Prácticas de Biología. Tercer curso del Grado en Criminología.

Universidad Europea Miguel de Cervantes.

PRÁCTICA. Determinación del factor Rh por PCR a partir de DNA extraído de

muestra de saliva humana.

PUNTO 1. MATERIAL
Primera parte de la práctica: Extracción de DNA de muestra de saliva.
 Una muestra de saliva por grupo de tres alumnos.
 Tubo de recogida de muestra de 50 ml (Tubo Nº 1).
 Pipeta Pasteur de plástico.
 Micropipeta de 100 - 1000 µl
 Puntas para micropipeta de 100 - 1000 µl
 Tubos de 1,5 ml de plástico (Nº 2: muestra de saliva).
 Kit de extracción de DNA de saliva:
o Tampón de lisis (Tubo Nº 3 TL).
o Tampón de precipitación de proteínas (Tubo Nº 4 TP).
o Isopropanol (Tubo Nº 5; conservado a -20 ºC)
o Etanol 70 % (Tubo Nº 6 EtOH conservado a -20 ºC).
o Tampón de Hidratación (tubo Nº 7).
 Recipiente para verter residuos.
 Baño termostatizado a 37 ºC y a 55 ºC
 Flotador de tubos de 1.5 ml
 Vórtex (agitador de tubos)
 Centrífuga de tubos de 1.5 ml (es imprescindible que siempre esté balanceada).
Se trata de una centrifuga de mesa de radio 3.5 cm.
 Cronómetro (*)
 Guantes.

Segunda parte de la práctica: Amplificación por PCR. Determinación del

grupo sanguíneo Rh. (La realizará el profesor y expondrá los resultados en
clase para su posterior análisis).
 Cubeta de electroforesis
 Fuente de electroforesis
 Reactivos para la realización de la electroforesis en gel de agarosa 1%:
o Tampón de electroforesis concentrado 10x
o Agarosa
 Reactivos para la realización de la PCR:
o Mezcla de reacción para la PCR (contiene todos los reactivos para la
realización de la PCR salvo el DNA molde)
o Control positivo Rh+.
o Muestra de DNA proporcionada en el kit correspondiente a un
individuo Rh+.
 Puntas con filtro de 10 µl, 20 y 200 µl.
 Tubos de ensayo 1.5 ml libres de nucleasas
 Tubos de PCR de 200 µl. libres de nucleasas
 Termociclador.
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PUNTO 2. FUNDAMENTO DE LA EXTRACCIÓN DE DNA DE SALIVA

Una manera sencilla de obtener DNA es a partir de una muestra de saliva. Para ello es
suficiente con “rascar” con la propia lengua las pareces internas de la boca y a continuación
recoger la saliva. Posteriormente se procede a la precipitación y extracción del DNA de las
células arrastradas con la saliva siguiendo los siguientes pasos:

o Lisis: este es el proceso mediante el cual se rompen las membranas celulares y

nucleares. Se consigue con detergentes que permiten liberar el DNA en la solución.
o Proceso de desempaquetar el DNA: utilizamos la proteinasa K (Incluida en el
tampón de precipitación de proteínas), una enzima que degrada las proteínas que
estaban ligadas al DNA y que lo mantenían compactado. Así que, cuando actúa la
proteinasa K, el DNA se descompacta y al mismo tiempo se degradan otras moléculas
orgánicas de nuestra muestra, como las DNasas, unas enzimas cuya función es
degradar el DNA.
o Proceso de precipitación del DNA: el paso final es la precipitación del DNA que nos
permitirá hacer visible lo invisible. Para ello utilizamos el etanol. El DNA es soluble
en agua, pero cuando añadimos etanol se “desenrolla” y precipita. Tras añadir el
isopropanol (un alcohol), observamos hebras blancas que empiezan a aparecer en
suspensión. Es nuestro DNA.

PUNTO 3. FUNDAMENTO TEÓRICO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La PCR es una de las técnicas moleculares más utilizadas tanto en laboratorios de

investigación biomédica como en laboratorios clínicos.

Se trata de una técnica que permite amplificar in vitro fragmentos de DNA millones de
veces en algo más de una hora partiendo de pocas o incluso una sola copia de DNA.
Se lleva a cabo en el laboratorio gracias a un moderno aparataje llamado
“termociclador”, que permite cambiar rápidamente de temperatura a la solución
incluida en un tubo de ensayo, que contiene el DNA molde y los reactivos necesarios
para la amplificación.

¿En qué consiste?

