Práctica No.

1
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS DIGESTIVAS SOBRE
CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS Y PROTEÍNAS DE LA DIETA
Modificación a modalidad virtual, segundo semestre, 2023

GUÍA GENERAL DE LA PRÁCTICA EN SU MODALIDAD VIRTUAL

Actividad Descripción Fecha

Entrega de Los estudiantes deben entregar el pre-laboratorio que Día de la

pre-laboratorio incluye el diagrama de flujo y cuestionario en formato práctica
(diagrama de flujo PDF en el Moodle del Laboratorio
Semana 7 – 11
y cuestionario)
agosto antes de
las 14:00

Examen corto Los estudiantes realizarán el examen corto de la Día de la

pre-laboratorio práctica durante los primeros 10 minutos del horario práctica
del laboratorio.
Semana 7 – 11
NOTA: Encender las cámaras para realizar el corto agosto

Explicación del Los instructores de laboratorio realizan una

fundamento explicación de los fundamentos teóricos por medio de
teórico de la una presentación Power Point, explican los
práctica, del procedimientos mediante los cuales se determina la Día de la
procedimiento de actividad de enzimas digestivas sobre las práctica
la práctica y de macromoléculas contenidas en los alimentos, explica
los cálculos para cómo se registran los resultados. Resuelve dudas, y Semana 7 – 11
la obtención de entrega a cada grupo una serie de tablas con los agosto
resultados. resultados obtenidos al realizar los procedimientos
descritos en la práctica

Material de apoyo

Foro de preguntas Los estudiantes pueden hacer sus preguntas respecto

al tema de la práctica en el transcurso de la semana
4 al 11 de
en el foro abierto en la plataforma Moodle del
agosto
laboratorio.

Los instructores de laboratorio responden las

preguntas.

Reporte de Cada grupo de laboratorio hace un reporte, siguiendo

laboratorio el formato que pueden descargar del Moodle del
Una semana
Laboratorio y lo entregan en formato PDF en la
después de
sección habilitada para ello en la misma plataforma
realizar la
práctica, antes
 de las 14:00
horas

INTRODUCCIÓN

La dieta provee al organismo de combustibles metabólicos, principalmente

carbohidratos, lípidos y proteínas; así como de fibra, minerales, vitaminas y ácidos
grasos esenciales. La mayor parte de los alimentos que son ingeridos se encuentran en
una forma inadecuada para poder ser absorbidos en el aparato digestivo hasta que son
reducidos a moléculas pequeñas. Los cambios químicos que ocurren durante la
digestión se llevan a cabo con la ayuda de enzimas hidrolasas del aparato digestivo,
que degradan a los polisacáridos, triglicéridos y proteínas de la dieta a sus unidades
monoméricas antes de ser absorbidos y utilizados por el cuerpo (Bender & Mayes,
2015).

La digestión de carbohidratos inicia con la hidrólisis enzimática que libera

oligosacáridos y luego mono- y disacáridos libres. En la dieta humana el almidón es la
principal fuente de carbohidratos, y por ende de energía. Es digerido por hidrólisis
enzimática catalizada por la amilasa salival (actúa en la boca), y por la pancreática, que
ejerce su acción en el intestino delgado (Latorre, 2008; Silva, 2007). Las enzimas
α-amilasa (α-1,4-D-glucan 4-glucanohidrolasa) están presentes en los humanos;
catalizan la hidrólisis al azar de los enlaces glucosídicos α (1-4) de la región central de la
cadena de amilosa y amilopectina del almidón, exceptuando las moléculas cercanas a
la ramificación (enlaces glucosídicos α 1-6), obteniendo como resultado glucosa,
maltosa, maltotriosa y dextrinas ramificadas (Espitia, 2009; Bender & Mayes, 2015).
Posteriormente, estos productos son digeridos por disacaridasas en el intestino
delgado, absorbidos por enterocitos en la mucosa intestinal y exportados hacia la
circulación porta (Harvey & Ferrier, 2011). Por otro lado, la celulosa contenida en
alimentos de origen vegetal contiene enlaces glucosídicos β (1-4) que no pueden ser
digerido por las α -amilasas de los mamíferos; junto con los polisacáridos de las
paredes celulares de los vegetales y la lignina de los alimentos son un componente
importante de la fibra dietética y forman la masa principal de los residuos de la
digestión (Martin, Mayes, Rodwell & Granner, 1986).

