MTODOS DE ESTUDIO DE LA CLULA

BLOQUE I: BIOMOLCULAS

CLASIFICACIN
Tcnicas para el estudio fisicoqumico: sirven para conocer la composicin y relacionarla con las estructuras celulares. a) Fraccionamiento celular b) Cromatografa c) Electroforesis d) Cultivos celulares d) Autorradiografa Tcnicas para el estudio morfolgico de la clula. Nos permiten conocer cmo es su forma, su tamao y su estructura. a) Microscopa ptica b) Microscopa electrnica
1) Microscopio electrnico de Trasmisin (MET) 2) Microscopio electrnico de barrido (MEB) 3) Difraccin de rayos X

Tcnicas para el estudio fisicoqumico

Se utilizan para el aislamiento, localizacin e identificacin de las sustancias que constituyen la materia viva. Presentan dos problemas principalmente:
a) Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas. b) La mayora de las sustancias que encontramos en los seres vivos son, a su vez, de una gran complejidad. Por ejemplo, que una sola de los varios miles de protenas que contiene una clula puede estar formada por ms 5000 aminocidos.

Fraccionamiento celular
Consiste en la rotura controlada de tejidos y clulas para separar orgnulos o componentes intracelulares.

Esta tcnica requiere los siguientes pasos: 1) HOMOGENEIZACIN 2) CENTRIFUGACIN

HOMOGENEIZACIN:
Coniste en una ruptura del tejido por:
Plasmlisis Aplastado Batido Ultrasonidos

As el material biolgico, se disgrega y romper las membranas celulares. La rotura de las membranas deja en libertad los orgnulos celulares y el contenido del hialoplasma. Si la homogeneizacin se realiza suavemente, los orgnulos permanecern intactos. Obtendremos as una "papilla" que estar compuesta de restos de membranas, orgnulos celulares, ncleos, molculas libres y agua.

CENTRIFUGACIN:
Las ultracentrugas son aparatos que consiguen velocidades de rotacin muy elevadas, hasta 500.000 v/mn. En el interior de estos aparatos se alcanzan grandes aceleraciones que se miden en g (1g=9,8 m/s2). En una ultracentrfuga pueden alcanzarse hasta 100.000 g. Se realizan centrifugaciones sucesivas, a distintas velocidades, que permiten la separacin de los distintos componentes celulares Los materiales biolgicos sometidos a estas aceleraciones se desplazan hacia el fondo de los recipientes que los contienen con velocidades que dependen de su masa, de su forma y volumen, y de la naturaleza del medio en el que se realice la centrifugacin. el Svedverg (S) es la unidad que mide la velocidad en que se sedimentan los diferentes materiales biolgicos e funcin de su densidad.

Fraccionamiento celular

CROMATOGRAFA
Se fundamenta en la separacin de los componentes de una mezcla por sus diferencias de absorcin. Estas diferencias se deben:
a las fuerzas de Van der Wals (fuerzas atractivas o
repulsivas entre molculas o en partes de una misma molcula) que se establecen entre los componentes de

la mezcla y una sustancia que acta de fase estacionaria. Segn la naturaleza de la fase estacionaria, tendremos los siguientes tipos de cromatografa: CROMATOGRAFA SOBRE PAPEL CROMATOGRAFA DE GASES

CROMATOGRAFA SOBRE PAPEL

Se emplea para la separacin de sustancias qumicas que presenten propiedades muy parecidas. Se opera de la siguiente manera: Una pequea cantidad de la mezcla a separar se deposita sobre un fragmento de papel poroso en el que quedar embebida. A continuacin se introduce el borde del papel en una sustancia en la que sean solubles los componentes de la mezcla que queremos separar. El disolvente se desplazar por capilaridad y los ir arrastrando. Los componentes de la mezcla viajarn ms o menos rpido segn establezcan fuerzas ms o menos grandes con las molculas del papel. Para observar los componentes ya separados se emplean reacciones coloreadas especficas.

CROMATOGRAFA SOBRE PAPEL

CROMATOGRAFA DE GASES
El aparato consiste en un serpentn largo y delgado cuyas paredes estn impregnadas de un fluido (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza y atraviesa el serpentn transportada por un gas. La fase estacionaria retiene ms o menos los diferentes componentes de la mezcla. Estos se detectan cuando al atravesar una llama entran en combustin, lo que aumenta la conductividad elctrica del detector. Este mtodo tiene la ventaja de necesitar pequesimas cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias muy parecidas qumicamente; por ejemplo: cidos grasos,azcares u hormonas.

CROMATOGRAFA DE GASES

ELECTROFORESIS
En este mtodo, la mezcla a separar se deposita en una cubeta sobre un soporte de tipo poroso (acetato de celulosa o gel de almidn). A continuacin se establece una diferencia de potencial entre los extremos del soporte. Las sustancias que componen la mezcla se desplazarn en funcin de su carga elctrica. Este mtodo se emplea con sustancias que presenten cargas elctricas, como protenas y cidos nucleicos

ELECTROFORESIS

CULTIVOS CELULARES
Estos mtodos nos van a permitir mantener lneas celulares en el exterior de un organismo en condiciones favorables a su multiplicacin. La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biolgico y su estandarizacin. Las clulas extradas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones fsicas y qumicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son capaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada tipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos perodos de tiempo.

CULTIVOS CELULARES

AUTORRADIOGRAFA
Consiste en suministrar istopos radiactivos a la clula, de forma que slo puedan ser incorporados a determinadas molculas. Estos radioistopos son inestables y emiten radiaciones ionizantes que se registran en contadores Geiger. As se sigue el recorrido de los radioistopos por la clula y los tejidos. Uno de los primeros usos fue seguir el CO2 marcado con 14C en el proceso de la fotosntesis.

