las muestras de tejido usadas

para esta prueba se preparan con técnicas que permitan el ingreso de los anticuerpos ya mencionados

para que por medio de un análisis microscópico ya sea óptico o electrónico se observen las marcas

(Kim et al., 2016).

Figura 1 Inmunohistoquímica positiva a la proteína S-100 en glándula mamaria. Obtenido de Ortiz Hidalgo & Frías
Soria, 2019

La Inmunohistoquímica es una de las pruebas que destaca ante otras pruebas de laboratorio debido a

que no causa daños en la arquitectura histológica, esto genera una posibilidad de estudiar al patrón que

puede expresar la molécula de interés en un microambiente (Kim et al., 2016).

6
 2. Utilidad

Esta prueba es ocupada como una herramienta estándar para investigaciones, y a pasado a ser una

técnica auxiliar en el diagnóstico anatomopatológico de distintas enfermedades infecciosa,

diagnóstico y clasificación de neoplasias por su alta especificidad (Bellizi, 2019) (Magaki, 2019).

Se utiliza en todas las etapas de la patología desde la identificación del agente infeccioso causal hasta

la caracterización de este, en caso de lesiones histológicas se considera como una prueba diagnóstica

definitiva. (Wedster, et al., 2021).

2.1 Enfermedades

• Papilomatosis en bovinos

Es una enfermedad infectocontagiosa viral crónica la cual se caracteriza por presentar tumores

benignos en la piel y mucosas, es ocasionada por diferentes tipos de Papilomavirus bovino. Para su

diagnóstico se puede utilizar inmunohistoquímica (Violet, et al., 2017).

Figura 2. Lesiones papilomatosas en diferentes partes del cuerpo. Obtenido de Violet, et al., 2017).

• Rabia

Es una enfermedad viral zoonótica por lo cual es de importancias y por se realizan pruebas de

laboratorio estandarizadas para su diagnóstico con tejidos de sistema nervioso central. Para la

7
identificación de agente pruebas como inmunohistoquímica, PCR, inmunofluorescencia que otorgan

un diagnóstico fiable de 98-100% (OIE, 2018).

Sarcomas felinos asociados a sitios de inoculación

Neoplasias de origen mesentérico que se producen en sitios utilizados para aplicaciones de vacunas,

se utiliza histopatología e inmunohistoquímica para caracterizar y determinar las células proliferantes

(Santelices, et al., 2019).

3. Toma la muestra

Se realiza una biopsia en la cual se obtiene un tejido vivo de una lesión, el material obtenido debe ser

suficiente, tanto en extensión como en profundidad ya que esto nos permitirá tener un buen

diagnóstico. La muestra debe ser representativa de la lesión y se debe realizar un buen manejo hasta

su procesamiento en el laboratorio. Para obtener un tejido se utiliza un bisturí el cual permite extirpar

una parte de la piel en su totalidad, además se puede utilizar un sacabocados el cual es un instrumento

que extirpa un cilindro corto o "corazón de manzana" del tejido para obtener una muestra de piel más

profunda (Magaki et al., 2019).

• Prefijación

Los factores que influencian el resultado de la IHQ comienzan con la toma de la muestra, el tiempo de

isquemia es el período que transcurre entre la interrupción del flujo sanguíneo y el inicio de la fijación.

Un tiempo de isquemia prolongado produce acidosis tisular, degradación enzimática y alteración de la

inmunoreactividad (Neumeister et al.,2016).

• Fijador

El formol o formalina es el fijador universalmente aceptado ya que es bien tolerado por los tejidos y

tiene buena penetración, aunque la fijación es lenta. Se prepara al 10% partiendo del formol comercial

lo que hace que la solución tenga una concentración final de formaldehido del 4%. Se utiliza a esta

8
concentración porque concentraciones muy elevadas pueden provocar que la fijación del tejido

periférico impida la entrada y fijación del tejido de la zona central (Goldstein et al., 2017).

• Fijación

Permite preservar los tejidos de la autolisis y putrefacción conservando la morfología celular lo más

parecido posible al estado vivo. El tiempo necesario para lograr la saturación del fijador es de 24 a 72

horas, las muestras fijadas menos o más de este tiempo pueden dar resultados falsos. Se debe evitar

que el tejido se seque en cualquiera de las etapas ya sea durante la extracción, el procesamiento o

durante la realización de la técnica de IHQ. Esto puede causar cambios morfológicos en la definición

de la cromatina y cambios estructurales en especial a nivel de los bordes. Pudiendo por un lado inhibir

la unión antígeno-anticuerpo y por otro, como el tejido seco es más absorbente incrementar la unión

inespecífica e interferir con la interpretación (Skaland et al., 2017).

