TEMA 2: TÉCNICAS ANALÍTICAS AVANZADAS.

ELECTROFORESIS CAPILAR.
Es una técnica de separación donde las sustancias que vamos a analizar se van a separar en función de la velocidad de
migración de las especies cuando aplicamos un campo eléctrico.
La electroforesis convencional se ha usado para separar sustancias iónicas o que se pueden ionizar en determinadas
condiciones de análisis. Generalmente se ha aplicado esta técnica de separación para separar cationes o aniones inorgánicos,
péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc. Con el paso de los años el campo de aplicación ha aumentado y ya no solo sirve
para compuestos cargados.
ANTECEDENTES HISTÓRICOS.
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En 1897, F. Kohlrausch estudió las propiedades de compuestos cargados en medios acuosos y describió ecuaciones para
estudiar el movimientos. Este estableció un perfil hidrodinámico de las especies cargadas en disolución. Pero, hasta 1937 no
se establecieron las bases de la electroforesis, A. Tiselius inventó un aparato en el que situó una muestra de proteínas entre
dos disoluciones tampón en un tubo y aplicó un campo eléctrico. Este encontró que los componentes de la muestra
migraban a una velocidad que era dependiente de la carga, masa y modalidad.

Las separaciones mediante electroforesis tradicional han sido y siguen siendo muy eficaces en el área de biología para la
separación, aislamiento y análisis de proteínas, biopolímeros y polinucleótidos, pero se ha visto que esta técnica presenta
algunos inconvenientes: metodologías lentas, procesos laboriosos y muchas veces los análisis son poco reproducibles y la
técnica es difícil de automatizar.
Para solventar estos problemas en 1967, S. Hjerten comenzó a utilizar pequeños tubos capilares con un pequeño diámetro
como celdas electroforéticas. En 1981, J.Jorgenson estableció el término de electroforesis capilar cuando utilizó los tubos
capilares como celdas electroforéticas. Es cuando se establecieron las bases de esta técnica.

CARACTERÍSTICAS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR.

• Se lleva a cabo en pequeños tubos capilares con un diámetro pequeño. Esto hace que se apliquen campos eléctricos de
hasta 30 kV.
• En la actualidad se emplean capilares de sílice fundida recubiertos de poliimida que le confiere al capilar buena
flexibilidad y hace que no se rompa. La longitud está comprendida entre 30-100 cm y el diámetro está entre 20-100 mm.
• El que podamos usar estos capilares hace que la velocidad de separación sea elevada porque podemos aplicar voltajes
elevados.
• En términos de eficacia (tiene que ver con la obtención de picos estrechos), se puede obtener una alta eficacia debido a
la utilización de estos capilares porque cuando estamos aplicando un alto voltaje se genera mucho calor que en el capilar
se disipa y hace que no se produzcan ensanchamientos en las bandas (1-5.105 platos).
• Podemos utilizar volúmenes de muestra pequeños del orden de nL (1-10 nL) y se requiere una mínima cantidad de
reactivos.
• Gran versatilidad en cuanto a modos de operación y campo de aplicación.
• Se puede automatizar fácilmente.
ASPECTOS TEÓRICOS.
Consideramos que tenemos en solución acuosa un ion con una carga q 1. Suponemos que este ion está en disolución infinita
por lo que no hay interacciones de tipo iónico.

Se aplica un campo eléctrico en el seno de la disolución, por lo que el compuesto se va a ver acelerado porque hay una fuerza
eléctrica en el medio que va a ser proporcional al campo eléctrico.
Al estar en disolución acuosa este va a tener un coeficiente de viscosidad y va a existir una fuerza de rozamiento que va a ser
opuesta a la fuerza eléctrica, esta va a depender del coeficiente de viscosidad, de la velocidad del ion y de la constante de
proporcionalidad. De acuerdo con la ley de Stokes esta constante de proporcionalidad para partículas esféricas tiene un valor
de 6πri, si se sustituye en la fuerza de rozamiento esta también va a estar influenciada por el radio aerodinámico del ion.

Si la aceleración causada por la fuerza eléctrica se ve compensada por la fuerza de rozamiento se alcanza un estado de
equilibrio y las fuerzas van a ser iguales, al igualarlas se puede establecer la velocidad de migración de la especie que es
proporcional al campo eléctrico aplicado. La constante de proporcional se denomina movilidad electroforética absoluta, esta
se puede decir que es la velocidad por unidad de campo eléctrico. Tanto la velocidad como la movilidad electroforética
absoluta pueden tener signo positivo o negativo dependiendo de la carga del compuesto. En el caso de la movilidad esta
también depende de la viscosidad y esta a su vez de la temperatura: al aumentar esta la movilidad aumenta porque varía el
coeficiente de viscosidad. La movilidad electroforética absoluta esta influenciada por la relación carga/radio, por lo que
partículas cargadas con un radio pequeño van a tener una movilidad mayor que aquellas partículas cargadas con un tamaño
mayor.
En la práctica el ion se va a encontrar en presencia de otras especies en un determinado medio, y va a haber otras
interacciones electrostáticas que van a afectar a la movilidad electroforética de este. El ion se va a ver rodeado de iones de
signo contrario denominados contraiones, estos forman lo que se denomina atmósfera iónica y en este caso van a ser los
responsables de la acción de dos fuerzas adicionales: la fuerza de retardo electroforético y la fuerza de efecto de relajación.
Retardo electroforético. Se produce porque el ion central no va a migrar en un medio estacionario, que es en el que nos
encontramos ahora (teoría de la Ley de Stokes). Estos contraiones van a tender a migrar en sentido contrario al ion central,
como consecuencia de ello la fuerza de rozamiento va a ser mayor. El resultado es que en este caso la movilidad va a
disminuir. Por otro lado, cuando mayor es la fuerza iónica del medio este efecto de retardo va a ser mayor.
Fuerza de efecto de relajación. A medida que ese ion migra por la aplicación de ese campo eléctrico, la fuerza iónica que se
ha generado como consecuencia del ion tiende a deformarse y esto va a conducir al efecto de relajación o de asimetría.
Existen fuerzas de Coulomb que van a intentar que la forma de la atmósfera iónica tienda a su estado original, es decir, van a
reconstruir esta forma. En esta reconstrucción la nube de la carga de ese ion va a aumentar en la parte delantera del ion y
disminuye en la parte posterior, en este proceso de reconstrucción el ion se va relajando y al ir relajándose su movilidad va
disminuyendo porque es una fuerza de sentido contrario. 3
Movilidad electroforética efectiva. En este caso vamos a tener en cuenta los dos efectos anteriores. Se sustituye qi por la
carga efectiva (Qefec) y el valor del radio iónico (ri) se sustituye por el valor del radio efectivo del ion (R) que tiene en cuenta la
atmósfera electrónica. La movilidad depende de la viscosidad y de estos dos efectos porque en el medio se encuentra
sometido a estas interacciones iónicas.
ELECTROOSMÓSIS.
El fenómeno de electroósmosis se produce cuando se aplica un campo eléctrico en un sistema líquido en contacto con una
superficie cargada. En disoluciones acuosas la mayoría de las superficies se encuentran con un exceso de carga por un
proceso de ionización, generalmente negativa, el cual puede ser debido a un equilibrio ácido-base o porque se produce
adsorción se especies iónicas sobre la superficie.
Se trabaja con capilares de sílice fundida que tienen grupos silanol que cuando se ionizan pueden dar lugar a grupos cargados
positiva o negativamente, o incluso neutros. Esto va a depender del pH del medio y del electrolito que vamos a usar en la
separación. Por ejemplo, el grupo silanol se ioniza, a pH mayores de 3 esta superficie se carga negativamente.

Tenemos el capilar cargado negativamente con una disolución acuosa. Se van a crear dos capas: una en la que los grupos
cargados negativamente van a ser neutralizados parcialmente por otros contraiones, se crea una capa inmóvil y, a
continuación, el remanente de carga negativa se va a neutralizar por un exceso de cationes solvatados y forman la doble
capa difusa. Si aplicamos un campo eléctrico en la superficie del capilar cargado estos contraaniones de la capa difusa
solvatados van a comenzar a moverse a través del capilar por la acción del campo eléctrico. Estos contraaniones solvatados
que migran con la acción del campo eléctrico van a ir arrastrando el agua en su movimiento, además como tenemos un
exceso de cationes solvatados el resultado final es un movimiento neto de la disolución hacia el cátodo, es decir, ocurre un
bombeo como efecto de la electroósmosis.

FLUJO ELECTROOSMÓTICO.
En este proceso de electroósmosis aparece un flujo neto que se denomina flujo electroosmótico. Este en ese caso es
prácticamente uniforme a lo largo de toda la disolución que va hacia el cátodo. La magnitud de este flujo electroosmótico se
puede expresar de dos formas: mediante la velocidad o la movilidad.
La velocidad viene expresada como el producto de la movilidad por el campo eléctrico, es proporcional a este.
En la movilidad interviene un factor que es el potencial ζ. El potencial ζ es un potencial eléctrico que se crea en una interfase
entre la doble capa difusa y la capa inmóvil. Este potencial va a depender del pH porque es el que va a marcar que la
superficie del capilar se cargue positiva o negativamente. Dependiendo del pH así será la magnitud del flujo electroosmótico.
Si el pH es muy alto tendremos cargas negativas, pero si este disminuye la superficie de la pared estaría cargada de forma
positiva. A pH altos la magnitud del flujo electroosmótico va a ser mayor.
Otro parámetro que condiciona mucho al flujo electroosmótico es la fuerza iónica del medio, si esta es muy elevada se va a
producir una compresión y va a disminuir la doble capa difusa. Si esta se comprime disminuye la magnitud del flujo
electroosmótico porque el potencial ζ va a ser menor.
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BENEFICIOS DEL FLUJO ELECTROOSMÓTICO.