La base de la PCR es la replicación (copia) de un pequeño fragmento de DNA, gracias

a la acción de una enzima, DNA polimerasa. Para ello se necesita incluir en el tubo de
ensayo:

1. El DNA que actuará como molde, a partir del cual la DNA polimerasa
copia una nueva molécula de DNA.
2. Un par de pequeños cebadores, oligonucleótidos o primers, consistentes en
pequeñas secuencias de nucleótidos (en torno a 20) que serán
complementarios a la secuencia de bases del fragmento de DNA a
amplificar. A partir de su extremo 3’ OH se unirá la DNA polimerasa para
copiar el DNA molde.
3. La DNA polimerasa, enzima que en presencia de Mg+2, catalizará la copia
del DNA molde a partir del extremo 3’-OH del cebador

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4. dNTPs (desoxirribonucleótidostrifosfato, los cuatro en las mismas

concentraciones, dATP, dTTP, dGTP y dCTP), que actuarán como
sustratos de la enzima, y que irá añadiendo a la molécula de DNA en
crecimiento a medida que vaya copiando el DNA molde.
5. Mg+2, que actúa como cofactor de la DNA polimerasa.
6. Buffer o tampón que garantizará el pH óptimo para que la reacción se lleve
a cabo.

Una PCR típica incluye tres pasos:

Paso 1. Desnaturalización. El tubo de ensayo, con los reactivos antes indicados

en su interior, se calienta entre 93 y 95ºC para romper los puentes de hidrógeno que
unen las dos cadenas de nucleótidos. De esta forma se generan las dos hebras de DNA
monocatenarias que servirán de molde para amplificar el DNA. La mezcla de reacción
se mantiene a esta temperatura entre 30 segundos y unos pocos minutos, dependiendo
de la longitud del fragmento de DNA a amplificar.

ddDNA

Paso 2. Anillamiento. Supone la hibridación o anillamiento de los cebadores

con la secuencia complementaria del DNA molde monocatenario a amplificar. Como
se dijo anteriormente, los cebadores son oligonucleótidos sintéticos que delimitarán el
sitio que se busca amplificar, y se anillan (unen al molde) a temperaturas que oscilan
entre 50 y 65ºC.

cebador cebador

ddDNA

Paso 3. Extensión. Se lleva a cabo a 72ºC, temperatura de actuación óptima de

la DNA polimerasa actúa, y permite copiar la nueva hebra de DNA, complementaria
de la cadena original.

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dNTPs

Estos tres pasos constituyen un ciclo, repitiéndose de manera secuencial, generalmente

entre 30 y 40 veces (30 y 40 ciclos), consiguiéndose amplificar el DNA molde inicial
millones de veces.

¿Qué podemos hacer con este DNA amplificado millones de veces?

Una de las mayores ventajas de la PCR radica en la facilidad de efectuar un

diagnóstico a partir de pequeñas muestras, que se pueden conseguir por medio de
métodos como cepillado, aspiración, biopsia, extracción de sangre periférica e incluso
a partir de material de archivo fijado o embebido en parafina. Su elevada sensibilidad
es la característica que permite demostrar la presencia de las mutaciones causantes de
enfermedades, además de funcionar como marcador biológico de diagnóstico
temprano en cáncer, en la identificación de agentes patógenos o marcadores
biológicos, como la determinación del grupo sanguíneo entre otras aplicaciones.

Ejemplo de utilidad de la PCR. Determinación del grupo sanguíneo Rh.

En 1940, Landsteiner y Wiener demostraron que los anticuerpos producidos contra las
células rojas de la sangre de los monos Rhesus eran capaces de aglutinar alrededor del
85 % de los eritrocitos de la sangre de la población humana.
Los anticuerpos producidos se demostró que se dirigían a una molécula que se
denominó antígeno Rhesus (Rh), los individuos que poseían esta molécula fueron
denominados Rh positivo y el 15 % restante Rh negativo. El locus Rh consiste en 2
genes estructurales: D y CcEe, los cuales codifican para la cadena del polipéptido D y
las proteínas C/c y E/e respectivamente. La presencia o ausencia del gen D en el
genoma determina la base genética del polimorfismo de los grupos sanguíneos Rh-
positivo/Rh-negativo. Por tanto, los individuos son clasificados como Rh+ si contienen
el antígeno D en la membrana de sus eritrocitos. De todas formas, el sistema Rh es
mucho más complejo, y hasta 47 diferentes Rh antígenos han sido descritos.
El antígeno D es altamente inmunogénico e induce una respuesta inmune en muchas
personas Rh- cuando reciben una transfusión con sangre Rh+. Por esta razón, en
muchos países se realizan controles rutinarios en los donantes de sangre y los
individuos que se van a someter a una transfusión, de forma que pacientes Rh- reciben
exclusivamente productos D negativo.

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PUNTO 4. FUNDAMENTO TEÓRICO DE LA DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh POR PCR.

