Nanoanticuerpos: Desarrollo Biotecnológico y Aplicaciones: Publicación Continua

PUBLICACIÓN CONTINUA
ARTÍCULO DE REVISIÓN
© 2021 Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza.

Este es un artículo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas, 24: 1-16, 2021.
https://doi.org/10.22201/fesz.23958723e.2021.398
Nanoanticuerpos: desarrollo biotecnológico y aplicaciones
Paola Andrea Ortega-Portilla1*, Laura Cancino-Villeda1,2,

Enrique Wenceslao Coronado-Aceves1 y Clara Espitia-Pinzón1
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México
(UNAM), Ciudad Universitaria, Circuito Escolar, Alcaldía Coyoacán, 04510 Ciudad
de México, México. 2Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico
Nacional. Ciudad de México, México. E-mail: *[email protected]
Resumen
Los anticuerpos monoclonales son una de las herramientas más revolucionarias en el área de la biomedicina por tener aplicaciones
inmunoterapéuticas e inmunodiagnósticas. Sin embargo, el rápido avance tecnológico que demandan estas áreas genera la
exploración de nuevas biomoléculas. El descubrimiento de anticuerpos compuestos únicamente por cadenas pesadas, presentes
de forma natural en el suero de los camélidos y en algunas especies de tiburón, son motivo de estudio desde las últimas décadas
como una alternativa a los anticuerpos convencionales. Estos poseen una región de reconocimiento antigénico, que consiste en
un dominio variable por cada cadena, conocidos como anticuerpos de un solo dominio o nanoanticuerpos. Estas biomoléculas
se caracterizan por tener un tamaño reducido, alta especificidad, estabilidad y bajo costo en su producción; propiedades que las
convierten en una herramienta altamente versátil. En la presente revisión se abordarán aspectos relevantes de los nanoanticuerpos,
como su descubrimiento, características estructurales, desarrollo en el campo de la biotecnología y su potencial de aplicación en
enfermedades como el cáncer y en la identificación de microorganismos.
Palabras clave: nanoanticuerpos, Nanobodies, cáncer, inmunoterapia, industria farmacéutica.
Nanobodies: Biotechnological development and applications
Abstract
Monoclonal antibodies are one the most revolutionary tools in the biomedicine
area for having immunotherapeutic and
immunodiagnostic applications. However, the rapid technological advance demanded by these areas generates the exploration of
new biomolecules. The discovery of antibodies composed solely of heavy chains, naturally present in the camelids’ serum and
some shark species, has been the subject of study since the last decades as an alternative to conventional antibodies. These have an
antigen recognition region, which consists of a variable domain for each chain, known as single domain antibodies or nanobodies.
These biomolecules are characterized by having a small size, high specificity, stability, and low cost in their production; properties
that make them a highly versatile tool. This review will address relevant aspects of nanobodies, such as their discovery, structural
characteristics, development in the field of biotechnology, and their potential for application in diseases such as cancer and in the
identification of microorganisms.
Keywords: antibody, Nanobodies, cancer, immunotherapy, pharmaceutical industry.
Artículo recibido el 29 de junio del 2021.

