TEMA 2 Cinética de las reacciones químicas

2.1- Fundamento y desarrollo de la ecuación de Michaelis &

Menten para reacciones monosustrato
2.2- Conversión de la ecuación de Michaelis
2.3-Tipos y cinética reacciones multisustrato
2.4- Ejercicios estudio e interpretación datos cinéticos (GR1)

Bibliografía:
Stryer capítulo 8
Feduchi. capítulo 8
Mathews van Holde capítulo 11
Lehninger principios de Bioquímica Capítulo 6
Enlace en el moodle al capitulo 6 del Lehninger.
M.Freire
¿Cómo caracterizamos las enzimas?

Se puede caracterizar
su estructura
a pocos Amstrong
mediante
análisis cristalográficos

Se pueden identificar
residuos del sitio
catalítico por trabajo
con inhibidores
de diferente naturaleza
o análogos de sustrato.

Se puede caracterizar la cinética del enzima:

cómo varía la velocidad de la reacción en función de
la concentración de sustrato, la presencia de inhibidores etc.
IMPORTANCIA- Metabólismo, medicina, biotecnología,
medioambiente, etc. M.Freire
Efecto de la [S] sobre la velocidad inicial de una reacción catalizada
por un enzima

Orden
mixto Orden cero

1 er
orden

Clasificación de las reacciones químicas por orden cinético

Orden 0: la velocidad no depende [S] => v = k[A]0 = k
Primer orden: la velocidad es proporcional a la [S]=> v = k[A]
Segundo orden: la velocidad es proporcional al producto de las concentraciones
de los reactantes. v = k[A]2
M.Freire
Curva hiperbólica de velocidad (V) de una reacción catalizada enzimáticamente
en función de la concentración de sustrato [S].

Orden Cero

Primer
orden

M.Freire
Dependencia de la [S] de una reacción catalizada por un enzima

V. máx Vo = Vmax [S]

Km + [S]
½ Vmax
Ecuación de Michaelis
y Menten

Km

Vmax: velocidad máxima de la reacción

Km: Constante de Michaelis.
M.Freire
M.Freire
 Obtención de la ecuación de Michaelis & Menten para una
reacción enzimática con un sólo sustrato. Estado estacionario.

K1 K2 K1 y K2 son las constantes

E +S ES E +P de velocidad en el sentido
K-1 K-2 de formación de productos
Premisas
1-[S] >> [E]. Cuando esto sucede toda la enzima podrá estar unida a S
formando el complejo ES, y seguirá habiendo sustrato disponible
para continuar la reacción.
2-Hay poca acumulación de P, de modo que la formación de ES a
partir de E+P es despreciable.

3-La velocidad de descomposición del complejo ES iguala a la

velocidad de formación del complejo ES.
Esta es la asunción del estado estacionario.
M.Freire
Desarrollo de la demostración en la pizarra
 V. máx Vo = Vmax [S]
Km + [S]
½ Vmax
Ecuación de Michaelis
y Menten

Km

Vo= Vmax / 2 Km= [S]

M.Freire
Conversiones de la ecuación de Michaelis

Representación de Dobles Recíprocos

La ecuación se obtiene al hacer los inversos de la ecuación de Michaelis-Menten

1/Vo = Km/Vmax 1/[S] + 1/Vmax

Ecuación de una recta

y=ax+b

M.Freire
Conversiones de la ecuación de Michaelis
Representación de EADIE-HOFSTEE

Se obtiene al multiplicar la ecuación

de Michaelis Menten por (Km+ [S])
en ambos lados de la ecuación

Vo = Vmax – KmV/[S]
-Km

M.Freire
La Km es un valor característico de las enzimas
Km de algunos enzimas

Enzima Sustrato Km (mM)

Catalasa H2O2 25

Hexoquinasa ATP 0,4

(cerebro) D-glucosa 0,05
D-fructosa 1,5
Anhidrasa carbónica HCO3- 9

Quimotripsina Glicil-tirosinil-glicina 108

N-benzoil-tirosinamida 2,5
galactosidasa D-lactosa 4

M.Freire
Expresión de las velocidades de reacción para reacciones de múltiples
pasos

K1 K2 K3
E+S ---> ES --> EP—> E+P

La ecuación de Michaelis también puede utilizarse reacciones más

complicadas.
En este caso K2 debe sustituirse por una constante más general:
Kcat = número de recambio
Vmax
Vo= Kcat [ET][S]
Vo= K2 [ET][S] KM +[S]
KM +[S]

M.Freire
 La magnitud Kcat incorpora todas las constantes de velocidad de
todas las reacciones entre ES y E + P

