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Metodología ABTS/TAC: principales hitos y aplicaciones

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Antonio Cano , Ana B. Maestre , Josefa Hernandez-ruiz y Marino B. Arnao*

Departamento de Biología Vegetal (Fisiología Vegetal), Universidad de Murcia, 30100 Murcia, España
* Correspondencia: [email protected]

Abstracto:ABTS (2,2′-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) es un compuesto ampliamente utilizado

para determinar la capacidad antioxidante total (TAC) de extractos de plantas, alimentos, fluidos clínicos,
etc. Este ensayo fotométrico se basa en la reducción por la presencia de compuestos antioxidantes de un
conocido radical metaestable (ABTS•+) que pueden formarse a través de varios enfoques diferentes y
usarse en muchas metodologías de determinación diferentes, como medidas fotométricas
automatizadas en microplacas, robots clínicos, titulaciones valiosas y separación cromatográfica líquida
previa. Otro aspecto interesante es que, en algunos casos, el método ABTS/TAC permite determinaciones
secuenciales de actividad antioxidante hidrófila y lipófila, obteniendo valores de actividad antioxidante
total a través de los datos sumatorios de ambos tipos de antioxidantes. En este trabajo, presentamos una
revisión de varios aspectos del ABTS/TAC, destacando los principales logros que han hecho que este
método sea tan ampliamente utilizado, por ejemplo, la formación de radicales ABTS en medios de
reacción hidrofílicos o lipofílicos, estrategias de medición, automatización y adaptación a sistemas de alto
rendimiento, así como los pros y los contras. Además,

Palabras clave:ensayo ABTS; antioxidantes; actividad antioxidante; muestras clínicas; extractos de plantas; TAC;
capacidad antioxidante total

Citación:Cano, A.; Maestre, AB;

1. Introducción
Hernández-Ruiz, J.; Arnao, MB
Metodología ABTS/TAC: Principales Uno de los análisis más comunes realizados en extractos de plantas, alimentos, fluidos clínicos y
Hitos y Aplicaciones Recientes. otras fuentes es el de la capacidad antioxidante. El método 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-
Procesos2023,11, 185. https:// sulfonic acid, ABTS) (ABTS/TAC o ABTS/TEAC) es uno de los más utilizados en diferentes áreas de
doi.org/10.3390/pr11010185 investigación como la tecnología de la ciencia de los alimentos, la agricultura , ciencia de las plantas y
nutrición. Su uso generalizado en muchos aspectos de la investigación ha dado como resultado un
Editor Académico: Alessandro
aumento en el número de citas a lo largo de los años (Figura1).
Trentini
ABTS se utilizó inicialmente en la detección de sangre oculta en heces.1] y como reactivo en la
Recibido: 19 de diciembre de 2022 determinación de glucosa [2] en un ensayo de glucosa oxidasa/peroxidasa. ABTS también se utilizó en la
Revisado: 31 de diciembre de 2022 determinación de la actividad de la peroxidasa y en estudios cinéticos [3–6]. El producto de reacción de
Aceptado: 4 de enero de 2023 ABTS es un catión radical de la forma oxidada de ABTS (ABTS•+), que posteriormente fue utilizado en la
Publicado: 6 de enero de 2023 determinación de la capacidad antioxidante de muestras biológicas.
El ensayo ABTS/TAC es un método espectrofotométrico que utiliza el catión radical ABTS oxidado (ABTS•+)
para reaccionar con los antioxidantes para reducir el radical ABTS y perder su color verde azulado.ABTS•+tiene
varias características que lo hacen adecuado para ensayos colorimétricos; tiene varios picos de absorbancia en
Derechos de autor:© 2023 por los
diferentes longitudes de onda [3,7], tiene un alto coeficiente de extinción, su solubilidad en agua es alta, y
autores. Licenciatario MDPI, Basilea,
también es soluble en medios orgánicos [8]. El potencial redox (mio′) para ABTS/ABTS•+es 0,68 V [9], lo
Suiza. Este artículo es un artículo de
suficientemente alto como para reaccionar con la mayoría de los compuestos antioxidantes [10,11]. Hay dos
acceso abierto distribuido bajo los
mecanismos principales involucrados en la reacción entre los radicales y los antioxidantes, la reacción de
términos y condiciones de la licencia
Creative Commons Attribution (CC BY)
transferencia del átomo de hidrógeno (HAT) que implica un movimiento de un solo paso de un átomo de