Artículo aceptado el 9 de diciembre del 2021.
2 TIP Rev.Esp.Cienc.Quím.Biol. Vol. 24
Introducción opción para su desarrollo y aplicación en diversas áreas,
D
esde que Köhler y Milstein desarrollaron los desde investigación básica hasta la evaluación de su potencial
anticuerpos monoclonales (Köhler & Milstein, terapéutico. Esto representa una alternativa o complemento
1975), su aplicación ha sido ampliamente para los anticuerpos convencionales.
explorada en la identificación directa y/o indirecta
de moléculas blanco, desarrollo biotecnológico, diagnóstico Nanoanticuerpos: estructura y propiedades
clínico e inmunoterapia, lo que manifiesta el impacto Estructura
revolucionario de su descubrimiento para la humanidad. A diferencia de la estructura heterodimérica de la
Sin embargo, a pesar de existir anticuerpos monoclonales inmunoglobulina tipo IgG convencional, que consiste en
aprobados para su uso en humanos (Singh et al., 2018), algunas 2 cadenas pesadas idénticas con 4 dominios y 2 cadenas
características inherentes a su estructura como el tamaño, ha ligeras idénticas con dos dominios y un peso de ~150 kDa
dificultado su aplicación terapéutica en áreas como el cáncer, (Padlan, 1994); los anticuerpos de cadena pesada tienen una
debido a su baja diseminación en el tejido tumoral, el desarrollo estructura homodimérica en ausencia de cadenas ligeras, con
de anticuerpos tipo HAMA (por el inglés Human Anti-Mouse dos dominios constantes (CH2-CH3) en ausencia del dominio
Antibodies), baja estabilidad estructural en condiciones CH1 en camélidos y cinco dominios constantes en tiburones,
adversas y alto costo en su producción, han incentivado la con un peso de ~90 kDa (Muyldermans, 2013; Nuttal et al.,
búsqueda y desarrollo de nuevas alternativas. 2001) (Figura 1).
El descubrimiento realizado por el grupo de Hamers-Casterman Su región de reconocimiento antigénico, consiste únicamente
en 1993, en el que por serendipia encontraron anticuerpos en un dominio variable por cada cadena con un peso ~15
compuestos únicamente por cadenas pesadas, presentes en el kDa. Tienen cualidades estructurales únicas en función de su
suero de Camelus dromedarius, seguido por la identificación de origen, por ejemplo, la presencia de 9 cadenas tipo Beta en
anticuerpos similares en el suero de Ginglymostoma cirratum camélidos y 7 en tiburones. Su capacidad de reconocimiento a
más conocidos como tiburón nodriza (Greenberg et al., 1995), pesar de tener un tamaño casi 10 veces menor a un anticuerpo
abrió la puerta a un panorama no explorado, puesto que la convencional, ocurre gracias a la presencia de regiones
región de reconocimiento antigénica de estos anticuerpos, determinantes de complementariedad, más conocidas como
está formada por un dominio variable perteneciente a cada CDRs (del inglés Complementarity Determining Regions),
cadena pesada. donde también se han evidenciado diferencias, siendo 3
para camélidos y 2 para tiburones por cada dominio, pero en
El porcentaje de este tipo de anticuerpos varía en función de las ambos casos CDR1 y 3 tienen mayor longitud y variabilidad.
especies que los desarrollan de manera natural, en camellos se El CDR3 de los nanoanticuerpos tiene 6 y 4 residuos de
ha reportado que representan entre el 50 y el 80% y en tiburones aminoácidos adicionales con respecto a los dominios de
de 0.1 a 1% del total de los anticuerpos. Las funciones que se cadena pesada de los ratones y humanos respectivamente.
les han atribuido son el reconocimiento de algunos virus y el Debido a estas condiciones, un puente disulfuro adicional
reclutamiento celular (Muyldermans, 2013). Sus dominios entre CDR1 y CDR3 está presente y brinda estabilidad a
variables son definidos como el formato de reconocimiento la estructura. Esta interacción se encuentra ausente en los
natural más pequeño que existe. Estos dominios comparten y anticuerpos convencionales (Govaert et al., 2012; Stanfield,
difieren en algunas características estructurales en función de Dooley, Verdino, Flajnik & Wilson, 2007).
su origen, por esta razón, se han establecido nomenclaturas para
su identificación. Los dominios variables de la cadena pesada Estas características les brindan una superficie suficiente para
de anticuerpos convencionales (humanos y de ratón tipo IgG), reconocer antígenos de forma similar a los fragmentos de
son reconocidos como VH (del inglés Variable Heavy), por otro reconocimiento de cadena sencilla compuestos por los dominios
lado, a los derivados de anticuerpos de cadena pesada, presentes variables de cadena pesada y ligera (Siontorou et al., 2013).
en tiburones, se les conoce como V-NAR (del inglés Variable
New Antigen Receptor) y a los presentes en camélidos, como En análisis de secuenciación, se ha identificado la sustitución
VHH (del inglés Variable Heavy from Heavy Chain Antibodies) de los residuos de aminoácidos hidrofóbicos conservados en
(Muyldermans, 2013). Estos últimos son más conocidos como los dominios variables de los anticuerpos convencionales,
Nanobodies (Nanoanticuerpos, Nac), nombre adjudicado por por residuos de aminoácidos de naturaleza hidrofílica. Estos
Ablynx, una bio-farmacéutica de SANOFI dedicada al desarrollo cambios son adjudicados a la ausencia de la cadena variable
de este formato de anticuerpo ablynx.com/our-company/ ligera (Muyldermans, 2013), las sustituciones y posiciones de
overview/ (Jovčevska & Muyldermans, 2020). mayor importancia son: valina (42) por fenilalanina/tirosina,
glicina (49) por ácido glutámico, leucina (50) por arginina y
Los Nac se caracterizan por su tamaño reducido, solubilidad, triptófano (52) por glicina (Muyldermans, 2013; Atarhouch,
estabilidad y especificidad, lo que los convierte en una atractiva Saldanha, Barbosa & Hamers, 1994; Harmsen et al., 2000).
2021 Ortega-Portilla, P. A. et al.: Nanoanticuerpos 3
Figura 1. Esquema de anticuerpos convencionales y anticuerpos de cadena pesada. A) Anticuerpos tipo IgG heterodímero compuesto
por dos cadenas pesadas (CH1, 2, 3 y un VH) y dos cadenas ligeras (CL1 y VL) y la región de reconocimiento antigénico (VH y VL). B)
Anticuerpos de cadenas pesadas-homodímero (CH2,3) y la región de reconocimiento antigénico (VHH). C) Nuevo receptor antigénico
de Inmunoglobulinas NRA-Ig-homodímero de dos cadenas pesadas (CH1-5) y la región de reconocimiento antigénico (V-NAR). D)
fragmento de reconocimiento antigénico (CH1-CL1 y VH-VL) y fragmento variable de cadena sencilla (VH-VL). E) Dominios variables
de reconocimiento. Abreviaturas: CH: Domino constante de cadena pesada, CL: Dominio constante de cadena ligera, V H/L: Dominio
variable, VHH: Dominio variable de anticuerpo de cadena pesada, V-NRA: Dominio variable del nuevo receptor antigénico. Elaboración
