Técnicas Analíticas Instrumentales HPLC

Serie 11: Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

Problema 1. Describa un esquema general de un equipo de HPLC.

Problema 2. ¿Qué requisitos deben cumplir los reservorios de solvente? ¿Qué cuidados es
necesario tener con las fases acuosas? ¿Qué función cumplen los filtros de entrada de
solvente?

Problema 3. ¿Qué función cumple la válvula de mezcla de solventes? ¿Cómo funciona?

Problema 4. ¿Qué requisitos debe cumplir una bomba de HPLC? ¿Qué tipos de bombas
existen? ¿Cuáles son las más comunes?

Problema 5. En el esquema que si indica a continuación se representa una bomba recíproca con
mezcla de gradientes a baja presión y a alta presión.

Bomba de mezclado en baja presión:

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Bomba de mezclado en alta presión:

a) ¿Cuál es el rango de caudales que cada bomba puede desarrollar?

b) ¿Cuál es la diferencia de construcción de este tipo de bombas?
c) Comente las características generales de cada una de ellas.
d) ¿Qué función cumple el damper (amortiguador)?.
e) ¿Qué requisito adicional debe tener una bomba que va a ser utilizada con soluciones de alto
contenido salino (por ej. buffers)?
f) ¿Qué función cumple la cámara de vacío representada en el esquema de la bomba de baja
presión? ¿Qué otras alternativas de desgasificación pueden utilizarse?

Problema 6. Describa el funcionamiento de un inyector manual. ¿Qué es el loop (bucle) de

inyección?

Problema 7. Defina que se entiende por:

a) límite de detección.
b) límite de cuantificación.
c) linealidad
d) selectividad
e) ¿Qué relación existe entre los conceptos antes definidos y las características
de un detector ideal?.

Problema 8.
a) Comente las diferencias de funcionamiento de un detector UV-VIS convencional, y un
detector UV-VIS por arreglo de diodos (PAD).

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b) ¿Qué ventajas adicionales presenta el detector PAD?

c) A continuación se representa un gráfico de isoabsorbancia obtenido con un detector PAD.
Explique qué se grafica y que información puede obtenerse de este gráfico.

Problema 9. El cromatograma que se indica a continuación representa la separación de 12

antibióticos diferentes. La corrida cromatográfica se hizo con un detector PAD leyendo en el
rango 220 – 400 nm. Se presentan los cromatogramas correspondientes a tres longitudes de
onda diferentes (275, 315 y 370 nm).

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a) Indique la longitud de onda más adecuada si quisiera cuantificar nicarbazin en presencia del
resto de los antibióticos.
b) ¿Qué longitud de onda utilizaría para cuantificar benzothiazuron en presencia de ethopabat?
c) ¿Qué utilidad representaría contar con el gráfico de isoabsorbancia de esta corrida?

Problema 10. Explique el principio de funcionamiento de un detector de fluorescencia para

HPLC:

Problema 11. El análisis de moléculas aromáticas polinucleares (PAH) en entornos naturales es

importante dadas las propiedades toxicológicas de estas moléculas. Estos analitos en general
presentan fluorescencia. A continuación se indica el cromatograma por HPLC de una serie de
quince sustancias PAHs analizadas en un equipo con un detector de fluorescencia.
En el primer cromatograma se ha programado una tabla de eventos de tiempo para el detector
que es la siguiente:

1. Ex/Em = 260/420 nm
2. Ex/Em = 260/440 nm
3. Ex/Em = 260/420 nm
4. Ex/Em = 260/440 nm
5. Ex/Em = 260/500 nm

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En base a los datos del cromatograma siguiendo el criterio de aumento del límite de
cuantificación, justifique esta tabla de eventos de tiempo.

Problema 12. Explique el principio de funcionamiento del detector de índice de refracción, del
detector ELSD, y del detector electroquímico. Indique para qué tipo de moléculas se aplican.

Problema 13. i) Seleccione el detector que le parezca más apropiado para cada uno de los casos
que se indican a continuación. Justifique su respuesta.

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ii) Haga un cuadro comparativo que describa las características de cada uno de los detectores
de HPLC.

