Evaluación de la actividad antifúngica del compuesto capsaicinoide

ABX-I sobre hongos fitopatógenos

Titulación integral por tesis para obtener el titulo de ingeniero bioquímico
Instituto Tecnológico de Morelia
Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo

Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas
Laboratorio de biotecnología molecular de plantas a cargo del Dr. Homero Reyes de la Cruz

Asesor: Dr. Jesús Salvador López Bucio

Coasesor: Dr. Ramón Pelagio Flores
Asesor interno: Dr. José Fernando Covián Nares
Presenta : C. Saúl Vázquez Fuentes
 Agricultura

 Uno de sus objetivo es proporcionar un abastecimiento de alimentos constante para las

satisfacción parcial de las necesidades alimenticias del ser humano por medio de la
aplicación de distintas técnicas y conocimientos que permiten hacer eficiente la
producción de recursos agrícolas. (Yvonne, 2006. World Archaeology 38: 153-163)
Factores que afectan al desarrollo vegetal
Problemáticas actuales
Lluvia en las prácticas agrícolas
Luz

• Escasez de agua y
Viento Patógenos nutrientes,
Plagas
• Agotamiento y
contaminación de los
suelos, mantos acuíferos
• Cambio climático
Nutrientes • Incremento en la frecuencia
Tropismos de desastres naturales a
causa del cambio climático.
Niveles de agua • Estrés biótico
(Mall et al., 2017. Current Developments in biotechnology and bioengineering 2:23-46)
Factores bióticos
• Animales
• Plantas
• Microorganismos • Botrytis cinerea (Moho gris)
*Protistas • Fusarium graminearum (Infecta todas las
*Bacterias especies de cereales)
• Hongos • Fusarium oxysporum (Causa marchites
vascular, y puede ser infeccioso en humanos)
• Colletotrichum spp (Antracnosis)
• Rhizoctonia solani. (Marchitamiento fúngico)

Responsables de perdidas del 30% en promedio de los cultivos precosecha y llegando a

ocasionar perdidas del 100% post cosecha.
(Dean et al., 2012. Molecular Plant Pathology 13:414-430; Landero-Valenzuela et al., 2016. Revista Mexicana de ciencias agrícolas 7:1189-1198))
 Sintomatología característica de hongos fitopatógenos

Hongos de interés
agronómico
a) Botrytis cinerea

b) Colletotrichum
spp
c) Fusarium spp
d) Rhizoctonia solani

Williamson et al., 2007. Molecular Plant Pathology: 561-580;

Phoulivong S., 2011. Current Research in enviromental &Applied
Mycology 1:53-73; Antonissen et al., 2014.Toxins 6:430- (Dal Bello et al., 2017;Scott, N., 2008; Vásquez-Ramírez & Castaño-Zapata, 2017;Howard F. Schwartz,
452;Misawa T. & Kuninaga S., 2010. Journal of General Plnat Colorado State University, Bugwood.org, 2018)
Pathology 76; 310-319
 • Resistencia (2-20 años)
Control de plagas fúngicas • Impacto en la salud humana
• Control de cultivos • Efecto negativo en organismo benéficos
• Control físico • Difícil degradación, favoreciendo la
• Control biológico movilidad y bioacumulación
• Control químico
*Sintético (Orgánico
e inorgánico)
*Biológico
• Manejo integral

(Rojo-Baez et al., 2019. Revista mexicana de fitopatología 35: 549-570; Stenberg et al., 2015. Trends in plant science 20: 698-712; Kohl et al., 2019. Frontiers in plant science 10: 845;
Soares-Brauer et al., 2019. Biomolecules 9: 1-21; Yang et al., 2011. ISRN Biology:1-8; Zubrod et al., 2019. Enviromental science & technology 53:3347-3365; Bolognesi C. & Merlo F.D.,
 Fungicidas químicos biológicos.
Ventajas Desventajas
• Menor efecto ambiental. • Síntesis dependiente de organismos
• Potencial similar a biológicos
fungicidas sintéticos. • Procesos de extracción y
• Inducción de resistencia purificación costosos
menor

Metabolitos secundarios
• Fenilpropanos
• Favorecer relaciones simbióticas.
• Acetogeninas
• Evitar la depredación.
• Terpenoides
• Protección contra enfermedades.
• Alcaloides
• Ventajas en la competencia
• Esteroides
• Adaptabilidad ante factores físicos y
químicos.
Seagraves & Lundgren, 2012. Journal of Pest Science: 125-132; Sepúlveda-Jimenéz et al., 2003. Revista Mexicana de Fitopatología 21: 355-363.
 Capsaicina
La capsaicina es un alcaloide de
fórmula
Se considera que su función
natural esta relacionada con la
protección de la planta contra
depredadores y contra algunos
organismos fitopatógenos.
No se bioacumula