personal (“Creado con Biorender.com”).
Todos estos cambios de plegamiento y de secuencia, les brindan parasitaria, con resultados prometedores (Cortez-Retamozo
mayor solubilidad, además, dan lugar a una estructura alargada et al., 2004; Baral et al., 2006).
o esferoide relacionada con una mayor exposición del lugar
específico de unión del anticuerpo con el antígeno, que aunado Su homología con los dominios variables de la cadena pesada
a su reducido tamaño, facilitan el reconocimiento de epítopos de origen humano es alrededor del 95% (Klarenbeek et al.,
antigénicos que son de difícil acceso para los anticuerpos 2015), además, la construcción de anticuerpos humanizados es
convencionales. otra estrategia que busca incrementar la posibilidad para una
aplicación terapéutica (Vincke et al., 2009). La cristalización
Propiedades de los Nanoanticuerpos de estas moléculas ha permitido dilucidar el tipo de unión
A pesar de su tamaño, tienen capacidad de unión a una amplia entre la molécula blanco y los Nac, y concluir que además de
variedad de epítopos con afinidades reportadas en rangos de tener la capacidad de reconocimiento, tienen el potencial para
nanomolar (Sockolosky et al., 2016; Valdez-Cruz et al., 2021), ser usados como herramientas de estabilización estructural y
se caracterizan por tener estabilidad conformacional, tolerancia capacidad neutralizante (Korotkov, Pardon, Steyaert & Hol,
térmica y a diferentes valores de pH (Cortez-Retamozo et al., 2009; Wrapp et al., 2020).
2004; Wang et al., 2014). Cuentan con la capacidad de replegarse
después de estar expuestos a condiciones extremas como presión Su estructura monomérica les permite reconocer a los antígenos;
y agentes caotrópicos, conservando su solubilidad y capacidad sin embargo, es posible obtener estructuras multiméricas
de reconocimiento (Dumoulin et al., 2002). mediante técnicas de biología molecular aumentando su avidez
y tiempo de vida media, por ejemplo, el formato bivalente
Se ha evaluado su aplicación en especies diferentes a la de su permite incrementar el área de reconocimiento para antígenos
origen, por ejemplo: en modelo murino de cáncer e infección multiméricos (Zhu et al., 2010) y el formato bi-específico para
reconocer a dos secuencias antigénicas diferentes de manera variable de los anticuerpos. Estos fragmentos variables, tienen
simultánea (Els Conrath, Lauwereys, Wyns & Muyldermans, una longitud aproximada de 120 residuos de aminoácidos y están
2001). También, es posible su conjugación con moléculas como codificados por una secuencia génica de ~360 pares de bases (pb).
fluorocromos, enzima peroxidasa de rábano, radionúclidos Posteriormente, estos fragmentos son ensamblados en vectores
como el galio 68 y nanopartículas entre otros, lo que permite de clonación, por ejemplo, fagémidos, que se caracterizan por
su aplicación hacia propósitos específicos (Cortez-Retamozo tener un origen de replicación para el plásmido y el fago, lo
et al., 2004). que permite el despliegue de los Nac en una superficie fágica
al exponerse a un fago adyuvante.
Desarrollo biotecnológico en su producción
Bibliotecas La resistencia a los antibióticos presentes en los vectores de
Con el fin de obtener Nac con estabilidad y afinidad idóneas clonación y la presencia de secuencias como las poli-histidinas
para su aplicación, la construcción de bibliotecas o bancos o c-Myc presente en los Nac, son estrategias de diseño que
con anticuerpos de diferente naturaleza ha sido ampliamente permiten seleccionar a las clonas transformadas por los fagos
utilizada (Liu et al., 2018). e identificar a los Nac solubles respectivamente. Estos vectores
de clonación, al actuar como vehículos de las secuencias
El desarrollo y selección de los Nac a partir de bibliotecas altamente variables, se utilizan para transformar a bacterias
inmunes (Figura 2), implica la inmunización con el antígeno o como Escherichia coli TG1 (E. coli TG1), en una biblioteca o
molécula de interés a animales que desarrollen de manera natural banco de Nanoanticuerpos.
anticuerpos de cadena pesada. Los pertenecientes a la familia
Camelidae como llamas, alpacas y camellos, son ampliamente Finalmente, mediante la interacción de una partícula fágica
usados en la construcción de este tipo de bibliotecas. adyuvante y la biblioteca presente en bacterias, se induce el
despliegue de los Nac en la superficie del fago, dando lugar a
Una vez que se completa el esquema de inmunización, el RNA una plataforma idónea para la interacción con la molécula blanco
mensajero (RNAm) extraído de los linfocitos de la sangre (Salvador, Vilaplana & Marco, 2019; Wang et al., 2016). El
periférica, se transforma en DNA complementario (DNAc), que desarrollo de los Nac a partir de las bibliotecas inmunes, ofrece
se usa como molde para amplificar específicamente la región ventajas como la maduración de la afinidad inmune desarrollada
Figura 2. Esquema de la construcción de una biblioteca de Nanoanticuerpos usando partículas fágicas. La extracción de sangre puede
ser de camélidos previamente inmunizados o no. Se separan los linfocitos B, se extrae el RNAm, y mediante RT-PCR se sintetiza DNAc,
el cual se expone a oligos que permiten amplificar al Nac específicamente mediante PCR. Estas secuencias amplificadas son insertadas
en vectores de clonación que son utilizados para transformar a E. coli TG1, dando lugar a la biblioteca de Nac. Finalmente esta es
transfectada con una partícula fágica que permite el despliegue de Nac unidos a proteínas de la superficie fágica, representando una
plataforma idónea para interaccionar con la molécula blanco. Abreviaturas: RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,
RNAm: RNA mensajero, DNAc: DNA complementario. Elaboración personal (“Creado con Biorender.com”).
in vivo y un mayor grado de conservación en las secuencias de Christ, 2007; Li et al., 2020). En la Tabla I se encuentran las
los fragmentos variables, en comparación con otros formatos, principales características de las bibliotecas.
donde se requiere el acoplamiento entre las secuencias génicas
de cadenas variables pesadas y ligeras mediante un péptido Un factor a tener en cuenta en la construcción de las bibliotecas,
adicional (Muyldermans, 2013). Sin embargo, las limitantes son: es la plataforma seleccionada para permitir la interacción Nac-
por cada molécula blanco se requiere repetir todo el proceso y molécula blanco. Algunas de las opciones más exploradas son
la naturaleza no inmunogénica o tóxica de algunas moléculas las partículas fágicas, las levaduras y los ribosomas como se
impide la inmunización. describe a continuación.
La construcción de bibliotecas naïve, no inmunes, toma Técnicas de despliegue de Nanoanticuerpos en fagos,