(https:// creativecommons.org/ hidrógeno.12–14], y la reacción de transferencia de electrones

licenses/by/ 4.0/).

proceder sss2023,11, 185. https://doi.org/10.3390/pr11010185 https://www.mdpi.com/journal/processes

Procesos2023,11, 185 2 de 10

(SET) donde se transfiere un solo electrón para reducir un compuesto [13–15]. El ensayo ABTS
sigue principalmente el mecanismo SET, aunque también se puede aplicar HAT [12].

Figura 1.Publicaciones y citas del método ABTS/TAC (1997–2022). Fuente: Web of Science, búsqueda: ABTS Y
TEAC (todos los campos).

El primer uso ampliamente reconocido deABTS•+como reactivo para medir la capacidad

antioxidante de una muestra o compuesto puro fue por Miller et al. [dieciséis] usando la reacción
de mioglobina/H2O2para producir el verde azuladoABTS•+, aunque hubo algunos procedimientos
publicados previamente de otros autores (ver más abajo). Posteriormente, el método fue
modificado en ciertos aspectos, como la forma deABTS•+generación y el parámetro a estimar [7].

En este estudio, revisamos varios aspectos del método ABTS/TAC, desde la generación de radicales
ABTS hasta las diferentes estrategias utilizadas para determinar las medidas fotométricas. Los
principales logros que han llevado a que este método sea tan ampliamente aplicado, tales como las
posibilidades de generación de radicales ABTS en medios de reacción hidrofílicos o lipofílicos, la posible
automatización y adaptación a un sistema de alto rendimiento, y varios ejemplos recientes en diferentes
materiales biológicos son discutido Por último, se analizan los pros y los contras de estos métodos.

2. Diferentes estrategias para el método ABTS/TAC

la generacion deABTS•+se puede lograr a través de diferentes estrategias, pero los
métodos enzimáticos y químicos son los más utilizados (Figura2). Miller et al. [dieciséis]
utilizó la mioglobina/H2O2sistema para oxidar ABTS; este procedimiento encierra muchos
pasos y es laborioso de realizar. Anteriormente, el radical ABTS (ABTS•+) fue generado usando
un H2O2/peroxidasa (HRP) para la determinación del flavonoide naringina [17] e indol-3-
carbinol (indol-3-metanol) [18,19], pero el método no fue presentado hasta 1996 por Arnao et
al. [20]. Aquí,ABTS•+se generó utilizando un método más rápido, más fácil y más controlable,
mediante el cual el medio de reacción está controlado por el H2O2cantidades presentes
debido a la bien conocida estequiometría de la reacción (2 molABTS•+por mol H2O2) [3,6].
Mesa1muestra una perspectiva cronológica del método ABTS/TAC y sus diferentes enfoques.

Posteriormente, se han utilizado diferentes reactivos químicos oxidativos para la generación

de radicales ABTS como el MnO2[21], persulfato de potasio [22–24], PbO2[25], 2,2'-azobis-(2-
amidopropano) (ABAP) [26], o H2O2a pH bajo [27]. OtroABTS•+Los métodos de generación incluyen
oxidación electroquímica [28,29] y nanozima similar a la peroxidasa [30,31].
Procesos2023,11, 185 3 de 10

Figura 2.Estrategias de generación [dieciséis,20–25,27,28].

Tabla 1.Hitos en el desarrollo del método ABTS/TAC.

Año Hito Árbitro.

Peroxidasa de rábano picante (HRP)/H2O2método de generación.

primer uso deABTS•+para determinar la actividad antioxidante del flavonoide
1990 [17]
naringina.
Estrategia de punto final.
HRP/hora2O2método de generación.
1992 ABTS•+utilizado para estimar la actividad antioxidante del indol-3-carbinol. [18,19]
estrategia de punto final
Mioglobina/HO
22 método de generación.
1993 [dieciséis]
Estrategia cinética: inhibición de la reacción a tiempo
fijo. HRP/HO
2 2 método de generación.
1996 [20]
Estrategia cinética:retrasotiempo.
Métodos ABTS para la determinación de carotenoides.
1996 MnO2método de oxidación. Estrategia de punto final. [21]

Microensayo con lector de microplacas.