Cedrón, 2013. PUCP 27:1-2; Rezende-Naves et al., 2019. Trends in Plant Science 109-120
 Capsaicinoide Hongo Inhibición Bibliografía
Antecedentes (%)
Capsaicina 1170 B. Cinerea 12.1 Xing et al., 2006. Journal
ppm A. niger 11.0 of Applied Polymer Science
102:1318-1321
Capsaicina 8 Fusarium ≈50 Tewksbury et al., 2008.
mg/g peso seco (Tewksbury) PNAS 11808-11811
de chile
Capsaicina 0.5 Verticillium 46.1 Veloso et al., 2012. Plant
mM dahliae UDC53Vd Biology : 177-185
Botrytis cinerea 35.9
2850
Rhizoctonia solani 45.6
2815
Fusarium 33.3
oxysporum f. sp.
lycopersici 2715
Pythium ultimum 49.1
Phytophthora 79.1
capsici UDC299Pc
Efecto de los capsaicinoides en la infección
por Fusarium en plantas de pimiento Dihidrocapsaici Verticillium 37.4
Tewksbury et al., 2008. PNAS 11808-11811 na 0.5 mM dahliae
(isolate VDL)
 CAPSAICINOIDES

Efecto de la N-
Rezende-Naves et al, 2019. Trends in Plant Science 24:109-120; Chen et al., 2019. PUCP 27:1-2 Vanillylnonamide en la
infección pro B. cinerea en
Veloso et al., 2012. Plant Biology : 177-185
hojas
Tratamiento con capsaicinoides a plantas de chile infectadas por distintas
cepas de Verticillum dahliae
Veloso et al, 2012. Plant Biology 16:177-185
 ABX-I (N-Vanillyl-octanamide)
Sintetizado por catálisis enzimática a
partir de una reacción directa de
amidación catalizada por la lipasa B
de Candida antarctica en 2-metil-2-
butanol con un rango de conversión
del 83-97.5%
Características equiparables a las de la
capsaicina.

Castillo et al., 2007.Biochemical and Biophysical Research Communications 356: 424-430;

Castillo et al.,2007. Food chemistry 100: 1202-1208
 Justificación
Las enfermedades por hongos son una de las principales causas de pérdida de
cultivos en el mundo, ocasionando pérdidas de producto, producción, calidad y
valor económico de cultivos, estimando un promedio de 30% en pérdidas y
hasta 100% de pérdidas post cosechas.
Siendo el control químico la principal alternativa de control fúngico, se requiere
de la creación de alternativas efectivas que puedan remplazar el uso de
fungicidas químicos y que su impacto con el medio ambiente sea mínimo ya
que esta forma de control es altamente toxica, produce un gran daño ambiental y
repercute sobre la vida de muchos organismos y el ser humano.
Recientemente se ha observado que los capsaicinoides poseen efecto antifúngico
además de que se estableció un método de síntesis mediante el cual se pueden
obtener de manera eficiente y rentable.
 Hipótesis
El compuesto capsaicinoide ABX-I posee actividad antifúngica contra un
amplio espectro de hongos fitopatógenos, además de proveer protección al
tejido vegetal contra infecciones fúngicas.
Objetivo general
Analizar el potencial antifúngico del compuesto capsaicinoide ABX-I sobre
hongos fitopatógenos.

Objetivos específicos
1. Determinar el efecto del compuesto ABX-I sobre del crecimiento micelial de
hongos fitopatógenos in vitro.
2. Analizar el efecto del compuesto ABX-I in vitro sobre la germinación de
esporas de Colletotrichum gloeosporioides y Botrytis cinerea.
3. Evaluar el efecto del compuesto ABX-I en el crecimiento y desarrollo de las
plantas de jitomate.
4. Evaluar el efecto del compuesto ABX-I en la inhibición del crecimiento de
Colletotrichum gloeosporioides y Botrytis cinerea in vivo sobre la infección en
fruto de aguacate y jitomate respectivamente, sobre hojas de jitomate.
1. Determinar el efecto del compuesto ABX-I sobre del crecimiento micelial de
hongos fitopatógenos in vitro.

Agar PDA Inoculado con 5 Determinación

suplementado a cepas distintas de del crecimiento
diferentes hongos diametral del
concentraciones de fitopatógenos micelio.
capsaicinoides

2. Analizar el efecto del compuesto ABX-I in vitro sobre la germinación de esporas de

Colletotrichum gloeosporioides y Botrytis cinerea.