Problema 14. Respecto del modo elegido (tipo de columna y solventes de elución) para resolver
un problema cromatográfico por HPLC existen cuatro grandes modos cromatográficos:
-Cromatografía de adsorción.
-Cromatografía de reparto (en fase normal y en fase reversa).
-Cromatografía de intercambio iónico.
-Cromatografía de exclusión por tamaño (permeación sobre geles y filtración sobre geles).
a) Indique el principio de funcionamiento de cada modo cromatográfico.
b) ¿Qué solventes se usan en cada uno de ellos?
c) ¿En qué casos se utiliza cada modo cromatográfico?
d) Indique los formatos de columnas cromatográficas más habituales.(largos, diámetros
internos, tamaño de partícula).
e) ¿Qué es una precolumna?. ¿Qué función cumple?
f) ¿Cuál es la diferencia entre una fase sólida y una fase ligada?

Problema 15. El modo cromatográfico puede ser elegido en función de la naturaleza de la

muestra aplicando los criterios del siguiente árbol de decisiones:

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Proponga un modo cromatográfico para las siguientes mezclas:

a) mezcla de proteínas de pesos moleculares aproximados 40.000, 57.000 y 120.000 u.
b) ATP + ADP + AMP + Adenosina.
c) el producto de la reacción de polimerización de una pintura látex.
d) Acido benzoico + Acido 4-metilbenzoico + Acido 4-clorobenzoico

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e)

Problema 16. Se presenta a continuación un cromatograma de una mezcla de ácidos grasos de

estructura general CH3(CH2)nCOOH.
a) Indique que modo cromatográfico se está utilizando. Justifique.
b) Explique el orden de elución observado.
c) ¿Por qué se utiliza un detector ELSD?
d) ¿Cómo se modificaría el cromatograma si el flujo fuera 1 mL/min?
e) ¿Cómo se modificaría el cromatograma si en vez de acetonitrilo se usara metanol como
solvente B?

Problema 17. Los cromatogramas presentados a continuación describen el comportamiento

cromatográfico de una serie de azúcares cuando se utiliza una columna de fase ligada en modo
fase normal (la columna es polar, está derivatizada con grupos amino) eluyendo con mezclas
acetonitrilo : agua

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a) Busque la estructura de la fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa, lactosa y rafinosa.

b) ¿En qué consiste un análisis isocrático?
c) ¿En qué consiste un análisis con gradiente de solventes?
d) Justifique las diferencias de los tiempos de retención en uno y otro caso.

Problema 18. Los cromatogramas que se indican a continuación representan corridas de una
serie de sustancias en una columna de fase reversa C8 y una columna de fase reversa C18 del
mimo largo y utilizando el mismo sistema de solventes de elución

Sustancia k cromatograma A (C8) k cromatograma B (C18)

1. uracilo - -
2. piridina 0.86 1.26
3. fenol 0.59 0.71
4. N, N-dimetilanilina 1.52 2.72
Ácido 4-butilbenzoico 1.49 2.75
Tolueno 1.88 3.61

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Columna fase reversa C8 Columna de fase reversa C18.

a) Justifique el orden de elución en ambas columnas.

b) Justifique las diferencias entre los tiempos de retención de ambas columnas.
c) ¿Cómo podría solucionar la asimetría del pico 2 (piridina)?

Problema 19. Se quiere hacer una determinación cuantitativa de vitaminas hidrosolubles

(ácido ascórbico, niacina, tiamina y riboflavina) en una matriz acuosa. Proponga la metodología
analítica a utilizar (modo cromatográfico, tipo de columna y sistema de solventes).

Problema 20. Se quiere hacer una determinación analítica del contenido de cafeína y aspirina
(ácido acetilsalicílico) de una tableta de analgésico. Proponga una metodología analítica.

Problema 21. Se quiere determinar si un atleta ha consumido esteroides anabólicos. Proponga

una metodología analítica.

Problema 22. Se necesita optimizar un método por HPLC para determinar en forma conjunta
fenol y ácido benzoico. Se utilizó un sistema con un detector UV visible y una columna
Spherisorb ODS (octadecilsilano). En las figuras se muestran los resultados obtenidos
trabajando con distintos eluyentes, todos mezclas de metanol y agua con diferente pH.
1) Explique claramente el efecto del aumento del % de metanol en el eluyente, sobre el
tiempo de retención para cada sustancia a pH = 3.
2) Explique el efecto del cambio de pH para un eluyente con 50% de metanol
3) De todas las condiciones anteriores: ¿cuál le parece la mejor? Calcule la resolución de los
picos para ese caso (¿es adecuada?).