4. Preparación

a. Preparación de la muestra

Las muestras de tejido pueden ser procesadas mediante congelación o por fijación. De forma

general, congelando las secciones se consigue que la conformación de la proteína diana quede

inalterada. Ello permite que el anticuerpo se una con más afinidad. Sin embargo, la congelación genera

pequeños cristales de hielo, es por ello por lo que no se recomienda el uso de las preparaciones después

de un largo periodo de almacenamiento. (Torlakovic, D’Arrigo and Dietel, 2017)

Figura 3. Fijación con formaldehido. obtenido de Torlakovic et al., 2017

9
Por contra, el procedimiento más utilizado para fijar e incluir tejidos es mediante fijación con

formaldehido (FFPE de las siglas en inglés: formaldehyde fixation with paraffin embedding). Esta

metodología permite almacenar estas secciones a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo

indefinido (Torlakovic, D’Arrigo and Dietel, 2017)

Otros usuarios, con el fin de aumentar la afinidad del anticuerpo primario, prefieren fijar las muestras

con una solución 50:50 (v/v) de metanol:acetona o un bien al 4% de paraformaldehido (PFA).

(Torlakovic, D’Arrigo and Dietel, 2017).

b. Recuperación de epítopo

La fijación con formaldehido causa reticulación de proteínas en el tejido. La principal ventaja es que

permite mantener la estructura del tejido, pero desnaturaliza los epítopos de a reconocer por el

anticuerpo. Es por ello por lo que la recuperación del antígeno se suele realizar mediante aumento de

temperatura o enzimáticamente. Estos factores (temperatura y pH) deben ser testados y puestos a

punto. Llegados a este punto, se recomienda utilizar una batería de métodos para cada par de

anticuerpo y tejido a testar. De esta manera, dispondremos de la combinación de tratamientos que más

se adapta a un anticuerpo en un tejido concreto (Torlakovic, D’Arrigo and Dietel, 2017)

Un buen punto de partida consiste en hervir en tampón citrato a pH 6.0 un minuto o dos en el

microondas. En secciones congeladas no es necesario realizar recuperación de antígeno. A pesar de

esto, los portaobjetos deben ser secados al aire durante al menos una hora antes de iniciar la tinción.

Posteriormente, las muestras son tratadas con xileno y rehidratadas con alcohol y agua desionizada.

(Torlakovic, D’Arrigo and Dietel, 2017)

10
 c. Manejo de las muestras

Figura 4. Unión tejido con Anticuerpo obtenido de Cheung et al, 2017.

Una vez las muestras han sido rehidratadas, es importante no dejarlas deshidratar. Utiliza una bandeja

o cubeta específica para obtener una cámara húmeda y así llevar a cabo tus experimentos de

IHC. Alternativamente, si no dispones de una de estas cámaras, puedes diseñar una utilizando papel

de cocina humidificado en agua. (Cheung, D’Arrigo

9 and Dietel, 2017).

Un truco realmente bueno, consiste en utilizar un PAP pen – un marcador especial que proporciona

una fina capa hidrofóbica cuando se dibuja alrededor de una muestra – para mantener las disoluciones

únicamente en las regiones de interés. Su uso no es esencial, pero puede ser de gran utilidad ya que te

permitirá ahorrar anticuerpo (Cheung, D’Arrigo and Dietel, 2017).

d. Permeabilización

Figura 5. Permeabilización de proteínas obtenido de Torlakovic et al., 2017.

11
Para muchas proteínas es muy recomendable añadir un paso de permeabilización al protocolo. Para

proteínas transmembranales, puede ser un paso evitable ya que los epítopos suelen estar en la parte

extracelular. La permeabilización implica el tratamiento con un detergente (por ejemplo, Triton-

X100 disuelto en PBS). Un buen truco si la tinción no funciona, es intentar añadir un detergente como

el Triton a concentración baja en todas las disoluciones que preparemos (en especial si estamos

trabajando con FFPE). (Cheung, D’Arrigo and Dietel, 2017).

e. Bloqueo

La solución de bloqueo se une a lugares de unión que no son específicos dentro del tejido con el fin

de prevenir la unión no específica de los anticuerpos primario y/o secundario. Las secciones se incuban

con una solución proteica que es inocua al progreso de nuestra IHC, un buen ejemplo es la albúmina

sérica bovina o también conocida por sus siglas en inglés: BSA. También podríamos utilizar suero del
10
huésped utilizado en el anticuerpo secundario. Un buen comienzo puede ser iniciar con una solución

3% de BSA e incubar durante 20 o 30 minutos. (Torlakovic, D’Arrigo and Dietel, 2017)

Figura 6. Prevención a la unión no especifica de los anticuerpos primario y/o secundario obtenido de Torlakovic et al.,
2017