1999 HRP/hora2O2método de generación. [32]
Estrategia cinética: inhibición de la reacción a tiempo
fijo. Generación directa deABTS•+en medios lipofílicos.
HRP/HO 2 2generación de metanfetamina sobredosis.
2000 [8]
Estrategia de punto final.
Adaptación de lipofílicoABTS•+a un lector de microplacas.
Actividad antioxidante total (TAA) como una combinación de actividad antioxidante
hidrofílica (HAA) y actividad antioxidante lipofílica (LAA)
2001 [33]
TAA = HAA + LAA.
Uso deABTS•+tanto en medios hidrofílicos como lipofílicos.
2001 Adaptación deABTS•+a la técnica HPLC. Adaptación deABTS• [34]
2001 +a la técnica de flujo detenido. Generación electroquímica [35]
2002 deABTS•+. Adaptación deABTS•+a la técnica de inyección de [28]
2003 flujo. ABTS•+generación a pH bajo con H2O2. Dispositivo [36]
2004 basado en papel paraABTS•+ensayo. basado en teléfono [27]
2019 inteligenteABTS•+ensayo, uso de nanozimas. [37]
2022 [30,31]

ABTS•+la generación es el primer paso en este ensayo antioxidante, que puede lograrse en
presencia del antioxidante o antes de la adición del antioxidante. Estas diferentes formas de
generar elABTS•+conducen a dos formas diferentes de cuantificar la capacidad antioxidante: (i)
enfoque cinético y (ii) punto final [7]. En el método ABTS de Miller et al. [dieciséis], se utilizó un
enfoque cinético, donde la inhibición de la reacción debido a la presencia del antioxidante se mide
después de un tiempo fijo. Arnao et al. [17,20] también utilizó este enfoque para determinar el
tiempo de retraso, pero registró el retraso en la aparición de la generación de estado estacionario
deABTS•+. Así, no sólo se determinó la capacidad antioxidante de las muestras
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pero también se evaluaron los posibles efectos inhibidores de la reacción por parte de algunos
compuestos presentes en las muestras [20].
Para simplificar las mediciones de la estrategia cinética, se desarrollaron varios métodos de punto
final, en los que los medios con preformadosABTS•+fueron usados [17–19]. En este caso, la posterior
adición de la muestra que contenía antioxidantes produjo una decoloración (blanqueo) de laABTS•+[22,38
,39]. Este enfoque da como resultado el método más fácil de realizar, eliminando la interacción del
antioxidante con las enzimas reactivas y haciéndolo adecuado para análisis de alto rendimiento. Aunque
la estrategia de punto final ha resuelto algunos de los problemas observados en los ensayos cinéticos,
han surgido nuevas dificultades, como las diferentes velocidades de reacción de los diferentes
antioxidantes presentes en las muestras con ABTS•+, obteniendo tipos de antioxidantes de reacción
rápida y lenta [40,41]. Recientemente, se han propuesto algunos procedimientos novedosos y prácticos
para determinar la capacidad antioxidante para mejorar la determinación de ABTS/TAC a través de la
estimación del ajuste de curva exponencial.24], porcentaje de inhibición [27], o valoración redox [25].