La mayor parte de los lípidos en la dieta son triacilglicéridos, los fosfolípidos aparecen
en menor proporción. Estas moléculas hidrofóbicas se deben hidrolizar y emulsificar en
forma de pequeñas micelas antes de poder ser absorbidas en el intestino. Las
vitaminas liposolubles y otros lípidos, incluyendo colesterol y carotenos, también se
absorben disueltos en estas micelas lipídicas. La hidrólisis de triglicéridos se inicia por
acción de lipasas linguales y gástricas, que atacan el enlace éster en posición 3,
liberando 1,2-diacilgliceroles y ácidos grasos libres, que actúan como agentes
emulsificantes. Posteriormente se secreta al intestino delgado la lipasa pancreática,
que requiere de la proteína colipasa para activarse. Sus blancos principales son los
enlaces éster de las posiciones 1 y 3 de los triglicéridos, resultando en la liberación de
2-monoacilgliceroles y ácidos grasos libres. La esterasa pancreática hidroliza
monoacilgliceroles con baja eficiencia en el lumen intestinal, de tal forma que
solamente el 25% de los triglicéridos ingeridos se hidrolizan completamente a glicerol y
ácidos grasos antes de su absorción.

Las sales biliares permiten la emulsificación de los productos de la digestión lipídica en

micelas, junto con los fosfolípidos, colesterol y vitaminas liposolubles de la dieta. Son
transportados de esta forma hasta el borde de la mucosa intestinal, en donde son
absorbidas por las células epiteliales (Bender & Mayes, 2015; Harvey & Ferrier, 2011).
Las proteínas de la dieta son naturalmente resistentes a la digestión, por lo que deben
ser desnaturalizadas previamente por calor y por la acción del ácido gástrico con el fin
de exponer sus enlaces peptídicos, volviéndolos accesibles a las enzimas proteolíticas.
La pepsina del jugo gástrico (pH 1 - 2) cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos
adyacentes a aminoácidos con cadenas laterales aromáticas, ramificadas y metionina.
La pepsina es una endopeptidasa, puesto que hidroliza enlaces peptídicos entre
aminoácidos específicos dentro de la estructura polipeptídica, produciendo péptidos
de diversos tamaños. El paso del quimo ácido al duodeno induce la secreción
pancreática y biliar, las cuales son alcalinas, produciendo un cambio de pH necesario
para la acción de las enzimas contenidas en los jugos pancreático e intestinal
(aproximadamente pH 8), pero que inhibe la acción de la pepsina (Martin, et al., 1986).
Dentro de las enzimas contenidas en el jugo pancreático, la tripsina cataliza la hidrólisis
de ésteres de lisina y arginina; quimiotripsina los de aminoácidos aromáticos, y elastasa
los de aminoácidos pequeños con cadenas alifáticas neutras. Así mismo, las
exopeptidasas catalizan la hidrólisis de un enlace peptídico a la vez en los extremos de
los péptidos, las carboxipeptidasas producen la liberación de aminoácidos de los
extremos carboxilo terminal libres. Las aminopeptidasas, secretadas por las células de
la mucosa intestinal, liberan aminoácidos de los extremos amino terminales libres.

Finalmente, las dipeptidasas y tripeptidasas presentes en los bordes en cepillo de las

