KUALITAS SPERMATOZOA PASCA IMOBILISASI BEBERAPA

BAGIAN SPERMAOZOA SAPI FH MENGGUNAKAN LASER DIODA

SKRIPSI

OLEH

ATHHAR MANABI DIANSYAH

I 111 15 353

FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2019

i
 KUALITAS SPERMATOZOA PASCA IMOBILISASI BEBERAPA
BAGIAN SPERMAOZOA SAPI FH MENGGUNAKAN LASER DIODA

SKRIPSI

OLEH

ATHHAR MANABI DIANSYAH

I 111 15 353

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana

Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin

FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2019

ii
 PERNYATAAN KEASLIAN

1. Yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Athhar Manabi Diansyah

NIM : I111 15 353

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa:

a. Karya skripsi yang saya tulis adalah asli

b. Apabila sebagian atau seluruhnya dari karya skripsi ini, terutama bab

hasil dan pembahasan tidak asli atau plagiasi maka bersedia dibatalkan

atau dikenakan sanksi yang berlaku.

2. Demikian pernyataan keaslian ini dibuat untuk dapat diperlukan semestinya

Makassar, 26 Februari 2019

Athhar Manabi Diansyah

iii
 HALAMAN PENGESAHAN

Judul Penelitian : Kualitas Spermatozoa Pasca Imobilisasi Beberapa Bagian

Spermaozoa Sapi FH Menggunakan Laser Dioda

Nama : Athhar Manabi Diansyah

Nomor Induk Mahasiswa : I111 15 353

Fakultas : Peternakan

Skripsi ini Telah diperiksa dan disetujui oleh:

Tanggal Lulus: 26 Februari 2019

iv
 KATA PENGANTAR

Assalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatuh

Puji dan Syukur senantiasa penulis panjatkan atas kehadirat Allah

Subhanahu Wa Taala Tuhan Yang Maha Esa, karena atas Kehendak, Rahmat dan

InayahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan makalah hasil penelitian yang

berjudul “Kualitas Spermatozoa Pasca Imobilisasi Beberapa Bagian

Spermatozoa Sapi FH Menggunakan Laser Dioda”. Tak lupa pula salam serta

shalawat senantiasa penulis haturkan kepada Rasulullah Muhammad Shallallahu

Alaihi Wasallam sebagai suri tauladan ummat manusia.

Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah

membantu dalam menyelesaikan makalah hasil penelitian ini, antara lain:

1. Kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Lellah Rahim, M.Sc sebagai Dekan Fakultas

Peternakan Universitas Hasanuddin.

2. Kepada Bapak Dr. Ir. Syahruddin Said, M.Agr sebagai Kepala Laboratorium

Reproduksi, Pemuliaan dan Kultur Sel Hewan, Pusat Penelitian Bioteknologi

LIPI, Bogor, Jawa Barat.

3. Kepada Bapak Prof. Dr. Muhammad Yusuf, S.Pt sebagai Pembimbing

Utama yang telah mengarahkan dan memberikan banyak masukan.

4. Kepada Ibu Dr. Ekayanti M. Kaiin, M.Si sebagai Pembimbing Anggota yang

telah membimbing, mengarahkan, memberi berbagai ilmu, petuah dan

semangat.

5. Kepada Bapak M. Gunawan, S.Pt., M.Si dan Bapak Tulus Maulana, S.Pt.,

M.Si yang telah mengarahkan dan memberikan berbagai ilmu, petuah dan

semangat.

v
6. Kepada Staff Laboratorium Reproduksi, Pemuliaan dan Kultur Sel Hewan,

Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, Bogor, Jawa Barat.

7. Kepada rekan mahasiswa dari Universitas Teknologi Sumbawa, Universitas

Indonesia, Institut Pertanian Bogor dan Universitas Soedirman.

8. Kepada kedua Orangtua saya, Bapak Dr. Ir. Syahruddin Said, M.Agr dan Ibu

dr. Rosdiana Rasyidi, MARS atas dorongan dan dukungan baik moril

maupun materil.

9. Kepada kedua adik saya, Faiqoh Dian Syahruddin dan Athoillah Ahkam

Diansyah atas dorongan dan dukungan baik moril maupun materil.

10. Kepada keluarga besar RANTAI 15, keluarga besar HIMAPROTEK-UH,

keluarga HmI Komisariat Peternakan Unhas Cab. Makassar Timur,

keluarga besar SEMA FAPET-UH, keluarga besar ISMAPETI dan keluarga

KKN Reguler Kab. Bantaeng Kec. Pa’jukukang Desa Biangloe yang telah

memberikan bantuan dan semangat kepada penulis.

11. Kepada St. Azizah Mahmud dan Adinda Maharani atas dorongan dan

dukungan baik moril maupun materil.

12. Kepada Hamdiyani Rusman, Fatiha Aprilianti dan Tuty Alawiyah atas

dorongan dan dukungan baik moril maupun materil.

13. Kepada Rekan Rusunawa Blok C no. 308 atas dorongan dan dukungan baik

moril maupun materil.

14. Kepada Fadillah Ahmad Agasi dan Glorinda Ella Teken atas dorongan dan

dukungan baik moril maupun materil.

Serta semua pihak atas segala perhatiannya dan bantuan kepada penulis,

yang tidak dapat penulis tulis satu persatu. Penulis menyadari bahwa makalah ini

jauh dari kesempurnaan, akan tetapi penulis telah berusaha melakukan yang terbaik

vi
dalam penyusunannya. Semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi

kita semua. Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih.

Wassalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatuh

Makassar, 26 Februari 2019

Athhar Manabi Diansyah

vii
 ABSTRAK

ATHHAR MANABI DIANSYAH. I111 15 353. Kualitas Spermatozoa Pasca

Imobilisasi Beberapa Bagian Spermatozoa Sapi FH Menggunakan Laser Dioda.
Pembimbing Utama MUHAMMAD YUSUF Pembimbing Anggota EKAYANTI
M. KAIIN.