Nos interesa el flujo electroosmótico porque presenta una serie de beneficios. En electroforesis capilar este es mayor que las
velocidades individuales de migración de los iones. Queremos que sea mayor para que arrastre todo hacia el cátodo porque
así conseguimos separar los cationes de los aniones de forma simultánea. Se consigue disminuir el tiempo de análisis porque
se pueden aplicar campos eléctricos elevados. Lo que nos interesa es obtener picos estrechos para mejorar la eficacia, el que
tengamos un adecuado flujo electroosmótico nos permite obtener un perfil de flujo plano.

PARÁMETROS DE CONTROL DEL FLUJO ELECTROOSMÓTICO.

Si este es muy elevado el tiempo de análisis es muy corto, pero se puede conseguir que la elución de los analitos sea tan alta
que no podamos separarlos, pero tampoco puede ser pequeño porque el tiempo sería muy largo y podríamos no eluir
ninguno. Los parámetros que tenemos que controlar son:
• Campo eléctrico. La velocidad del flujo electrosmótico depende de este.
• pH del tampón de separación. Hay que ajustar el pH del medio porque es el que va a marcar
la carga de la pared del capilar, cuanto mayor sea el pH vamos a tener más cargas negativas,
va a haber más densidad de carga y el potencial ζ va a ser mayor por lo que va a aumentar la
magnitud del flujo electrosmótico y, por tanto, la velocidad.
• Fuerza iónica del medio. Afecta al espesor de la doble capa difusa. Si aumentamos esta la
capa va a disminuir y va a disminuir el flujo electroosmotico porque se afecta el potencial ζ.
• Temperatura. Provoca cambios en la viscosidad del medio del electrolito que usamos para la separación, esto va a
afectar a la velocidad de flujo electroosmótico. A mayor temperatura se aumenta el flujo electroosmótico.
• Adición de disolventes orgánicos. Se usa para mejorar la separación. Afecta a la viscosidad, se ha visto que metanol,
etanol e isopropanol hace que se reduzca el flujo electroosmótico, mientras que el acetonitrilo lo aumenta.
• Recubrimiento de la pared interna del capilar. En este se hacen reacciones químicas con grupos covalentes para
modificar la pared del capilar. Esto se emplea para cosas más específicas.
Es importante estudiar estos parámetros cuando se pone a punto un método de separación.
ASPECTOS OPERACIONALES.
Vamos a considerar que tenemos una muestra con cationes, aniones y especies neutras. Se acondiciona el capilar y se deja
pasar tampón para asegurar que tenemos una carga negativa en el capilar. Después se inyecta la muestra y se aplica el
campo eléctrico en la muestra que hemos introducido en el capilar.
Las especies cargadas cuando se aplica la diferencia de potencial van a migrar a lo largo del capilar a una determinada
velocidad electroforética, que va a depender de la relación carga/radio y al final vamos a registrar un electroferograma. En
este podemos observar en primer lugar las especias cargadas positivamente más pequeñas, luego las de mayor tamaño,
luego las especies neutras con el flujo electroosmótico y, por último las especies cargadas negativamente. Cabe destacar que
cada especie tiene su tiempo de migración. Este electroferograma nos da información cualitativa y cuantitativa.

MOVILIDAD APARENTE.
El catión va a migrar en el mismo sentido que el flujo electroosmótico, entonces tendrá una movilidad aparente que viene
dada por la movilidad y el flujo electroosmótico. Los cationes tienen una movilidad electroforetica en el mismo sentido que el
flujo, pero las neutras no tienen movilidad propia, por eso en las especies neutras no hay pico en el electroferograma. En los
aniones la movilidad electroforética es contraria al flujo electroosmotico.

PARÁMETROS DETERMINANTES DE LA SEPARACIÓN.

Para obtener una separación adecuada y eficaz se tienen que controlar una serie de parámetros a la hora de establecer un
método de análisis. Cuando se pone a punto un método de separación por electroforesis capilar se quiere obtener un tiempo
razonable y se puede obtener información cuantitativa o cualitativa, pero antes hay que analizar unos parámetros para
comprobar que ese método es correcto.
TIEMPO DE MIGRACIÓN.
Tiempo que tarda el compuesto iónico en recorrer la longitud efectiva del capilar, va del extremo desde donde se introduce
la muestra a la ventana del detector. Ese parámetro lo podemos calcular a partir de los parámetros experimentales: voltaje
aplicado y longitud del capilar.
Velocidad aparentes es la movilidad aparente (movilidad de la especie iónica + movilidad del flujo electroosmótico) por el
campo eléctrico (voltaje/longitud total del capilar). El tiempo de migración, por su parte, viene definido como la longitud
efectiva del capilar entre la velocidad aparente. Este se puede poner en función del voltaje aplicado sustituyendo en la
velocidad aparente. Experimentalmente consideramos que longitud efectiva y longitud del capilar son iguales, por lo que l
tiempo de migración se calcula como L2/movilidad aparente por voltaje aplicado. A mayor voltaje los tiempos de migración
disminuyen.
EFICACIA.
La eficacia se mide como el parámetro N y está relacionado con el número de platos teóricos que se alcanzan dentro del
capilar de electroforesis. Se calcula con el tiempo de migración y la anchura de los picos. Cuanto más estrechos sean los picos
mayor es la eficacia. La eficacia se relaciona con el voltaje. Teniendo en cuenta la fórmula si consideramos que las longitudes
son iguales se relacionan, por lo que aumentando el voltaje aplicado se mejora la eficacia en un tiempo corto de análisis
(características importantes de esta característica). La altura de plato (H) se calcula como la longitud efectiva del
capilar/eficacia (N).

SELECTIVIDAD.
La selectividad es un factor que permite distinguir dos picos en el electroferograma. El valor de α que es la selectividad es la
capacidad de separar dos picos consecutivos, es decir, es la capacidad del sistema para separar dos compuestos próximos
entre sí y se puede calcular en función de los tiempos de migración y del flujo electroosmótico. Un valor adecuado de alfa
está entre 1-1,2.

RESOLUCIÓN.
Relacionado con el grado de separación de dos picos consecutivos. Nos indica lo bien separados que están dos compuestos. A
partir de los datos del electroferograma se establece la resolución: tiempo de migración/anchura de los picos (W). También
se puede calcular a partir de los datos experimentales: voltaje, movilidad electroforética de las especies y del flujo, longitud
efectiva del capilar y total. La D es el parámetro de la movilidad electroforética de los compuestos que vamos a separar. La
resolución aumenta con el voltaje aplicado, pero no aumenta igual que en la eficacia y en el tiempo de análisis porque está
elevado a ½.

¿Se puede incrementar el voltaje hasta un valor infinito? No se puede porque al aumentar un voltaje hasta un valor
excesivo se puede perder la linealidad respecto a la intensidad de corriente, podemos hacer que no se cumpla la ley de Ohm,
esto pasa a voltajes superiores a 30 kV.

INSTRUMENTACIÓN.
Un equipo de electroforesis tiene una fuente de alto voltaje, capilar, inyector tampón de separación, sistema de
termostatización y el detector.
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FUENTE DE ALTO VOLTAJE.

Tiene que ser una corriente continua que sea capaz de aplicar un voltaje comprendido ente 1-30 kV, además si es la
adecuada podemos dar intervalos crecientes o decrecientes de 0,1 kV. Tiene que proporcionar una fuente constante de
voltaje e intensidad, que no varie. Además, debe permitir cambiar la polaridad de los electrodos, generalmente se hace con
el software del equipo. Da una rampa de potencial, cuando se va a dar la separación los kV no se ponen de golpe, este voltaje
hay que darlo en forma de rampa de voltaje porque si se da de golpe puede ocasionar un calentamiento en el capilar de
forma rápida e instantánea y se produce una expansión del tampón de separación dentro del capilar que puede provocar que
se pierda la muestra que hemos inyectado.
SISTEMA DE INYECCIÓN.
Es un parámetro crítico porque debe tener la capacidad de introducir volúmenes muy pequeños de muestra que debe ser
proporcional al volumen total del capilar. Cuando se inyecta la muestra se debe hacer de forma eficaz y reproducible. Dentro
del capilar va a ocupar una longitud que va a ser un parámetro muy crítico, cuando se introduce la muestra se debe hacer en
forma de banda y esa banda tiene que ser lo más estrecha posible porque eso va a ayudar a que tengamos una eficacia y una
resolución adecuada en la separación. Generalmente, cuando se inyecta la muestra se intenta que sea un 1% de longitud
dentro del capilar, si inyectamos una cantidad mayor puede afectar negativamente sobre todo a la eficacia, los picos van a
ser muy anchos y se va a afectar la resolución. El método más empleado para inyectar una muestra es emplear uno de los
extremos del capilar, va a ser el propio inyector, de esta manera evitamos las válvulas de inyección que hacen que la muestra
se introduzca en forma de bandas anchas. La inyección se puede hacer de dos formas, en ambos casos se hace en los
extremos del capilar, no se usan válvulas:
Electrocinética. Reemplazando el vial donde tenemos el tampón de separación por el vial donde está la muestra, para ello se
aplica un voltaje durante un pequeño periodo de tiempo. Los analitos o componentes de la muestra entran dentro del capilar
de acuerdo con la movilidad electroforética y al bombeo del flujo eletroosmótico. Este tipo de inyección es discriminatoria
porque van a entrar los compuestos que sean más móviles, el capilar se va a cargar de las especies más móviles en
proporción a las especies menos móviles. La composición de la muestra original va a cambiar, por lo tanto va a ser una
inyección más selectiva porque se va a preconcentrar las especies más móviles. Estas son inyecciones menos reproducibles
porque cuando estamos inyectando la muestra va a variar la conductividad, lo que puede hacer que el campo eléctrico
difiera, lo que hace que varie la cantidad de muestra inyectada. Sin embargo, presenta dos ventajas: funciona bien en medios
muy viscosos y cuando se usan capilares rellenos de gel.

