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J Biosci (2019) 44:38 Academia India de Ciencias

DOI: 10.1007/s12038­019­9856­8 (0123456789().,­volV)(0123456789().,­volV)

Revisar

Enzimas de restricción y su uso en biología molecular:

Una visión general

FRANCESCA DI FELICE1, GIOACCHINO MICHELI2 y GIORGIO CAMILLONI1,2*

1
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie, Sapienza, Universita` di Roma, Piazzale A. Moro 5, 00185 Roma, Italia

2
Istituto di Biologia e Patologia Molecolari, CNR, Roma, Piazzale A. Moro 5, 00185 Roma, Italia

*Autor de correspondencia (correo electrónico, [email protected])

MS recibido el 24 de octubre de 2018; aceptado el 3 de enero de 2019; publicado en línea el 8 de abril de 2019

Las enzimas de restricción se identificaron a principios de la década de 1950 del siglo pasado y rápidamente se convirtieron en actores
clave en la biología molecular del ADN. Hace cuarenta años, los científicos cuyo trabajo pionero había explorado la actividad y especificidad
de secuencia de estas enzimas, contribuyendo a la definición de su enorme potencial como herramientas para la caracterización, mapeo
y manipulación del ADN, fueron galardonados con el Premio Nobel. En esta breve reseña, celebramos la historia de estas enzimas a la luz
de sus muchos usos diferentes, ya que estas proteínas han acompañado la historia del ADN durante más de 50 años y representan
testigos activos de los principales pasos en el campo.

Palabras clave. Clonación; manipulación del ADN; historia; enzimas de restricción

1. Introducción Bertani y Weigle 1953). Estos trabajos describen los cambios que sufre la
capacidad infectiva del fago durante el ciclo de crecimiento, demostrando
Historia magistra vitae: la expresión de Cicerón, extraída de su De Oratore que estas alteraciones no se deben a mutaciones de novo ni a procesos
de casi 2000 años, sintetiza brillantemente cómo la comprensión de la selectivos. Posteriormente, se comprobó que el sistema de defensa
realidad presente debe valorar la experiencia pasada. subyacente se basa en endonucleasas específicas de secuencia de ADN,
Este requisito es muy relevante para los estudios científicos y está muy que restringen la acción viral (de ahí el término enzimas de restricción) al
bien ejemplificado por las referencias en las que se basa cada artículo digerir el ADN del fago, junto con una actividad correspondiente de ADN
científico: los nuevos conocimientos acumulan adquisiciones anteriores metil transferasa, que protege la integridad del huésped. ADN mediante
y las reconocen. En este sentido, presentamos una descripción general la modificación de sitios de corte potenciales mediante la adición de
de la importancia experimental de una clase específica de proteínas, las grupos metilo (revisado en Wilson y Murray 1991).
enzimas de restricción de tipo II. Ha pasado más de medio siglo desde los
primeros estudios sobre estas moléculas.
Su papel fundamental como herramientas para la caracterización y Por su contribución fundamental al descubrimiento y uso de las enzimas
manipulación del ADN rápidamente las hizo muy conocidas dentro de la de restricción, Werner Arber, Dan Nathans y Hamilton Smith recibieron el
comunidad científica. Destacar su relevancia para los estudios de ADN va Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1978. Arber había planteado la
en paralelo con la historia de la doble hélice y puede atraer también a hipótesis de que estas enzimas podían unirse al ADN en sitios
aquellos que, aunque no trabajan en ADN, están interesados en los representados por secuencias de ADN específicas (Arber 1965). Smith
avances realizados por las investigaciones en esta área. había verificado la hipótesis de Arber utilizando enzimas purificadas y
demostrando que eran capaces de cortar secuencias de nucleótidos
simétricas y específicas (Kelly y Smith 1970; Smith y Wilcox 1970).