células intestinales, catalizan la hidrólisis de di- y tripéptidos, que no son sustratos de
las amino-y carboxipeptidasas (Bender & Mayes, 2015). El producto de esta digestión
enzimática es una mezcla de aminoácidos libres, di- y tripéptidos y oligopéptidos, los
cuales son absorbidos por las células intestinales. En general los di y tripéptidos son
hidrolizados dentro de los enterocitos a aminoácidos libres y se transportan a la vena
hepática portal.
En la presente práctica se determinará de forma experimental la acción de cuatro
enzimas de la digestión sobre almidón, fibra, grasas de la leche entera, gelatina y
caseína (Quesada-Mora, 2017). Los azúcares reductores producidos durante la
hidrólisis enzimática del almidón por la amilasa pancreática pueden ser detectados
cualitativamente por medio del ensayo de Benedict. Este consiste en medir
colorimétricamente la reducción de iones Cu2+ a Cu+, inducida por la acción de los
azúcares reductores que se formarán en el medio conforme la degradación enzimática
avanza. La producción de azúcares reductores se evidenciará por la formación de un
precipitado de color rojo-naranja (Plummer, 1981). La producción de ácidos grasos
libres y 2-monoacilglicéridos durante la digestión de triglicéridos por la lipasa
pancreática produce acidificación del medio conforme avanza la reacción (Cardellá &
Hernández, 2007; Luna, 2015). El cambio de pH en la leche entera se detectará
mediante el uso de una solución indicadora, que virará de verde amarillento (pH de la
leche ~6.5 [Nelson & Cox, 2018]) a tonos de rosado (medio ácido) (revisar anexo 1).
Para evidenciar la digestión de proteínas en condiciones de pH ácido o básico, la acción
de la enzima pepsina se demostrará por medio de la degradación de gelatina, una
proteína derivada de la degradación del colágeno (Easote, 1955), y la de la tripsina
sobre la caseína, proteína encontrada comúnmente en la leche. La degradación de
gelatina producirá su licuefacción en tubo, mientras que la degradación de caseína
producirá halos claros o transparentes en el agar.

OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:

● Conocer el efecto degradativo de cuatro enzimas digestivas sobre carbohidratos,

lípidos y proteínas.
● Determinar de forma experimental el efecto que tienen la variación de pH y
temperatura sobre la acción de las enzimas digestivas.
● Describir el tipo de enlace químico sobre el cual actúan las cuatro enzimas digestivas
empleadas en la práctica.
● Extrapolar sus observaciones al proceso fisiológico de la digestión humana, que
tiene lugar en diferentes ambientes en donde varía el pH
● Realizar un sumario de los procesos digestivos en el humano con énfasis en sus
aspectos bioquímicos.

MATERIALES Y EQUIPO

● Pipetas pasteur de vidrio

● Pipetas de 1, 5 y 10 mL
● Bulbos
● Cajas de Petri
● Tubos de ensayo
● Marcador rotulador
● Gradillas
● Estufa
● Papel parafilm
● Baño de María a 37°C
● Incubadora microbiológica a 37°C
● Campana de flujo
● Regla

REACTIVOS

● Solución de leche entera al 12 % p/v

● Solución de pancreatina (lipasas, proteasas y amilasas) al 5% p/v
● Solución indicador universal pH 4-10
● Solución de gelatina al 16 % p/v
● Solución de tripsina al 0.05% p/v en HCl 0.1 N
● Solución de tripsina al 0.05% p/v en PBS 0.01 M pH 8.1
● HCl 0.1 N
● PBS 0.01 M (pH 8.1)
● Leche descremada en polvo
● Agar
● Medios de agar-caseína al 1% p/v: disolver 1.25 g de leche descremada en polvo en
125 mL de agua destilada, calentar. Mientras se calienta, agregar 1.875 g de agar
poco a poco, agitando constantemente. Dejar calentando hasta que se disuelva todo
el agar. Servir en cajas de Petri y dejar enfriar dentro de campana de flujo.
● Solución de pepsina al 10% p/v en buffer de acetatos 0.4 M pH 4.4
● Solución de pepsina al 10% p/v en NaOH 0.1 N
● Buffer de acetatos 0.4 M pH 4.4
● NaOH 0.1 N pH 13
● Solución de fibra al 1% p/v en buffer de fosfato de sodio y cloruro de sodio, pH 6.8
● Solución de almidón al 1% p/v en buffer de fosfato de sodio y cloruro de sodio pH
6.8
● Solución de amilasa diluida: Macerar 0.1 g de amilasa (5,000 unidades SKB/g), en 10
mL de buffer de fosfato de sodio y cloruro de sodio, pH 6.8. Centrifugar la
suspensión a 3,000 rpm por 5 minutos y guardar el sobrenadante. Diluir esta
solución para obtener una dilución 1:50.
● Solución de Benedict

Importante
Asegúrese de haber leído el manual de toxicidades de los reactivos a utilizarse en esta
práctica (estructura, descripción, seguridad, toxicidad, descarte), así como saber cuál
es el procedimiento adecuado para el manejo de biológicos y el procedimiento a seguir
en casos de emergencia que pudieran surgir durante la práctica con estos reactivos.

