BQI - Protocolo-Practica 2-3 Sacarosa - Curvapatrón-Cereales - 23-24
BQI - Protocolo-Practica 2-3 Sacarosa - Curvapatrón-Cereales - 23-24
BQI - Protocolo-Practica 2-3 Sacarosa - Curvapatrón-Cereales - 23-24
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PRÁCTICA 2 - 3. Cuantificación de azúcares en los
cereales del desayuno. PROTOCOLO
INTRODUCCIÓN
Estas dos prácticas (práctica número 2 y 3) se desarrollarán en dos días y tienen como
objetivo medir la concentración de sacarosa en distintas marcas de cereales del
desayuno a través de un método espectrofotométrico. Cada grupo usará una marca de
cereal diferente para poder compararlos al final de la práctica.
2. Fundamentos
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Figura 1. El carbono anomérico es el carbono del heterociclo derivado del carbono
carbonílico (cetona o aldehído) de la cadena abierta del carbohidrato.
Figura 2. La sacarosa es un disacárido sin carbono anomérico libre y que está formado
por una unidad de glucosa y otra de fructosa. El hecho de que los carbonos anoméricos
de ambos monómeros intervienen en enlace O-glucosídico hace que la molécula
carezca de un extremo reductor, es decir, la sacarosa no es un azúcar reductor.
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Bases de la espectrofotometría:
ESPECTRO DE ABSORCIÓN Y CURVA DE CALIBRACIÓN
La luz es un tipo de radiación electromagnética
que contiene a la vez características de onda y
de partícula (fotón). Uno de los descriptores de
una onda es la longitud de onda (λ), que es la
distancia entre dos máximos y se suele medir en
nanómetros (nm) (Figura 4).
La luz que recibimos del sol está compuesta por Figure Figura 4. Representación de una
onda.
longitudes de onda que cubren un gran rango del
espectro electromagnético, incluso aquellas que no puede percibir el ojo humano,
como la luz ultravioleta o la luz infrarroja. Algunas sustancias tienen la capacidad de
absorber la radiación de determinada longitud de onda y esta característica se utiliza
para poder medir la concentración de esa sustancia concreta, ya que la cantidad de
luz absorbida y la concentración de la sustancia siguen una proporción lineal hasta
cierto grado de concentración.
De esta manera, cuando un rayo de luz de una longitud de onda concreta atraviesa
una solución de una sustancia capaz de absorber esa luz, la intensidad de ese rayo
(cantidad de fotones) disminuye una vez atravesada la disolución (Figura 5).
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monocromática incide sobre la muestra. La intensidad de luz que consigue atravesar
la muestra es detectada por un detector (Figura 6).
𝑨 = 𝜺 · 𝒄 · 𝒍
donde:
A = Absorbancia medida en el espectrofotómetro
ε = Coeficiente de absorción molar a una determinada longitud de onda. Es la
absorción de luz de una determinada longitud de onda al atravesar una disolución
1 M y con paso óptico de 1 cm. Se expresa en M-1· cm-1
l = Paso óptico (espesor del tubo que contiene la disolución, en cm). En las
cubetas que se utilizan para este tipo de ensayos este valor suele ser de 1 cm.
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absorbancia obtenidos (A1-A3) a concentraciones conocidas (C1-C3) del compuesto
(solución patrón, calibrador o solución estándar). Posteriormente, conociendo la
absorbancia de la muestra problema (Ax), se determina la concentración de la solución
problema (Cx) por interpolación.
Una vez leída esta información y antes de entrar al laboratorio, visualiza el siguiente
videotutorial e identifica aquellas partes explicadas en este apartado.
Técnicas básicas en Bioquímica: espectrofotometría (5: 58)
https://www.youtube.com/watch?v=fXjP10sdmQU
3. Preparación
Materiales
Vasos de precipitados (50 y 100 ml), gradilla con tubos de 20 ml, rotulador para vidrio,
pipetas automáticas de diversos volúmenes, pipetas de vidrio con su dispositivo para
pipetear (pera), cubetas para medir en el espectrofotómetro, espectrofotómetro
(colorímetro), pipetas Pasteur de plástico, baño de agua a 90 – 100 ºC, baño de hielo,
agitatubos (vortex), agitador magnético, bolsa de diálisis.