Tujuan dari penelitian ini adalah menemukan metode yang tepat untuk imobilisasi
sperma tanpa menurunkan integritas DNA dan merusak keutuhan spermatozoa sapi.
Imobilisasi sperma dilakukan dengan penembakan Laser Octax MTG panjang
gelombang sebesar 1,48 µm sebanyak 2 kali dengan bantuan software Eye Ware
3.0. Penembakan dilakukan pada 4 titik yaitu ujung ekor spermatozoa, pertengahan
ekor spermatozoa, leher spermatozoa dan kepala spermatozoa masing-masing
sebanyak 20 sel spermatozoa. Penembakan laser 1,48 µm memberikan pengaruh
terhadap immobilitas tertinggi mencapai 100% pada bagian kepala dengan
integritas DNA spermatozoa mencapai 90%, keutuhan sperma tetap normal (100%)
dan tidak menunjukkan pengaruh nyata. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
(1) penembakan laser dioda pada bagian badan ekor yang paling efektif dalam
imobilitas spermatozoa; (2) penggunaan laser dioda dengan panjang gelombang
1,48 um dapat digunakan untuk melakukan imobilisasi spermatozoa sebelum
intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Penembakan laser dioda dengan panjang
gelombang 1,48 µm pada bagian badan ekor yang paling efektif dalam imobilisasi
spermatozoa dengan imotilitas sebesar 95,00 ± 5,98 dan integritas DNA sebesar
85,00 ± 11,65.

Kata kunci : Imobilisasi, spermatozoa, laser dioda, ICSI, sapi

viii
 ABSTRACT

ATHHAR MANABI DIANSYAH. I11115 353. The Quality of Sperms Post-

Immobilization at Some Parts of FH Sperm using Laser Diodes. Main Supervisor:
MUHAMMAD YUSUF and Co-supervisor: EKAYANTI M. KAIIN.

The aim of this study was to find the proper method for sperms immobilization without
reducing DNA integrity and damaging the shape of bovine sperms . Sperm immobilization
was carried out by double shots using laser Octax MTG with wavelength of 1.48 µm and
Eye Ware 3.0 software. A total of 20 sperms were shoot at 4 points, which was the tail end,
the mid-tail, the neck and the head of the sperms. The shooting of 1.48 µm laser had the
highest effect on immobility reaching 100% on the head and the DNA integrity of the
sperms reached up to 90%, the shape of sperms were remained normal (100%) and did not
showing significant effect. The results of this study indicated that (1) the laser diode with
a wavelength of 1.48 µm at the mid-tail section of the sperm was most effective for sperm
immobilization; (2) the use of laser diodes with a wavelength of 1.48 µm can be used to
immobilize the sperms before intracytoplasmic sperm injection (ICSI). The diode laser
shooting with a wavelength of 1.48 µm at the tail was the most effective in immobilizing
the sperms with an immobility of 95.00 ± 5.98 and DNA integrity of 85.00 ± 11.65.

Key Words : Immobilization, sperm, laser diode, ICSI, Bovine

ix
 DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL .................................................................................. i

HALAMAN JUDUL ..................................................................................... ii

PERNYATAAN KEASLIAN ....................................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iv

KATA PENGANTAR ................................................................................... v

ABSTRAK ...................................................................................................... viii

DAFTAR ISI ................................................................................................. x

DAFTAR TABEL ......................................................................................... xii

DAFTAR GAMBAR...................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xiv

PENDAHULUAN ......................................................................................... 1

Latar Belakang ....................................................................................... 1

Rumusan Masalah .................................................................................. 2
Tujuan dan Manfaat ................................................................................ 3
TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 4

Gambaran Umum Sapi FH .................................................................... 4

Gambaran Umum Spermatozoa ............................................................ 5
Metode Swim Up ................................................................................... 9
Imobilisasi Sperma ................................................................................ 9
METODE PENELITIAN ............................................................................. 11

Waktu dan Tempat ................................................................................ 11

Materi Penelitian ................................................................................... 11
Metode Penelitian ................................................................................... 12
Parameter Penelitian .............................................................................. 16

x
 Rancangan Penelitian ............................................................................. 16
Prosedur Penelitian ................................................................................ 17
Analisis Data ......................................................................................... 17

HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... 18

Kualitas Spermatozoa Pasca Thawing ................................................... 18

Kualitas Spermatozoa Pasca Swim Up .................................................. 19
Kualitas Spermatozoa Pasca Penembakan Laser Dioda ......................... 21
PENUTUP ...................................................................................................... 24

Kesimpulan ............................................................................................ 24
Saran ...................................................................................................... 24
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 27

LAMPIRAN.................................................................................................... 29

RIWAYAT HIDUP ........................................................................................ 34

xi
 DAFTAR TABEL

No. Halaman

1. Kualitas Spermatozoa Pasca Thawing .......................................................... 18

2. Kualitas Spermatozoa Pasca Swim Up .......................................................... 19

3. Kualitas Spermatozoa Pasca Penembakan Laser Dioda ............................... 21

xii
 DAFTAR GAMBAR

No. Halaman

1. Mikroskop inverted yang dilengkapi dengan micromanipulator dan laser

dioda. ........................................................................................................... 15