En la práctica se aislará el DNA de saliva de los alumnos utilizando un kit comercial.
Posteriormente se amplificará un fragmento del gen que codifica para el polipéptido D.
La amplificación de este fragmento indicará que la persona es Rh+. Debido a que los
genes D y CcEe son altamente homólogos, es posible diseñar cebadores que unan en
una región del gen D y también a una región del gen CcEe (ver figura 1).
Los individuos Rh+ producirán 2 fragmentos de diferentes tamaños (1200pb y 600 pb)
y los individuos Rh- un único fragmento correspondiente al gen CcEe (1200 pb).

A continuación, se harán migrar las muestras de los diferentes individuos en un gel de

agarosa. Lo que se conoce como electroforesis en gel de agarosa. Técnica para la
separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico. La
separación puede realizarse sobre una matriz porosa (electroforesis en gel). La
separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa
(migran más los fragmentos más pequeños y menos los fragmentos más grandes).

Polo -
Polo +

Para el análisis de las PCRs de diferentes individuos para la determinación del Rh, se
utiliza un gel de agarosa (1%) que se tiñe con un colorante que hace visible los
fragmentos de DNA amplificados.

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Marker (M): DanaMarker BEETHOVEN; Pocillo 1: Individuo Rh+; Pocillo 2:

Individuo Rh+; Pocillo 3: Individuo Rh+; Pocillo 4: Control negativo; Pocillo 5:
Individuo Rh-; Pocillo 6: Individuo Rh-

PUNTO 5. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA (Técnica)

Por motivos de tiempo, los alumnos solo realizarán la extracción de DNA de su propia
saliva (primer día. Extracción de DNA). A partir del DNA extraído, el profesor
procederá con la PCR para la amplificación del gen que codifica para del polipéptido
D. Posteriormente “se correrán” las muestras amplificadas en un gel de agarosa 1%, tal
y como se ha indicado en el fundamento teórico de la práctica. El profesor obtendrá
una foto del patrón de bandas aparecido en el gel y se discutirán los resultados en
clase.

Primer día. Extracción de DNA de saliva. (El alumno realizará solamente este
parte de la práctica, la correspondiente al día 1).
La obtención de una buena muestra de saliva es el paso más importante del proceso.
El objetivo es obtener muestras de saliva en donde encontremos el mayor número
posible de células que contengan una gran cantidad de ADN.
Es importante que no se haya bebido ni comido nada antes de 30 minutos de la toma
de la muestra.

TOMA DE MUESTRA.
1. Depositar aproximadamente entre 1 y 1.5 ml de saliva en un tubo de 50 ml
(Tubo Nº 1). Para facilitar la obtención del mayor número de células posible
rascar con la lengua el interior de la boca, paladar y mejillas, e incluso dientes,
durante 1 minuto, para desprender las células de estas zonas antes de secretar la
saliva.
2. Trasladar con pipeta pasteur de plástico entre 600 y 800 µl de saliva a un tubo
de plástico de 1.5 ml de capacidad (Tubo Nº 2). (Aproximadamente llenar hasta
la mitad el tubo Nº 2).
3. Centrifugar el tubo Nº 2 a 12000 rpm en la centrífuga de mesa (recordar que
la centrífuga debe estar balanceada correctamente) durante 90 segundos.
Aparecerá un pequeño precipitado blanco en el fondo del tubo. Eliminar

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sobrenadante (líquido) con cuidado de no tocar el precipitado (también llamado

pellet). Esta operación la podemos realizar con una micropipeta de 100 -1000 µl
o con una pasteur de plástico.

LISIS CELULAR
4. Añadir 600 µl de solución de lisis (tubo Nº 3). Pipetear moderadamente con
micropipeta de 100 -1000 µl arriba y abajo repetidas veces hasta que
desaparezca el pellet de células.
5. Incubar durante 10 minutos a 37ºC. Para ello podemos disponer los tubos en
el baño termostatizado. Agitar suavemente cada 2 minutos.

PRECIPITACIÓN PROTEICA
6. Añadir 200 µl de Tampón de precipitación de proteínas contenido en el Tubo
Nº 4. Puedes tomarlo con la micropipeta de 100 – 1000 µl.
7. Mezclar vigorosamente con el agitador vórtex a máxima velocidad durante 30
segundos.
8. Centrifugar a 12000 rpm durante 5 minutos. Se formará un precipitado
blanco.