. En reacciones de 2 pasos Kcat =K2

.En reacciones más complicadas Kcat es una combinación de

otras constantes de velocidad

En cualquier caso Vmax = Kcat [ET]

Kcat= Nº de moléculas de sustrato recambiadas por molécula de enzima

por segundo
Kcat es una medida directa de la producción catalítica de producto
en condiciones óptimas (toda la enzima unida al S)
Es una medida de la actividad catalítica máxima de la enzima
M.Freire
Nº de recambio =moles de sustrato que se transforman en producto /s
Kcat=Kp mol de enzima

1/Kcat= duración del ciclo catalítico de un enzima =

tiempo necesario para que 1 molécula de enzima
recambie 1 molécula de sustrato

Ej: Una solución de catalasa 10-9M, cataliza la degradación

de 0,4 moles/L de H2O2 por segundo. Calcular el número de
recambio y la duración del ciclo catalítico.

2H2O2  2 H2O + O2
Kcat= 0,4 moles/L seg-1 = 40 X106 seg -1
10-9 moles /L
1/Kcat= 2,5 x 10-8 segundos
M.Freire
A menudo se utiliza el cociente Kcat/Km como una medida directa
de la eficiencia y especificidad de un enzima
Kcat/Km= Constante de especificidad del enzima

Ej.: tenemos dos posibles sustratos para el enzima E:

Aó B
Tras hacer los correspondientes ensayos enzimáticos se pudo
determinar que :
Kcat/Km A > Kcat/Km B

De éste resultado podemos concluir que el sustrato A y no el B

será el sustrato preferente
M.Freire
Preferencias de la quimotripsina en la hidrólisis de varios N-acetil ácido
metil-ésteres, medidas por Kcat/Km

M.Freire
EJEMPLOS comparando constantes

Kcat/Km = Cte de especificidad

M.Freire
 Continuación TEMA 2

Cinética de las reacciones químicas.

Fundamento y desarrollo de la ecuación de Michaelis & Menten
para reacciones monosustrato
Conversión de la ecuación de Michaelis
Tipos y cinética reacciones multisustrato
Cinética en presencia de inhibidores
Ejercicios estudio e interpretación datos cinéticos (Grupos Red)

M.Freire
Cinética de las reacciones multi-sustrato

En estas reacciones habitualmente se realiza la transferencia de un átomo

o un grupo funcional desde uno de los sutratos a otro.

Al Azar
.Desplazamiento simple: Unión ordenada de sustratos
(secuencial)

.Doble desplazamiento (mecanismo Ping-Pong).

La velocidad de éstas reacciones también puede analizarse por el
método de Michaelis-Menten

M.Freire
 • Desplazamiento simple (SECUENCIAL):
se forma un complejo ternario (el enzima y los dos sustratos ES1S2)
-Al azar

Ejemplo: la hexoquinasa

-Unión ordenada de sustratos

S1 S2
E  ES1  ES1S2  E +P1 +P2

Ejemplo en reacciones con NAD+ como coenzima

M.Freire
 Notación de Cleland

-Ejemplo de unión ordenada de sustratos

Ej.: en reacciones con NAD+ como coenzima, como la lactato deshidrogenasa (LDH)

NADH Piruvato Lactato NAD+

Enzima
E (NADH)(piruvato) E (lactato)(NAD+)

M.Freire
• Doble desplazamiento: No se forma complejo ternario
Mecanismo , desplazamiento ―Ping-Pong‖

+ P2

Ejemplo la quimotripsina (proteasa):

S1= péptido que se va a hidrolizar
P1= porción N-terminal
P2= porción C-Terminal
E*P1= Intermediario acil-enzima
S2= 1 molécula de agua.
M.Freire
¿Cómo podemos estudiar las enzimas multisustrato utilizando
las técnicas de cinética enzimática?

M.Freire
Representación de dobles recíprocos para reacciones bisustrato
A

KM ap=KM aparente; Vmax ap= Vmax aparente

Para las enzimas multisustrato la verdadera KM es la observada cuando

los otros sustratos están a saturación
M.Freire
Representación de dobles recíprocos para reacciones bisustrato
B

M.Freire
M.Freire
TEMA 2 (continuación)
Cinética en presencia de inhibidores
Tipos de inhibición enzimática:
Irreversible: ejemplos y aplicaciones
Reversible: Competitiva. Ejemplos
No competitiva
Mixta
Velocidad de la reacción enzimática en presencia de inhibidores
Ejemplos de inhibidores y aplicaciones
Ejercicios inhibición (Grupos Reducidos)