2. Skema Penembakan Laser Dioda ................................................................ 15

3. Alur Penelitian ............................................................................................. 17

4. Motilitas spermatozoa menggunakan CASA ............................................. 20

5. Viabilitas spermatozoa menggunakan perwanaan Eosin 2% ...................... 20

6. Abnormalitas spermatozoa menggunakan perwanaan Eosin 2% ................ 21

7. MPU spermatozoa menggunakan larutan HOS........................................... 21

8. Hasil pengamatan integritas DNA spermatozoa pasca penembakan laser

dioda menggunakan mikroskop flouresence. Bar menunjukkan 20 µm. .... 23

xiii
 DAFTAR LAMPIRAN

No. Halaman

1. Data Kualitas Spermatozoa Pasca Thawing ................................................ 29

2. Data Kualitas Spermatozoa Pasca Swim Up................................................ 29

3. Analisis Data Kualitas Spermatozoa Pasca Penembakan Laser Dioda ....... 30

4. Dokumentasi ................................................................................................ 33

xiv
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) merupakan metode bioteknologi

reproduksi berbantu yang efisien karena hanya membutuhkan satu sel sperma dan

sel telur yang telah matang untuk memulai proses pembentukan individu baru

(Yanagida, 2009). Metode ini pertama kali ditemukan oleh Hiramoto (1966) untuk

membuktikan bahwa peristiwa dekondensasi spermatozoa dan pembentukan

pronukleus jantan tidak akan terjadi sebelum spermatozoa masuk ke dalam sel telur.

Pada tahun 1976, Uehara dan Yamaguchi melanjutkan penelitian Hiramoto untuk

menguji kelayakan penggunaan metode ICSI pada manusia (Said et al., 2006).

Laporan keberhasilan ICSI dimulai sejak adanya keberhasilan penerapan

metode In Vitro Fertilization (IVF) dan Embryo Transfer (ET) pada pasangan yang

sulit mendapatkan keturunan oleh Edwards et al. (1980). Sejak saat itu, para

ilmuwan mengembangkan berbagai metode fertilisasi berbantu berupa metode

Zona Thinning (ZT), Zona Drilling (ZD), Sub-Zonal Insemination (SUZI) dan ICSI

tingkat lanjut untuk memberikan solusi terhadap berbagai kegagalan fertilisasi yang

tidak dapat diselesaikan menggunakan metode IVF (Palermo et al, 1992).

Penemuan metode ICSI telah mengantarkan manusia pada era revolusi

reproduksi berbantu secara radikal melalui penggunaan sperma tunggal untuk

menghasilkan kehamilan pada manusia serta kebuntingan pada hewan

(Yanagimachi, 2001). Saili et al. (2005) melaporkan bahwa penggunaan metode

ICSI telah berhasil dilakukan pada kelinci (Hosoi et al., 1988; dan Iritani, 1989),

mencit (Kimura dan Yanagimachi, 1995), kucing (Pope et al., 1998), kuda

(Cochran et al., 1998), domba (Gomez et al., 1998), sapi (Hamano et al., 1999),

1
kera (Hewitson et al., 1999), babi (Martin, 2000) dan tikus (Said et al., 2003).

Sebelum spermatozoa diinjeksikan ke dalam oosit, pada setiap pelaksanaan ICSI

dilakukan immobilisasi pergerakan spermatozoa. Hal ini dilakukan agar

spermatozoa mudah dimasukkan ke dalam pipet injeksi dan tidak melakukan

pergerakan lebih lanjut di dalam pipet injeksi. Immobilisasi spermatozoa umumnya

dilakukan dengan menekan ekor spermatozoa sampai ke dasar petri (Dozortzev et

al., 1995) atau dengan memisahkan kepala dan ekor dengan ultrasonikasi (Kuretake

et al., 1996). Boediono (2001) menyatakan bahwa perlakuan immobilisasi

spermatozoa pada kambing sebelum dilakukan ICSI, akan meningkatkan angka

pembelahan pada tahap awal perkembangan embrio. Namun, hal tersebut memiliki

resiko merusak spermatozoa yang cukup tinggi. Saat ini, terdapat teknik baru dalam

imobilisasi sperma sebelum ICSI, yaitu dengan menggunakan laser dioda.

Penggunaan laser dioda dapat mengidentifikasi spermatozoa yang layak untuk ICSI

dan menunjukkan peningkatan keberhasilan kehamilan (Chen, 2015). Namun,

informasi mengenai imobilisasi sperma dengan laser masih sangat terbatas.

Rumusan Masalah

Aplikasi ICSI membutuhkan kondisi spermatozoa yang imotil, untuk

memudahkan injeksi spermatozoa kedalam sel telur. Saat ini imobilisasi

spermatozoa dilakukan dengan berbagai metode diantaranya: pemisahan kepala dan

ekor dengan metode sonikasi, menekan spermatozoa ke dasar petri dengan dengan

pipet injeksi serta memberikan getaran pipet dengan eletrik piezo. Metode

imobilisasi tersebut beresiko merusak spermatozoa sehingga mempengaruhi

kualitas spermatozoa, oleh karena itu diperlukan suatu metode yang mampu

mengimobiliasasi spermatozoa tanpa menurunkan kualitas spermatozoa tersebut.

Penggunaan laser dioda yang biasa digunakan sebagai alat bantu untuk

2
memudahkan terjadinya fertilisasi juga dapat digunakan untuk mengimobilisasi

spermatozoa untuk keperluan ICSI. Penelitian ini mencoba melakukan imobilisasi

menggunakan laser dioda pada beberapa bagian spermatozoa.

Tujuan dan Manfaat

Tujuan penelitian secara umum adalah menemukan metode yang tepat untuk

imobilisasi sperma tanpa menurunkan integritas DNA dan merusak keutuhan

spermatozoa sapi. Secara khusus penelitian ini bertujuan:

1. Menemukan letak posisi paling efektif dalam imobilisasi sperma

menggunakan laser dioda dengan panjang gelombang 1,48 µm.

2. Menemukan metode imobilisasi sperma untuk ICSI.

Manfaat penelitian ini adalah adanya tambahan informasi baru terkait dengan

metode imobilisasi spermatozoa sapi dengan menggunagkan laser dioda.