PRECIPITACIÓN DEL DNA

9. Trasladar el sobrenadante (líquido) que contiene el DNA al tubo Nº 5, que
contiene 600 µl de isopropanol.
10. Mezclar invirtiendo el tubo entre 25 y 50 veces. Aparecerán “hilos
blanquecinos”.
11. Centrifugar a 12000 rpm durante 2 minutos. El DNA aparecerá como un
precipitado blanco en el fondo del tubo. Procurar no tocar la parte inferior del
tubo donde se localiza el pellet para evitar suministrarle calor y con ello
favorecer que se “despegue”.
12. Eliminar el sobrenadante el tubo con micropipeta 100 – 1000 µl, evitando
tocar el precipitado.
13. Añadir 600 µl de etanol 70 % para lavar el DNA. No es necesario
resuspender.
14. Centrifugar a 12000 rpm durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el
sobrenadante sin tocar el pellet de DNA (Por ejemplo, con micropipeta de 100 –
1000 µl).
15. Repetir centrifugación a 12000 rpm durante 1 minuto. Eliminar el
sobrenadante (líquido) y secar con papel de manos los restos de líquido
teniendo cuidado de no tocar el pellet de DNA.
16. Invertir el tubo y dejar secar durante 10 minutos sobre el papel (mantel) de
la poyata.

HIDRATACIÓN DEL DNA

17. Añadir 200 - 250 µl de Tampón de Hidratación. Resuspender con
micropipeta de 100 – 1000 µl (pipetear varias veces arriba y abajo).
18. Incubar a 55º C durante 60 minutos.
19. Conservar a -20 º C hasta la realización de la PCR.

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Segundo día. PCR para la determinación del factor Rh a partir de las muestras de DNA
extraídas por los alumnos. (La realizará el profesor y comentará los resultados a los
alumnos).
Como se indicó el principio, la amplificación del gen que codifica para el polipéptido
D la realizará el profesor. Para ello se seguirá el siguiente protocolo de PCR:

Numeramos (rotulamos) cada tubo de reacción de PCR de forma que sepamos a qué
grupo de alumnos pertenece. En cada tubo disponemos las siguientes cantidades de los
diferentes reactivos:

Notas:
 Mix PCR se trata de una mezcla comercial que contiene todos los reactivos y
en las concentraciones adecuadas (dNTPs, tampón, Cofactor –Mg+2-, DNA
polimerasa) para que se lleve a cabo la reacción, salvo el DNA que lo
adicionamos después.
 Es conveniente disponer un control positivo. Se trata de una muestra de DNA
conocida que sabemos que se corresponde a un paciente Rh+, de forma que
ha de amplificar generando dos fragmentos de 1200 y 600 pb. Esto nos
permite saber que la PCR funciona (puesta a punto)
 Es conveniente también utilizar un control negativo. Por ejemplo, un tubo que
no contenga DNA, de forma que no ha de producirse amplificación alguna. De
esta forma nos aseguramos que los reactivos no están contaminados con DNA.

Disponemos las muestras, los controles, y el marcador de peso molecular (DNA

comercial que genera un patrón de bandas de tamaño conocido que permite saber el
tamaño de los productos amplificados) en un termociclador, aparato que permite
realizar la reacción de amplificación, según el siguiente programa:

Tras finalizar la amplificación, los productos de la PCR pueden ser dispuestos

directamente en un gel de agarosa y mediante una electroforesis permitir que migren
en función de su tamaño y carga.

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Se obtendrá un patrón de bandas similar al expuesto en el apartado de fundamento

teórico.
Marker (M): DanaMarker BEETHOVEN.

Pocillo 1: Individuo Rh+

Pocillo 2: Individuo Rh+
Pocillo 3: Individuo Rh+
Pocillo 4: Control negativo.
Pocillo 5: Individuo Rh-
Pocillo 6: Individuo Rh-

PUNTO 6. RESULTADOS DE LA PRÁCTICA

Se proporcionará a cada alumno una fotografía del gel de agarosa donde se hizo
migrar las PCR a partir de las muestras de DNA de cada grupo.
El objetivo es identificar qué muestras se corresponden con un Rh+ y cuales con un
Rh-, razonando las respuestas.

Normas generales de uso del laboratorio de Bioquímica

Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas

elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad.

1. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente el guion para adquirir una idea
clara de su objetivo, fundamento y técnica (desarrollo). Los resultados deben ser siempre
anotados cuidadosamente apenas se conozcan.
2. Se debe elaborar un cuaderno de prácticas, que contendrá los guiones, y las respuestas a
los ejercicios propuestos.
3. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En
consecuencia, al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material
que se ha utilizado.
4. Cada grupo de prácticas o alumno, en caso de ser individuales, se responsabilizará de su
zona de trabajo y de su material.
5. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el
que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.
6. No tocar con las manos y menos con la boca los productos químicos.

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7. Extremar las precauciones al hacer uso de las micropipetas (caso que sea necesaria su
utilización en la práctica). Son instrumentos delicados que se contaminan y pierden su
calibración con facilidad si se utilizan inadecuadamente.
8. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se
engrasen.

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