Hidrodinámica. Es de las que más se usan en electroforesis capilar, ya que es la más

ampliamente estudiada. Se realiza de tres formas: realizando presión en el extremo de
inyección del capilar, por succión por vacío aplicado a la salida del capilar o por gravedad por
lo que los viales están a diferente altura (efecto sifón). En cualquiera de ellos antes de hacer
la inyección tenemos el tampón, en la entrada se pone la muestra y en el otro extremo un
vial vacío y se aplica cualquiera de los métodos anteriores. Conseguimos inyectar un
pequeño volumen controlando el tiempo de presión, succión o de sifonado, pero esa presión
también va a depender de la viscosidad del medio y de las dimensiones del capilar. Cuando
estudiamos el parámetro de inyección hidrodinámica hay que controlar tiempo, viscosidad y
longitud y si se cambia de capilar el diámetro. Cuando estamos inyectando hay que
conseguir que sea una banda estrecha para conseguir buena eficacia y resolución.
CAPILAR.
Tiene que ser química y eléctricamente inerte, transparente a la radiación UV-visible, robustos, flexibles y baratos. El más
usado es el de sílice fundida que cumple casi todos los requisitos, menos la flexibilidad por lo que se recubren de una capa de
poliamida. Cuando se trabaja con los capilares se compra un rollo y los cortas, pero en el capilar hay que generar la ventana
de detección, para lo que hay que quitar la capa de poliamida, para ello se introduce el capilar dentro de una resistencia
eléctrica que quita esta capa, luego se limpia con etanol o acetona.

Esa ventana de detección es una zona crítica, ya que es por dónde se va a poder romper el capilar. Una vez que se ha
preparado el capilar hay que acondicionarlo: en primer lugar hay que introducirlo en una solución de sosa 1M durante un
tiempo, se pasa a otra solución 0,1% y, lo último es pasar por el tampón de separación. Este tampón debe tener un pH mayor
de 4 para mantener un buen flujo electroosmótico. Esta etapa de acondicionamiento hace que se eliminen los componentes
que se hayan adsorbido y obtener una buena pared del capilar que esté desprotonada y tenga una gran cantidad de cargas
negativas para que se produzca un buen flujo electroosmótico. Otra forma es pasar sosa al 0,1% durante 20 minutos, luego
tampón de separación y luego hay que hacer una separación sin aplicar voltaje.
Cuando se está trabajando hay que tener un cuidado especial, no hay que cambiar el tampón de separación porque pueden
cambiar las cargas de la superficie y si se usa sulfactante puede ocurrir lo mismo. Cuando se hacen separaciones seguidas hay
que realizar un lavado porque las cargas se van a ir modificando, por lo que se lava con sosa 0,1%. Cuando se acaba la
secuencia hay que almacenar el capilar en las condiciones adecuadas porque se pueden producir cristalizaciones debido a las
sales del tampón, por lo que se lava con agua y luego se pasa a aire.
SISTEMA DE TERMOSTATIZACIÓN.
Todos los equipos deben llevarlo porque la temperatura de separación influye en la viscosidad. Puede modificar la movilidad
de los iones y del flujo electroosmótico, entonces influye en la cantidad de muestra que vamos a inyectar. Los sistemas de
termostatización son por aire o líquido refrigerante.

TAMPÓN DE SEPARACIÓN.
Las características principales que debe cumplir son: el pH debe ser estable con la temperatura que se fija al realizar el
experimento, el pH debe ser elevado para que el flujo electroosmótico empuje las especies hacia el cátodo, alta capacidad
reguladora, baja conductividad eléctrica ya que influye en la movilidad, se trabaja con sistemas de detección UV-Visible por lo
que debe ser trasparente en estas franjas y no debe interferir en la separación. La composición del tampón de separación y,
por lo tanto, las variables de estudio son: pH, fuerza iónica del medio, concentración, conductividad que afecta a la movilidad
y aditivos que modifican la selectividad y se añaden al tampón de separación, estos pueden ser sulfactantes para formar
micelas.
TIPOS DE DETECTOR.
La electroforesis es parecida a la técnica del HPLC, tenemos un soluto que va a eluir por un conducto, pero hay una diferencia
grande entre las dos técnicas porque en la electroforesis la forma de los picos de elución afecta a la velocidad con la que llega
al detector. Es muy importante que el detector esté en columna, en el mismo capilar así se puede evitar efectos de
dispersión o ensanchamiento de la banda. Los detectores más empleados son los ópticos de absorción UV-Vis y
fluorescencia, aunque se usan también los amperimétricos y los de conductividad.
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SISTEMA DE DETECCIÓN UV-VISIBLE.

En el capilar tenemos la ventana de detección que se va a fabricar, se quita la capa de poliamida y se queda una zona
transparente (ventana de detección). El diseño del detector es un parámetro crítico porque el paso de luz a través del capilar
está limitado al pequeño diámetro del capilar. Cuando estudiamos la detección de estas especies se nos viene a la cabeza la
Ley de Lambert-Beer, para mejorar la sensibilidad y el intervalo de linealidad donde podemos estudiar la separación hay que
aumentar el paso óptico. Las posibilidades para aumentar la sensibilidad podemos dentro del equipo trabajar con el diseño
de z de esta forma se aumenta el paso óptico, con capilares de multireflexión, capilares de burbuja o capilares rectangulares.

Podemos trabajar con detectores de longitud de onda fija, de longitud de onda variable que emite en un rango amplio o
detectores de barras de diodos, esto depende del sistema comercial.

Si se trabaja con el último podemos obtener electroferogramas en 3D, si seleccionamos una longitud de onda obtenemos un
electroferograma y el espectro de absorción a un tiempo de detección determinado. De esta forma podemos trabajar con
una muestra que sea absorbente a diferentes longitudes de onda.
MODALIDADES. 10
ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA.
Es la más simple de todas las modalidades de estas técnicas de separación y es la más utilizada debido a la simplicidad de su
metodología y porque es muy versátil, pero no permite llevar a cabo la separación de compuestos neutros. El modo de
proceder es el siguiente, se introduce por el lado anódico del capilar en un vial que contiene el tampón de separación y el
lado catódico se introduce en un capilar vacío. Se aplica una presión o succión en el lado catódico para que por el lado
anódico entre el tampón de separación y de esta forma el capilar se va a rellenar uniformemente. Posteriormente, se debe
sumergir por el lado anódico del capilar en un vial que contiene la muestra y el lado catódico se sumerge en un vial con el
tampón de separación y se procede a realizar la inyección de la muestra de forma hidrodinámica o electrocinética.
Esta inyección se realiza durante un tiempo determinado (segundos) y una vez que se ha realizado, el capilar por el lado
anódico se introduce en el tampón de separación y se comienza la separación aplicando un determinado potencial que se
inicia con una rampa para que no se produzca una elevada temperatura en el sistema, así el tampón no se dilata y no hay
pérdidas de la muestra.
Una vez aplicado el potencial para que se de la separación, los diferentes componentes iónicos se mueven a lo largo del
capilar de acuerdo con su movilidad y se van a separar en forma de bandas. Si tenemos un buen flujo electroosmótico se va a
permitir la separación se aniones y cationes, los cationes van a migrar en la misma dirección que el flujo electroosmótico
hacia el lado catódico, si tenemos la misma carga los primeros en migrar van a ser los cationes que tengan menos tamaño, si
presentan diferente carga los primeros en migrar son los de mayor carga. Los aniones tienden a migrar al lado anódico, si hay
un buen flujo electroosmótico los va a arrastrar al lado catódico, si tienen la misma carga los aniones de mayor tamaño son
los que migran antes y si tienen diferente carga los de mayor carga son los que tienen tiempos de migración mayores. Los
compuestos no iónicos van a eluir con el flujo electroosmótico donde no somos capaces de separarlos.
Esta técnica se aplica en bioquímica para llevar a cabo la separación de proteínas.

CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR.