ventaja de la diversidad inmunológica natural del animal sin ribosomas y levaduras
inmunización; sin embargo, una desventaja es que para obtener Existen varias técnicas de selección como: despliegue en fagos
una mayor variedad de secuencias en los Nac, es necesario un (phage display), en levaduras (yeast display), en ribosomas
mayor número de linfocitos, que en cantidad de sangre representa (ribosome display), en bacterias (bacterial display) y la técnica
hasta un litro recolectado de diferentes individuos. de CIS display, two hybrid, deep sequencing entre otros
(Muyldermans, 2021).
Otra alternativa, es la construcción de bibliotecas sintéticas y
semisintéticas, construidas a partir de un menor volumen de La técnica de despliegue en fagos tiene como principio la
sangre o de secuencias de anticuerpos (in silico). Mediante el asociación del genotipo de los bacteriófagos con su fenotipo, es
uso de oligos aleatorios en PCR (del inglés Polymerase Chain decir, relaciona a la proteína expresada en la cápside viral con
Reaction) se modifican las secuencias de los CDRs, en especial el gen que la codifica (Wu, Liu, Lu & Wu, 2016). Es la técnica
la número tres, conservando los marcos de lectura canónicos de de selección más utilizada. Descrita en 1985 por el Dr. George
los dominios variables de la cadena pesada. Estas bibliotecas o P. Smith (Smith, 1985), acreedor en 2018 al premio Nobel de
bancos, cuentan con las características estructurales de los Nac Química por su aporte a la biotecnología. El despliegue de
y un alto número de secuencias diferentes de CDRs (Goldman los Nac en las partículas fágicas, se logra mediante su unión
et al., 2006). Representando así, una fuente de anticuerpos de a proteínas de superficie, siendo la proteína III (pIII) la más
un solo dominio y Nac que pueden ser dirigidos contra una utilizada, puesto que se encuentra ubicada en un extremo del
amplia gama de antígenos, incluyendo aquellos con los que fago, lo que permite una óptima interacción entre la molécula
no es posible realizar una inmunización. Una ventaja es que blanco y los Nac; su selección es llevada a cabo mediante
no se requiere de todo el proceso de construcción para cada múltiples rondas de exposición al antígeno (biopanning), y
molécula blanco. Algunos autores nombran a los anticuerpos mediante la aplicación de estrategias metodológicas, es posible
derivados de estas bibliotecas “Sybodies” en referencia a que seleccionar a aquellos Nac-fagos con mayor afinidad. Finalizadas
son de origen 100% sintético. las rondas, se evalúa el reconocimiento de clonas individuales
hacia la molécula de interés, con una selección individual para
Extrapolando estas estrategias metodológicas, es posible la su posterior obtención como Nac soluble (Figura 3A).
construcción de bibliotecas de origen humano, aumentando la
posibilidad de su aplicación terapéutica (Lee, Iorno, Sierro & Entre las ventajas del despliegue en fago se encuentran la
Tabla I. Bibliotecas de Nanoanticuerpos.
Bibliotecas
Características
Inmune Naïve Semi/Sintéticas
Variabilidad ~10 6
~10 9
~1012
Inmunización Sí No No
Volumen de sangre 0.05L >1L <0.01L
Origen humano No No sí
Rango Rango Rango
Afinidad KD
Nano/pico Molar Micro/Nano Molar Micro/pico Molar
Tipo de antígenos Limitada No limitada No limitada
L:litro; KD: constante de disociación.
Figura 3. Despliegue en fago, levadura y ribosoma. A) Representación del proceso de selección del Nac (biopanning), evaluación, expresión,
purificación y caracterización. B) Esquema de despliegue del Nac en el receptor Aga2 de la levadura. C) Complejo del ribosoma-RNAm-
VHH. Elaboración personal (“Creado con Biorender.com”).
tolerancia de los fagos a las altas temperaturas y ambientes (no tienen un codón de terminación) y sintetizan la secuencia
ácidos, permitiendo seleccionar Nac con resistencia a estas polipeptídica codificada, para formar complejos de RNAm-
condiciones (Muyldermans, 2013). Sin embargo, una desventaja ribosoma-proteína (Figura 3C) utilizados para una selección
es que al estar el Nac unido a la proteína III, existe la posibilidad por exposición al antígeno de interés. Posteriormente, el RNAm
de que ocurra un impedimento estérico (Silva et al., 2011). de los complejos seleccionados es liberado y utilizado en una
prueba de PCR con transcripción reversa, RT-PCR (del inglés
Por otro lado, el despliegue en levadura es un sistema que Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), donde
utiliza el receptor de adhesión de α-aglutinina de la superficie se amplifica y prepara para subsecuentes rondas de selección.
de la levadura para desplegar al Nac. Este sistema, usa el par Finalmente es posible la producción de anticuerpos de un solo
de proteínas Aga1 y Aga2 unidas a la pared celular; la primera dominio altamente específicos capaces de detectar al antígeno
se une mediante los β-glucanos, mientras que la Aga2 se une de interés (Galán et al., 2016). Al ser un ensayo sin células
a Aga1 a través de puentes disulfuro. El anticuerpo de un solo (cell-free), posee varias ventajas como la posibilidad de evaluar
dominio se encuentra fusionado a la proteína Aga2. La fusión grandes bibliotecas (1012-1014) en pocas reacciones de PCR y
sigue la vía secretora de las levaduras desde el retículo hasta llevar a cabo la transcripción y la traducción acopladas o por
la membrana plasmática (Salema & Fernández, 2017). Para separado, mientras que las desventajas de la técnica residen en
cuantificar el nivel de expresión del Nac, se utilizan epítopos la labilidad del RNAm y la necesidad de controlar variables