Documentos electrónicos de consulta:

1. Manual Toxicidades - Depto. Bioquímica - USAC.pdf. Recuperado de:
https://drive.google.com/file/d/0B6jPwByhE5KJYWdnSVBjWk5ZRHM/view?usp=sharin
g&resourcekey=0-YcECQ3of-LS6edFLdKhf8g
2. Guía de Respuesta en caso de Emergencia (2017)
https://www.phmsa.dot.gov/sites/phmsa.dot.gov/files/2020-07/GRE2020-WEB.pdf
PROCEDIMIENTO (adaptado de Quesada Mora, 2007)

A. Digestión de grasas por enzimas lipasas contenidas en la pancreatina.

1. A un tubo de ensayo rotulado como PanH (solución de pancreatina hervida),

agregar 2 ml de solución de pancreatina al 5% p/v, y colocar en un baño de agua
hirviendo durante 5 minutos. Dejar enfriar.

2. Prepare 3 tubos de ensayo con los siguientes reactivos:

Número de tubo
Reactivo
1 2 control
Solución de leche entera al 12% p/v 1 ml 1 ml 1 ml
Solución de indicador universal 2-3 gts 2-3 gts 2-3 gts
Solución de pancreatina al 5% p/v 1 ml ----- -----
Solución de pancreatina hervida
---- 1 ml -----
(PanH)
Agua destilada ----- ---- 1 ml

3. Tapar cada tubo con papel parafilm y mezclar suavemente por inversión.

4. Colocar los tres tubos en baño de María a 37°C por 20 minutos.

5. Anotar cambios en la tabla 1 de resultados.

B. Digestión de gelatina por pepsina

1. Prepare 4 tubos de ensayo con los siguientes reactivos:

Número de tubo
Control Control
Reactivo
1 2 (solución (solució
ácida) n básica)
Solución de gelatina al 16 % p/v 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Solución de pepsina al 10 % p/v en medio ácido 1 ml ----- ----- -----
Solución de pepsina al 10 % p/v en medio
----- 1 ml ----- -----
básico
Control de solución tampón de acetatos pH 4.4 ----- ---- 1 ml -----
Control de NaOH 0.1 N ----- ----- ----- 1 ml

2. Colocar los cuatro tubos en baño de María a 37°C por 20 minutos. Mezclar
suavemente eventualmente durante la incubación.

3. Luego de transcurridos los 20 minutos, dejar enfriar a 4°C por 30 minutos.

4. Anotar los cambios en la tabla 2 de resultados.

C. Digestión de caseína por tripsina
1. En el plato que contiene agar caseína, realizar un mapa de la posición en que se
servirá cada solución de la siguiente manera:

Posició Componente
n
1 Solución de tripsina al 0.05 % en
medio ácido
2 HCl 0.1 N
3 Solución de tripsina al 0.05 % en
medio básico
4 PBS 0.01 M pH 8.1

Posición Componente
1 Solución de tripsina al 0.05 % en medio ácido
2 HCl 0.1 N
3 Solución de tripsina al 0.05 % en medio básico
4 PBS 0.01 M pH 8.1

2. Servir 15 μl de cada componente en la posición correspondiente.

3. Incubar la caja a 37°C en incubadora y observar cambios a las 2 horas y 24 horas.

4. Anotar cambios en la tabla 3 de resultados.

D. Digestión de almidón y fibra por amilasa

1. Servir 2 ml de amilasa diluida a un tubo de ensayo y colocarla en un baño

hirviendo por 5 minutos. Dejar enfriar.

Rotular tres tubos y prepararlos de acuerdo a la siguiente tabla:

Reactivo Tubo
1 2 3
Solución de almidón 1 ml 1 ml
Solución de fibra 1 ml
Solución de amilasa diluida 1 ml 1 ml
Solución de amilasa diluida hervida 1 ml

2. Mezclar los tubos cuidadosamente e incubar por 30 minutos a 37°C.

3. Agregar a cada tubo 1 ml de Reactivo de Benedict.

4. Mezclar y calentar en un baño de agua hirviente por 5 minutos.

5. Anote los cambios de color observados en las muestras, en la tabla 4 de

resultados.
Anexo 1
Cambios de color de la solución indicadora utilizada en la práctica

Fuente: https://www.pngwing.com/es/free-png-xphee
DIAGRAMA DE FLUJO

Esquematice el procedimiento a emplear en la realización de la práctica, usando las

instrucciones que puede descargar del Moodle de Laboratorio.
RESULTADOS

Tabla 1. Digestión de grasas por lipasas contenidas en la pancreatina

Tubo Color Apariencia

Tabla 2. Digestión de gelatina por pepsina

Observaciones
Tubo Aspecto
(grado de licuefacción en cruces)

Tabla 3. Digestión de caseína por tripsina

Posición Diámetro de halo (mm) Observaciones

Tabla 4. Digestión de almidón y fibra por amilasa

Tubo Color/apariencia Observaciones
REFERENCIAS

Bender, D. & Mayes, P. (2015). Nutrición, digestión y absorción. En V. W: Rodwell, D.A.