Los compuestos neutros no se pueden separar en la anterior, pero en este caso con el tampón de separación se emplearon
sulfactantes y se dio lugar a este tipo de electroforesis. Es una mezcla de cromatografía de partición con el efecto de la
electroósmosis. Esta técnica en lo que consiste es que tenemos el tampón de separación al que se adiciona un sulfactante a
una concentración superior a la concentración crítica micelar. A una determinada concentración de un determinado
sulfactante se forman agregados anfifilícos conocidos como micelas, un agregado es una agrupación de monómeros
constituidos por una cadena R y un grupo X. La cadena R es hidrocarbonado e hidrófoba y la parte X es la cabeza hidrofílica
constituida por un grupo polar. Cuando se supera la concentración crítica micelar los monómeros se agregan y se forman las
micelas.
 11
Dependiendo del tipo de cabeza hidrofílica los sulfactantes se pueden clasificar como: aniónicos, catiónicos, anfóteros o no
iónicos. En la tabla se muestran los más utilizados y su concentración crítica, el más utilizado en la electroforesis capilar es el
SDS. La característica principal de estos sulfactantes es que tienen la capacidad de autoasociación, en este caso lo hacen en
disolución acuosa y van a tener una estructura definida dependiendo del medio donde se dispersan y a qué concentración se
encuentran. Las micelas por encima de la concentración son esféricas, pero si la concentración es muy alta tienen forma de
elipse. En disolución acuosa los grupos polares de la micela van a estar orientados hacia la fase acuosa y la parte hidrófoba va
a estar hacia el interior. En lo referente a su uso en esta modalidad, a la hora de elegir un sulfactante nos fijamos si es soluble
en el tampón de separación, trasparente a la radiación UV y homogéneo y presenta baja viscosidad.

Cuando tenemos el tampón de separación y añadimos el sulfactante vamos a tener dos fases: una fase acuosa y una fase
micelar. Suponemos que vamos a inyectar en el sistema una muestra constituida por especies neutras, entonces a la hora de
aplicar el campo eléctrico, si tenemos una especie muy hidrofílica se va hacia el tampón de separación y sale al tiempo del
flujo electroosmótico, pero si es muy hidrofóbica va a tender a la micela y su tiempo de migración va a ser el tiempo de
migración de la micela. En las especies que están en la mitad, ni muy hidrofílicas ni muy hidrofóbicas, se da un equilibrio y su
tiempo de migración va a estar comprendido entre el tiempo del flujo y las micelas. La diferencia entre el tiempo de
migración de la micela y del flujo se denomina ventana de migración.

Para establecer cuál es el tiempo de la micela y cual el del flujo se usa una especie muy hidrofóbica como el Sudán IV que se
inyecta para establecer el tiempo de la micela y para establecer el tiempo de flujo se emplea una especie muy hidrofílica
como el metanol, así se establece la ventana de migración y luego se inyecta la muestra. De esta manera se establece el
tiempo de migración de las especies neutras estableciendo los equilibrios de partición.
Si tenemos especies cargadas estas se pueden separar en teoría porque depende de la constante de reparto y de la
movilidad. Las partículas neutras se mueven según el equilibrio entre las dos fases, pero las especies cargadas van a migrar
en función de la constante de reparto y su propia movilidad. A la hora de establecer un método de separación hay que
estudiar bien el sulfactante que se va a emplear para que haya un buen equilibrio de reparto entre la micela, el tampón de
separación y la movilidad del compuesto cuando no hay micela. Hay que ir a una situación de compromiso.
ELECTROFORESIS CAPILAR EN GEL.
En esta modalidad lo que se hace es rellenar el capilar con un gel que va a actuar como un tamiz molecular y la separación se
realiza en función del tamaño. Este gel que se usa para rellenar consta de tampón de separación y polímeros hidrofílicos
(poliacrilamida lineal, derivados de metilcelulosa, alcohol polivinílico). Este gel va a eliminar el flujo electroosmótico, por lo
que tampoco van a migrar las moléculas neutras, además este evita la adsorción de estos compuestos en la pared del capilar.
Es útil para separar en este caso macromoléculas con la misma relación masa/carga, la separación se hace por el tamaño.
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ISOELECTROENFOQUE CAPILAR.
Esta técnica es empleada para la separación de especies anfóteras como proteínas. La separación se hace en base a los
puntos isoeléctricos para lo que se emplea un gradiente de pH.
ISOELECTROENFOQUE CONVENCIONAL.
Se emplea un soporte de agarosa o poliacrilamida que se emplea para evitar las corrientes de difusión. En este se inyectan
diferentes compuestos con diferentes pK y se genera un gradiente de pH. Se aplica un campo eléctrico y las moléculas se van
moviendo hasta que alcanzan una zona donde el pH del entorno es igual a su punto isoeléctrico y se paran, de esta manera
se realiza la separación de las moléculas. Tiene una limitación, no es muy habitual para llevar a cabo la separación de
moléculas de gran tamaño debido al soporte empleado. En este caso se recurre al isoelectroenfoque capilar.

ISOELECTROENFOQUE CAPILAR.
No se necesita soporte, lo que hace que los tiempos de análisis sean más cortos y posibilita el empleo de un detector en
columna como el UV. Esta técnica se realiza en ausencia de flujo electroosmótico para lo que se emplean capilares
recubiertos de metilcelulosa. Se aplica para la separación de proteínas de gran tamaño molecular y compuestos con distinto
punto isoeléctrico. Las etapas son: inyección o carga, enfoque y movilización y la separación se basa en los puntos
isoeléctricos de la muestra que se pretende separar.
ETAPAS: Tenemos una muestra compuesta de anfolitos (especies que actúan como ácidos o bases), el lado anódico se
introduce en un reservorio que tiene una disolución ácida y el catódico se introduce en un reservorio con una disolución
básica, se genera al aplicar un campo eléctrico un gradiente de pH. Las especies se van a ir moviendo, van migrando por el
capilar hasta que alcanzan un entorno donde su pH es igual al punto isoeléctrico, entonces se produce el enfoque o etapa de
focalización. En este momento hay una fase estacionaria, quedan fijas las especies entonces la movilidad es cero. Ahora
pasamos a la etapa de movilización que se puede hacer de dos forma: hidrodinámica o salina.
• Hidrodinámica. Se va a aplicar una diferencia de presión entre los dos extremos del capilar y se mantiene un voltaje
constante. En este momento se produce una elución de los compuestos por la ventana de detección.
• Salina. En la etapa de enfoque las especies se dejan de mover, pero en este caso la corriente que hay es relativamente
baja, la conductividad se debe a los protones y los OH que hay en el sistema. Además, en el momento del enfoque el
gradiente de pH es constante. En la movilización salina en unos de los reservorios se adicionan sales, en este caso cloruro
de sodio en la disolución básica, ahora tenemos en el reservorio OH, sosa y cloruro, estos iones van a competir para
introducirse en el capilar por electromigración. Esas cargas de los Cl y OH tienen que verse compensados por los
protones del otro reservorio. Al haber competencia los OH que se introduzcan van a ser menos, esto hace que el pH
disminuya, lo que hace que se establezca un gradiente de pH. Al haber zonas donde hay diferentes pH se genera un
gradiente y las especies se vuelven a cargar, entonces se van moviendo y llegan primero los compuestos con puntos
isoeléctricos más elevados. Si se quiere el efecto contrario en el otro reservorio se introducen diferentes tipos de sales.
13

ISOTACOFORESIS CAPILAR.
Se basa en una separación en la cual las especies se van a mover a lo largo del capilar a velocidad uniforme. Se pueden
separar cationes y aniones, pero no simultáneamente. Se realiza aplicando una intensidad de corriente constante y en
ausencia de flujo electroosmótico, por lo que se usan los capilares anteriores. Se trabaja con dos tipos de tampones, uno
frontal y otro terminal. La muestra se va a mover entre estos dos tampones que presentan diferente conductividad.
ISOTACOFORESIS ANIÓNICA.
En este caso se seleccionan dos disoluciones tampón que contienen diferentes aniones, pero el catión tiene que ser común y
deben tener capacidad de tamponar. El tampón frontal tiene que contener aniones que tengan una movilidad electroforética
superior a la de los aniones de la muestra y a la del tampón terminal. El tampón frontal se introduce en el ánodo y en el
terminal se sumerge el cátodo. La muestra se inyecta y debe quedar entre estos dos tampones.
Cuando se inyecta se aplica un campo eléctrico y los aniones comienzan a migrar al ánodo, de manera que el primer anión
que eluye es el del frontal y como tiene una movilidad elevada y tenemos un detector de conductividad esta va a ser muy
elevada, hasta que al final llega el anión del tampón terminal. El isotacoferograma que se genera (detector conductimétrico)
tiene plataformas, se inicia con una conductividad elevada porque los aniones en salir primero son del tampón frontal y así
sucesivamente y, por último cuando la conductividad es casi cero las aniones que salen son los del tampón terminal. En este
para cuantificar se realiza según la longitud de la plataforma.

ELECTROCROMATOGRAFÍA CAPILAR.
Se refiere a una hibridación entre electroforesis capilar y cromatografía líquida. El tener columnas empaquetadas
proporciona alta capacidad de separación y el trabajar con buenos flujos electroomóticos da buena eficacia. La
instrumentación es la misma que en la electroforesis capilar, el capilar está relleno con partículas (fase estacionaria) que van
a tener un doble papel: interviene en la separación porque es muy selectiva y, además hace que impulse a la fase móvil a
través del capilar. Otra propiedad es que va a generar una buena doble carga eléctrica dentro del capilar lo que genera
buenos flujos electroosmóticos. Se emplea para separar tanto mezclas de analitos neutros (reparto) como cargados
(migración y reparto). El inconveniente es que es muy caro.
 14

APLICACIONES ELECTROFORESIS CAPILAR.