Bibliografía:
Stryer capítulo 8
Mathews van Holde capítulo 11
Lehninger principios de Bioquímica Capítulo 8

M.Freire
 Inhibición enzimática

La mayoría de los enzimas pueden inhibirse por reactivos químicos

específicos

M.Freire
 Inhibición enzimática

Gracias al estudio de los inhibidores enzimáticos

se ha podido conocer mejor:

La especificidad de los enzimas por sus sustratos

La naturaleza de los grupos funcionales del sitio activo

(marcadores de afinidad para identificar residuos)
 El mecanismo de la catálisis

 Establecimiento de rutas metabólicas

 Desarrollo de medicamentos que ejercen su efecto inhibiendo

específicamente enzimas con actividad defectuosas
M.Freire
 REVERSIBLE
Inhibición enzimática
IRREVERSIBLE

Irreversible: el inhibidor queda unido al enzima (la unión puede ser

o no covalente) de modo que su disociación es muy lenta.

DIPF: diisopropilfosfofluoridato

El DIPF se combina con un grupo hidroxilo de serina,

situado en el sitio catalítico de la enzima para formar un derivado
catalíticamente inactivo.

M.Freire
 H
H3C-C-CH3
Acetil- O
colinesterasa CH2OH +
F-P =O DIPF
O

R H3C-C-CH3
H
O
Acetil-
colinesterasa CH2O -P = O + HF

O Enzima inactivada de modo

R irreversible

El DIPF inhibe a muchas enzimas capaces de romper

enlaces peptídicos y ester: acetil colinesterasa
Tripsina, elastasa, fosfoglucomutasa etc.
M.Freire
 Inhibicion reversible
Reversible: Competitiva
No competitiva
Mixta
Acompetitiva

Se caracteriza por la rápida disociación del complejo enzima inhibidor

M.Freire
 Ki= Constante de disociación
para la unión del inhibidor

Mathews-van Holde M.Freire

Ejemplos de inhibición competitiva

A-El inhibidor es similar al sustrato

Succinato DH Fumarato

B- El producto de la reacción es el inhibidor

1,3 bisfosfoglicerato
mutasa

M.Freire
 Ki= Constante de disociación
para la unión del inhibidor

es una función de la concentración del

inhibidor y su afinidad por la enzima

Mathews-van Holde M.Freire

INHIBICION COMPETITIVA
El enzima puede unirse al S -> [ES]
O bien al inhibidor -> [EI]
Nunca se forma el complejo [ESI]
Representación de dobles recíprocos
Lineweaver-Burk
1/Vo
+I

-I
1/Vmax

1/[S]
-1/Km -1/Kmap
M.Freire
M.Freire
INHIBICION NO COMPETITIVA
Inhibición no competitiva pura
[ESI]
1/Vo
+I

1/Vmaxap
-I

1/Vmax

-1/Km
-1/Km 1/[S]

Afecta al número de recambio (Vmax /[Et])

M.Freire
 Inhibicion acompetitiva

1/vo +I
-I

1/[S]
Puede darse en reacciones monosustrato y multiustrato
Complicaciones para discernir el mecanismo.
M.Freire
Inhibición acompetitiva

+I

ES ESI
Ki
+IESI

1/Vo

1/Vmax ap

1/Vmax
-1/Kmi-1/Km ap -1/Km M.Freire 1/[S
]
 EFECTOS DE LOS TIPOS DE INHIBICIÓN SOBRE EL VALOR
DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS

Tipo de inhibición Cte. de Michaelis Velocidad máxima

Ninguna KM Vmax

Competitiva KM ap.=KM (1+ [I]/Ki) Vmax

No Competitiva KM Vmax ap=Vmax/(1+[I]/Ki)

Acompetitiva KM ap.=KM/ (1+ [I]/Ki) Vmax ap=Vmax/(1+[I]/Ki)

M.Freire
Inhibicion Mixta
El inhibidor afecta a la vez a la unión de sustrato y al número de recambio
del enzima

1/vo +I
-I

1/[S]

Un ejemplo común de inhibición mixta son los iones metálicos de las enzim
M.Freire
M.Freire
M.Freire
M.Freire
 Efecto de la aspirina en la síntesis de prostaglandinas

M.Freire

Stryer capitulo 12 pp332-3

M.Freire
Inhibición de la ribonucleasa A
Sustrato UpA Inhibidor UpcA

¿Qué tipo de inhibición esperaríamos?

M.Freire
La cocoonasa también se inhibe con DIPF

A secretion called
cocoonase helps tobreak
down the sericin
binding the silk.

http://www.silkmoths.bizland.com/lszlunmoth.htm

M.Freire