2. Restricción y modificación Nathans se había dado cuenta de la posible explotación de estas enzimas,
produciendo los primeros mapas de sitio de corte de restricción de
Las principales observaciones en genética microbiana que revelaron la fragmentos de ADN específicos (Danna y Nathans 1971). Desde los
capacidad de las bacterias para resistir las infecciones por bacteriófagos estudios de Arber, Smith y Nathans, la caracterización de las enzimas de
se publicaron a principios de la década de 1950 (Luria y Human 1952; restricción se ha desarrollado muy rápidamente y cuatro

http://www.ias.ac.in/jbiosci 1
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Se han identificado diferentes clases de enzimas. Las enzimas que a continuación, todo el contenido del gel se transfirió (blotted) sobre
pertenecen a la clase II se explotan comúnmente en la manipulación una membrana flexible (normalmente un filtro de nitrocelulosa) para
y caracterización del ADN. Solo requieren Mg2?, y no ATP, para que los fragmentos de ADN se unieran a este soporte sin alterar las
reconocer su secuencia de ADN objetivo y escindirla. Muchas posiciones relativas que habían alcanzado en el gel.
enzimas de restricción, originarias de una amplia gama de especies A continuación, el filtro se sometió a hibridación molecular con
bacterianas, pertenecen a esta clase y se han identificado cientos sondas de ADN específicas marcadas radiactivamente. Así, sólo se
de secuencias de reconocimiento/corte. Usando diferentes evidenciaron el o los fragmentos correspondientes a la sonda.
combinaciones de enzimas de restricción, se han vuelto posibles Una aplicación particularmente interesante del mapeo de
muchas formas diferentes de caracterizar y manipular el ADN restricción se basa en el análisis de polimorfismos de longitud de
(Williams 2003). Los análisis comparativos han demostrado que las fragmentos de restricción (RFLP). Esta técnica permite comparar
enzimas de restricción de tipo II son miembros de una gran muestras de ADN extraídas de diferentes fuentes (individuos)
superfamilia de proteínas, denominadas nucleasas PD­(D/E)XK, evaluando la variabilidad de tamaño de fragmentos de restricción
caracterizadas por un pliegue central conservado (un motivo a/b específicos. Los fragmentos de una región de ADN dada de un solo
común) pero que carecen de una similitud de secuencia significativa individuo se comparan con una muestra de referencia o se puntúan
excepto para residuos críticos de su sitio activo (Knizewski et al. 2007). para una firma individual. El análisis RFLP ha ganado una amplia
Esto plantea preguntas interesantes y aún abiertas sobre las vías aceptación como una herramienta de alta precisión en el diagnóstico prenatal.
evolutivas de los muchos miembros de esta familia (Gupta et al. El uso de sondas específicas contra secuencias de una sola copia,
2012). capaces de distinguir polimorfismos de secuencia cuando se hibridan
Las enzimas de restricción de clase I, III y IV se emplean con con ADN digerido con endonucleasas de restricción, se propuso por
mucha menos frecuencia en estudios de ADN debido a su menor primera vez durante la década de 1980 (Botstein et al. 1980;
especificidad de corte de ADN. En lugar de coincidir con sus Weatherall et al. 1985 ) . Posteriormente, este enfoque también fue
secuencias de reconocimiento, sus sitios de corte a menudo se ampliamente adoptado por la genética molecular forense (Sajan tila
localizan muy lejos y/o no son específicos de secuencia. Además, y Budowle 1991; Balazs 1992). Hoy en día, la serología forense
su actividad de restricción no siempre está separada de la actividad convencional ha sido reemplazada casi por completo por ensayos
de metilación y su número no es tan abundante como el de las basados en el ADN.
endonucleasas de restricción de clase II. Finalmente, la actividad de
las enzimas de restricción de clase I, III y IV a menudo depende del
ATP (revisado en Roberts et al. 2003). 4. Uso básico de las enzimas de restricción: manipulación del ADN

