Catalisis Enzimatica
Catalisis Enzimatica
Catalisis Enzimatica
Son catalizadores: Reducen la energia de activacion de una reaccion mediante la creacion de un mecanismo alterno. Muchas enzimas son proteinas (otras no: eg. Ribonucleoproteinas) Estas macromoleculas se unen temporalmente a uno o mas sustratos de la reaccion que catalizan.
Importancia
Convierte Substratos en Productos
Aumentan velocidad de la reaccin hasta en 106 Son especficos incluso hasta
estereoespecficos
Pueden cambiar substratos aquirales a
productos quirales
ai f i Ci
concentration
Activity coefficient
0.51z 2 I log f z 1 I
Ionic strength
Charge on the ion
1 2
2 C z ii
Activacin de Zimgeno
Las enzimas que son sintetizadas en una forma inactiva se llaman proenzima o zimgeno.
Preproinsulin
Para activarse el zimgeno necesita de un cambio bioqumico en su estructura que le lleve a conformar un centro activo, mediante protelisis en un lugar especfico. El fragmento eliminado es llama pptido de activacin Esto regula la actividad de la enzima, al mantenerla en forma no-funcional hasta que se la necesite.
Algunos zimgenos conocidos: Tripsingeno. Quimotripsingeno. Pepsingeno. Protenas del sistema de coagulacin. Proelastasa. Prolipasa. Procarboxipolipeptidasas.
La actividad enzimatica es afectada dramaticamente por cambios en pH y Temperatura. Cada enzima trabaja mejor a cierta temperatura y pH
Su actividad disminuye fuera de cierto rango (de pH & Temp). Esto se debe a una alteracion en la estructura terciaria y a un cambio en las fuerzas nocovalentes (puentes-H, interacciones ionicas, etc.) Por ejemplo: La pepsina (proteasa del estomago) trabaja efectivamente a pH of 1-2 La Tripsina (proteasa del intestino delgado) no tiene actividad a pH bajo, pero es activa a pH = 8.
Cambios en pH afectan la ionizacion de aminoacidos (e.g., Asp, Lys) que pueden estar jugando un rol crucial en las uniones con sustratos. Por ejemplo, el pH afecta la ionizacion de los grupos aminos y carboxilicos de los aminoacidos Por otro lado, los puentes de hidrogeno son facilmente rotos (no son enlaces covalentes!) al aumentar la temperatura. Al reducirse el numero de estas interacciones, la conformacion de la enzima cambia y por lo tanto cesa su actividad.
- Si la especie es inorganica (ion: Fe2+, Mn2+, Mg2+, etc.) generalmente se lo llama cofactor.
Cofactores se unen a enzimas mediante interacciones ion-dipolo (forman complejos acido-base Lewis), o mediante dipolo-dipolo.
- Si la especie es organica generalmente se la llama coenzima. Estas son moleculas o iones ayudantes que facilitan una transformacion quimica.
Es decir, son agentes que llevan informacion quimica (eg: grupos) entre enzimas, y por lo tanto se unen debilmente a las enzimas.
Una enzima sin cofactor es llamada apoenzima, mientras que la enzima con su cofactor se la conoce como Holoenzima:
Apoenzima
cofactor Holoenzima
Grupos Prostticos
Cuando el cofactor o coenzima est fuertemente y permanentemente ligado a la enzima, se lo llama grupo prostetico
Centro Activo
Es una cavidad tridimensional, usualmente inaccesible al solvente. Contiene un centro catalitico y uno de union Esta formado por residuos (aas) responsables por la especificidad de la enzima, y residuos responsables por la accin catalitica. Los residuos cataliticos son donadores/aceptores de H+, o se unen a un cofactor.
Modelos
a) Lock & Key b) Induced fit.
Lock & Key.- Asume que el centro activo tiene la forma exacta de un sustrato especifico. Una vez que el sustrato se une a la enzima, no hay mas modificaciones (reordenamiento interno) Induced fit.- Asume que el centro activo es flexible y los residuos (aas) buscan el sustrato correcto. Cuando el sustrato se une al centro activo, nuevos cambios conformacionales ocurren.