12
Alternativamente, utilizar una dilución entre el 5% y el 10% de suero de cabra (¡siempre que el

anticuerpo secundario se haya producido en esta especie!) puede ser un buen punto de partida para la

puesta a punto del protocolo. (Shi, Imam, Young L, Cote R, Taylor C, 1995)

f. Escoger el anticuerpo primario

Para escoger qué anticuerpo se adapta mejor a nuestra muestra tendremos que tener en cuenta factores

como: los niveles de expresión de la proteína de interés en ese tejido y que otros anticuerpos se pueden

utilizar en ese tejido para realizar la colocalización. Deberás utilizar anticuerpos producidos en

diferentes especies con el fin de poder distinguirlos a la hora de incubar con los respectivos anticuerpos

secundarios. Por otro lado, deberás tener en cuenta si un anticuerpo monoclonal o bien policlonal se

adapta más a tus necesidades. Los anticuerpos monoclonales ofrecen una señal más específica mientras

que los policlonales pueden ofrecer más señal en casos en que los niveles de expresión de la proteína

de interés sean bajos. (Shi, Imam, Young L, Cote R, Taylor C, 1995).

g. Anticuerpos de control

Existen algunas opciones para testar la especificidad de un anticuerpo primario.

• El control ideal para testar la especificidad de un anticuerpo primario sería utilizar un tejido

que no contenga la proteína de interés, como, por ejemplo, el tejido de un ratón knock-out o

células en que la proteína diana se ha silenciado mediante un siRNA.

• La técnica de western blot se suele utilizar para detectar si la proteína de interés tiene el tamaño

correcto. Si se detectan múltiples bandas en la membrana, ello indica que el anticuerpo no es

capaz de detectar de forma específica.

13
• La especificidad del anticuerpo se puede chequear mediante pre-incubación del anticuerpo

primario con el péptido antigénico (test de adsorción). Este proceso no es necesario en aquellos

anticuerpos purificados por afinidad.

• Si es anticuerpo ha sido generado de forma casera, se recomienda hacer un WB utilizando

sueros de diferentes etapas del proceso de obtención del anticuerpo, para determinar si la banda

que representa a tu proteína es detecta en las fracciones correctas de la etapa de purificación

del anticuerpo. (Tong, Nahid, Tsourigiannis and Mulligan ,2011).

h. Dilución del anticuerpo

Normalmente, se proporciona una guía de las diluciones a testar juntamente con el anticuerpo.

De todas formas, diluciones desde 1:50 a 1:300 son buenos puntos de partida para iniciar la

optimización del protocolo. Se recomienda realizar un panel de diluciones cada vez que se

adquiera un nuevo anticuerpo. En general, una vez diluido el anticuerpo en solución de bloqueo

(por ejemplo, 3% de BSA en PBS), incuba durante 1 o 2 horas a temperatura ambiente o bien

toda la noche a 4ºC. (Tong, Nahid, Tsourigiannis and Mulligan, 2011)

i. Lavados

• Los lavados para eliminar el exceso de anticuerpo primario se suelen realizar con PBS. Un

lavado rápido seguido de tres lavados de duración igual a 5 minutos es más que suficiente. Las

secciones congeladas pueden ser un tanto frágiles, de tal forma que es recomendable verter la

solución de lavado utilizando una pipeta Pasteur. En buen truco es utilizar Tris-buffered Saline

(TBS) en vez de PBS. (Tong, Nahid, Tsourigiannis and Mulligan, 2011).

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 j. Detección

La detección del anticuerpo primario se suele realizar utilizando anticuerpos secundarios contra

inmunoglobulinas de la especie huésped en que se ha realizado el anticuerpo primario. Estos

anticuerpos secundarios pueden estar conjugados a un fluoróforo (por ejemplo, FITC) o bien a una

enzima cromogénica (como por ejemplo la peroxidasa de rábano; horse-radish peroxidase HRP).

El background o ruido de fondo puede variar entre experimentos. Añade siempre un control negativo,

es decir una muestra en la que se ha omitido la incubación con anticuerpo primario.

• Diluye el anticuerpo secundario en solución de bloqueo y en un factor de dilución entre 1:800

y 1:1000.

Figura 7. Detección del anticuerpo primario obtenido de Carol et al., 2017.

Otros consejos a tener en cuenta en experimentos con fluorescencia son los siguientes:
13
• Comprueba que el fluoróforo que pretendes detectar puede ser utilizado en tu microscopio. Es

importante evitar espectros que se solapan y evitar la reactividad cruzada entre anticuerpos

secundarios.

• Mantén las secciones en la oscuridad una vez los anticuerpos fluorescentes se hayan añadido

con el fin de prevenir que se pierda la señal.