• Determinación de pequeños iones (en aguas, productos farmacéuticos o fluidos biológicos).
• Compuestos farmacéuticos tales como: sulfamidas, penicilinas, cefalosporinas, analgésicos, barbitúricos, vitaminas, etc.
(en productos farmacéuticos y fluidos biológicos).
• Herbicidas y pesticidas (alimentos y aguas).
• Análisis de carbohidratos.
• Separación de isómeros (en la industria farmacéutica).
• Análisis clínico determinación de fármacos y drogas de abuso.
• Análisis biológico en la determinación de aminoácidos, péptidos, proteínas, oligonucleótidos, ácidos nucleicos y en la
separación de bacterias donde se ha conseguido separar bacterias específicas de una determinada colonia, lo que
permite estudiar la distribución de microorganismos de una población mixta.
ESPECTROMETRÍA DE MASAS.
Es una técnica que ha sido consolidada en los últimos años y ha tenido un gran avance en los laboratorios de origen biológico
y biomédico por las diferentes teorías que se han puesto a punto, y por el acoplamiento con técnicas de separación.
Es una técnica de análisis que se basa en la separación en función de su relación masa/carga (m/z) de las diferentes partículas
que han sido cargadas a partir de la ionización de una muestra. Hay diferentes tipos dependiendo del campo de aplicación y
del estudio concreto de la muestra:
- Espectrometría de masas elemental. Técnica que va a proporcionar información elemental.
- Espectrometría de masas molecular. Técnica que proporciona información estructural de los compuestos de la muestra.
Un espectro de masas es la base de la espectrometría de masas, para obtenerlo en primer lugar es necesario formar las
especies iónicas, para posteriormente separarlas y medir la abundancia individual de cada ion que compone cada muestra.
Un equipo básico de espectrometría consta de una fuente de ionización, analizador de masas y detector de iones. La fuente
de ionización es la parte del equipo que permite generar iones, átomos, moléculas gaseosas, fragmentos de moléculas
neutras, etc., pero su principal función es generar especies iónicas. El analizador de masas o separador de iones separa los
iones que se generan en la fuente de ionización por su relación masa/carga. El detector de iones, por su parte, debe ser
capaz de transformar la señal de cada ion que se ha generado y se ha separado en una señal eléctrica medible o continua, es
lo que se conoce como abundancia.
Si se representa la abundancia o la corriente en función de la masa/carga se obtiene el espectro de masas. De estos se puede
obtener información cuantitativa y cualitativa:
- Cualitativa. En el espectro se obtienen diferentes picos a una relación masa/carga, la aparición de ese pico sirve para
identificar el ion correspondiente.
- Cuantitativa. Si medimos la altura o el área del pico podemos conocer la concentración del ion que tenemos en la
muestra.
ESPECTROMETRÍA DE MASAS ELEMENTAL.
Houk y colaboradores en el año 1980 empezaron a realizar estudios para ver como podían acoplar una fuente de iones a un
separador de masas para emplearlo como espectrometría de masas elemental. Esto tuvo que afrontar varias limitaciones ya
que la fuente de iones, por ejemplo el plasma de acoplamiento inductivo, trabaja a presión atmosférica y el analizador de
masas a presión de vacío, esto finalmente se solucionó y surgió una fuerte sinergia de estos dos componentes dando lugar a
la espectroscopía de masas con plasma de acoplamiento inductivo (IPC-MS).
INSTRUMENTACIÓN ICP-MS.
Fuente de ionización. Es un plasma de acoplamiento inductivo conocido como IPC y el gas empleado para generar el plasma
es el argón. El plasma IPC se genera mediante el acoplamiento de la energía suministrada de un generador de
radiofrecuencia con el gas argón, a través de un campo magnético que es generado por una bovina de inducción que se 15
encuentra rodeando una antorcha que es donde se va a generar el plasma. La bovina genera una energía que debe ser igual o
superior al potencial de ionización del argón. La antorcha consta de tres tubos concéntricos: el tubo exterior es el que va a
confinar y aislar el plasma y refrigera, el tubo intermedio que acelera el plasma y el tubo inyector interno que es por donde
va a pasar la muestra para su introducción. El plasma adquiere temperaturas entre 5 mil y 6 mil grados Kelvin (K), esta
temperatura es suficiente para atomizar e ionizar la muestra de todos los elementos del sistema periódico. Esta antorcha
está a presión atmosférica y es la fuente que genera los iones.

Interfase. Es la que nos va a permitir el acoplamiento entre la fuente de ionización y el analizador de masas. Consta de dos
partes: una primera formada por un primer cono denominado sample cone o cono de muestreo, está fabricado en níquel y
este es el que se va a introducir directamente en el plasma, por lo que se encuentra refrigerado. Tiene un orificio de 1 mm
por el que pasa la muestra que se ha ionizado. En esta parte se reduce la presión de 760 atm a 1-2 atm. La muestra pasa en
un régimen continuo y se forma un chorro superatómico o supersónico que pasa a través del plasma. La segunda parte
consta del cono separador o skimmer cone, su función es reducir la presión de 1-2 atm a 10-5-10-7 atm. Tiene un orificio de
entrada de 0,7 mm y es de níquel. Mediante este se reduce la presión y se consigue el acoplamiento con el analizador.

Sistema de enfoque de los iones. El haz iónico que pasa por el skimmer tiene un problema, pasa de forma difusa y con
mucha dispersión en la energía cinética de los iones que se generan. En esta etapa hay que focalizar el haz iónico para que
llegue al analizador. Esto lo hace el sistema de enfoque constituido por dos tipos de lentes: las lentes de extracción que van a
separar las especies no cargadas y los fotones de los iones. Además incrementan la energía cinética de los iones que se han
formado y reducen la expansión del haz iónico. Las lentes de enfoque, por su parte, van a confinar el haz de iones
independientemente de la masa de los iones que formen el haz y hacen que haya una buena distribución de las energías
cinéticas de los iones. Es una de las partes más importantes del equipo.
 16

Analizador de masas. Su función principal es separar los iones que se han generado en función de su relación masa/carga,
además va a seleccionar aquellas del ion que nos interesa. El dispositivo más habitual que se emplea es un cuadrupolo que
está constituido por cuatro barras de molibdeno que actúan de filtro de masas. La principal función del cuadrupolo es
transmitir los iones deseados, esa relación masa/carga transmitida va a depender del potencial que apliquemos al
cuadrupolo y este nos permite realizar un barrido espectral de masas.
El ion llega al detector o transductor de la señal que va a transformar la señal del ion en una señal medible de corriente. El
detector más habitual es el SEM (multiplicador de electrones secundarios). Este funciona como un fotomultiplicador, está
formado por dinodos dispuestos en cascada y es el que va a transformar la señal del ion en una señal eléctrica que nos va a
dar la abundancia.

SISTEMA DE INTRODUCCIÓN DE MUESTRAS AL IPC-MS.

La forma más habitual de introducir la muestra en un IPC masas es en estado líquido, pero también se pueden introducir en
estado sólido o gaseoso. En el caso de los líquidos se hace con un nebulizador acoplado a una cámara de nebulización y las
muestras sólidas se introducen mediante ablación láser. En el caso del gas depende del diseño del equipo.
MUESTRAS LÍQUIDAS: NEBULIZADOR ACOPLADO A UNA CÁMARA DE NEBULIZACIÓN.
Hay diferentes tipos, pero todos se basan en el mismo principio, se forma un aerosol líquido porque se aplica la corriente de
un gas a presión constante. La muestra se introduce por acción de una bomba peristáltica por un tubo capilar y por el efecto
Venturi se genera un aerosol líquido, ya que por otra parte se introduce el gas argón, que va a la cámara de nebulización.

MUESTRAS SÓLIDAS: ABLACIÓN LÁSER.

El sistema es la ablación láser consta de una cámara de ablación y un láser. Dentro de la cámara se dispone la muestra sólida
y en esta muestra se hace incidir el láser en un punto específico, esos fotones lo que hacen es interaccionar con las partículas
de la superficie del sólido y se genera un vapor que es arrastrado por la corriente del argón que lo lleva a la cámara del IPC
masas.
ESQUEMA DE UN INSTRUMENTO DE IPC-MS.