3
 TINJAUAN PUSTAKA

Gambaran Umum Sapi FH

Sapi Friesian Holstein (FH) merupakan bangsa sapi yang paling banyak

terdapat di Amerika Serikat, sekitar 80-90% dari seluruh sapi perah yang berada di

sana. Sapi ini berasal dari Belanda yaitu provinsi North Holand dan West Friesland

yang memiliki padang rumput yang sangat luas. Sapi FH mempunyai beberapa

keunggulan, salah satunya yaitu jinak, tidak tahan panas tetapi sapi ini mudah

menyesuaikan diri dengan lingkungan. Ciri-ciri sapi FH yang baik adalah memiliki

tubuh luas ke belakang, sistem dan bentuk perambingan baik, puting simetris, dan

efisiensi pakan tinggi yang dialihkan menjadi produksi susu (Blakely dan Bade,

1998).

Sapi perah yang dipelihara di Indonesia pada umumnya adalah Friesian

Holstein (FH) dan peranakan Friesian Holstein (PFH). Sapi Friesian Holstein

memiliki ciri-ciri fisik antara lain warna hitam berbelang putih, ekor dan kaki

berwarna putih, kepala panjang dan tidak menghadap atau menjulur ke depan, pada

dahi terdapat warna putih berbentuk segitiga, produksi susunya tinggi, serta sifatnya

tenang dan jinak (Arifiantini dkk., 2005).

Sapi Friesian Holstein (FH) memiliki kemampuan berkembang biak yang

baik, rata-rata bobot badan sapi Friesian Holstein (FH) adalah 750 Kg dengan tinggi

bahu 139,65 cm. Kemampuan produksi susu sapi FH lebih tinggi dibandingkan

bangsa sapi perah yang lain. Untuk mencapai produksi yang optimal sapi perah

sebaiknya dipelihara di tempat yang bersuhu rendah. Suhu lingkungan yang

optimum untuk sapi perah dewasa berkisar antara 5-21 C, sedangkan kelembaban

4
udara tang baik untuk pemeliharaan sapi perah adalah sebesar 60% dengan kisaran

50%-75% (Adriyani dkk., 1980).

Gambaran Umum Spermatozoa

1. Morfologi Spermatozoa

Spermatozoa merupakan sel gamet jantan (Karlinah dkk., 2015). Morfologi

spermatozoa terdiri atas bagian kepala, leher, dan ekor. Bagian kepala mengandung

materi genetik yang dilindungi oleh membran nukleus. Di bagian ujung kepala,

terdapat akrosom yang mengandung enzim untuk membantu penetrasi spermatozoa

ke dalam sel gamet betina (Alters, 2000). Leher berfungsi sebagai penyambung

bagian kepala dengan ekor spermatozoa. Bagian spermatozoa terdiri atas bagian

principal piece atau bagian kepala, mid piece atau bagian tengah, dan end piece atau

bagian akhir (Chenoweth & Lorton, 2014). Pada bagian mid piece, terdapat

mitokondria yang berperan dalam menghasilkan ATP sebagai energi untuk

pergerakan spermatozoa (Cochran, 2011). Ekor spermatozoa secara keseluruhan

berfungsi sebagai alat pegerakan (Applegate, 2011).

Bentuk dan ukuran spermatozoa beragam pada tiap spesies. Pada sapi,

bagian kepala spermatozoa berbentuk seperti dayung, pipih, dan relatif besar

(Rouge, 2004). Spermatozoa sapi memiliki ukuran panjang total yaitu sekitar 70,

21 µm (Kondracki dkk., 2005).

2. Metabolisme Spermatozoa

Metabolisme merupakan reaksi kimia yang terjadi di dalam sel makhluk

hidup. Metabolisme terdiri atas dua reaksi utama yaitu anabolisme dan katabolisme.

Anabolisme merupakan reaksi yang membutuhkan energi untuk pembentukan

senyawa sederhana menjadi senyawa kompleks. Katabolisme merupakan reaksi

yang menghasilkan energi dari penguraian senyawa kompleks menjadi senyawa

5
sederhana (Wright, 2000). Metabolisme pada spermatozoa merupakan faktor

penting yang mendukung pergerakan spermatozoa (Storey, 2008).

Jalur metabolisme spermatozoa terdiri atas proses glikolisis yang terjadi di

kepala spermatozoa serta proses fosforilasi oksidatif yang terjadi di dalam

mitokondria pada bagian midpiece (Oliveira & Alves, 2015). Pada proses glikolisis,

terjadi perombakan substrat berupa glukosa atau fruktosa menjadi tiga molekul

asam piruvat (Susilawati, 2011). Proses tersebut menghasilkan 2 molekul ATP.

Asam piruvat kemudian teroksidasi menjadi CO2 dan menghasilkan asetil koenzim

A. Selanjutnya, asetil koenzim A teroksidasi sempurna menjadi CO2 melalui siklus

asam sitrat (siklus Krebs). Proses glikolisis dan siklus asam sitrat menghasilkan

molekul NADH dan FADH2. Oksidasi NADH dan FADH2 pada rantai transport

elektron menghasilkan molekul ATP melalui proses fosforilasi oksidatif. Jumlah

ATP yang dihasilkan pada proses fosforilasi oksidatif 15 kali lipat lebih banyak

dibanding pada proses glikolisis (Pasupuleti, 2007).

Preferensi sumber energi untuk mendukung pergerakan spermatozoa dapat

berbeda-beda pada tiap spesies. Spermatozoa manusia lebih bergantung besar pada

metabolisme glikolitik dibanding pada metabolisme oksidatif. Sebaliknya,

spermatozoa babi sangat bergantung pada metabolisme oksidatif dan tidak dapat

bergantung pada metabolisme glikolitik untuk mendukung pergerakannya

(Pasupuleti, 2007). Pada sapi, spermatozoa dapat bertahan baik dengan

metabolisme glikolitik maupun oksidatif. Sperma sapi dapat tetap mempertahankan

pergerakannya hanya dengan terdapatnya oksigen tanpa susbtrat glukosa, begitu

pula sebaliknya (Storey, 2008).