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 • Después de la incubación, lava las secciones muchas veces con PBS antes de añadir el medio

de montaje. Además, ten cuidado al añadir el cubreobjetos a la preparación.

• Evita que se produzcan burbujas en el momento en que añadas el cubreobjetos especialmente

en secciones congeladas. Y recuerda, no aprietes el cubreobjetos demasiado fuerte, ¡podrías

romper el tejido!

• Es bastante habitual teñir el núcleo, como por ejemplo con DAPI. Este paso puede ser incluido

durante un lavado o bien en el momento de añadir el medio de montaje.

• Es posible utilizar anticuerpos primarios directamente conjugados con fluoroforos. Este paso,

ahorra tiempo y reduce falsos positivos. Sin embargo, la señal obtenida puede ser bajo. Por

suerte, existen métodos para aumentar esta señal como incluir un complejo avidina-biotina

(ABC) y unirlo con streptavidina-biotina (LSAB). (Carol C. Cheung; Clive R. Taylor; Emina E.

Torlakovic. (2017)

5. Interpretación de resultados

Se pueden interpretar los resultados según la inmunorreacción cuando es positiva o negativa, además

la distribución citológica y las características de expresión de los antígenos. Según el sitio de

localización, la inmunomarcación de antígenos celulares puede presentarse en la membrana, el núcleo

o el citoplasma (Gastrointestinal & Liver Specialists of Tidewater, 2018).

Le lectura estará dada entorno a la interpretación de los resultados, en primer lugar, si es negativo de

la prueba significa que el laboratorio no encontró ningún cambio en las proteínas e indica que el animal

no está afectado por un trastorno en particular, ni es portador de una mutación genética específica o no

tiene un mayor riesgo de desarrollar una determinada enfermedad (Gastrointestinal & Liver Specialists

of Tidewater, 2018).

16
Un resultado positivo de la prueba significa que el laboratorio encontró un cambio particular en las

proteínas de su tumor. Esto significa que es posible que tenga una condición genética hereditaria y se

recomiendan más pruebas genéticas (Hawes, 2015)

En algunos casos, el resultado de una prueba se encuentra entre el rango positivo y negativo. Este tipo

de resultado se denomina no informativo, indeterminado, no concluyente o ambiguo (Gastrointestinal

& Liver Specialists of Tidewater, 2018).

Para interpretar los resultados de manera efectiva, el patólogo debe tener un amplio conocimiento de

los patrones de tinción de los anticuerpos primarios en consideración, incluido un conocimiento

detallado de la especificidad del tejido y la localización subcelular. del antígeno y conocimiento de las

variables técnicas (Hawes, 2015).

17
 CONCLUSIONES
En el presente trabajo hemos determinado que la prueba de inmunohistoquímica es una prueba

diagnóstica auxiliar en el campo de la patología y tiene como fin detectar un antígeno específico en el

tejido que por lo generales es una proteína, proporcionando así su localización, cantidad y distribución

específica, también detallamos que la utilidad de realizar estas pruebas es lograr el diagnóstico

anatomopatológico de distintas enfermedades infecciosa y la clasificación de neoplasias por su alta

especificidad. Con esto debemos entender que dichas pruebas son un aliado del médico veterinario en

la detección e investigación de comportamiento de muchas enfermedades.

Además, logramos distinguir los pasos a seguir en la toma de muestras para realizar la prueba de

inmunohistoquímica son la limpieza de la zona a tomar la muestra, extracción representativa de tejido

de la lesión ya sea mediante el uso de bisturí, muestras en cilindros o a saca bocados. Cualquiera que

realice debe procurar realizar la fijación de la muestra lo más pronto posible para evitar falsos

resultados.

Describimos como se prepara y se lee los resultados en la prueba de inmunohistoquímica.

Mostrándonos así que la interpretación se da en positiva o negativa en base a la reacción del tejido a

un inmunomodulador específico siendo esto lo que determine si el animal está o no afectado por un

trastorno en particular. En algunos casos se presenta los resultados en rangos de reacción.

Finalmente explicamos la manera correcta de la lectura de los resultados que se basa en la

interpretación de los resultados, por ejemplo en el caso de ser negativa la prueba significa que el

laboratorio no encontró ningún cambio en las proteínas e indica que el animal no está afectado y en

caso de ser positivo significa que el laboratorio encontró un cambio particular en las proteínas y se

sugiere sea posible que tenga una condición genética hereditaria y se recomiendan más pruebas

genéticas para confirmar dicho diagnóstico.

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ANEXOS

Figura 8. Resumen de los principales pasos del protocolo. Recuperado de Carol et al., 2017

22