Los sustratos se unen al centro activo a travs de puentes-H, interacciones hidrofobicas, enlaces covalente temporales, o una combinacion de todos estos, dando lugar al complejo enzima-sustrato. Una vez que la reaccion ha ocurrido en el centro activo, los productos son eliminados debido a interacciones no-covalentes no favorables o debido a efectos estericos.
Enzimas Alostericas
Enzima cuya actividad est regulada mediante un centro alostrico, que es un sitio, distinto del centro activo, al que se une un regulador (llamado regulador alostrico) de manera reversible. La unin de este regulador modifica la estructura tridimensional de la enzima y llega a afectar la configuracin del centro activo. Cuando el regulador incrementa la actividad de la proteina, se lo llama activador alosterico, mientras que si disminuye la actividad se lo llama inhibidor alosterico.
Regulacin alostrica
Efectos Alostricos: Efectos Homotrpicos: cuando los sitios son idnticos Efectos Heterotrpicos: cuando la unin de un ligando afecta la unin de otro sitio diferente: El efecto de BPG (Bifosfoglicerato) en la afinidad de la Hb por el O2
Isoenzimas (Isozimas)
Son enzimas que difieren en la secuencia de los aminoacidos, pero catalizan la misma reaccion quimica.
Se las identifica por diferentes parametros (e.g. KM) o diferentes propiedades reguladoras. Difieren en la sensibilidad al substrato, la velocidad de la reaccin o los sitios donde se utilizan
Una oxidacion requiere de un incremento en los atomos de oxigeno, o una disminucion en los atomos de hidrogeno. Una reduccion involucra un incremento en los hidrogenos o disminucion en los oxigenos. Oxidacion de alcanos: CH3CH3 (etano) CH3CH2OH (etanol) CH3COH (acetaldehide) CH3COOH (a. acetico)
Oxidoreductases
Histidine
6) Ligasas (sintetasas) Catalizan reacciones de sintesis (union de dos sustratos) y generalmente requieren de ATP:
Cinetica Enzimatica
Cuando una enzima cataliza una reaccion, el mecanismo involucra la formacion de un compuesto intermedio llamado complejo enzima-sustrato, ES
E + S ES E + P
El primer paso es un equilibrio rapido. El segundo paso es la formacion de producto del complejo enzima-sustrato La enzima queda lista para volver a realizar otra reaccion.
En general, la asociacion y disociacion del equilibrio son rapidas debido a que solo intervienen interacciones no-covalentes. El segundo paso involucra ruptura y formacion de enlaces, por lo tanto es el paso determinante.
Notese que no consideramos la reaccion inversa k-2 porque este tratamiento considera velocidades iniciales, donde [P] <<< [S]
Cuando [S] >> [E], cada molecula de enzima se une a un sustrato y se dice que la enzima est saturada de sustrato.
Por lo tanto, en una reaccion enzimatica, la concentracion de enzima [E] tambien afecta la velocidad.
Cuando la enzima esta saturada, el incremento en [E] incrementara proporcionalmente la velocidad de reaccion.
Grafico indica que al duplicarse [E] bajo saturacion de S, la pendiente es mayor; por lo tanto v0 es mayor (v0 = vel inicial)
Grafico indica que al duplicarse [E] bajo saturacion de S, la pendiente es mayor; por lo tanto la vel inicial, v0, es mayor.
La velocidad de la reaccion total esta limitada por el paso ES E + P, ya que el equilibrio inicial es rapido.
vel = k2[ES]
Por cuanto [ES] es un intermedio, la ley de velocidad no puede expresarse en funcion de [ES], sino en funcion de [E] y/o [S].
Se asume que el sistema esta en un estado estacionario respecto al complejo ES, es decir, [ES]<<[E]<<[S]. Por lo tanto, la velocidad de desaparicion de ES expresada como cambio infinitesimal se aproxima a cero:
Es decir,
Y despejando [ES],
Igualmente,
Notese que en
Todas las constantes estan agrupadas. Aqui se define la constante de Michaelis-Menden, KM, como:
Que corresponde a
Anteriormente definimos,
Sustituyendo KM,
Cuantificando la cantidad total de enzima: [E0] = [E] + [ES] Donde [E0] = conc. Einicial = conc. Etotal [E] = conc. Elibre [ES] = conc. de complejo ES Por lo tanto la conc de Elibre es igual a [E] = [E0] - [ES]
Sustituyendo,
vel = k2[ES]
Sustituyendo [ES] queda,
PERO La velocidad maxima se observa cuando [S]>>[E], y se puede asumir que todo la enzima se encuentra como [ES]
Resulta en
Entonces,
Que es igual a
Finalmente,
De aqui, el grafico
Pero que significa fisicamente? KM es un indicador de la afinidad de una enzima por cierto sustrato.