17

INTERFERENCIAS ESPECTRALES.
Es muy importante al realizar un análisis por IPC-MS las interferencias porque nos podemos encontrar interferencias
espectrales por iones extraños que van a solapar con los de interés. Hay diferentes tipos:
Interferencias isobáricas. Se producen cuando tenemos dos elementos que comparten algún isótopo con la misma relación
masa/carga nominal. Por ejemplo, el 40Ar+, ya que el plasma se genera por el gas argón, interfiere en 40Ca+. Se puede eliminar
midiendo un isótopo alternativo o haciendo correcciones matemáticas por el propio software del equipo (204I = 204IPb + 240IHg).
Interferencias poliatómicas. Se dan cuando se trabaja con matrices complejas. Se deben a que hay iones de especies
moleculares compuestas por dos, tres o cuatro átomos cuyas relaciones masa/carga individuales sumadas dan el mismo valor
que la masa/carga nominal que el isótopo del elemento de interés. Por ejemplo, 40Ar16O+ solapa con 56Fe+.
Una solución es emplear un equipo de alta resolución que sea capaz de separar isótopos con una alta resolución (3 o 4 cifra
decimales), minimizar la formación de especies poliatómicas y correcciones matemáticas jugando con las lentes de extracción
y de enfoque y que el equipo IPC-MS tenga celdas de reacción (H2) o colisión (He), unos dispositivos que se encuentran
delante del cuadrupolo. En este caso esas celdas se presurizan con determinados gases que son reactivos a esas especies.
La celda de reacción emplea como gas el hidrógeno, este va a transferir protones a la especie poliatómica transformándola
en otra especie que ya no va a interferir. La celda de colisión emplea como gas el helio, las especies poliatómicas tienen gran
tamaño y el gas helio va a chocar con esas especies poliatómicas y la energía de estas disminuye. Entre la salida de la celda y
la entrada del cuadrupolo se establece una barrera de potencial, como las energías han disminuido no van a superar la
barrera y no van a entrar al cuadrupolo.
Interferencias por iones doblemente cargados. El plasma ICP debido a las elevadas temperaturas que alcanza, es capaz de
ionizar a todos los elementos del sistema periódico, debido a esta gran energía puede formar especies doblemente cargadas
que pueden servir de interferencias al elemento que estamos determinado. Por ejemplo, el 138Ba2+ interfiere con 69Ga+. Esto
ocurre cuando tenemos muestras con elementos con bajos potenciales de ionización (alcalinos y alcalinotérreos). Se elimina
minimizando la ionización y, por tanto la formación de especies. Cuando se pone a punto el método se juega con los
parámetros instrumentales del equipo: flujo, óptica, potenciales de las lentes, etc.
ESPECTRO DE MASAS.
Es más sencillo que el espectro óptico del plasma de acoplamiento inductivo (ICP-OES). En este caso, mediante esta técnica
se obtiene el espectro que sirve para identificar un elemento en una muestra desconocida a través del patrón isotópico que
nos dice como están distribuidos los diferentes isótopos (presencia de todos los isótopos) y su abundancia relativa.

VENTAJAS.
Elevada sensibilidad y bajos valores de fondo espectral, esto hace que los límites de detención sean bajos, se encuentran en
el orden de ng/L o ppt. Los espectros de masas son sencillos, mucho más simples que los espectros ópticos obtenidos por
ICP-OES. Además, esta técnica permite un posible análisis semicuantitativo, multielemental, rápido y fiable. Para cuantificar
de forma semicuantitativa se puede emplear el factor de respuesta, sabemos la concentración de un patrón y se mide su
señal analítica, así se puede calcular el factor de respuesta que posteriormente se puede aplicar a una muestra problema
para conocer su concentración, no hace falta hacer una recta de calibrado. También se pude hacer un análisis isotópico
directo.
ANÁLISIS ISOTÓPICO.
Identificación de la firma isotópica de la muestra, es saber cuál es la distribución característica de los isótopos estables de un
elemento. El saber esto mediante ICP-MS es muy sencillo y es una herramienta única de esta técnica, pero conocer la
relación de las abundancias le afectan a una serie de factores. Los factores que afectan a la medida de las relaciones
isotópicas son:
- Precisión en las medidas. Esta técnica tiene una precisión elevada.
- Posible presencia de interferencia. Se corrige instrumentalmente, pero hay que tenerlas en cuenta para el análisis
isotópico. 18
- Efectos de discriminación de masa. En general, los isótopos más pesados se transmiten de manera más eficaz que los
ligeros, lo que puede afectar a la relación isotópica. Se corrige con un buen sistema de lentes de enfoque y extracción.
- Tiempo muerto del detector. Los detectores que se usan son de pulsos. El tiempo muerto en este caso se refiere al
tiempo que necesita el detector para detectar señales independientes que proceden de un evento (iones) diferente. Es
bueno conocerlo para medir las relaciones isotópicas.
- Posibles contaminaciones. Ocurre con contaminación exógena de los elementos que vamos a estudiar porque pueden
hacer que varíen las relaciones de la muestra de estudio.
DILUCIÓN ISOTÓPICA.
Es una herramienta muy útil. Permite cuantificar o determinar un elemento a partir de la medida de las relaciones isotópicas.

Podemos decir que es un método absoluto porque presenta gran exactitud y no se ve afectado por la sensibilidad del método
ni por los problemas de deriva de las señales del isótopo.
Para llevar a cabo este método necesitamos una muestra en la que se determina la concentración de un elemento, un
trazador y la mezcla de las dos. La muestra tiene una concentración desconocida del elemento, pero va a tener una relación
isotópica conocida porque es la natural del elemento. Del trazador se conoce la concentración, pero tiene una relación
isotópica artificial que es diferente a la de la muestra. A continuación, se mezcla una cantidad de muestra y trazador de
concentración conocida, se estable el equilibrio entre ambos y la mezcla que resulta va a tener otra relación isotópica
diferente a la muestra y el trazador.
Esta relación (R) se puede conocer directamente con la técnica ICP masas, ya que si conocemos el valor de R podemos
calcular la concentración del elemento en la muestra a partir de la siguiente fórmula:

VENTAJAS DE LA CUANTIFICACIÓN POR DILUCIÓN ISOTÓPICA.

Las ventajas son muchas porque es un método absoluto por su gran exactitud y no le afecta que dentro del proceso de
análisis haya pérdida de analito, tampoco afecta al resultado si hay una modificación de la señal por parte de la matriz. Por
este método podemos medir diferentes elementos a la vez porque una de las grandes ventajas de ICP-masas es que se
realiza análisis multielementales, y es muy versátil porque se puede hacer de casi todos los elementos siempre que tenga dos
isótopos como mínimo libre de interferencias. Es un método de referencia porque es muy exacto y preciso y tiene poca
incertidumbre.
INCONVENIENTES DE LA CUANTIFICACIÓN POR DILUCIÓN ISOTÓPICA.
Los inconvenientes es que los trazadores son muy caros y no está implementado universalmente como una técnica de rutina.
Además, el inconveniente principal es que tenemos que conocer de forma exacta la concentración del trazador.
APLICACIONES DEL IPC-MASAS EN ANÁLISIS CLÍNICO.
En el análisis clínico tiene un campo muy fructífero porque se ha implementado en el análisis de muestras de interés
bioquímico y clínico porque se pueden analizar elementos traza en muchos tipos de muestras: bioelementos traza en sangre,
suero, orina, líquido intersticial, dientes, huesos, pelo y células. Además, se pueden analizar elementos esenciales en
funciones biológicas (Cu, Fe, Zn) y elementos tóxicos (Pb, Hg, Cd). Cuando se trabaja con elementos esenciales estos
presentan interferencias, por lo que debes tener un equipo IPC-MS con celdas de reacción o colisión para eliminar estos
interferentes. 19
La preparación de la muestra va a variar dependiendo del tipo de muestra que tengamos: cuando se trabaja con orina, suero
o plasma se hace una simple dilución con agua al 2% (dilución 1:9 en orina y suero), pero cuando se trabaja con sangre total
la matriz es más compleja y se trabaja con medios alcalinos y tensioactivos que crean depósitos en el cono que hacen que
baje la sensibilidad. También se puede trabajar en un medio ácido (HNO3 ultrapuro) con microondas en tejidos: digieres la
muestra, adicionas el ácido (ácido nítrico) y agua y lo sometes a un programa de microondas de esta forma digieres y extraes
el elemento de interés. Cuando la muestra es sólida se trabaja con microondas, ácido nítrico y agua oxigenada, así nos
aseguramos de que los elementos están en disolución acuosa.
La ablación láser ha permitido el análisis de superficies. Además, se pueden obtener imágenes por MS (Bioimaging). Esta
técnica se emplea por ejemplo, para medir la efectividad de un antitumoral.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS MOLECULAR.

En la figura se recogen las partes fundamentales de este equipo que se debe encontrar en condiciones de vacío porque en
este caso unas condiciones de alto vacío hacen que haya un mejor movimiento de los iones que se han generado en la fuente
de ionización.

La fuente de ionización está relacionada con la forma de introducción de la muestra. Si está en fase gaseosa hay diferentes
fuentes de ionización. En fase líquida o sólida hay que realizar una fase de desorción previa para que pasen a forma de vapor.
En la tabla se observan las fuentes de ionización más comunes:
Analizador de masas. En este caso es donde los fragmentos que se generan son separados en función de su relación
masa/carga. Esta separación ocurre de forma diferente si se aplica un campo eléctrico o un campo magnético. Estos se
diferencian en la sensibilidad, resolución y rango de masas en el que se puede medir. Podemos diferenciar diferentes tipos de
analizadores de masas:
- Analizador de masas tipo cuadrupolo (MS).
- Analizador de masas tipo trampa de iones (MSn).
- Analizador de masas tipo sector magnético (HRMS).
- Analizador tipo cuadrupolo (QqQ).
- Analizador de tipo cuadrupolo-trampa lineal (Qtrap).
- Analizador tiempo de vuelo. 20
- Resonancia iónica de ciclotrón por transformada de Fourier.
ESPECTROS DE MASAS MOLECULARES: ETAPAS PARA SU OBTENCIÓN.
Al final cuando analizas una muestra obtienes el espectro de masas molecular. Para obtener este se deben seguir diferentes
pasos: en primer lugar se debe producir la ionización del analito, después se debe producir la descomposición molecular del
analito ionizado y la separación y cuantificación individual de los iones según su relación masa/carga. Finalmente, se
representa la abundancia relativa en función de la relación masa/carga.
PICO MOLECULAR Y PICO BASE.
En un espectro de masa molecular tenemos el denominado pico base y pico molecular. El ion molecular es el que tiene
mayor masa/carga y el pico base es aquel que tiene mayor intensidad, a este de forma arbitraria se le da el valor de cien y el
resto son un porcentaje con respecto al pico base. Cabe destacar que no tiene por qué coincidir el valor del pico base con el
molecular.