Pergerakan atau motilitas spermatozoa dapat dipengaruhi secara langsung

maupun tidak langsung oleh faktor-faktor eksternal seperti suhu ekstrim dan radiasi

6
ultraviolet. Suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan kejutan dingin pada

spermatozoa. Hal tersebut menyebabkan produksi ATP menjadi rendah sehingga

spermatozoa kehilangan motilitasnya. Pada umumnya spermatozoa akan inaktif

pada suhu 10oC dan sebagian kecilnya dapat bergerak lemah. Suhu yang terlalu

tinggi juga dapat merusak spermatozoa melalui denaturasi enzim. Radiasi sinar

ultraviolet dilaporkan dapat mempengaruhi motilitas spermatozoa. Hal tersebut

dibuktikan oleh penelitian yang memaparkan cahaya putih pada spermatozoa sapi.

Hasilnya ialah selama 24 sampai 72 jam pemaparan, spermatozoa sapi tersebut

kehilangan motilitasnya. Sebaliknya, spermatozoa sapi yang tidak dipaparkan

cahaya dapat tetap mempertahankan motilitasnya (Metz & Monroy, 1967).

3. Kualitas Spermatozoa

Kualitas semen sapi dapat dievaluasi melalui paramater makroskopis

maupun mikroskopis. Parameter makroskopis terdiri atas volume, warna, bau,

konsistensi, dan pH semen. Parameter makroskopis penting untuk dievaluasi karena

dapat dijadikan sebagai indikator awal untuk mengetahui adanya ketidaknormalan

pada semen. Semen yang tidak normal secara makroskopis, dapat mengindikasikan

terdapatnya kerusakan ataupun infeksi bakteri pada sistem reproduksi (Agarwal &

Said, 2011).

Parameter mikroskopis untuk mengevaluasi kualitas semen meliputi

gerakan massa, konsentrasi, motilitas, viabilitas, dan membran plasma utuh (MPU).

Gerakan massa spermatozoa merupakan pergerakan sekumpulan spermatozoa pada

semen segar yang membentuk gelombang seperti gerakan awan. Pemeriksaan

gerakan massa spermatozoa membantu untuk memprediksi kualitas semen (Sutama

dkk., 2000). Gerakan massa dapat dinilai ke dalam tiga kategori yaitu cukup, baik,

dan sangat baik. (Sujoko dkk., 2009).

7
 Parameter mikroskopis utama untuk mengevaluasi kualitas semen ialah

motilitas dan viabilitas. Penilaian motilitas dan viabilitas penting dilakukan untuk

mengetahui keberhasilan kriopreservasi. Hal tersebut dikarenakan motilitas dan

viabilitas spermatozoa berkaitan dengan kemampuan spermatozoa dalam

membuahi sel ovum (Chian & Quinn, 2010).

Motilitas merupakan kemampuan spermatozoa untuk bergerak bebas.

Penilaian motilitas spermatozoa dapat dilakukan dengan menghitung persentase

spermatozoa yang bergerak (motil) pada kamar hitung (Algarubi, 2014). Analisis

viabilitas spermatozoa dilakukan untuk mengetahui persentase spermatozoa yang

hidup. Penilaian viabilitas spermatozoa dilakukan dengan menggunakan pewarnaan

diferensial yang berkaitan pada integritas membran sel. Sel spermatozoa yang hidup

dan mati akan menunjukkan reaksi yang berbeda terhadap zat pewarna tertentu,

sehingga keduanya dapat dibedakan dan persentase sel spermatozoa yang hidup

dapat dihitung (Rurangwa dkk.,2004).

Pewarna diferensial yang umum digunakan untuk mengamati viabilitas

spermatozoa ialah eosin (Budai dkk., 2014). Spermatozoa mati memiliki membran

plasma yang rusak sehingga dapat menyerap warna eosin. Sebaliknya spermatozoa

yang hidup tidak dapat menyerap warna merah dari eosin karena membran

plasmanya tidak rusak dan dapat mempertahankan integritasnya. Oleh karena itu

ketika diamati di bawah mikroskop, spermatozoa yang mati tampak berwarna

merah dan spermatozoa yang hidup tampak berwarna putih (Legato, 2004).

Parameter membran plasma utuh dapat dinilai menggunakan metode Hypo

Osmotic Swelling Test (Uji HOS). Uji HOS dapat menilai integritas membran

berdasarkan kemampuan spermatozoa dalam menjaga keseimbangan antara

lingkungan di dalam sel dengan lingkungan luar (Ramu & Jeyendran, 2012).

8
Lingkungan hipo osmotik menyebabkan masuknya cairan ke dalam spermatozoa

sehingga membuat ekor spermatozoa menggembung. Ekor spermatozoa yang

menggembung mengindikasikan membran plasma spermatozoa tidak rusak dan

dapat berfungsi dengan baik (Gunawan dkk., 2015).

Metode Swim Up

Metode persiapan spermatozoa yang ideal adalah teknik yang melibatkan

penghilangan plasma semen secara efisien, cepat dan murah, tidak menyebabkan

terjadinya kerusakan pada spermatozoa, mampu mengeliminasi faktor dekapasitasi

atau Reactive Oxygen Species (ROS) serta mampu meningkatkan jumlah

spermatozoa yang memiliki kemampuan fertilisasi. Meskipun plasma semen

melindungi spermatozoa dari kondisi stres, namun plasma semen mengandung

faktor-faktor yang menghambat kemampuan fertilisasi spermatozoa dan

mengurangi induksi kapasitasi (Donelly et al, 2001). Swim up merupakan salah satu

metode persiapan spermatozoa dalam fertilisasi in vitro yang menyeleksi

spermatozoa dengan motilitas tinggi yang mencapai permukaan media setelah

diinkubasi. Metode swim up berdasarkan pada pergerakan aktif spermatozoa dari

pelet pada dasar media menuju permukaan media (Henkel dan Schill, 2003).