de hemaglutinina (HA) y de c-Myc que son detectados por como la presencia de enzimas RNAsas (Galán et al., 2016).
anticuerpos (Orcutt & Wittrup, 2010) (Figura 3B). Una ventaja
clara de esta técnica, es la posibilidad de caracterizar la constante Por último, la técnica de CIS display, es un sistema de selección
de disociación (KD) del anticuerpo expresado en su superficie sin de bibliotecas in vitro que aprovecha la capacidad de la proteína
necesidad de expresarlo y purificarlo en su forma soluble (Gai & repA de unirse exclusivamente al DNA a partir del cual se
Wittrup, 2007; Salema & Fernández, 2017). Una desventaja es ha expresado (propiedad llamada cis). Inicialmente se crea
el tamaño relativamente pequeño de sus bibliotecas, comparado una biblioteca de péptidos muy diversa mediante la unión de
con otras técnicas de despliegue, debido a su limitada eficiencia fragmentos de DNA con secuencia aleatoria a fragmentos de
durante la transformación (Orcutt & Wittrup, 2010). DNA codificantes para la proteína repA. Posteriormente, se
realiza una transcripción y traducción in vitro donde se obtienen
En la técnica de despliegue en ribosoma, el DNA de la biblioteca un conjunto de complejos de DNA-repA-Nac, que pasan a
de interés es transcrito, produciendo RNAm utilizados para través de rondas de selección por afinidad a ligandos de interés
una traducción in vitro. Los ribosomas traducen a los RNAm inmovilizados. A continuación, el DNA retenido es eluido y
amplificado mediante PCR para formar una biblioteca de DNA tumorales (Liu, Li, Jin & Liu, 2021). Además, su tamaño y la
lista para rondas de selección subsecuentes (tres a cinco rondas). facilidad para ser conjugados o acoplados a diferentes moléculas,
Así, el DNA recuperado es clonado en un vector de expresión optimizan la identificación y visualización del tejido de interés
apropiado para la identificación de las secuencias peptídicas (Jovčevska & Muyldermans, 2020).
individuales (Odegrip et al., 2004; Mathonet, Ioannou, Betley
& Ullman, 2011). Un gran número de Nac se encuentran en etapas preclínicas
y ensayos clínicos para ser utilizados como herramientas de
Sistemas de expresión de Nanoanticuerpos diagnóstico, su acoplamiento con las técnicas PET y SPECT, van
Los Nac se expresan en microorganismos, líneas celulares de la mano con el reconocimiento hacia marcadores moleculares
eucariotas y plantas (Muyldermans, 2013), por mencionar como HER2 para cáncer de mama (Keyaerts et al., 2016; Xavier
algunos ejemplos: las levaduras Saccharomyces cerevisiae et al., 2016); el ligando PD-L1 como inhibidor de proliferación
y Pichia pastoris (Salema & Fernández, 2017), la bacteria de linfocitos T (Xing et al., 2019; Gao et al., 2020), un dominio
Corynebacterium glutamicum (Yim et al., 2015), el hongo específico a fibronectina que detecta tumores primarios y sitios
Ustilago maydis (Terfrüchte et al., 2017), células de Spodoptera metastásicos (Jailkhani et al., 2019); o dirigido a VCAM como
frugiperda (línea celular Sf9) infectadas con baculovirus molécula de adhesión celular vascular (Zhang et al., 2018;
(Shokrollahi, Habibi Anbouhi, Jahanian-Najafabadi, AliRahimi Bridoux et al., 2020); por mencionar algunos.
& Behdani, 2021), u otros novedosos sistemas de expresión.
Sin embargo, debido a sus altos rendimientos ~2 mg/ 200 La facilidad para ser conjugados con otros componentes,
mL (Ortega et al., 2020), simplicidad y bajo costo, E. coli ha permitido explorar el potencial de los Nac como agentes
es uno de los sistemas más utilizados, además, mediante terapéuticos contra el cáncer. Por ejemplo, en combinación
herramientas de biología molecular es posible obtener a los con PDT (del inglés Photodynamic Therapy) la cual se basa en
Nac como proteínas solubles a partir del ambiente periplásmico las propiedades foto-sensibilizantes de un compuesto químico
bacteriano, optimizando la formación de los puentes disulfuro. Su para generar especies reactivas de oxígeno (ROS), produciendo
purificación se lleva a cabo utilizando columnas cromatográficas la muerte celular de las células cancerígenas por las vías de la
con afinidad a los metales y de filtración en gel para obtener altos apoptosis y la necrosis (Deken, et al., 2020).
niveles de pureza. En caso de no utilizar algún marcaje presente
en la secuencia de los Nac, también se purifican mediante la La adaptación de los Nac a células CAR-T (del inglés Chimeric
unión a la proteína A (Muyldermans, 2013; Ortega et al., 2020 ). Antigen Receptor-T Cells), se han evaluado siendo parte de su
receptor de reconocimiento, o como moléculas de secreción
Aplicación de los nanoanticuerpos con propiedades inmunomoduladoras para optimizar su efecto
Su tamaño, estabilidad, capacidad para replegarse, afinidad, antitumoral (Xie et al., 2020). De igual manera, se ha explorado
especificidad y bajo costo de producción, convierte a los Nac su aplicación al conjugarlos con diferentes fármacos, enzimas y
en moléculas altamente versátiles (De Meyer, Muyldermans toxinas (Kang et al., 2021). En la Tabla II, se muestran algunos
& Depicker, 2014). Abordaremos su aplicación en tres áreas ejemplos de estos Nac.
principalmente: cáncer, identificación de microorganismos y
en la industria alimentaria. Nanoanticuerpos para enfermedades Infecciosas
La versatilidad de reconocimiento que tienen los Nac, permiten
Nanoanticuerpos en cáncer su aplicación en diferentes pasos durante un proceso infeccioso.
Los Nac se han propuesto como candidatos alternativos para La identificación del microorganismo y de los factores de