Reactivos
Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), sacarosa 10 mM, HCl 2M, NaOH 2M, NaCl 2M, agua
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destilada.Preparación de los tubos con concentraciones conocidas de sacarosa
Tubo nº 0 1 2 3 4 5
Tratamiento
La sacarosa no tiene carbono anomérico libre, por lo que no es reductor. Para que
pueda reaccionar con el reactivo DNS es necesario hidrolizarla con un ácido fuerte como
el HCl, descomponiéndose en sus respectivos monómeros (glucosa y fructosa). Estos
productos de la hidrólisis sí tienen carácter reductor. Así pues, la reacción colorimétrica
se lleva a cabo en 3 etapas: hidrólisis ácida, neutralización y reacción con DNS
Tabla 2. Cantidades de reactivos añadidos a cada tubo para la hidrólisis ácida y posterior neutralización.
Tubo nº 0 1 2 3 4 5
HCl 2 M (ml) 1 1 1 1 1 1
Hidrólisis ácida
AGITAR + + + + + +
NaOH 2M (ml) 1 1 1 1 1 1
Neutrali
zación
AGITAR + + + + + +
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En este momento, cada tubo contiene un volumen aproximado de 10 ml. Para continuar
con el protocolo hay que tomar 2 ml del contenido de cada tubo y transferirlos a un
nuevo juego de tubos de ensayo, numerados igual que los anteriores.
Tubo nº 0’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’
AGITAR + + + + + +
Calentar 5 - 10 minutos a 90 ºC + + + + + +
AGITAR + + + + + +
NOTA IMPORTANTE: El DNS es muy nocivo. Hay que extremar las precauciones.
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- Realizar las medidas comenzando por el tubo de menor concentración y
terminando con el de mayor concentración. Los valores de A540 se van
apuntando en la tabla adjunta.
Tubo nº 0 1 2 3 4 5
A540 (u.a.)
4. Cálculos y Resultados
1.- Calcula las concentraciones de sacarosa en cada tubo y añade ese dato a la
tabla 4. Ten en cuenta las diluciones realizadas en los pasos de las tablas 1-3.
(HAZ ESTOS CÁLCULOS ANTES DE ENTRAR EN EL LABORATORIO).
2.- Representa en una hoja milimetrada (hay un modelo en eGela) un gráfico con los
datos de A540 frente a la [sacarosa]. Traza una recta de regresión que se aproxime a
todos los puntos que has dibujado. Escribe la ecuación de la recta en base a la línea
dibujada.
Nota: la ecuación de la recta es del tipo “y=mx + b”. En base a la línea dibujada tienes
que dar los valores de “b” (punto de corte con el eje de ordenadas) y “m” (pendiente).
Puedes dibujar los ejes del gráfico ANTES DE ENTRAR EN EL LABORATORIO. En
el eje de ordenadas (eje de las “y”) se representa la absorbancia entre 0 y 2 unidades
de absorbancia (u.a.). En el eje de abscisas (eje de las “x”) se indicará la [sacarosa]
tomando como rango los valores calculados para la tabla 4.
3.- Usando la recta de calibrado determina el coeficiente de absorción molar () de la
sacarosa. Pista: la cubeta tiene un grosor de 1 cm, por lo que ε se saca de un
parámetro de la ecuación de la recta. Adivina cuál y por qué.
4.- Una vez terminada la práctica y fuera del laboratorio, dibuja la recta de calibrado
del punto 2 usando un programa informático (Ej. Excel) y la calculadora. Compara los
valores de la ecuación de la recta del método manual y el calculado con ordenador y
calculadora. Dispones de un vídeo tutorial en eGela para aprender a hacer una recta
de calibrado (recta de regresión) en Excel y con diferentes modelos de calculadora.
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PRÁCTICA 3. Cuantificación de sacarosa en los cereales
del desayuno (DÍA 2).
1.- INTRODUCCIÓN
Primero: se dializan los cereales frente a agua para separar los azúcares de bajo
peso molecular (monosacáridos y disacáridos) del almidón y otros polisacáridos. Esta
parte se realiza el mismo día que la práctica 2.
Segundo: cuantificación de la sacarosa mediante un método espectrofotométrico y
se calcula el porcentaje de este disacárido con respecto a la masa total de cereal.
