Extracción de DNA Genómico de Escherichia Coli y PCR Convencional en El Laboratorio de Biología Molecular de La Universidad Simón Bolívar

Extracción de DNA genómico de Escherichia coli y PCR convencional en el laboratorio
de biología molecular de la Universidad Simón Bolívar.
Lorena Patricia Peña Peñaranda, estudiante de microbiología, Universidad Simón Bolívar.
RESUMEN.
Con el mejoramiento de técnicas de biología molecular como la extracción de DNA y el

invento de la PCR ha dado un gran salto en la compresión y estudio del DNA. la extracción
de DNA, PCR y electroforesis son técnicas más frecuentemente utilizadas en estudios
genéticos y funcionando en conjunto son una herramienta fundamental para estudios
moleculares. El objetivo de este trabajo es desarrollar procedimientos de biología
molecular para adquirir el conocimiento y destreza de las técnicas de extracción DNA,
PCR y electroforesis. Para lograrlo se realizó extracción de DNA de Escherichia coli
mediante el método fenol:cloroformo, además realizó una PCR convencional para analizar
la calidad del DNA extraído a partir de la amplificación de un marcador molecular.
Finalmente, a través de una electroforesis se logró observar la extracción de DNA fue
exitosa ya que se logró obtener DNA óptimo para la amplificación.
Palabras claves: PCR, electroforesis, DNA bacteriano.
INTRODUCCIÓN.
En la actualidad combatir enfermedades infecciosas y la identificación de agentes

microbianos requiere de procedimientos rápidos y sensibles, para lo cual se requiere de
técnicas de biología molecular que permitan dar un diagnostico en corto tiempo.
La PCR (reacción en cadena de la polimerasa), es una técnica de biología molecular que

permite la amplificación en millones de veces una secuencia especifica de DNA. Esta
técnica no es solo utilizada en genética si no en otras ciencias (Mas et al., 2016).
Por otro lado, se encuentra la electroforesis, es otra técnica utilizada en la biología

molecular que permite separar moléculas según la movilidad y la carga en una matriz
porosa, generalmente es agarosa (Fierro, 2014).
El objetivo de este trabajo es desarrollar procedimientos de biología molecular para

adquirir el conocimiento y destreza de las técnicas de extracción DNA, PCR y
electroforesis.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Extracción de DNA.
Se utilizó como agente bacteriano un mono cultivo de Escherichia coli para la extracción
de DNA genómico. La técnica utilizada fue realizada de acuerdo al protocolo establecido
por (Wright, Adelskov, & Greene, 2017). Sin embargo, la metodología aplicada en el
laboratorio sufrió algunas modificaciones que en términos generales se puede resumir de
la siguiente manera:
1. Adicionar 1ml de buffer TE al tubo eppendorf que contiene el cultivo bacteriano y

centrifugar a 12000rpm por 5 min y luego descartar el sobrenadante. Este
procedimiento se realizó por duplicado.
2. Resuspender el pellet en 250uL de buffer TE y agregar 50uL de SDS y 50uL de
lisozima e incubar por 15 min a 45°C. Luego centrifugar a 12000rpm por 5min y
descartar el sobrenadante.
3. Agregar solución de fenol:cloroformo y centrifugar a 12000rpm por 5min. Transferir
el sobrenadante a un tubo nuevo.
4. Precipitar el DNA con 1ml etanol 100%. Centrifugar a 12000rpm por 5min. Descartar
el sobrenadante.
5. Lavar el DNA con etanol 70% frio y centrifugar a 12000rpm por 5min. Descartar el
sobrenadante. Este paso se puede repetir de varias veces.
6. Hidratar el DNA en buffer TE o agua destilada estéril.
Para más información se puede consultar el protocolo establecido por (Wright et al.,
2017).
PCR y electroforesis.
Para la PCR se utilizaron todos los componentes por separado (Polimerasa, dNTPs, MgCl2,
cebadores, DNA blanco y agua.) y las reacciones fueron de 25uL. En la tabla 1 y 2 se
demuestran los componentes y el protocolo del termociclador para la PCR.
Tabla 1. Reactivos utilizados para preparar la mix.