Laminas de agar PDA y Inoculado con Análisis

medio PDB esporas de C. microscopio y
suplementado a gloeosporioides y conteo de esporas
diferentes B. cinerea germinadas
concentraciones de ABX-
I
Efecto del capsaicinoide ABX-I sobre el crecimiento
micelial de hongos fitopatógenos.

Las barras representan el promedio ± el error estándar de una n=4

colonias de micelio de 5 replicas del experimento, los colores muestran
las diferentes cepas utilizadas y las letras indican las diferencias
estadísticas determinadas a través de ANOVA y Tukey test (P<0.01)
Efecto del
capsaicinoide ABX-I
sobre el crecimiento
micelial de hongos
fitopatógenos.

Las barras representan el

promedio ± el error
estándar de una n=4
colonias de 5 replicas del
experimento, los colores
muestran las diferentes
cepas evaluadas y las
letras indican las
diferencias estadísticas
determinadas a través de
ANOVA y Tukey test
(P<0.01).
Efecto diferencial
producido por la
capsaicina y ABX-I
sobre hogos
fitopatógenos.

Las barras representan el

promedio ± el error
estándar de una n=5
colonias de micelio de2
replicas del experimento,
los colores muestran las
diferentes cepas evaluadas
y las letras indican las
diferencias estadísticas
determinadas a través de
ANOVA y Tukey test
(P<0.01).
 Efecto diferencial producido por los capsaicinoides sobre B. cinerea.

Las barras representan el promedio ± el error estándar de una n=5 colonias de micelio de 2 replicas del experimento, y las
letras indican las diferencias estadísticas determinadas a través de ANOVA y Tukey test (P<0.01).
Efecto celular del capsaicinoide ABX-I
sobre la geminación de esporas de C.
gloeosporioides

Las barras representan el promedio ± el error estándar

de una n=20 esporas germinadas y las marcas indican
las diferencias estadísticas a través de un análisis t
Student (P<0.001).
 Efecto del capsaicinoide ABX-I en la germinación de esporas de Botrytis cinerea
y Colletotrichum gloeosporioides

Las barras representan el promedio ± el error estándar de una n=3 inóculos de esporas de 2 replicas del experimento, los
colores muestran las diferentes concentraciones del capsaicinoide evaluadas y las letras indican las diferencias
estadísticas entre cada día determinadas a través de ANOVA y Tukey test (P<0.05).
3. Evaluar el efecto del compuesto ABX-I en el crecimiento y desarrollo de las plantas de
tomate.
Plantas de tomate asperjadas con Evaluación de efectos macroscópicos adversos
soluciones a distintas concentraciones de producidos por el compuesto
ABX-1

4. Evaluar el efecto del compuesto ABX-I en la inhibición del crecimiento de Colletotrichum

gloeosporioides y Botrytis cinerea in vivo sobre la infección en fruto de aguacate y jitomate
respectivamente, sobre hojas de jitomate.

Frutos y hojas de tomate y Evaluación de grado de

Infección con esporas de B. cinerea
frutos aguacate tratados con infección en el tejido vegetal
para tomate y C. gloeosporioides para
distintas concentraciones del producido por los patógenos
aguacate
capsaicinoide
3 días post
inoculación Acción protectora de ABX-1 sobre
hojas de tomate infectadas con
esporas de B. cinerea

5 días post
inoculación

Las barras representan el

promedio ± el error estándar de
una n=5 hojas infectadas por
tratamiento y las letras muestran
diferencias estadísticas entre cada
tratamiento determinadas a través
de ANOVA y Tukey test (P<0.05).
 Acción
protectora de Efecto del compuesto ABX-I sobre plantas
ABX-I sobre aplicado por medio de aspersión.
fruto de tomate
contra la
infección
causadas
B.cinerea

Las barras representan el

promedio ± el error
estándar de una n=4
tomates de 2 replicas del
experimento y la marca
representa las
diferencias estadísticas
obtenidas a través de un
análisis t Student
(p<0.01)
Acción protectora del compuesto ABX-I sobre frutos de
aguacate contra la infección por C. gloeosporioides.
Efecto del compuesto ABX-I sobre plantas aplicado por medio
de aspersión

Las barras representan el promedio ± el error estándar de una n=4 aguacates de 2

replicas del experimento y la marca representa las diferencias estadísticas
obtenidas a través de un análisis t Student (p<0.01)
 Conclusión
• El capsaicinoide ABX-1 posee efecto antifúngico de forma dosis dependiente directamente proporcional
a la inhibición sobre el hongo, tanto en el crecimiento micelial como en la germinación de esporas,
produce alteraciones en la morfología y características de crecimiento de los hongos, induciendo la
proliferación de ápices en las hifas, causando deformaciones en las primeras etapas post germinación y
disminuyendo la elongación de estas.