3. Métodos ABTS/TAC para antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos

Inicialmente, el ensayo ABTS/TAC fue desarrollado para la determinación hidrofílica,
estimando antioxidantes hidrofílicos como ácidos orgánicos, aminoácidos, glutatión y fenoles,
entre otros antioxidantes que pueden solubilizarse en agua. En esta situación, los antioxidantes
liposolubles aparentemente estarían dispersos en el medio acuoso, de manera que no podrían
medirse con precisión. Miller propuso el desarrollo de un método lipofílico para determinar estos
antioxidantes liposolubles.21] para medir la capacidad antioxidante de los carotenoides, usando un
radical ABTS generado en medio acuoso después de disolver muestras de carotenoides en hexano/
acetona. Utilizando la capacidad de la peroxidasa de rábano picante (HRP) para actuar en medios
orgánicos, Cano et al. [8] propuso un método ABTS/TAC modificado para generarABTS•+
directamente en medios orgánicos, donde se probaron diferentes solventes orgánicos para la
reactividad de la peroxidasa yABTS•+estabilidad.
La importancia de obtener un método que fuera capaz de medir ambas capacidades
antioxidantes (hidrofílica y lipofílica) usando el mismo cromógeno reactivo llevó a la posibilidad de
determinar la actividad antioxidante total (TAA) como una combinación de actividad antioxidante
hidrofílica (HAA) y actividad antioxidante lipofílica (LAA) (TAA = HAA + LAA) (Figura3). Esto se
demostró en nuestros estudios en diferentes materiales vegetales como la lechuga [42], tomate [
43], uvas [44], frutas cítricas [45,46], espinaca [47], lupino [48], cereales [49], alcachofa [50],quercus
árbol [51], y manzanilla [52], así como en productos alimenticios como las sopas de verduras [33],
vino [53,54], y cervezas [38], y en material animal
como rata [55–57], canino [58], y plasma humano [59], además de órganos renales, hepáticos y
cerebrales [56,60], y muestras seminales de verraco [61]. Mesa2muestra algunos de los valores
obtenidos mediante el método ABTS/TAC para diferentes productos, con una clasificación relativa
según su capacidad antioxidante.

Figura 3.Actividad antioxidante total (TAA) como suma de las actividades hidrofílica (HAA) y
lipofílica (LAA), así como sus componentes.
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Tabla 2.Clasificación de TAC alto, moderado y bajo de diferentes productos según los valores publicados.

Muestra Tipo TACa Árbitro.

Café Bebida 47.16 [36,62]

uva, negro Fruta 35.93 [36,44,63]
Mora Fruta 20.24 [36]
Vino tinto Bebida 18.85 [36,54,62,64]
Frambuesa Fruta 16.79 [36]
Alcachofa Verdura 15.03 [36,50]
Oliva negro Fruta 14.73 [36]
Grosella Fruta 14.05 [36]
Arándano Fruta 13.09 [36]
Fresa Fruta 11.05 [36,63]
Cerdo Carne 3.50 [sesenta y cinco]

Pomelo Fruta 3.43 [36,45,63]

Rábano Verdura 3.22 [36]
zumo de naranja Bebida 2.90 [36,66,67]
Carne de res Carne 2.90 [sesenta y cinco]

Calabacín Verdura 2.86 [36]

Jugo de uva Bebida 2.75 [36,66,67]
riñón de frijol Verdura 2.70 [63]
Limón Fruta 2.68 [45]
Pollo Carne 2.56 [sesenta y cinco]

Banana Fruta 0,64 [36]

agua saborizada Bebida 0.50 [68]
Apio Verdura 0.49 [36]
Zanahoria Verdura 0.44 [36]
Pepino Verdura 0.43 [36]
Hinojo Verdura 0.43 [36]
Lechuga iceberg Verdura 0.32 [42]
Endibia Verdura 0.30 [36]
Lechuga baby head Verdura 0.24 [42]
Refresco Bebida 0.07 [68]
aTAC: capacidad antioxidante total, expresada en mmol Trolox/kg FW (valores medios).

4. Adaptación del ensayo ABTS a diferentes técnicas

El aumento en el uso del ensayo ABTS/TAC para determinar la capacidad antioxidante y el
aumento de los estudios sobre la relación entre el compuesto estructural y la capacidad
antioxidante llevó a la adaptación de los diferentes métodos discutidos para su uso en sistemas de
alto rendimiento. Se han realizado adaptaciones para varias técnicas, como lectores de
microplacas, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), ensayo de inyección de flujo (FIA),
técnicas de flujo detenido y equipo de análisis automatizado (Figura4).

Figura 4.Adaptación del método ABTS/TAC a diferentes sistemas de alto rendimiento.