ANÁLISIS CUALITATIVO.
Se puede determinar una forma empírica a partir de la masa exacta o de las relaciones isotópicas. Además, se puede
identificar los compuestos por la fragmentación característica, al igual que los grupos funcionales. También se pueden
determinar las abundancias isotópicas.
ANÁLISIS CUANTITATIVO.
Es una técnica que presenta una alta sensibilidad y una gran selectividad.
Para limitar las posibles estructuras a unas pocas debemos determinar el peso molecular del analito, estudiar la distribución
isotópica y aplicar modelos de fragmentación.
IDENTIFICACIÓN POR COMPARACIÓN DE ESPECTROS.
Si tenemos un compuesto de referencia se puede comparar este espectro con el del analito de la muestra. Se supone que hay
un modelo de fragmentación único y que las condiciones donde se han llevado a cabo son reproducibles. Cuando se trabaja
con estereoisómeros, compuestos con la misma fórmula molécula, pero en los que la distribución espacial de sus átomos es
diferente no se puede suponer lo anterior.
VARIABILIDAD EN LOS PICOS.
Si hay diferencia en la altura de picos puede ser por la energía del haz de electrones, la localización de la muestra respecto al
haz (geometría y diseño) o porque se ha llevado a cabo en diferentes laboratorios o en diferentes equipos (analizadores,
fuentes, etc.).
Si hay diferencias lo que se hace es comparar los espectros para encontrar la estructura, ya que se necesita confirmación.
Estos compuestos de referencia se buscan en librerías: sistemas computarizados de comparación de espectros, bases de libre
acceso (http://www.sisweb.com/mstools/isotope.htm, http://www.chemspider.com/, https://massbank.eu/MassBank,
http://www.drugbank.ca/, https://metlin.scripps.edu/landing_page.php?pgcontent=mainPage, http://www.lipidmaps.org/,
http://www.hmdb.ca/) o aplicaciones móviles (Molecular Formula Generator).
TÉCNICAS ACOPLADAS.
Cuando tenemos mezclas de compuestos es insuficiente una espectrometría de masa porque tenemos el problema de que
nos podemos encontrar una gran cantidad de iones con diferente relación masa/carga (m/z). Para ello en los últimos años se
han acoplado técnicas de separación con espectrometría de masas, esto da lugar a una instrumentación más compleja que
son las técnicas acopladas.

21
Mediante la técnica de separación conseguimos separar los compuestos y obtenemos picos de separación. Cada pico
corresponde a un compuesto y a cada uno de ellos se le aplica la espectrometría de masas. Con ello conseguimos aumentar
la sensibilidad porque la relación señal/ruido aumenta y, además, mejoramos la selectividad porque nos permite diferenciar
qué masas corresponden con cada compuesto.

Existen diferentes tipos de técnicas acopladas que podemos ver a continuación:

CROMATOGRAFÍA DE GASES-MASAS.
Este tipo de acoplamiento se ha convertido en una de las herramientas más poderosas para el análisis de muestras complejas
de origen orgánico y de interés bioquímico. La fase móvil es un gas, ya que tenemos acoplado un cromatógrafo de gases con
la espectrometría de masas: fuente de ionización y espectrómetro de masas.
En el cromatógrafo de gases los compuestos son separados y, luego en el espectrómetro de masas se van a analizar, por lo
que cada pico tiene su correspondiente espectro de masa. El caudal que proviene de la columna es lo suficientemente bajo y
adecuado para introducir dentro de la cámara de ionización estos compuestos. Los componentes que han sido separados se
ionizan en la fuente de ionización, esta puede ser de dos tipos: impacto electrónico e ionización química.
- Impacto electrónico. Cuando llegan a esta fuente los analitos están en estado vapor y van a ser bombardeados por una
fuente que produce electrones de alta energía. Como se produce un exceso de energía estos compuestos son
fragmentados en diferentes iones. Este tipo de fuente recibe el nombre de fuente dura porque produce una gran
fragmentación del analito.
- Ionización química. En esta caso vamos a tener un gas que va a ser bombardeado por un haz de electrones, esto hace
que se formen iones que van a colisionar con los analitos en de estado vapor. Este tipo de fuente es una fuente blanda 22
porque no produce una ionización tan grande como en el caso anterior.
El analizador de masa que más se usa es el de tipo cuadrupolo (Q), en este caso la separación está basada en el estabilidad
de un valor masa/carga (m/z) dentro de los campos de radiofrecuencia y corriente directa aplicados sobre los electrodos.
Cuando se producen los iones en la fuente de ionización llegan a la trampa de iones donde se aplica un campo de
radiofrecuencia que hace que los iones empiecen a orbitar y quedan atrapados. A continuación, pueden ser expulsados en
función de su relación masa/carga (m/z) aplicando un voltaje y llegan al detector multiplicador de electrones. Con este tipo
de analizadores se puede mejorar la sensibilidad porque se puede rebajar el índice de detección, es una de las ventajas de
este tipo de analizadores.
APLICACIONES.
Tiene aplicaciones en clínica como la determinación de metabolitos de fármacos o en diagnóstico médico basado en los
componentes de aliento. Es uno de los acoplamientos de análisis que se emplea como una técnica de rutina.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDO-MASAS.
Cuando se desarrolló presentaba incompatibilidades:
- HPLC. Al provenir la muestra de un sistema líquido, tenemos una fase líquida, la temperatura en este caso está
comprendida entre 25-50ºC, se puede separar cualquier tipo de muestra de cualquier peso y se trabaja con tampones
inorgánicos a presión atmosférica.
- ESPECTRÓMETRO DE MASAS. En este caso se trabaja con analitos en fase gaseosa, con una temperatura comprendida
entre 100-350ºC, los compuestos que se introducen deben ser volátiles y presenta límite de peso molecular. En este
caso no tolera bien los tampones (en el caso anterior se trabajaba con tampones fosfato y en este caso el
espectrómetro de masas se puede contaminar) y se necesitan condiciones de alto vacío.
A lo largo de los años, se han ido valorando cómo puede realizarse el acoplamiento. El cromatógrafo de líquido-masas está
compuesto por una fase móvil que va a ser bombeada hacia el inyector por una bomba. La muestra se va a introducir en la
columna cromatográfica gracias a un inyector. Posteriormente, el eluyente debe llegar hasta la fuente de ionización donde la
muestra se volverá volátil para que posteriormente sea analizada en el espectrómetro de masas.

Encontramos distintos tipos de fuente de ionización una de ellas es la ionización por electronebulización o electrospray (ESI),
otro tipo es la ionización química a presión atmosférica (APCI). Tanto ESI como APCI son fuentes blandas o suaves.
- Ionización por electronebulización o electrospray (ESI). Cuando nuestra muestra o compuestos son eluidos de la
columna se van a bombear por un capilar de acero inoxidable muy fino, si trabajamos en cromatografía de alta
resolución hay que tener cuidado porque se trabaja a un flujo de mL/min o μL/min. El extremo del capilar de acero
inoxidable se mantiene a un potencial eléctrico elevado (varios kV) con respecto a un electrodo cilíndrico que rodea
dicho capilar. En este caso al tener un elevado potencial se va a generar un campo eléctrico que hace que el líquido
que está fluyendo por el capilar emerja como un aerosol constituido por partículas cargadas. Las gotas finas cargadas
pasan a través de unas cámaras de vacío en las que se evapora el disolvente (desorción del disolvente) y al final se
obtienen iones cargados del analito.
 23

Estas partículas tienen múltiples cargas. Por lo que si está eluyendo una molécula de gran peso molecular que está
múltiplemente cargada la relación masa/carga (m/z) va a ser pequeña, del orden de 1000-2000, esto es adecuado para
un analizador de tipo cuadrupolo. Esto es una ventaja de esta fuente, produce iones con múltiples cargas que hacen
disminuir la relación masa/carga (m/z). Las principales características de esta fuente de ionización son las siguientes:
o Produce una ionización suave porque se trata de una fuente suave o blanda: iones moleculares cuasi intactos
y conservación de los enlaces covalentes.
o Genera iones con múltiples cargas.
o No utiliza temperaturas elevadas, lo que permite el análisis de moléculas lábiles.
o Se puede producir formación de aductos con los tampones de la fase móvil, por lo que es muy importante la
elección de esta.
o Acepta flujos de 1 mL/min.
o Permite obtener espectros de masas de iones positivos y negativos.
ESPECTRO DE MASAS ESI-MS.
Vamos a tener diferentes señales a lo largo de un determinado dominio espectral, estas se van a corresponder con los
diferentes iones que se van produciendo. Podemos tener una secuencia de iones, de esta forma si tenemos dos iones
consecutivos con una misma masa aparente vamos a tener sistemas para calcular la masa molecular del compuesto. Se
generan diferentes iones porque estos adquieren diferentes cargas. Por lo tanto, si tenemos dos picos consecutivos vamos a
poder calcular el peso aparente.