el diagnóstico del cáncer, gracias a sus propiedades y como virulencia como toxinas y proteínas de secreción, permiten
consecuencia de que las técnicas utilizadas para su diagnóstico, su aplicación en las fases de diagnóstico, neutralización y
como rayos X, tomografías, resonancia magnética o ultrasonido, tratamiento (Tabla II).
cuentan con baja resolución, visualización y altos costos (Yang
& Shah, 2020). Han sido estudiados contra los patógenos de las vías
respiratorias, y son candidatos gracias a su alta estabilidad
Actualmente las proyecciones de imágenes moleculares a través para ser administrados mediante inhalación, facilitando su
de las técnicas nucleares como PET (del inglés Positron Emission ingreso directamente al sitio de la infección (Respaud, Vecellio,
Tomography) y SPECT (del inglés Single-Photon Emission Diot & Heuzé-Vourc’h, 2015). Su potencial como moléculas
Computed Tomography), son ampliamente utilizadas en la neutralizantes dirigido contra SARS-CoV-2, causante de la
detección de tumores, puesto que proporcionan una información pandemia actual, está siendo ampliamente explorado (Valdez-
completa del tejido tumoral y son no invasivas. Estas técnicas Cruz et al., 2021), con resultados prometedores. Su aplicación
representan un escenario ideal para la aplicación de los Nac por ha mostrado inhibir la entrada del virus in vitro (Wrapp et al.,
su versatilidad, y por el extenso desarrollo de estos dirigidos 2020), y disminución de la carga viral y protección al tejido
hacia proteínas o receptores sobre-expresados en las células afectado en modelo in vivo (Tabla II).
Tabla II. Potencial de Aplicación Nanoanticuerpos.
Anticuerpos de Metodología de
un solo dominio y Antígeno Selección- Despliegue en Potencial de aplicación Referencias
Nanoanticuerpos fago
Cáncer
Moléculas de adhesión Biblioteca inmune- Roshan et al.,
Nb4 Agente terapéutico
de células epiteliales camello 2021
Biblioteca inmune- Receptor de células T
VHH-28z RFCVE Hajari et al., 2019
camello terapéuticas
Agente terapéutico dirigido
Biblioteca inmune- hacia cáncer de pulmón,
Nb@IC-NPs EGFR Zhang et al., 2020
camello inhibe metástasis y
destruye tumor primario
Agente terapéutico contra De Groof et al.,
Viral GPCR US28 GPCR Biblioteca inmune-llama
glioblastoma 2019
Agente terapéutico contra Sadeghi et al.,
anti-VEGF VEGF Biblioteca inmune-llama
cáncer metastásico 2020
Agente terapéutico contra Hassani et al.,
NBPII-CAR IL-2 y CD25 Biblioteca inmune-llama
cáncer de próstata 2020
Nanoanticuerpo- Agente terapéutico contra
HER2 Biblioteca inmune-llama Deken et al., 2020
(PS) cáncer de mama HER2+
Enfermedades de origen infeccioso
Biblioteca inmune- Tratamiento profiláctico en Kalusche et al.,
VHHA6 Proteína Env de VIH-1
camello mucosas 2020
Biblioteca de origen Neutralización de infección
VH ab8 RBD-SARS-CoV-2 Li et al., 2020
humano por SARS- Cov-2
Nb21 Neutralización de infección
RBD-SARS- CoV-2 Biblioteca inmune-llama Xiang et al., 2020
Nb20 por SARS- Cov-2
2TCE39 Antígenos secreción Identificación específica de Morales et al.,
Biblioteca inmune-llama
1TC39 Toxocara canis (ASTC) ASTC 2019
10 Pf12p, proteína de Dietrich et al.,
Biblioteca inmune-alpaca Identificación funcional
Nanoanticuerpos Plasmodium falciparum 2021
Adhesina, factor de Amcheslavsky
2R215 Biblioteca inmune llama Tratamiento profiláctico
colonización de E. coli. et al., 2021
VHHS: D12/11B5 BoNT/A1 Neutralización efecto
Biblioteca inmune-alpaca Lam et al., 2020
H11/20/G12 BoNT/B1 tóxico
HLA-A*0201
/Ag85Bp299-207 de Biblioteca de origen Identificación de células
2C Ortega et al., 2020
Mycobacterium humano infectadas con M. tb
tuberculosis
Industria
Biblioteca sintética Identificación de alérgeno
Nb16 Ara h 3** Chen et al., 2019
VHH*** en alimentos
Identificación de A.
V2-5 desplegado en Aspergillus flavus/ Biblioteca
flavus/parasiticus, en los Ren et al., 2020
fago parasiticus Inmune-alpaca
alimentos
Tabla II. Potencial de Aplicación Nanoanticuerpos (continuación).
Anticuerpos de Metodología de
un solo dominio y Antígeno Selección- Despliegue en Potencial de aplicación Referencias
Nanoanticuerpos fago
Detección de la toxina
Toxina Cry1Ie de Biblioteca de origen
3C3 (bioinsecticida) en Xu et al., 2017
Bacillus thuringiensis humano
muestras agrícolas
Péptido relacionado
Inmunoensayo para
dAb8E-desplegado con la producción Biblioteca de origen García-García et
detección de gluten en
en fago de anticuerpos en la humano al., 2020
alimentos
enfermedad celíaca
Salmonella enteritidis Biblioteca inmune- Detección de
Nb13, Nb16, Nb22 He et al., 2020
inactivada en formalina camello S. enteritidis en leche
Inmunosensor
Oloketuyi et al.,
Epítopo superficial de electroquímico para
C1 Biblioteca inmune-llama 2020; Mazzega et
Alexandrium minutum detección de la microalga
al., 2019
tóxica A. minutum
Aprobado por FDA
Prevención de la
Holliefield et al.,
Caplacizumab Factor Von Willebrand Biblioteca inmune-llama trombosis en púrpura
2020
trombocitopénica
Abreviaturas: M. tb: Mycobacterium tuberculosis; RFCVE: Receptor del Factor de Crecimiento Vascular Endotelial; **ARAh3: Proteína Alergénica
identificada en cacahuate; ***VHH: dominio variable de anticuerpo de cadena pesada de camello-humanizado; EGFR: receptor del factor de crecimiento
epidérmico; GPCR: receptor acoplado a proteínas G; HER2: receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2; IL-2: interleucina 2; VEGF:
factor de crecimiento endotelial vascular; PS: photosensitizer (fotosensibilizador); BoNT/A1-B1: Neurotoxina Botulínica A1/B1; FDA: Food and
Drug Administration.