AUTORRADIOGRAFA

MTODOS MORFOLGICOS
Los mtodos morfolgicos nos van a permitir la observacin directa de la estructura celular. El ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre s 0,2 mm. Este es el poder separador o poder de resolucin del ojo. Las clulas de mamfero suelen tener unos 0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellas detalles estructurales. El microscopio va a permitir su observacin al aumentar el poder de resolucin del ojo.

MICROSCOPIO PTICO
FUNDAMENTO:
Una fuente luminosa enva rayos de luz a una primera lente, llamada condensador, que concentra los rayos de luz sobre el objeto a observar. Estos rayos atraviesan el objeto y una lente denominada objetivo da una imagen aumentada de ste. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por el objetivo. Esta ltima imagen es la que ser recibida por el observador

MICROSCOPIO PTICO

PREPARACIN DEL MATERIAL

Requiere las siguientes etapas:
Corte Fijacin Deshidratacin Tincin Montaje

Corte
Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominados micrtomos. Estos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor, corrientemente entre 3 y 20 . El tejido destinado al corte debe congelarse o incluirse en parafina para darle una mayor consistencia y que se pueda cortar con facilidad.

Fijacin
Su fin es matar a las clulas con la menor alteracin de las estructurasp osible, para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismo celular o por la descomposicin. Como fijadores se emplean determinadas sustancias qumicas:
Formaldehdo Tetrxido de osmio.

Deshidratacin
La extraccin del agua del interior de las clulas permitir una mejor conservacin y la penetracin de los colorantes. Para deshidratar el material se le sumerge en alcoholes de cada vez mayor graduacin que por dilucin irn extrayendo el agua

Tincin
Es la coloracin de las clulas o de partes de stas para que resalten y posibilitar as su observacin. Algunos colorantes son selectivos pues tien partes concretas de la clula. Existen dos clases de colorantes:
a) Los colorantes vitales. Que tien las estructuras celulares pero sin matar a las clulas (el verde de metilo, el rojo neutro, el azul de metileno). b) Los colorantes no vitales. Que matan a las clulas (eosina, hematoxilina)

Montaje
Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre un porta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre "porta" y "cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duracin limitada y slo sirven para la observacin momentnea o a lo sumo de unos das. Si se desea una mayor duracin debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina.

MICROSCOPIO ELECTRNICO
Existen dos clases de microscopios electrnicos: B1) Microscopio electrnico de trasmisin (MET). B2) Microscopio electrnico de barrido (MEB).

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN (MET)

El microscopio electrnico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos tericos de De Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partculas.
Como ondas pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al ser partculas negativas pueden ser desviadas por campos elctricos que actan como lentes.

En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio ptico. Un ctodo emite un haz de electrones que son acelerados por la aplicacin de una diferencia de potencial entre el ctodo y el nodo. El flujo de electrones es concentrado sobre el objeto por una primera lente magntica que hace las veces de condensador. Los electrones atraviesan la muestra. Una segunda lente magntica, el objetivo, da una imagen aumentada del objeto. Una tercera lente, el ocular, aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. La imagen final es proyectada sobre una pantalla o fotografiada. Los microscopios electrnicos permiten aumentos tiles que van de 2000 a 100.000 pudiendo llegar hasta 600.000. Los microscopios electrnicos son aparatos de hasta 2 m de alto y llegan a pesar 500 kg.

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB)

Este tipo de microscopio permite obtener imgenes tridimensionales del objeto a estudiar. Primero se efecta un sombreado metlico de la superficie de la muestra, y la rplica obtenida es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se forman son captados y convertidos en imgenes sobre una pantalla de televisin. Estos microscopio son muy tiles para revelar estructuras anatmicas submicroscpicas. Su aumento no suele pasar de 20.000

DIFRACCIN DE RAYOS X
Tcnica de microscopa electrnica que se utliza para estudiar detalles de la estructura molecular de los componentes celulares. El haz de rayos X puede determinar la disposicin de los tomos en una molcula. Los rayos X son dispersados por por los electrones de la muestra, de modo que los tomos grandes se detectan con msfacilidad que los pequeos. El patrn de difraccin se recoge en una placa fotogrfica y nos permite obtener modelos tridimensionales

PREPARACIN DEL MATERIAL

Los electrones necesitan desplazarse en el vaco, esta es la razn por la que no es posible la observacin de clulas vivas al microscopio electrnico. A) FIJACIN: Las clulas son fijadas mediante fijadores no coagulantes. Los ms corrientes son el tetrxido de osmio (OsO4), el formaldehdo (HCHO) y el permanganato potsico (MnO4K). Los metales pesados que algunos contienen se fijan selectivamente a las diferentes estructuras celulares. Aquellas que retengan ms los metales aparecern ms oscuras. Es por esto que la imagen depende mucho del tipo de fijador utilizado. B) DESHIDRATACIN e INCLUSIN: La pieza es deshidratada e infiltrada mediante una resina o plstico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte. C) CORTE. Los cortes se realizan mediante ultramicrotomos de cuchilla de vidrio o de diamante. Los cortes ms finos (0,03) son depositados sobre un tamiz y dispuestos para su observacin al microscopio.

MICROSCOPIO PTICO/ELECTRNICO

MICROSCOPIO PTICO/ELECTRNICO

MICROSCOPIO PTICO/ELECTRNICO
Se observa la estructura Aparato relativamente barato Preparaciones sencillas Poco aumento (X1000) Se pueden ver seres vivos Fuente de iluminacin: La luz Se observa la ultraestructura Instrumento muy caro Preparaciones complejas Mucho aumento (X300 000) No se pueden ver los seres vivos Fuente de iluminacin: electrones