- Ionización química a presión atmosférica (APCI). Técnica suave que tiene la ventaja de que trabaja a presión
atmosférica, lo que hace que podamos tener un alto rendimiento en el análisis que estamos realizando. Vamos a tener
una sonda de entrada de muestra conectada a un nebulizador neumático que va a estar dentro de una cámara de
nebulización calentada a temperaturas de 500-600ºC, dentro se encuentra un electrodo en forma de aguja y en este se
va a producir una descarga eléctrica.
 La muestra entra en la cámara de nebulización en forma de aerosol, gracias a la acción de un jet de nitrógeno de alta
velocidad. Se forman pequeñas gotas, muchas de ellas con exceso de carga positiva o negativa, que avanzan por la
cámara calentada, desolvatándose poco a poco, y arrastradas por un flujo de nitrógeno (gas envolvente). Al disminuir
el tamaño de gotas, aumenta el campo eléctrico en su interior, favoreciéndose la evaporación iónica por repulsión de
partículas cargadas de igual signo.

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La muestra seca y transportada por el gas entra en contacto con un pequeño plasma generado en la región de descarga
de una corona donde los gases se van a ionizar. Los iones de gas a partir de nitrógeno y los vapores de agua son los
responsables de ionizar los analitos.

Las principales características de la ionización química a presión atmosférica (APCI) son las siguientes:
o Se trata de una técnica de ionización suave, ya que apenas se produce ionización.
o La ionización se produce mediante una reacción ion-molécula a presión constante.
o Se puede realizar análisis de moléculas con bajo peso molecular no volátiles.
o Esta técnica acepta flujos de 1-4 mL/min.
o Su sensibilidad no depende del pH ni del flujo de la fase móvil.
o Permite obtener espectros de masas de iones positivos y negativos.
APLICACIONES APCI Y ESI.
Permiten realizar análisis de control de calidad en la producción de proteínas
recombinantes y péptidos sintéticos. Además, permite la caracterización de proteínas,
oligonucleótidos, carbohidratos, etc. Se emplea en el análisis forense,
toxicológico/drogas y alimentación. La técnica APCI es ideal en el análisis de compuestos
farmacéuticos, metabolitos, esteroides, etc., mientras que ESI presenta límites de
detección inferiores a 10-15 moles e intervalos de masas desde menores de 500 hasta
200000 Da.
ELECTROFORESIS-MASAS.
En los últimos años se ha ido desarrollando esta técnica, ya que ha suscitado gran interés. La electroforesis capilar es una
técnica que presenta cortos tiempos de análisis, consume poco volumen de muestra y reactivos, además tiene buena
resolución, mientras que la espectrometría de masas tiene una gran selectividad y proporciona información estructural. Se ha
trabajado mucho en la técnica de ionización y se han conseguido algunos avances como son las técnicas de ionización, las
interfases y los analizadores de masas. Esta técnica presenta grandes aplicaciones: análisis de iones bioinorgánicos,
biomoléculas de elevado peso molecular y nanopartículas.
INTERFASE ESI.
Permite una transferencia directa de los compuestos desde el capilar de separación hasta el espectrómetro de masas.
Permite un análisis eficaz de compuestos polares, lábiles y/o de compuestos con un alto peso molecular (hasta 100000 Da),
ya que la fuente ionización no produce apenas fragmentación, pero genera múltiples cargas. Se trata de una técnica fácil de
implementar, sensible y que presenta un amplio intervalo de aplicaciones.
Esta interfase lleva un flujo adicional, esta constituida por tres tubos concéntricos: uno proviene del equipo de electroforesis,
otro es de acero y va a fluir un flujo de líquido adicional y, por último, encontramos un tubo con un gas para producir el
aerosol. Necesitamos un flujo adicional porque el caudal que puede provenir del equipo de electroforesis puede ser de
nL/min, pero lo adecuado es de mL/min, por lo tanto, introducimos el incremento de flujo por la inserción de este.
Presenta como ventajas que es muy robusta y fácil de manejar, lo cual es muy importante, pero el inconveniente es que 25
disminuimos la sensibilidad por ese flujo adicional.

De todas las modalidades de la electroforesis las más adecuadas son la electroforesis capilar y la micelar, pero la más
empleada es la capilar en zona (CZE). Encontramos diversos problemas relacionados con los electrolitos de separación y los
disolventes: en electroforesis el detector más utilizado es el UV-Visible que trabaja bien con fosfatos, boratos, detergentes
como SDS que aumentan el ruido en masas, selectores quirales, etc., pero cuando usamos este tipo de fase móviles podemos
contaminar u obstruir el espectrómetro de masas y podemos aumentar el ruido de fondo. Además, el uso de sales de
metales alcalinos da lugar a la formación de aductos con los analitos en la fuente de ionización. Por lo tanto, las fases móviles
más utilizadas son tampones volátiles y con fuerza iónica baja o media, pero hacen falta buenos campos eléctricos. Por
ejemplo: agua, etanol, metanol, acetonitrilo, isopropanol, ácido acético, ácido fórmico, ácido aminocapróico, acetato
amónico, formiato amónico, bicarbonato amónico, trietanolamina, trietilamina, etc.
De esta manera se mejora la reproducción cuando tenemos este tipo de acoplamientos que son los más difíciles a la hora de
optimizar un método de análisis.
MS + MS = TÁNDEM MS.
En la primera etapa se aísla el ion de una muestra y en la segunda etapa se analiza su relación con otros iones que se han
producido a partir de ese analito. Cuando trabajamos con espectrometría de masas en tándem se pueden realizar estudios
estructurales y de trazas de algunos compuestos. El usar estos tipos de instrumentación ayuda a mejorar los espectros.
APLICACIONES.
Esta técnica se emplea en estudios estructurales, ya que ayuda en la interpretación de espectros complejos, suministra
información adicional mediante fragmentación inducida, permite conseguir información de secuencias en biopolímeros y,
también se puede emplear en estudios de estructuras iónicas, procesos de ionización y energías de relajación.
Además, permite realizar análisis de mezclas y trazas, ya que permite la identificación y análisis de compuestos minoritarios,
lo que permite la cuantificación de analitos en mezclas complejas. Permite realizar el aislamiento, detección e identificación
de elementos o compuestos traza.
TRIPLE CUADRUPOLO (QqQ).

Se aprovechan las ventajas de un cuadrupolo. En este caso tenemos tres

cuadrupolos dispuestos en línea: el Q1 y Q3 sirven de guía o filtro de iones, sin
embargo el Q2 se usa como cuadrupolo o hexapolo y actúa como celda de colisión.
El ion que se filtra en el Q1 cuando pasa a la celda de colisión se fragmenta y esos
iones que se han fragmentado pasan al Q3.
ESTUDIOS CON EL TRIPLE CUADRUPOLO (QqQ).
Barrido de ion fragmento: Sintonizar el primer cuadrupolo para dejar pasar únicamente la masa correspondiente al
precursor seleccionado y realizar un barrido con el tercer cuadrupolo para obtener el espectro de los iones fragmento
originados por colisión en el segundo cuadrupolo.
Barrido de ion precursor: Se fija el tercer cuadrupolo para transmitir solo un fragmento determinado, mientras se barre con
el primer cuadrupolo para enfocar sucesivamente todos los posibles precursores que puedan dar origen al ion seleccionado,
por disociación inducida en la célula de colisión.
Barrido de fragmento neutro: Barrer simultáneamente con el primer y tercer cuadrupolo, manteniendo una diferencia en
masa fija entre ambos, que corresponde a la masa del fragmento neutro en estudio.
Multiple reaction monitoring (MRM): Sintonizar el primer y tercer cuadrupolo a las masas correspondientes al precursor y 26
fragmento correspondientes. Pueden observarse secuencias de tales transiciones, en tiempo real, enfocando cíclicamente los
conjuntos de valores correspondientes a las transiciones a estudiar, bajo el control de un ordenador.
Espectros normales: Barrido con el tercer cuadrupolo y dejar el primero y el segundo inoperantes.
Con este triple cuadrupolo se puede realizar estudios estructurales de diferentes compuestos, lo que ofrece muchas ventajas.
TRIPLE CUADRUPOLO-TRAMPA LINEAL (Qtrap). En ambos casos vamos a tener modificaciones en el Q3.
Se realizan modificaciones en el Q3 que va a pasar a ser Qtrap. Este cuadrupolo normal que hace de guía de iones se modifica
por una trampa lineal. En Q3 se aplica un campo eléctrico axial que genera un flujo de iones, a la salida se aplica un alto
voltaje que hace de trampa porque bloquea la salida de los iones. Esta acumulación de iones que se genera se consigue
porque se bloquea la salida y porque se aplican radiofrecuencias que permiten que se queden atrapados en la trampa. Si
antes de llegar al detector se acumulan, se mejora la sensibilidad porque del mismo analito van a llegar más fragmentos lo
que mejora la sensibilidad. También se puede modificar la velocidad del filtro, esto va a afectar a la resolución y sensibilidad:
si se reduce la velocidad se mejora la resolución, pero afecta la sensibilidad.

CUADRUPOLO-TIEMPO DE VUELO (Q-TOF).

En este caso Q3 se modifica por un módulo de tiempo de vuelo. Vamos a conseguir separar los iones jugando con el tiempo
que tardan en atravesar un tubo de longitud conocida, los iones más ligeros lo van a atravesar antes, ya que el tiempo que
tardan en atravesarlo va a depender de la relación masa/carga (m/z).

OTROS ACOPLAMIENTOS.

Los espectrómetros de masas se pueden acoplar a

gases, líquidos, etc. Además, se incluyen
acoplamientos de ICP masas a técnicas de
separación. La ablación láser-IPC masas tienen
muchas aplicaciones en el ámbito bioanalítico.