Imobilisasi Sperma

Imobilisasi spermatozoa umumnya dilakukan dengan memotong ekor

spermatozoa menggunakan pipet suntik dengan cara menekan sambil menggores

ekor spermatozoa pada dasar cawan petri. Hal ini dilakukan sesaat sebelum

penyuntikan agar spermatozoa menjadi tidak bergerak (imobil) sehingga operator

dapat dengan mudah memasukkan spermatozoa ke dalam pipet suntik untuk

selanjutnya disuntikkan ke dalam sel telur (Boediono, 2001).

9
 Selain itu, Saili dan Said (2005) melaporkan bahwa spermatozoa yang nyata

telah mati karena perlakuan pembekuan tanpa krioprotektan dan perlakuan

pemisahan kepala spermatozoa dengan ekor, masih mampu mendukung

pembentukan pronukleus jantan dan betina setelah diinjeksikan ke dalam sel telur

tikus. Hal ini merupakan bukti tambahan bahwa untuk tujuan fertilisasi melalui

teknik ICSI, spermatozoa yang digunakan tidak perlu motil dan utuh.

10
 METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Desember 2018 sampai dengan bulan

Februari 2019 bertempat di Laboratorium Reproduksi, Pemuliaan dan Kultur Sel

Hewan, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, Bogor, Jawa Barat.

Materi penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan digital ATX124

[Shimadzu], pinset, tabung plastik (conical tube 15 ml), gloves, google, gelas kaca,

pipet mikro skala 100 µl dan 1000 µl [Eppendorf], micro pipet puller Model P2000

[Sutter Instrument Co.], pneumatic micromanipulator [Narishige], waterbath

[Memmert], micro-tube, mikroskop cahaya CX23 [Olympus], mikroskop inverted

Observer.A1 Axio [Zeiss], mikroskop flouresence Imager.Z2 [Zeiss], kabinet

laminar air flow BH-100 [Telstar], gunting straw, straw, micro-tube Eppendorf 1,5

ml [Axygen], warm plate HT 300 [Minitube], rak tabung, counter, lemari

pendingin, goblet, objek glass, cover glass, alat sentrifus EBA20 [Hettich],

Computer Assisted Semen Analysis (CASA) Scope.A1 [Minitube], pipet holding

dan Laser Dioda [Octax MTG].

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah semen beku sapi FH,

Alkohol 70%, pewarna Eosin 2%, medium TALP (Tyrode's Albumin Lactate

Pyruvate), larutan PVP (Polyvinylpyrrolidone) 7,5%, larutan HOST (Hypo-

Osmotic Swelling Test), Aquabides steril dan pewarna Hoecsht.

11
Metode Penelitian

1. Pengambilan Semen

Semen beku sapi FH di thawing dengan mencelupkan 1 straw sperma pada

goblet yang berisikan air dengan suhu 37ºC selama 30 detik. Straw dikeringkan

dengan tisu, lalu kedua ujung straw dipotong dan ditempatkan dalam micro-tube.

Selanjutnya diinkubasi pada warm plate dengan suhu 37ºC selama 10 menit, lalu

dilakukan evaluasi secara mikroskopis.

2. Evaluasi Semen Pasca Thawing

Pemeriksaan semen dilakukan secara mikroskopis. Penilaian semen secara

mikroskopis yaitu motilitas, viabilitas, abnormalitas dan MPU (Membran Plasma

Utuh).

a. Motilitas spermatazoa dihitung dengan terlebih dahulu membuat

spot spermatozoa 10 µl diatas gelas objek. Spermatozoa selanjutnya

dianalisis menggunakan CASA dengan program Sperm Vision Versi

3.7.5. dengan pengamatan 4 kali lapang pandang.

b. Viabilitas spermatozoa dihitung dengan mencampurkan secara

merata 10 µl semen dan 10 µl Eosin 2% diatas gelas objek.

Selanjutnya dibuat preparat ulas dan diamati menggunakan

mikroskop pada pembesaran 200 kali dengan software Indomicro

View 3.7. Spermatozoa yang mati akan menyerap warna merah dan

yang hidup tidak berwarna, sedikitnya 100 sel sperma setiap

pengamatan dihitung untuk menentukan persentase spermatozoa

hidup. persentase viabilitas spermatozoa dihitung menggunakan

rumus:

A = [ P / ( P + Q) ] x 100%

12
 A = Persentase daya hidup spermatozoa.

P = Jumlah spermatozoa yang hidup.

Q = Jumlah spermatoza yang mati.

c. Abnormalitas spermatozoa dihitung dengan mencampurkan secara

merata 10 µl semen dan 10 µl Eosin 2% diatas gelas objek.

Selanjutnya dibuat preparat ulas dan diamati menggunakan

mikroskop pada pembesaran 200 kali dengan software Indomicro

View 3.7. Spermatozoa abnormal yang diamati berupa ekor terputus,

ekor patah dan bentuk kepala abnormal sedikitnya 100 sel sperma

setiap pengamatan dihitung untuk menentukan persentase

spermatozoa hidup. Selanjutnya dibuat preparat ulas dan diamati

menggunakan mikroskop. Sedikitnya dihitung sampai 100 sel

spermatozoa, persentase abnormalitas spermatozoa dihitung

menggunakan rumus:

A = [ P / ( P + Q) ] x 100%

A = Persentase abnormalitas spermatozoa.

P = Jumlah spermatozoa yang abnormal.