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Datos: pKa (benzoico) = 4,2 pKa (fenol) = 9,2

Problema 23. La determinación de colorantes en alimentos y productos farmacéuticos puede

llevarse a cabo eficientemente con HPLC en fase reversa utilizando un detector UV-visible de
arreglo de diodos. El problema que aparece habitualmente está relacionado con la gran
polaridad de los colorantes sulfonados. En estos casos suelen aparecer “colas” que dificultan la
identificación e integración de los picos. En el ejemplo se estudian los colorantes de la tabla
utilizando distintos eluyentes.

Pico Compuesto Nº grupos

sulfónicos
1 Tartracina 2
2 Amaranto 3
3 Ponceau 4R 3
4 Sunset Yellow 2
5 Scarlet Red 0
6 Eritocina 0

Condiciones:
Columna: Hypersil BDS (C18), 125 x 3 mm
Flujo: 0,8 mL/min
Temperatura: 40 ºC
Volumen de inyección: 1 μL

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Fase móvil A:
A: 0,01 M NaH2PO4 + 0,001 M (TBA)H2PO4 , pH=4,2 (TBA= tetrabutil amonio)
B: Acetonitrilo (ACN)
Gradiente: comienza con 15% ACN, a los 10 min 40%, a los 14 min 90% hasta los 19 min. A los
20 min vuelve a 15% ACN.

Fase móvil B:
A: 0,01 M NaH2PO4 + 0,001 M (TBA)HSO4 , pH=4,8
B: Acetonitrilo (ACN)
Gradiente: comienza con 15% ACN, a los 10 min 40%, a los 14 min 90% hasta los 19 min. A los
20 min vuelve a 15% ACN.

Fase móvil C:
A: 0,01 M NH4AcO, pH = 4,9
B: Acetonitrilo (ACN)
Gradiente: comienza con 7% ACN, a los 10 min 40%, a los 14 min 90% hasta los 19 min. A los 20
min vuelve a 7% ACN.

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Fase móvil D:
A: 0,01 M NaH2PO4 , pH = 4,3
B: Acetonitrilo (ACN)
Gradiente: comienza con 7% ACN, a los 10 min 40%, a los 14 min 90% hasta los 19 min. A los 20
min vuelve a 7% ACN.

i) ¿Cuáles condiciones dieron mejores resultados?

ii) ¿Cómo afecta el número de grupos sulfónicos en la calidad del cromatograma?
¿Por qué?
iii) ¿Cuál es la función de las sales de amonio cuaternario?

A continuación se presentan los espectros de absorción de algunos colorantes y cromatogramas

de colorantes de alimentos y fármacos, determinados utilizando un detector de arreglo de
diodos; con condiciones de corrida similares a las del ítem anterior. Indique a que longitud de
onda se detectó cada cromatograma.

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Problema 24. Se desarrolló un método por HPLC en fase reversa para determinar compuestos
aromáticos policíclicos típicamente presentes en el humo del cigarrillo. Se realizan
experimentos con un equipo con columna no polar (Phenomex Envirosep-PP) conectada en

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serie con un detector de fluorescencia HP1046A. El solvente de elución consiste de agua:

acetonitrilo:THF en relación 50:40:10. A los 4 minutos de la inyección se aplica un gradiente
lineal de solventes que llega a una relación final 90:10 de acetonitrilo:THF.
La Figura 1 muestra algunos de las posibles sustancias presentes. La figura 2 muestra resultados
obtenidos usando diferentes condiciones de λ de excitación y emisión. La figura 3 muestra el
cromatograma de una muestra proveniente de humo de cigarrillo (λexc= 288 nm, λems= 405 nm).

1) ¿Cómo se explica el orden de elución?

2) ¿Por qué se utiliza un gradiente de solventes?
3) ¿Cómo podría mejorar la resolución entre 14 y 15 en la figura 1c?
4) ¿Qué especies puede detectar en la muestra?

En las condiciones en que se detectó la muestra, puede garantizar que no hay fenantreno?
¿Cómo operaría el detector para determinar fenantreno con buena sensibilidad?

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Respuestas:

19.

20.

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21.

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