Por lo tanto, KM, es un parametro que define la tendencia de ES de asociarse y/o disociarse En KM, 50 % de los centros activos contienen sustrato: Cuando [S] = KM , [S]/(KM + [S]) = 0.5 Mientras mas elevado es el KM la enzima requiere mas sustrato.
Observacion importante:
La interpretacion cuantitativa del grafico hiperbolico (Michaelis Plot) es dificil: Vmax nunca se alcanza y por lo tanto KM solo se puede determinar aprox. Una mejor interpretacion y cuantificacion Vmax & KM se lo hace transformando la ecuacion de MichaelisMenden en una ecuacion lineal: Lineweaver-Burk plot (double reciprocal plot)
La reciproca es
Que se reordena en
1/Vmax cruza al eje-y cuando x = 0 porque cuando la concentracin del sustrato es infinita, 1/ = 0
Es fcil encontrar KM ya que solo hay que determinar la interseccion con el eje-x
Limitaciones
- La regresion Lineweaver-Burk es muy sensible a errores y es adecuada solo en el rango de bajas concentraciones. porque
- Las transformaciones reciprocas distorcionan el error experimental; por lo tanto el grafico no es equivalente a una regresion lineal.
- La
cinetica Michaelis-Menten (M-M) es una teora basada en la ley de accin de masa, que asume difusin libre y colisiones aleatoreas
En reacciones enzimaticas homogeneas, la mobilidad de la enzima tambien puede ser muy limitada (eg. Polimerasa del DNA se mueve a lo largo de la cadena del sustrato, en 2-D)
Las limitaciones en la mobilidad de las moleculas (y otras condiciones no-ideales) requieren de modificaciones a la cinetica de MM: cinetica fractal & enzimologia fractal.
La constante de velocidad del paso determinante es tambien llamada kcat ya que de esta define el nmero de moleculas de [S] transformadas a [P] por unidad de tiempo (turnover number)
Inhibicion Enzimatica
Inhibidores enzimaticos son moleculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Muchisimos farmacos (y pesticidas) son inhibidores enzimaticos La interaccion con un inhibidor puede evitar que un sustrato entre al centro activo detener la reaccion de catalisis
En general, la inhibicion irreversible ocurre cuando cierto agente reacciona con la enzima y produce cambios qumicos o estructurales
En general, la inhibicion reversible ocurre mediante interacciones no-covalentes.
La enzima ALDH-2 (aldehdo deshidrogenasa-2) es conocida por su capacidad para reducir el nivel de acetaldehdo, una molcula que se acumula con el consumo de alcohol y que es responsable de los sntomas causados por las resacas.
Un grupo de investigadores de EEUU ha demostrado ahora que un inhibidor de ALDH-2 hace que las ratas consuman menos cocana. El inhibidor acta indirectamente reduciendo la produccin y liberacin de dopamina (= euforia). (Nature Medicine, 24-08-2010)
Un inhibidor enzimatico es evaluado por su especificidad y su potencia (Kdis, que indica la concentracion necesaria para inhibir la enzima).
Una alta especificidad y potencia son indicadores de que el inhibidor (e.g. farmaco) tendra pocos efectos secundarios y/o toxicidad.
Algunos inhibidores enzimaticos tienen su origen en el organismo para regular el metabolismo,
Inhibicion Reversible
Estas sustancias se unen a la enzima en forma nocovalente (puentes-H, atraccion electrostatica y fuerzas de London)
No sostienen cambios qumicos
Inhibicion Competitiva
El sustrato [S] y el inhibidor [I] compiten por el centro activo al poseer estructuras semejantes. La union de cada uno es estadistica y depende de la concentracion. Un exceso de [S] favorece la reaccion hacia los productos.
Inhibicion No-competitiva
El inhibidor se une con igual afinidad a la enzima y al complejo enzima-sustrato. Tambin se le llama inhibicion mixta.