Procesos2023,11, 185 6 de 10

Laigth et al. desarrollaron una adaptación de microplacas. en 1999 [32] para medir la
actividad antioxidante en plasma de rata. El ensayo de microplaca se adaptó a la estrategia radical
ABTS preformada [8,33] o generación de radicales ABTS en microplaca en pozo [69]. Cano et al. [8]
adaptó el ABTS/H lipofílico2O2/HRP método de punto final a un lector de microplacas para
determinar la capacidad antioxidante de α-tocoferol y β-caroteno lipofílicos.
El ABTS/H2O2El método de generación de /HRP también se adaptó a un sistema de HPLC, en
una reacción de radicales ABTS post-columna [70,71], y se aplica a antioxidantes hidrofílicos y
lipofílicos. En este caso, se obtuvo una mejor comprensión del pico de los compuestos separados
con capacidad antioxidante, al mismo tiempo que se cuantificaba el contenido del compuesto y su
respectiva actividad antioxidante hidro- o lipofílica.
Recientemente, se han desarrollado dos nuevas e interesantes adaptaciones, una utilizando un
dispositivo de papel como soporte para la determinación de antioxidantes mediante el ensayo ABTS
junto con el Folin-CiocaEnsayos lteu y CUPRA [37], y el otro usa una nanozima similar a la peroxidasa
para generarABTS•+[30], midiendo el nivel de TAC con un dispositivo portátil, mientras promueve una
medición a gran escala de la actividad antioxidante usando un teléfono inteligente [31].

5. Aplicaciones recientes del ensayo ABTS/TAC

Desde el primer uso de este ensayo para determinar la capacidad antioxidante (ver Tabla1) se ha
convertido en uno de los métodos más utilizados, solo superado por el método DPPH [45]. Muchos campos de
investigación han utilizado el método ABTS/TAC en sus estudios, como la tecnología de los alimentos, la
agricultura, la ciencia de las plantas, la nutrición y la clínica.7]. A continuación se comentan algunos de los
últimos estudios en diferentes campos de investigación.
En un estudio realizado en perros, diferentes métodos ABTS/TAC, incluido el método de Miller et al.
con metmioglobina [dieciséis], el método deABTS•+generado a bajo pH [27], y el método de Arnao et al.
con peroxidasa [38] se compararon en términos de determinaciones de la capacidad antioxidante total
en el suero canino de perros sanos y afectados por enfermedad inflamatoria intestinal [58]. Los tres
métodos ABTS/TAC ensayados mostraron resultados aceptables, con una imprecisión inferior al 15%,
pero sólo el H2O2/peroxidasa mostró diferencias significativas entre las dos muestras de perros, junto
con una mayor correlación entre las actividades antioxidantes observadas y esperadas en el ensayo de
dilución de muestras caninas. Después de la validación de los métodos para su uso en suero canino, los
autores recomendaron métodos de metmioglobina y peroxidasa para la generación de radicales ABTS.58
].
Un estudio sobre diabetes mellitus gestacional en ratas utilizó el ensayo ABTS/TAC de Arnao
et al. [38] para determinar la capacidad antioxidante hidrófila en muestras de suero, describiendo
una correlación directa entre el tratamiento y un aumento de HAA, confirmado por un marcador
oxidativo bajo [57,59].
El ensayo ABTS/TAC se utilizó en la caracterización y comparación de plantas de
manzanilla silvestre [52], utilizando la determinación hidrofílica y lipofílica del método de la
peroxidasa [8]. En este estudio, se describieron las diferencias entre las diferentes plantas de
manzanilla estudiadas en los extractos de raíces, tallos, hojas y flores, con diferencias
relevantes en HAA y LAA según el órgano y la especie de manzanilla.52]. Además, se encontró
una excelente correlación entre las capacidades antioxidantes (HAA, LAA y TAA) y el contenido
de fenoles y flavonoides (acuosos, orgánicos y totales).
En otro estudio interesante, se analizó y comparó la actividad antioxidante de seis
subproductos del procesamiento industrial de la alcachofa [50]. Estos desechos biológicos son muy
ricos en fitoquímicos con beneficios potenciales para la salud de humanos y animales.72]. Se
analizó el contenido de fenoles y flavonoides, y las capacidades antioxidantes, entre otros
parámetros, con tratamiento térmico selectivo en corazones y brácteas de alcachofa; los
subproductos más prometedores se encontraron más cerca del corazón de la alcachofa. En este
tipo de estudio, el método ABTS/TAC demostró ser una técnica rápida y confiable, en términos de
la línea de procesamiento, las propiedades antioxidantes de los alimentos y sus subproductos.
En los últimos años, se han publicado algunas revisiones sobre ensayos de actividad antioxidante,
donde se discutieron algunas controversias y limitaciones de diferentes enfoques de ensayos
antioxidantes.7,13,73,74]. Ciertos problemas en el uso de persulfato para oxidación ABTS, y
Procesos2023,11, 185 7 de 10