Los muchos enfoques heurísticos y aplicativos que emplean enzimas

3. Uso básico de las enzimas de restricción: mapeo físico del de restricción han demostrado ser fundamentales para el mapeo
ADN físico del ADN. De manera similar, la tecnología del ADN
recombinante, que tiene vínculos igualmente fuertes con estas
Desde los primeros experimentos de Danna y Nathans (1971), el extraordinarias herramientas moleculares, tuvo un impacto
principal uso de las enzimas de restricción estuvo dirigido a localizar revolucionario en la biología molecular, así como en la biomedicina y la biotecnolog
sus sitios de corte en moléculas de ADN seleccionadas. En una era Poco antes de la identificación de las primeras enzimas de restricción,
en la que todavía se estaban desarrollando métodos efectivos de Lederberg (1952) propuso utilizar el término 'plásmido' para
determinación de secuencias de nucleótidos, la especificidad de los cualquier elemento extracromosómico que determinara la herencia
perfiles de escisión de restricción de diferentes regiones de ADN o el sexo. Unos años más tarde (Hickson et al. 1967) las propiedades
permitió compararlos fácilmente, lo que resultó en un flujo sin físicas y químicas del ADN plasmídico y su naturaleza circular se
precedentes de estudios estructurales, funcionales y evolutivos muy caracterizaron ampliamente y los plásmidos también se visualizaron
interesantes en muchos sistemas de genes ( Holsinger y Jansen mediante microscopía electrónica. En 1972, Cohen y sus
1993). La comparación de ADN de organismos que pertenecen a colaboradores insertaron en una cepa bacteriana un ADN circular
taxones diferentes, incluso estrechamente relacionados, se volvió cerrado exógeno que albergaba secuencias que codificaban la
tan simple como comparar sus perfiles de restricción. De hecho, la resistencia contra un antibiótico determinado. Seleccionaron la
variación de un solo nucleótido que se produce en un sitio de corte población que contenía el plásmido examinando la capacidad de
de restricción dado es suficiente para afectar la escisión y dar como crecer en presencia del mismo antibiótico (Cohen et al. 1972).
resultado un patrón de digestión diferente. En 1976 se produjo un En ese momento, la capacidad de la ligasa de ADN para unir dos
gran avance en el mapeo físico del ADN mediante la digestión con nucleótidos adyacentes alineados en una plantilla complementaria
enzimas de restricción con la introducción del método de transferencia mediante la creación de un nuevo enlace fosfodiéster había sido
Southern. En esencia, el escenario experimental fue estandarizado demostrada después de experimentos con extractos de E. coli
por el método de Edwin Southern para analizar fragmentos de capaces de unir cadenas de polidesoxinucleótidos y convertir círculos
restricción de ADN específicos después de clasificarlos unidos por hidrógeno a partir de fagos k. en una forma circular
electroforéticamente por tamaño a través de una losa de gel de covalentemente cerrada (Cozzarelli et al. 1967; Gefter et al. 1967;
agarosa (Southern 1975). La posibilidad de analizar solo un Gellert 1967; Olivera y Lehman 1967; Weiss y Richardson 1967).
subconjunto de fragmentos fue de particular interés: el ADN se desnaturalizó dentro delagel
Sin embargo, al final de
principios de la
la separación electroforética
década de 1970, y
una herramienta para la
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todavía faltaba la fragmentación específica del ADN. Stanley Cohen, función y regulación de los genes, y ha llevado a notables logros
una de las personalidades más importantes en el campo, había estado biotecnológicos. Se hizo posible diseñar in vitro en profundidad genes,
experimentando con la fragmentación mecánica del ADN (Cohen et al. incluso humanos, transcribirlos y dar lugar, mediante su posterior
1967) , pero el tipo correcto de "tijeras moleculares" altamente traducción, a proteínas de interés médico como las globinas o la
específicas estuvo disponible solo a través de los estudios de Arber, insulina. Este último se produjo por primera vez en 1979 (Goeddel et
Smith y Nathans ( Arber 1965; Smith y Wilcox 1970; Danna y Nathans al. 1979).
1971). El trabajo del laboratorio de Herbert Boyer representó un hito al Desde entonces, la producción de moléculas complejas biológicamente
proporcionar una enzima de restricción histórica, EcoRI (Yoshimori et activas mediante tecnologías de ADN recombinante se ha convertido
al. 1972). También quedó claro que algunas actividades de clase II en una práctica común (Khan et al. 2016).
producían un corte escalonado en la doble hélice (figura 1), dejando Estos hallazgos han estimulado en gran medida la investigación
extremos complementarios (los llamados pegajosos o cohesivos) sobre la manipulación específica del sitio del genoma, con énfasis en
(Hershey et al. 1963; Gellert 1967), que podían unirse, el desarrollo de herramientas basadas en endonucleasas capaces de
independientemente del origen del ADN, con ADN ligasa (Jensen et al. apuntar y escindir prácticamente cualquier secuencia. Esto ha llevado
1971; Jackson et al. 1972; Lobban y Kaiser 1973). De repente, el a dos poderosos sistemas: ZFN (nucleasa de dedo de zinc) (Liu et al.
campo de juego del ADN recombinante estaba listo. Stanley Cohen 1997) y TALEN (nucleasa efectora similar a un activador de
(Cohen 2013) ha publicado en los últimos años una excelente transcripción) (Christian et al. 2010; Miller et al. 2011). ZFN se basa en
descripción sobre los orígenes y el desarrollo de la clonación molecular, nucleasas artificiales en las que el dominio de escisión del ADN de Fok