Esto permitirá comparar el contenido de azúcares entre las distintas marcas de
cereales.
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En el caso de esta práctica, las moléculas pequeñas como la sacarosa y los
monosacáridos saldrán del tubo de diálisis y se repartirán entre ambos compartimentos,
mientras que las moléculas grandes como el almidón permanecerán en el interior del
mismo. Si, tras alcanzarse el equilibrio, reemplazáramos la disolución externa y
repitiéramos el proceso varias veces, se podría reducir mucho la concentración de
moléculas pequeñas en el interior del tubo de diálisis, hasta hacerla prácticamente
inexistente.
Nota: Las membranas de diálisis comerciales suelen estar contaminadas con glicerol y
metales pesados, por lo que antes de su utilización se deben lavar con abundante agua.
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por igual en el volumen total, que es la suma del volumen de dentro de la bolsa de diálisis
más el volumen exterior. Sabiendo que se ha partido de 1 gramo de cereal, se podrá
determinar el porcentaje en peso de sacarosa que hay en cada tipo de cereal.
2.1.- Materiales
2.2.- Reactivos
Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), HCl 2 M, NaOH 2M, NaCl 2M, agua destilada,
disolución de iodo (sirve el Betadine).
3.- MÉTODO
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interior).
Se preparará un tubo adicional que sólo tendrá agua y que se utilizará como
blanco para realizar las medidas de absorbancia. Este tubo servirá para resetear
a 0 el valor de absorbancia del espectrofotómetro.
Tabla 5. Relación de pasos para la hidrólisis ácida y neutralización de las muestras de cereal.
Enfriar + + + - -
NaOH 2M (ml) 1 1 1 - -
Neutraliz
NaCl 2M (ml) - - - 2 2
ación
AGITAR + + + + +
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A los tubos “NH” se les añade 2 ml de NaCl para igualar el volumen de los tubos que han
sido sometidos a la acidificación y neutralización (1 ml HCl 2M + 1 ml NaOH 2M). Así no
habrá diferencias de volumen entre los tubos hidrolizados y los no hidrolizados. En este
momento, cada tubo contiene un volumen aproximado de 10 ml.
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preparado a tal efecto.
Realizar las medidas de absorbancia. Los valores de A540 se van apuntando en
la tabla 7.
Tabla 7. Medida de absorbancia de las muestras de cereal.
Rellena los datos que se piden en la tabla 8 y compáralos con otros/as compañeros/as.
NOTAS
(1) Para calcular la [sacarosa] que hay en el tubo de ensayo donde se ha medido la
absorbancia se utiliza la recta patrón obtenida en la práctica anterior.
(2) La cantidad de sacarosa total de la muestra se calcula teniendo en cuenta que el
volumen total de dializado es de 110 ml (100 ml en el exterior del tubo de diálisis y 10
ml en su interior). Mw sacarosa = 342,3 g/mol
(3) La cantidad de cereal dentro de cada membrana de diálisis es de 1 gramo.
4. Preguntas
1.- ¿Por qué se debe realizar la diálisis a 4 ºC? Si la diálisis se realizara a 25 ºC, ¿el
equilibrio se alcanzaría de forma más rápida, más lenta o igual de rápida?, ¿por qué?
2.- ¿Por qué se colorean con yodo molecular las muestras que contienen almidón?
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fructosa es de 300 M-1·cm –1.
4.- ¿Qué objetivo persigue la distinción entre los tubos “H” y “NH”? ¿Por qué se hacen
las medidas por duplicado (H1 y H2; NH1 y NH2)?
5.- Indica la cantidad de “Hidratos de carbono” y del parámetro “de los cuales
azúcares” por 100 g de cereal de acuerdo a los valores nutricionales de los tres tipos
de cereales usados. Indica el porcentaje en peso de la cantidad de “azúcares” de los
tres cereales. ¿Dentro de qué parámetro (“hidratos de carbono” o “azúcares”) se
encuentra la sacarosa analizada en esta práctica? ¿por qué? ¿qué tipos de glúcidos
podemos encontrar en el parámetro “azúcares”? Da ejemplos. (RESPONDE A ESTA
PREGUNTA ANTES DE ENTRAR EN EL LABORATORIO)
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