The effect of noncompetitive inhibitor cannot be overcome with high substrate concentration. A noncompetitive inhibitor reduces the reaction rate at all substrate concentrations.
The Michaelis-Menten equation for noncompetitive inhibition is:
Inhibicion Anticompetitiva
Es poco comun. En estos casos [I] se une al complejo [ES] en forma reversible.
2) Los graficos de Lineweaver-Burk son tiles para estimar KM y Vmax para la inhibicion enzimatica reversible.
Sin embargo las constantes de disociacion Ki (Keq para la formacion de [EI] y/o [ESI]), solo se pueden determinar con exactitud usando metodos de regresion no-lineales.
3) El diseo de frmacos usa de base molculas con estructura similar al estado de transicion del paso de catlisis.
Agonista: Se une a un receptor y tiene la misma funcin (imita) que el ligando natural. Por lo tanto tiene un efecto biolgico similar.
Antagonista: Compiten con el ligando natural y actuan como inhibidores reversibles competitivos, no-competitivos, e irreversibles.
Ritonavir, a protease inhibitor containing three peptide bonds. As this drug resembles the protein that is the substrate of the HIV protease, it competes with this substrate in the enzyme's active site.
Casos Especiales
En ciertas enzimas, se observa inhibicion por sustrato o inhibicion por producto; y esta inhibicion depende de la concentracion de [S] o [P] (feedback enzyme regulation).
(ii) En ciertos casos, un inhibidor reversible se convierte en irreversible (aun sin interaccion covalente!). Esto sucede en, Slow-tight inhibition cuando el complejo [EI] se isomeriza a un complejo ms estable (mayor fuerza en los enlaces) [EI*].
Inhibicion Irreversible
El agente a menudo contienen grupos funcionales electrofilicos reactivos: contienen el grupo carbonilo, C=O, que reacciona con grupos nucleofilicos, como el extremo amino, hidroxi o sulfidrilo de aas.
La inhibicion irreversible es diferente de la inactivacion irreversible. La primera es especfica y no es general para todas las enzimas; la segunda ocurre cuando hay destruccion de la estructura cuaternaria y generalmente es general para todas las enzimas (pH, calor, etc.)
Enzyme Immobilization
Advantages: increased stability to temperature and pH not effected by products or other pollutants not flushed away
Disadvantages Distorting enzyme within constrained conformation Partitioning of the enzyme within the support If substrates or products are insoluble.
E
E
Insoluble particle E
E
Insoluble particle
Cross-linked polymer
E E
Semipermeable membrane
Cross-linked polymer
E E
Semipermeable membrane
OH
OH
CNBr
Cyanogen bromide
O CN OH
Sepharose
O CNH OH
E NH2
O CN O
E
Immobilised enzyme on Sepharose
OH
OH
CNBr
O CN OH
O CNH OH
E NH2
O CN O
E
Immobilised enzyme on Sepharose
OH
OH
CNBr
O CN OH
O CNH OH
E NH2
O CN O
E
Immobilised enzyme on Sepharose
E
the number of potential coupling sites in the enzyme
Biscuits
Flour
Food/drink Enzymes
High fructose, glucose and maltose syrups Fruit juice
Sucrose Brewing
Meat
Cheese
Anaerobic Digestion
Proteins
Carbohydrates
Lipids
Protease s
Glucosidase s
Lipase s
Hydrolysis
Amino acids
Monosaccharides
Biogas
CH3COOH
H2; CO2
Aerobic Digestion
O2
Disadvantage: large amounts of biosolids containing volatiles, nutrients, pathogens, metals, toxic chemicals
Bioleaching
Role of enzymes in bioleaching associated with Au, Cu, Cd, etc.
Cu (II)
Outer Membrane
CopA
CopB
CopY CopZ
Periplasm
ATPases
CopD Cu (I)
Inner Membrane
Cupric Reductas e
Cu (II)
NADH
NAD+
Computational Modelling
Experimental validation
Hypothesis
Bioinformatics/Computational Biology
Use: Applied mathematics Statistics Computer science Chemistry/Biochemistry to solve biological problems at molecular level
Sequence & protein sequence alignment Genome assembly Protein structure alignment Gene expression