incluido un relato del famoso encuentro en la playa de Waikiki (Hawái) . I, una enzima de restricción de tipo II, se fusiona con el extremo C de
un dominio de unión al ADN con dedos de zinc: en la proteína de
fusión, el dominio de la nucleasa Fok I es responsable de la actividad
Al unir fragmentos de ADN de diferentes organismos, se hizo posible de corte, mientras que el dominio de dedo de zinc reconoce y se une
la generación de los llamados ADN quiméricos. a la secuencia objetivo. El sistema TALEN también explota una proteína
La inserción de algunos fragmentos de ADNr de X. laevis en el plásmido de fusión, constituida por el dominio de escisión Fok I y un dominio de
pSC101 fue uno de los primeros ejemplos (Morrow et al. 1974). Estos unión al ADN efector similar a un activador de la transcripción (Gaj et
experimentos demostraron que era posible usar plásmidos bacterianos al. 2013). Hasta 2011, ZFN y TALEN fueron los sistemas más
para clonar ADN de varias fuentes; que la unión de ADN de diferentes prometedores dotados de una alta especificidad de focalización/corte.
organismos podría tener lugar después de cortarlos con enzimas de Sin embargo, en términos de tiempo y requisitos económicos, ambos
restricción generando el mismo tipo de extremos; y, por último, pero no sistemas han demostrado ser bastante exigentes y se produjo un
menos importante, que este procedimiento no afectó a la funcionalidad progreso sustancial con la introducción de sistemas programables de
del propio plásmido que continuó replicando y transcribiendo los genes selección/corte mediados por ARN (Kim y Kim 2014) como RGEN
albergados. (nucleasas de ingeniería guiadas por ARN), que ha ha sido
reemplazado rápidamente por su sucesor más efectivo y ahora
Luego, siguió otro paso importante: la creación de bibliotecas de ampliamente adoptado, CRISPR­Cas9 (consulte la Sección 6).
genes (revisado en Durmaz et al. 2015). Estas bibliotecas involucraron
la fragmentación del ADN genómico por digestión con enzimas de
restricción que cortan con alta frecuencia, es decir, tienen secuencias
de reconocimiento cortas (4–6 bases). Los fragmentos obtenidos se 5. Estudios de accesibilidad del ADN: cromatina, metilación
unieron in vitro a varias moléculas de plásmido asegurando una del ADN
cobertura estadísticamente suficiente de todo el genoma. Así, los
fragmentos de restricción obtenidos de un genoma dado se distribuyeron El estudio de la estructura de la cromatina se ha basado en gran
en diferentes plásmidos que representaban colectivamente el genoma medida en los análisis de resistencia a las nucleasas (Hewish y
completo del organismo. Burgoyne 1973; Rill y Van Holde 1973; Noll 1974) que condujeron al
Estas bibliotecas han permitido un estudio sistemático de genomas modelo de nucleosoma básico propuesto por R. Kornberg (Kornberg
completos, incluso aquellos con un tamaño notablemente grande (por 1974). El enfoque de nucleasa fue seguido por otra metodología
ejemplo, el humano). En general, el uso de enzimas de restricción para (REAA, ensayo de accesibilidad de enzimas de restricción) basada en
dividir grandes fragmentos de ADN en fragmentos de tamaño definido la especificidad de corte de enzimas de restricción para probar la
y con extremos específicos allanó el camino no solo para la tecnología accesibilidad in vivo de regiones específicas de ADN (Pfeiffer et al.
de ADN recombinante sino también para los primeros esfuerzos de 1975; Ho¨ rz et al . 1976 ; Lipchitz y Axel 1976).
secuenciación de ADN (revisado en Heather and Chain 2016) . Informes sucesivos mostraron que los genes transcritos eran más
La manipulación del ADN mediada por enzimas de restricción ha sensibles a las enzimas de restricción que los no transcritos (Grummt
abierto la posibilidad de introducir deleciones específicas de subregiones y Gross 1980). El corte se vio obstaculizado cuando el sitio de
de genes o promotores, con el fin de comparar el comportamiento de restricción se mapeó dentro de una región de ADN asociada con
las plantillas eliminadas con copias de tipo salvaje en términos de histonas para formar un nucleosoma. Por el contrario, si la ubicación
sustratos para la transcripción/procesamiento y traducción del ARN. La del nucleosoma no abarcara el sitio de restricción, podría ocurrir un
capacidad de cortar y unir piezas de genes casi a voluntad ha dado un corte. Por lo tanto, se hizo posible observar el posicionamiento del
tremendo impulso al conocimiento básico de la naturaleza, nucleosoma o los eventos de remodelación de la cromatina.
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Figura 1. Diagrama que muestra el mecanismo de acción general de las endonucleasas de restricción tipo II y los productos finales de la reacción. ¿En
presencia de Mg2? iones una enzima de tipo II cataliza la escisión de los enlaces fosfodiéster (flechas continuas que apuntan al enlace entre 30 O y
P) en ubicaciones específicas a lo largo del ADN, generando fragmentos con extremos 50 ­fosforilo/30 ­hidroxilo. La reacción ocurre por ataque
nucleofílico en el átomo de fósforo, pero aún no está completamente establecido si procede por hidrólisis directa o mediante la formación de un
intermedio de reacción covalente (Pingoud et al. 2005) . Si bien los pasos químicos individuales del mecanismo real pueden exhibir variaciones
específicas para cada enzima de restricción, el esquema general informado aquí está bien conservado. La secuencia de nucleótidos que se muestra
(GAATTC) es el sitio de reconocimiento/corte para EcoRI, una enzima de restricción que opera un corte escalonado que deja 50 extremos cohesivos que sobresalen.