Por sus características estructurales, ofrecen el reconocimiento Otra estrategia recientemente explorada, es su capacidad para
necesario para diferenciar antígenos de secreción altamente identificar células infectadas por microorganismos persistentes
similares entre especies de un mismo género, situación frecuente como Mycobacterium tuberculosis, mediante la identificación de
entre algunos parásitos causantes de zoonosis o infección en péptidos plegados con las moléculas de presentación antigénica
humanos (Morales et al., 2019). clase I (Dass, Norazmi, Acosta, Sarmiento & Tye, 2020; Ortega
et al., 2020).
Se han propuesto como vehículos de una toxina para inducir la
muerte parasitaria (Baral et al., 2006), diagnóstico serológico y Nanoanticuerpos para la Industria
seguimiento de la infección (Pinto Torres et al., 2018; Deckers Por otro lado, la efectividad que ejercen los Nac al aplicarlos
et al., 2009). se extiende hasta la industria agrícola y de los alimentos,
donde se han desarrollado como herramientas de identificación
Su tamaño reducido también ha permitido evaluar estrategias y detección de las toxinas producidas por microorganismos
para combatir microorganismos intracelulares, al dirigir su como las bacterias y los hongos principalmente. Por ejemplo,
reconocimiento hacia sistemas de secreción ampliamente usados las micotoxinas de Aspergillus flavus (Ren et al., 2020), y la
como factores de virulencia en bacterias (Zhang et al., 2021). producida por Bacillus thuringiensis, que se han utilizado como
un bio-insecticida efectivo para el control de plagas agrícolas
Diversos grupos de investigación han explorado el uso de (Xu et al., 2017). Para el año 2022, en Estados Unidos se
bacterias que son parte de la microbiota como vehículos de los espera el lanzamiento del primer biofungicida con el nombre
Nac, expresados en superficie o secretados. Su aplicación va “Biofun-1”, el cual combina el reconocimiento de los Nac y
enfocada a neutralizar el efecto de las toxinas producidas por antifúngicos contra Botrytis cinerea (Njeru & Kusolwa, 2021).
algunas bacterias como Clostridium difficile. Con el objetivo Empresas como Biotalys www.biotalys.com y el Institute for
de proponer tratamientos que puedan ser administrados vía Agricultural, Fisheries and Food Research ILVO www.ilvo.
oral (Andersen et al., 2015) o aplicados en mucosas, actuando vlaanderen.be, exploran el uso de los Nac en cultivos, con el
como barrera de ingreso a la infección (Kalusche et al., 2020). objetivo de optimizar y mejorar la calidad de los alimentos.
Los Nac también se han utilizado en inmunoensayos para detectar Adicionalmente, los Nac también se han desarrollado como
a patógenos transmitidos por alimentos (He et al., 2020; Hu et antivenenos, capaces de neutralizar o disminuir los efectos
al., 2021), así como a los alérgenos del cacahuate (Chen et al., de las mordeduras de serpientes (Bailon et al., 2020) o de las
2019) y de los cereales (García-García, Madrid, González, García picaduras de los arácnidos (Tabla II). En la Figura 4, se observa
& Martín, 2020). Además, se han creado inmunosensores para su potencial aplicación de forma esquemática.
identificar a las microalgas tóxicas que afectan a la industria
pesquera y turística (Oloketuyi et al., 2020; Mazzega, Beran, Finalmente, el Nac bivalente humanizado Caplacizumab
Cabrini & Marco, 2019). (Hollifield, Arnall & Moore, 2020), fue el primer anticuerpo
Figura 4. Esquema del potencial de aplicación de los Nanoanticuerpos: Sus características fisicoquímicas les permiten actuar como
herramientas de estudio en el cáncer: mediante la identificación específica de tejido tumoral y su potencial inmunoterapéutico; en las
enfermedades causadas por microorganismos: con diagnóstico y potencial neutralizante tanto del agente causal como de sus factores
de virulencia; en el acoplamiento y optimización de técnicas como inmunoensayo, imagenología, citometría de flujo y microscopía de
fluorescencia; y en el área industrial mediante la identificación de alérgenos, microorganismos y toxinas en alimentos. Abreviaturas: HER2:
Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico humano 2; IFN-γ: Interferón gamma; IL-2: interleucina 2; VEGF: factor de crecimiento
endotelial vascular; VHH: Nanoanticuerpos; TCR: Receptor de Células T. Elaboración personal (“Creado con Biorender.com”).
con este formato en ser aprobado por la FDA (del inglés, Food Referencias
and Drug Administration) y la EMA (del inglés, European Amcheslavsky, A., Wallace, A. L., Ejemel, M., Li, Q., McMahon,
Medicines Agency). Su mecanismo de acción consiste en C. T., Stoppato, M., Giuntini, S., Schiller, Z. A., Pondish, J.
impedir la interacción del factor von Willebrand y las plaquetas, R., Toomey, J. R., Schneider, R. M., Meisinger, J., Heukers,
para disminuir la formación de trombos. La administración R., Kruse, A. C., Barry, E. M., Pierce, B. G., Klempner,
subcutánea de Caplacizumab actúa como un tratamiento de M. S., Cavacini, L. A. & Wang, Y. (2021). Anti-CfaE
la Púrpura Trombótica Trombocitopénica adquirida, que en nanobodies provide broad cross-protection against major
combinación con la terapia actual, incrementó la resolución pathogenic enterotoxigenic Escherichia coli strains, with
de la enfermedad y la disminución de los casos recurrentes implications for vaccine design. Scientific Reports, 11(1),
(Jovčevska & Muyldermans, 2020). 2751. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-021-81895-0
Andersen, K. K., Strokappe, N. M., Hultberg, A., Truusalu,
Los Nac, a pesar de ofrecer ventajas con respecto a los anticuerpos K., Smidt, I., Mikelsaar, R. H., Mikelsaar, M., Verrips, T.,