Q = Jumlah spermatoza yang normal.

d. Membran Plasma Utuh (MPU)diamati dengan cara memasukkan

sampel semen sebanyak 10 µl ke dalam larutan HOST (0,179g NaCl

dalam 100 ml aquabides), kemudian diinkubasi selama 1 jam pada

suhu 37 ºC. Spermatozoa dengan membran plasma utuh ditandai

dengan ekor yang melingkar dan sperma yang rusak ditandai dengan

ekor lurus. Evaluasi dilakukan dengan mikroskop perbesaran 400

13
 kali menggunakan software Indomicro View 3.7, dengan

menghitung 100 sel spermatozoa menggunakan rumus:

A = [ P / ( P + Q )] x 100%

A = Persentase MPU.

P = Jumlah spermatozoa dengan ekor melingkar.

Q = Jumlah spermatoza dengan ekor lurus.

3. Seleksi Spermatozoa (Swim Up)

Seleksi spermatozoa bertujuan untuk mendapatkan spermatozoa yang layak

dengan metode swim up. Pada metode swim up, tahap pertama dilakukan dengan

memasukkan medium TALP sebanyak 10 ml, lalu dicampurkan semen sebanyak

50 µl. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 1800 rpm selama 10 menit

dan dilakukan pembuangan supernatan. Tahap kedua, hasil sentrifugasi

dimasukkan ke micro-tube 1,5 ml yang berisikan medium TALP sebanyak 1 ml.

Kemudian tahap ketiga, didiamkan pada warm plate selama 30 menit.

4. Imobilisasi Sperma menggunakan Laser Dioda

• Preparasi Spermatozoa

Spermatozoa hasil swim up diberi 5 µl pewarna Hoecst di dalam medium

yang mengandung PVP 7,5%. Selanjtnya membuat 8 spot medium masing-masing

5 µl (4 spot berisi spermatozoa dan 4 spot tanpa spermatozoa).

• Instrumentasi Alat Imobilisasi

Menyiapkan mikroskop inverted yang telah terpasang laser dioda dan pipet

holding yang dikontrol dengan pneumatic micromanipulator (Gambar 1).

Imobilisasi sperma dilakukan menggunakan penembakan Laser dioda panjang

gelombang sebesar 1,48 µm sebanyak 2 kali (Montag et al., 2000) dengan software

Eye Ware 3.0. Perlakuan penembakan spermatozoa dilakukan pada 4 titik yaitu

14
ujung ekor spermatozoa, badan ekor spermatozoa, leher spermatozoa dan kepala

spermatozoa masing-masing sebanyak 20 sel spermatozoa (Gambar 2).

Spermatozoa hasil penembakan laser dioda kemudian dipindahkan ke spot yang

lainnya dengan menggunakan pipet holding untuk dilakukan pengamatan

selanjutnya.

Gambar 1. Mikroskop inverted yang dilengkapi dengan micromanipulator dan

laser dioda. (a) Mikroskop Inverted; (b) Pneumatic Micromanipulator; (c) Laser
Dioda; (d) Software Eye Ware 3.0.

(a)
(a) (b)
(b)
Gambar 2. Skema Penembakan Laser Dioda. (a) Posisi Penembakan Laser Dioda;
Gambar 3. Skema penembakan laser dioda. (a) posisi penembakan laser; (b) bagian
(b) Bagian Penembakan
penembakan Pada Spermatozoa.
pada spermatozoa. Bar30menunjukkan
Bar menunjukkan um. 30 µm

5. Evaluasi Spermatozoa Pasca Imobilisasi Sperma

Evaluasi spermatozoa pasca imobilisasi sperma dilakukan secara

mikroskopis dengan mengamati imotilitas, keutuhan dan integritas DNA

spermatozoa. Pengamatan imotilitas dan keutuhan spermatozoa diamati sesaat

setelah penembakan laser. Selanjutnya pengamatan integritas DNA dilakukan

15
dengan menggunakan pewarna Hoechst yang diamati melalui mikroskop

flouresence dengan software Axio Vision Rel. 4.8 menggunakan filter DAPI.

Paramater Penelitian

Parameter penelitian yang diamati setelah pemberian perlakuan adalah

penilaian kualitas spermatozoa setelah imobilisasi yang terdiri dari evaluasi

mikroskopis:

a. Integritas DNAnjnn diamati dengan melihat individu spermatozoa dengan

menggunakan pewarnaan hoecst melalui mikroskop fase kontras.

b. Imotilitas diamati dengan melihat individu spermatozoa dengan

menggunakan mikroskop fase kontras.

c. Keutuhan diamati dengan melihat individu spermatozoa dengan

menggunakan mikroskop fase kontras.

Rancangan Penelitian

Data yang diperoleh dari penelitian ini berupa persentase integritas DNA,

imotilitas dan keutuhan spermatozoa sapi dianalisis dengan menggunakan analysis

of variance (ANOVA) dan apabila terdapat pengaruh diantara perlakuan

dilanjutkan dengan uji Fisher LSD.

16
Prosedur Penelitian

Gambar. 3 Alur Penelitian

Analisis Data

Data persentase integritas DNA indivudu, imotilitas individu dan keutuhan

individu spermatozoa dianalisis menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL)

pada perlakuan penembakan laser dioda di kepala, leher, badan ekor dan ujung ekor

dengan 8 ulangan. Data penelitian dianalisis dengan analysis of variance (ANOVA)

dan apabila terdapat pengaruh diantara perlakuan dilanjutkan dengan uji Fisher

LSD. Data diolah menggunakan software Minitab 17.

17
 HASIL DAN PEMBAHASAN

Kualitas Spermatozoa Pasca Thawing

Kualitas spermatozoa pasca thawing pada sapi Friesian Holstein dapat

dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Kualitas Spermatozoa Pasca Thawing.