• Existe un efecto antifúngico diferencial entre los distintos capsaicinoides que no esta ligado al grado de
pungencia.

• El compuesto capsaicinoide ABX-1 posee actividad antifúngica contra las 5 cepas fúngicas utilizadas en
el presente trabajo, los que lo vuelve un potencial producto agronómico ya que no posee un efecto
adverso aparente en las plantas de tomate y aguacate permitiendo su aplicación con un menor número
de restricciones que otros fungicidas comerciales.

• La reducción del deterioro causado por los hongos en los frutos y hojas infectados, al ser tratados con el
capsaicinoide ABX-1, abre la puerta al uso de este compuesto como una alternativa para aumentar la
vida de anaquel de distintos productos al permitir conservar la calidad de estos por un mayor tiempo
cuando esto son infectados alguno de los patógenos utilizados.
Agradecimientos
 Referencias

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pesticide class? Environmental Science & Technology, 3347-3365.
Material complementario
Mecanismo de accion Grupo químico con actividad Ejemplos
fungicida.
Lípidos, esterol y otros Hidrocarburos aromáticos, Dicloran, etridiazol, triadimefon, triticonazol,dimetomorf,hexaconazol,
componentes de triazoles, amidas de ácido fenpropimorf,propiconazo, acriflavina
membrana cinámico, clorhidrato, morfolina
Síntesis de aminoácidos Glucopiranosil, Tetraciclina Estreptomicina, oxitetraciclina
y proteínas
Transducción de señales Fenilpirroles, dicarboxamidas Fludioxonil, iprodiona, vinclozolin

Respiración Pirimidinas, piridin carboxamidas, Diflumetorim, boscalid, flutolanil, carboxin, fluazinam, dinocap
xantin carboxamidas,2,6-
dinitroanilinas,
Dinitrofenilcromato
Mitosis y división Metil benzimidasol carbamato, Benomilo, carbendazim, pencicuron
celular fenilurea
Síntesis de ácidos Acilalaninas, oxazolidinonas, Metalaxil, oxadixil, etirimol
nucleicos hidroxypirimidinas
Actividad mutisitio Ftalonitrilo, ditiocarbamato, Cloratalonil, mancozeb, captan, tiram, ditianon, sulfato cuprico.
ftalimida, antraquinona, cobre

Soares-Brauer et al., 2019. Biomolecules 9: 1-21; Yang et al., 2011. ISRN Biology:1-8; Zubrod et al., 2019. Enviromental science & technology 53:3347-3365.
 Propiedades de los capsaicinoides
Capsaicina
ABX-I La capsaicina es un alcaloide de fórmula
Formula: Punto de fusión: 28-34°C Sólido a temperatura ambiente (punto de fusión 64°C).
De carácter más económico que la Se encuentra en forma de una oleo resina
capsaicina comercial disponible la cual tiene Se considera que su función natural esta relacionada con la
un SHU de 3,500,000. protección de la planta contra depredadores y posiblemente
Posee un valor SHU de 10,500,000 el cual al contra algunos organismos fitopatógenos.
ser un valor alto de pungencia y por tanto Propiedades antinflamatorias, antitumorales, antioxidantes,
puede estar directamente relacionado con la analgésicas, para perdida de peso y como aditivo alimenticio.
magnitud del efecto antifúngico Capsaicina 100% tiene un SHU de 16,000,000
Síntesis y purificación costosa y poco eficiente.

Cedron, 2013. PUCP 27:1-2

 Degradación de los capsaicinoides
Los capsaicinoides se degradan a partir de las enzimas Citocromo P450 en el hígado dando como resultados
diferentes productos como ácidos grasos, además de tener un permanencia de hasta 4 días cuando es
administrada por vía oral

esh & Snirivasan, 2010. Tissue distribution & elimination of capsaicin, piperine & curcumin following oral intake in rats. Indian J Me
:682-91.
Conidias germinadas de Colletotrichum capsici en medios de agar papa-dextrosa con
diferentes concentraciones de capsaicina después de 5, 6 y 7 horas de incubación.

Kasetsart et al, 2008. Nat. Sci. 42:417-422

 Metodología
Determinar el efecto del compuesto ABX-I sobre del crecimiento micelial de hongos fitopatógenos in vitro.