convencionales, también han mostrado ciertas limitaciones para Hammarström, L. & Marcotte, H. (2015). Neutralization
su aplicación y desarrollo. Un estudio de biodistribución en of Clostridium difficile Toxin B Mediated by Engineered
ratones identificó su acumulación a nivel renal, lo que limitaría Lactobacilli That Produce Single-Domain Antibodies.
su uso para la evaluación de blancos en órganos cercanos al Infection and Immunity, 84(2), 395–406. DOI: https://doi.
riñón, por ejemplo, el páncreas; sin embargo, el hígado y el bazo org/10.1128/IAI.00870-15
no presentaron problemas de acumulación (De Vos, Devoogdt, Bailon, H., Yaniro, V. O., Cáceres, O. A., Colque, E. G., Leiva,
Lahoutte & Muyldermans, 2013). Su formato monomérico es W. J., Padilla, C., Montejo, H., García, D., Galarza, M.,
idóneo para la aplicación en estudios de imagenología; sin Bonilla, C., Tintaya, B., Ricciardi, G., Smiejkowska, N.,
embargo, bajas concentraciones de su antígeno en sangre y su Romão, E., Vincke, C., Lévano, J., Celys, M., Lomonte, B.
corto tiempo de vida, pueden ser factores que afecten de forma & Muyldermans, S. (2020). Development of nanobodies
negativa su aplicación terapéutica (Jovčevska & Muyldermans, against hemorrhagic and myotoxic components of Bothrops
2020). Otro factor a tener en cuenta, es que los Nac de origen atrox snake venom. Frontiers in Immunology, 11, 655. DOI:
cien por ciento de procedencia humana, si bien brindan una https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00655
mayor posibilidad de aplicación, no cuentan con las mismas Baral, T. N., Magez, S., Stijlemans, B., Conrath, K.,
cualidades estructurales típicas de los derivados de anticuerpos Vanhollebeke, B., Pays, E., Muyldermans, S. & De
de cadena pesada. En cuanto a su desarrollo, se ha reportado la Baetselier, P. (2006). Experimental therapy of African
pérdida del reconocimiento hacia la molécula blanco después de trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human
separar a los Nac de su plataforma de selección (fago, levadura trypanolytic factor. Nature Medicine, 12(5), 580–584. DOI:
etc.), o debido a mutaciones presentes en su secuencia (Ortega https://doi.org/10.1038/nm1395
et al., 2020). Disminuyendo las posibilidades de encontrar un Bridoux, J., Neyt, S., Debie, P., Descamps, B., Devoogdt, N.,
Nac con el reconocimiento esperado. Cleeren, F., Bormans, G., Broisat, A., Caveliers, V., Xavier,
C., Vanhove, C. & Hernot, S. (2020). Improved Detection
Conclusiones of Molecular Markers of Atherosclerotic Plaques Using
El avance acelerado en el desarrollo biotecnológico de los últimos Sub-Millimeter PET Imaging. Molecules, 25(8), 1838.
años, y la necesidad de generar alternativas a los tratamientos DOI: https://doi.org/10.3390/molecules25081838
y métodos de diagnóstico actuales, se acopla muy bien a las Chen, F., Ma, H., Li, Y., Wang, H., Samad, A., Zhou, J., Zhu,
propiedades fisicoquímicas de los Nanoanticuerpos. L., Zhang, Y., He, J., Fan, X. & Jin, T. (2019). Screening of
Nanobody Specific for Peanut Major Allergen Ara h 3 by
Los anticuerpos de un solo dominio o Nanoanticuerpos, ofrecen Phage Display. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
un panorama altamente versátil que permite su exploración 67(40), 11219–11229. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.
y evaluación como herramientas de aplicación biomédica, jafc.9b02388
industrial, biofarmacéutica, diagnóstica y terapéutica para Cortez-Retamozo, V., Backmann, N., Senter, P. D., Wernery, U.,
enfermedades de diferentes orígenes. De Baetselier, P., Muyldermans, S. & Revets, H. (2004).
Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate.
Agradecimientos Cancer Research, 64(8), 2853–2857. DOI: https://doi.
Paola Andrea Ortega-Portilla estudiante del Programa de org/10.1158/0008-5472.can-03-3935
Doctorado en Ciencias Bioquímicas, de la Universidad Nacional Dass, S. A., Norazmi, M. N., Acosta, A., Sarmiento, M. E.
Autónoma de México (UNAM) agradece la beca (707238) & Tye, G. J. (2020). TCR-like domain antibody against
al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). Mycobacterium tuberculosis (Mtb) heat shock protein antigen
Enrique Wenceslao Coronado-Aceves agradece a la Dirección presented by HLA-A*11 and HLA-A*24. International
General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) de la Journal of Biological macromolecules, 155, 305–314. DOI:
UNAM por su beca para estancia posdoctoral. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.03.229
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Targeted Photodynamic Therapy Selectively Kills Viral Gao, H., Wu, Y., Shi, J., Zhang, X., Liu, T., Hu, B., Jia, B.,
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Nanoanticuerpos: Desarrollo Biotecnológico y Aplicaciones: Publicación Continua

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© 2021 Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza.

Nanoanticuerpos: desarrollo biotecnológico y aplicaciones

Paola Andrea Ortega-Portilla1*, Laura Cancino-Villeda1,2,

Nanobodies: Biotechnological development and applications

Artículo recibido el 29 de junio del 2021.

Introducción opción para su desarrollo y aplicación en diversas áreas,

La construcción de bibliotecas naïve, no inmunes, toma Técnicas de despliegue de Nanoanticuerpos en fagos,

Tabla I. Bibliotecas de Nanoanticuerpos.

Tabla II. Potencial de Aplicación Nanoanticuerpos.

Tabla II. Potencial de Aplicación Nanoanticuerpos (continuación).

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