mediada, por ejemplo, por cambios ambientales. REAA se ha explotando la sensibilidad de metilación diferencial a las enzimas
utilizado durante mucho tiempo para evaluar los cambios en la de restricción y representa el origen de la epigenética molecular,
estructura de la cromatina. que posteriormente ganó un enorme impulso con el advenimiento
En 1978, Edwin Southern y Adrian Bird desarrollaron una de la secuenciación de ADN de alto rendimiento (Lin 2018 ).
estrategia de mapeo que implicaba el estado de metilación del ADN
(Bird y Southern 1978). En Xenopus laevis, el ADN ribosomal de
los eritrocitos (ADNr somático) mostró una mayor resistencia a la 6. CRISPR­Cas9: nuevas fronteras en la edición de ADN
acción de enzimas de restricción específicas en comparación con
el mismo sustrato abundantemente presente en los ovocitos como La capacidad de las endonucleasas de restricción para distinguir
ADNr amplificado. La diferencia resultó depender del estado de entre sustratos de ADN metilados y no metilados es esencial para
metilación diferencial del ADNr en los dos tejidos en lugar de proteger el genoma bacteriano contra la invasión de bacteriófagos.
diferentes secuencias de nucleótidos. Las enzimas de restricción se consideran un componente
Este enfoque dio lugar a una serie de comparaciones fundamental de un sistema de defensa innato desarrollado por
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bacterias durante la evolución. Recientemente, un mecanismo de