Concentración Concentración
Reactivos
inicial final
Taq Polimerasa 2X 1X
MgCl2 25,000 µM 500µM
dNTPs 2mM 0,2mM
Primer F 10µM 0,5µM
Primer R 10µM 0,5µM
DNA X X
H2O Destilada
X X
estéril
Tabla 2. Protocolo del Termociclador

Etapas Tiempos Temperaturas Ciclos
Pre-desnaturalización 2min 94°C
Desnaturalización 30seg 94°C
Anillamiento 30seg 55°C 30X
Extensión 1min 74°C
Extensión final 5min 74°C
Almacenamiento 4°C Infinito
Por otro lado, el montaje de la electroforesis, se tuvo en cuenta un gel de agarosa al 1%,
buffer de corrido, un intercalante de DNA y buffer de carga. Además, las condiciones
fueron de 1hr a 80V.
Figura 1. Buffer de carga utilizado para montar las muestras en los pozos del gel de agarosa.
Figura 2. Montaje de la electroforesis.
RESULTADOS.
Finalizada la extracción de DNA bacteriano, se logró obtener DNA íntegro y de calidad

aceptable para futuros montajes de PCR. Cabe aclarar que a pesar de las muestras
amplificaron, esto no se puede demostrar claramente debido a que la foto grupal del
corrido electroforético no fue capturada de la mejor manera, tal y como se observa en la
figura 3.
Figura 3. Corrido de electroforesis de los amplicones.

CONCLUSIÓN Y DISCUSIÓN.
Inicialmente se puede concluir que el método de extracción de DNA utilizado en el

presente trabajo logro permitir obtener DNA óptimo para futuros estudios moleculares a
pesar de no utilizar un kit comercial. Las ventajas de realizar extracción de DNA con
reactivos preparados en el laboratorio es que se pueden desarrollar destrezas como la
preparación de soluciones y la comprensión de lo que ocurre en cada etapa de la
extracción de DNA, caso contrario con los kits, que extraen DNA de forma muy rápido sin
necesidad de preparar soluciones, lo cual no deja de ser novedoso y practico, pero para
academia no es aconsejable.
Algunos autores (López & Mejía, 2012) han realizado extracción de DNA bacteriano bajo
el método de fenol:cloroformo y de igual manera han obtenido DNA de gran calidad.
Por otro lado, la PCR es una novedosa técnica que revoluciono la genética y biología
molecular. Esta es una técnica que ofrece resultados muy confiables y rápidos, sin
embargo, al ser muy sensibles los investigadores prefieren utilizar kits comerciales que
disminuyen el margen de error, pero suelen ser muy costosos. Sin embargo, en este trabajo
los componentes de la PCR se prepararon por separados, esto disminuye costos y aumenta
el margen de error si no se tiene el cuidado pertinente. A pesar de que el gel de
electroforesis del presente trabajo no es el mejor se demostró que si se puede hacer PCR
convencional con los componentes por separado.
Finalmente, la figura 4 se utiliza como ejemplo para simular lo que pudo haber ocurrido
en el gel de electroforesis que no se pudo apreciar y a partir allí sacar algunas
conclusiones.
Figura 4. Perfil de corrido de electroforesis (Alejos, Aragón, & Cornejo, 2005).
En el carril 1 se encuentra la escalera de peso molecular que sirve para determinar el

tamaño del fragmento amplificado. En los carriles 4, 5, 6 y 7 hay producto de PCR. A pesar
de que en la imagen los productos de PCR tienen el mismo tamaño, es importante afirmar
que entre más pequeño el fragmento más lejos se desplaza del pozo y entre más grande
el fragmento menos se desplaza del pozo. Además, el barrido que se observa en el carril
5 es producto de contaminación por RNA. Finalmente, la concentración del producto
amplificado o DNA genómico puede estimarse a partir de la intensidad de la banda, lo que
quiere decir la intensidad de la banda es directamente proporcional a concentración de
DNA genómico o producto amplificado.
BIBLIOGRAFÍA
Alejos, L., Aragón, M., & Cornejo, A. (2005). Extracción y purificación de ADN. In Manual
de tecnicas basicas de biologia molecular.
Fierro, F. (2014). Herramientas moleculares aplicadas en ecologia.
López, L., & Mejía, C. (2012). Evaluación de métodos de extracción de ADN para
detección de Listeria monocytogenes en productos cárnicos. Revista MVZ Cordoba,
17(3), 3169–3175.
Mas, E., Poza, J., Ciriza, J., Zaragoza, P., Osta, R., & Rodellar, C. (2016). Fundamento
de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). AquaTIC: Revista Electrónica de
Acuicultura, ISSN-e 1578-4541, No. 45, 2016, Págs. 24-25, (45), 24–25. Retrieved
from https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=6034805
Wright, M., Adelskov, J., & Greene, A. (2017). Bacterial DNA Extraction Using Individual
Enzymes and Phenol/Chloroform Separation. JOURNAL OF MICROBIOLOGY &
BIOLOGY EDUCATION, 18(2), 0–6.

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