PDA
suplementado con Inoculación del
Medición del crecimiento
ABX-I (100, 200, medio de cultivo Incubación a 25°C
radial del hongo a analizar
400, 800 y 1600 con un disco de en ausencia de luz
cada 24 h.
µM), capsaicina micelio de 6 mm de
(800 y 1600 µM) y diámetro.
%I=
DMSO como
control • Fusarium spp Donde:
• Colletotrichum %I=Porcentaje de inhibición
gloeosporoides =Crecimiento micelial promedio del hongo tratado
• Colletotrichum acutatum con ABX-I
• Botrytis cinerea =Crecimiento micelial promedio del hongo sin
• Rhizoctonia solani AG2 tratamiento
Analizar el efecto del compuesto ABX-I in vitro sobre la germinación de
esporas de Colletotrichum gloeosporioides y Botrytis cinerea.
Recolección por filtración de esporas
Crecimiento de
usando tela quirúrgica SMS.
hongos fitopatogenos
*Colletotrichum gloeosporioides
en medio PDA
*Botrytis cinerea

Medio PDA y PDB Inoculación con suspensión

suplementado con ABX-I a de esporas
distintas concentraciones
(400, 800 y 1600 µM).

Laminas de PDA: 5 µl de una solución PDB:500000 esporas/mL

de 100000 esporas/mL incubadas a incubadas a 25°C en
25°C con ausencia de luz. agitación con ausencia de
luz.

Tomar fotos en microscopio (objetivos Conteo de esporas en

x10 y x40 y en microscopio de campo cámara de Neubauer a
claro (objetivo x20). diferente tiempo con
microscopia óptica
(objetivo x40)
  Evaluar el efecto del compuesto ABX-I en el desarrollo de las plantas de jitomate y aguacate.

Semilla de jitomate esteril Sustrato esteril para planta.

*Hipoclorito de sodio al 70% Mezcla 3:1:1 de: Peat moss:
*Lavandos con agua destilada estéril Vermiculita: Perlita

Sembrado de plantas de jitomate en sustrato estéril en

sistemas de 4x6 semillas por tratamiento.

Incubación a 21 °C con períodos de iluminación/oscuridad

de 16/8 horas y humedad constante, por 15 días.

Tratamientos:
-Aspersión con
Riego con tratamiento de ABX-I
solución de ABX-I a
y DMSO/agua como control hasta
400, 800 y 1600 µM
finalizar el experimento (2
DMSO/agua como
meses)
control
Monitorea parámetros de
desarrollo en la planta cada 8 días.
Evaluar el efecto del compuesto ABX-I en la inhibición del crecimiento de
Botrytis cinerea in vivo sobre la infección de hojas de jitomate.
Sembrado de plantas de jitomate en
sistemas de 4x6 semillas por
tratamiento.

Incubación a 21 °C con períodos de iluminación/oscuridad

de 16/8 horas y humedad constante, por 15 días.

Tratamientos:
Aspersión con tratamiento de ABX- Crecimiento de hongos fitopatogenos en medio
-ABX-I a 400, 800
I y DMSO/agua como control PDA
y 1600 µM
durante 1 semana, regando con
-DMSO/Agua Recolección por filtración de esporas del
agua estéril hasta finalizar el
como control. hongo Botrytis cinerea usando tela
experimento.
quirúrgica estéril y cuantificación por
Elección de hojas similares en medio de una cámara de Neubauer
tamaño y condiciones de
clorofila

Tratamientos por inmersión de Infección de las hojas Evaluar daño de la

soluciones a distinta concentración de con 10000- 30000 infección en un
ABX-I y DMSO/Agua como control esporas en suspensión periodo de 3 a 5
durante 20 min. aprox. días.
 Evaluar el efecto del compuesto ABX-I en la inhibición del crecimiento e infección de Colletotrichum
gloeosporioides y Botrytis cinerea in vivo sobre la infección en fruto de aguacate y jitomate
respectivamente.
Desinfección de frutos de aguacate y jitomate con Crecimiento de los hongos Colletotrichum
hipoclorito de sodio al 20% gloeosporoides (para aguacate) y Botrytis cinerea (Para
jitomate), en medio PDA

Perforación en el pedúnculo del fruto Recolección de las esporas por filtración y

suspensión de las mismas en agua.
Inoculación con Inoculación en
tratamiento de ABX-I pedúnculo del fruto Cuantificación de las
a 1600 µM y con aproximadamente suspensiones de esporas.
DMSO/Agua como 30000 esporas por
control. fruto.

Monitoreo signos de infección cada

día

Aproximadamente en un lapso de entre 3 y 5 días

después de la inoculación se realizo un corte
transversal del fruto y estimo el área de lesión interna.