Se han descrito dificultades en el enfoque cinético de antioxidantes con múltiples grupos hidroxilo.
13]. Apak et al. proporcionó una lista de características deseables para un ensayo antioxidante
ideal [13,14], la mayoría de los cuales se logran mediante el ensayo ABTS/TAC usando peroxidasa.
Estas características incluyen pH fisiológico (el ensayo ABTS puede ejecutarse a diferentes pH),
sondas estables y reproducibles (el radical ABTS es un radical metaestable con una reacción
peroxidativa controlada), actividad contra antioxidantes acuosos y orgánicos (el ensayo ABTS es
compatible con ambos antioxidantes acuosos (HAA) y lipofílicos (LAA), absorción en la región
espectrofotométrica visible, preferiblemente más allá de 500-700 nm para evitar la interferencia de
las clorofilas y las antocianinas (ABTS•+tiene varios máximos espectrales a 414, 734 y 800 nm en la
región visible) y un potencial redox óptimo (ABTS•+es capaz de oxidar los antioxidantes más
importantes) [13,14].
El importante papel de los antioxidantes en la respuesta al estrés oxidativo en material biológico y,
por tanto, en la prevención de muchas enfermedades y disfunciones ha incrementado la búsqueda de
nuevos compuestos antioxidantes, así como la evaluación de su actividad antioxidante in vitro.
Obviamente, estos ensayos deben contrastarse con otros estudios de antioxidantes in vivo. Por ejemplo,
recientemente se presentaron algunos estudios que comparan las actividades antioxidantes in vitro e in
vivo entre diferentes ensayos antioxidantes, destacando la prioridad de determinar el efecto in vivo de
los antioxidantes y su correlación con la actividad antioxidante in vitro en nutrientes interesantes.75].

6. Conclusiones
A pesar de algunas desventajas observadas con el método ABTS/TAC, que se comparten con el
método DPPH comúnmente utilizado (no es un radical fisiológico natural, de gran tamaño y una reacción
antioxidante lenta versus rápida) [45], este método sigue siendo útil. El método ABTS/TAC es rápido, con
un procesamiento mínimo, es extremadamente versátil frente a diferentes pH, se pueden seleccionar
diferentes longitudes de onda para evitar interferencias espectrofotométricas, se puede usar tanto para
mediciones hidrofílicas como lipofílicas, y es fácilmente adaptable a alto rendimiento. (microplaca, HPLC,
etc.), satisfaciendo así casi todos los requisitos para un ensayo antioxidante ideal.

Contribuciones de autor:AC, JH-R. y ABM contribuyeron a la planificación de las ideas principales y la

visualización; AC fue responsable del primer borrador del manuscrito; ABM, AC y MBA fueron los
responsables de la revisión y versión final. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada
del manuscrito.

Fondos:Este trabajo ha sido financiado a través del proyecto del Ministerio de Ciencia e Innovación
“Proyectos I+D+I”, el Programa Estatal para la Generación de Conocimiento y Fortalecimiento Científico y
Tecnológico del Sistema I+D+I y la I+D+i Orientada a los Retos de la Sociedad del Plan Estatal de
Investigación e Innovación Científica y Técnica 2017-2020, Beca PID2020-113029RB-I00 financiada por
MCIN/AEI/10.13039/501100011033. Se puede encontrar más información enhttps://www.um.es/es/ web/
fitohormonas/(consultado el 30 de diciembre de 2022; Phytohormones and Plant Development Lab).

Declaración de disponibilidad de datos:No aplica.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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