defensa adicional explotado por las bacterias ha suscitado un gran
interés. Se basa en elementos CRISPR (repeticiones palindrómicas
cortas agrupadas e inspeccionadas regularmente) y en sus
proteínas asociadas, Cas. En cada infección por fago, los
fragmentos del genoma del fago se integran en el genoma
bacteriano en los loci CRISPR (Barrangou et al. 2007). Estos loci
luego se transcriben y los pequeños ARN que se originan a partir
de los fragmentos de ADN del fago integrado reconocen las
secuencias exógenas. Estos ARN son utilizados como guía por una
proteína Cas específica, Cas9 (proteína 9 asociada a CRISPR),
una endonucleasa codificada por un gen ubicado cerca de los loci
CRISPR. Cuando la guía de ARN se empareja con la secuencia de
ADN del fago, Cas9 se activa y degrada el ADN del fago.
Ambos mecanismos de defensa, restricción/modificación y
CRISPR­Cas9, explotan actividades endonucleolíticas. La eficacia
del primer mecanismo se basa en la capacidad de la endonucleasa
de restricción para distinguir e inactivar selectivamente el ADN del
fago, conservando al mismo tiempo el ADN del huésped, sobre la
base del estado de metilación. El segundo mecanismo (figura 2)
Figura 2. Diagrama simplificado de CRISPR­Cas9 como un sistema de aprovecha la guía de ARN que forma un dúplex de ARN/ADN con
segmentación/escisión de ADN impulsado por ARN. Un ARN guía único, el ADN del fago y, por lo tanto, induce la escisión mediada por
pequeño y sintético (sgRNA) lleva una secuencia corta (generalmente 20 Cas9 de la secuencia objetivo (esto puede ocurrir incluso más
nucleótidos; línea de puntos gris) capaz de coincidir con un sitio de ADN
tarde, durante una infección posterior por el mismo fago). ).
objetivo (línea de puntos negra). El reconocimiento de la diana se ve
facilitado por la presencia de una secuencia corta (50 ­NGG), el motivo
De manera similar a las enzimas de restricción, aunque a un
adyacente al protoespaciador (PAM). Tras la separación de bases
complementarias y la formación del bucle R, la endonucleasa Cas9 se activa ritmo mucho más rápido, el sistema CRISPR­Cas9 también se ha
y se produce la escisión (flechas) de ambas cadenas de ADN (consulte sometido a extensos estudios para aclarar los mecanismos
Jiang y Doudna 2017 para una revisión en profundidad reciente). moleculares subyacentes y diseñarlos adecuadamente para manipular el ADN.

Figura 3. Enzimas de restricción: testigos activos de la historia del ADN.

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Figura 4. Línea de tiempo que muestra los principales hitos en la historia de las enzimas de restricción.

plantillas. En esencia, el sistema CRISPR­Cas9 se ha convertido herramienta molecular capaz de generar fragmentos específicos de
rápidamente en una herramienta biotecnológica novedosa y muy ADN ha supuesto un punto de inflexión en la historia del ADN. La
poderosa, que hace que la edición del genoma sea prácticamente participación de las enzimas de restricción en una amplia variedad de
posible en cualquier célula. Esto se ejemplifica con la posibilidad de procedimientos sofisticados convierte a estas proteínas en 'testigos
introducir mutaciones genéticas en ubicaciones específicas simplemente moleculares' activos de los avances en el análisis, manipulación y
identificando una secuencia de ADN diana apropiada/única y adoptando explotación de la doble hélice (figura 3) . Lo que inicialmente fue un
la guía de ARN correspondiente para colocar la endonucleasa Cas9 en descubrimiento impulsado por los intereses y principios de la investigación
posición (Jinek et al. 2012) . Una especificidad tan alta no sería básica se ha convertido rápidamente en una poderosa herramienta para
alcanzable con endonucleasas de restricción ya que sus sitios de la ciencia aplicada y los enfoques traslacionales (figura 4). Curiosamente,
reconocimiento/corte están dispersos por todo el genoma. Los sitios de el sistema CRISP/Cas actualmente sigue un camino muy similar. En
corte de las enzimas de restricción de tipo II están 'cableados' en la general, estas observaciones constituyen un excelente ejemplo de cómo
estructura de la proteína, es decir, cambiar la especificidad de la investigación básica, no orientada, representa un reservorio muy
reconocimiento/corte requiere una nueva proteína. Por el contrario, la valioso de nuevos descubrimientos con un fuerte potencial de aplicación.
endonucleasa Cas9 se basa en un pequeño ARN guía para emparejarse
con su objetivo de ADN complementario y un nuevo ARN guía es
suficiente para cambiar la especificidad de corte, sin necesidad de
modificar la proteína.

Referencias
7. Observaciones finales

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Editor de correspondencia: SUDHA BHATTACHARYA