Bender, K. M. Botham, P. J. Kenelly, & P. A. Weil (Eds.) Harper. Bioquímica ilustrada
(30ª ed.) (pp. 537-545). México: McGraw-Hill Interamericana Editores, S. A. de C. V.
Cardellá, R. & Hernández, R. (2007). Bioquímica Humana. Cuba: Editorial Ciencias
Médicas.
Easote, J.E. (1955). The amino acid composition of mammalian collagen and gelatin.
Biochem J, 61(4), 589-600.
Harvey, R. & Ferrier, D. (2011). Bioquímica (5ª ed). Florida, U.S.A.: Lippincott, Williams
& Wilkins.
Latorre, L. (2008). Análisis estructural y modificación funcional de la glucoamilasa de
Saccharomyces cerevisiae var. Diastaticus (Tesis de Doctorado) Valencia, España:
Servei de Publicacions.
Luna, C. (2015). Aplicación de lipasas microbianas para la producción de
biocombustibles similares al biodiesel que integran la glicerina en forma de
monoglicérido. (Tesis de Doctorado). Córdoba, España: Servicio de Publicaciones
de la Universidad de Córdoba.
Martin, D., Mayes, P., Rodwell, V., & Granner, D. (1986). Harper. Bioquímica ilustrada
(10ª ed.). México: El Manual Moderno, S.A. de C.V.
Nelson, D.L. & Cox, M.M., (2018). Lehninger Principios de Bioquímica (7 ed). Cuchillo
Foix C.M., Suau León P. & Vendrell Roca J., traductores. Barcelona, España.:
Ediciones Omega.
Plummer, D. T. (1981). Introducción a la bioquímica práctica.
Quesada Mora, S. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica
(p.148). San José, Costa Rica: Editorial Universidad Estatal a Distancia. ISBN
978-9968-31-616-3.
Silva, L. (2007). Estudio de la digestibilidad de carbohidratos y capacidad antioxidante
de leguminosas de mayor consumo en México. (Tesis de Maestría) Morelos,
México: Instituto Politécnico Nacional.
CUESTIONARIO

1. De las enzimas listadas abajo, esquematice en una tabla los siguientes aspectos:
a) El pH (o rango de pH) óptimo para su funcionamiento
b) Temperatura óptima para su funcionamiento.
c) Indique cuáles son los sustratos específicos sobre las que trabajan.
d) En qué parte del cuerpo (órgano y tipo de células) se sintetizan.
e) Forma de secreción (zimógeno o enzima activa)
f) Órgano o sitio fisiológico realizan su acción.

Enzimas: amilasa, lipasa, pepsina, renina, tripsina, quimiotripsina, elastasa,

carboxipeptidasa, ribonucleasa, desoxirribonucleasa, colesterilesterhidrolasa,
fosfolipasa A2, sales biliares, aminopeptidasas, dipeptidasas, sucrasa, maltasa,
lactasa, trehalasa, fosfatasa, isomaltasa, polinucleotidasa, nucleosidasas.

2 ¿Cuáles son los componentes de la pancreatina?

3 Explique cuál es la reacción que se produce con el ensayo de Benedict y los azúcares
reductores.

4 Indique la importancia de la lipasa lingual en los bebés.

5 ¿Por qué es tan importante el calor en la digestión de los lípidos en el estómago?

6. ¿Cuál es la función de la fibra dietética en el proceso de digestión?

7. En una tabla indique cuales son los principales componentes aminoacídicos (en %)
de la gelatina y la caseína.

Guatemala, julio 2023

Departamento de Bioquímica
Elaboración: PS/GG, 2019 (adaptado de Quesada Mora, 2007)
Adaptación a modalidad virtual, 2020 PS/HDL/RV
Revisión, 2023 PS