Parameter Rataan (± SD)
Motilitas (%) 49.23 ± 1.94
Viabilitas (%) 73.46 ± 1.48
Abnormalitas (%) 12.38 ± 3.40
MPU (%) 73.00 ± 0.71

Pada Tabel 1 memperlihatkan kualitas spermatozoa pasca thawing dimana

motilitas (Gambar 4) sebesar (49.23 ± 1.94), viabilitas (Gambar 5) sebesar (73.46

± 1.48), abnormalitas (Gambar 6) sebesar (12.38 ± 3.40) dan MPU (Gambar 7)

sebesar (73.00 ± 0.71). Data ini menunjukan bahwa motilitas kualitas spermatozoa

pasca thawing pada penelitian ini sesuai standar kelayakan SNI 4869-1-2017 untuk

produk semen sapi beku yaitu mempunyai kualitas spermatozoa menunjukkan

motilitas spermatozoa minimal 40% (BSN, 2005). Garner dan Hafez (2000)

menyatakan bahwa viabilitas spermatozoa minimal memiliki 60 % sampai 75%

spermatozoa hidup. Presentase hidup spermatozoa ditentukan oleh membran

plasma yang utuh karena membran plasma spermatozoa berfungsi untuk

melindungi organel spermatozoa dan transpor elektrolit untuk metabolisme

spermatozoa (Salmah, 2014). Membran plasma yang rusak dapat mempengaruhi

fungsi fisiologis dan metabolisme spermatozoa, sehingga menyebabkan

spermatozoa mati (Butarbutar, 2009). Membran plasma yang utuh memiliki

kolerasi dengan motilitas spermatozoa, semakin banyak membran plasma

spermatozoa yang utuh maka semakin banyak spermatozoa yang motil (Azzahra

dkk., 2016). Standar Nasional Indonesia (SNI) SNI 4869-1-2017 produk sperma

18
sapi beku mensyaratkan bahwa semen sapi memiliki morfologi abnormalitas baik

primer maupun sekunder < 20% (BSN, 2005). Pernyataan serupa juga dinyatakan

oleh Balls and Peters (2004) yang menyatakan seekor pejantan tidak akan memiliki

fertilitas yang tinggi apabila ditemukan spermatozoa abnormalitas sebesar >17%.

Hasil ini menujukkan bahwa spermatozoa pasca thawing yang digunakan

memenuhi standar kelayakan teknis.

Kualitas Spermatozoa Pasca Swim Up

Kualitas spermatozoa pasca swim up pada Sapi Friesian Holstein dapat

dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Kualitas Spermatozoa Pasca Swim Up.

Parameter Rataan (± SD)
Motilitas (%) 53.59 ± 3.52
Viabilitas (%) 72.63 ± 1.56
Abnormalitas (%) 13.71 ± 3.23
MPU (%) 72.33 ± 1.19

Pada Tabel 2 dapat memperlihatkan kualitas spermatozoa pasca Swim Up

memiliki motilitas (Gambar 4) sebesar (53,59 ± 3.52), viabilitas (Gambar 5) sebesar

(72,63 ± 1.56), abnormalitas sebesar (Gambar 6) (13,71 ± 3.23) dan MPU (Gambar

7) sebesar (72,33 ± 1.19). Kualitas Spermatozoa pasca swim up menunjukkan

kecenderungan lebih tinggi dibandingkan dengan pasca thawing. Hal ini

disebabkan karena pada metode swim up membuat pemisahan spermatozoa yang

hidup dan motil terpisah dengan spermatozoa yang mati dan imotil. Pasaribu (2014)

menyatakan bahwa peningkatan persentase motilitas spermatozoa setelah proses

pemisahan dengan swim up diakibatkan oleh terpisahnya spermatozoa yang mati

dengan yang hidup. Spermatozoa yang hidup dapat bermigrasi keluar dari pelet

menuju ke permukaan medium, sedangkan spermatozoa yang mati tetap berada

pada lapisan bawah. Data penelitian juga menunjukan terjadinya peningkatan

abnormalitas dan penurunan presentase MPU yang disebabkan oleh pengaruh

19
mekanik gaya sentrifugasi seperti gesekan permukaan membran spermatozoa

dengan dinding tabung selama proses swim up. Hal ini sesuai dengan pernyataan

Donnelly et al (1995) bahwa pemisahan spermatozoa dengan sentrifugasi dapat

menginduksi terjadinya kerusakan membran plasma spermatozoa sehingga

mengakibat peningkatan abnormalitas. Walaupun terjadi penurunan presentase

viabilitas namun masih dalam taraf normal, dimana angka viabilitas spermatozoa

minimal 60% (Garner dan Hafez, 2000). Hasil ini menujukkan bahwa spermatozoa

pasca swim up yang digunakan memenuhi standar kelayakan teknis.

(a) (b)
Gambar 4. Motilitas spermatozoa menggunakan CASA. (a) Pasca Thawing; (b)
Pasca Swim Up.

(a) (b)
Gambar 5. Viabilitas spermatozoa menggunakan perwanaan Eosin 2%. (a) Pasca
Thawing; (b) Pasca Swim Up. Ket: H = Hidup; M = Mati. Bar
menunjukan 20 µm.

20
 (a) (b)
Gambar 6. Abnormalitas spermatozoa menggunakan perwanaan Eosin 2%. (a)
Pasca Thawing; (b) Pasca Swim Up. Ket: 1 = Kepala Putus; 2 = Ekor
Putus; 3 = Ekor Patah. Bar menunjukan 20 µm.

(a) (b)
Gambar 7. MPU spermatozoa menggunakan larutan HOS. (a) Pasca Thawing; (b)
Pasca Swim Up. Ket: U = Utuh; TU = Tidak Utuh. Bar menunjukan 20
µm.

Kualitas Spematozoa Pasca Penembakan Laser Dioda

Kualitas spermatozoa pasca penembakan laser dioda pada berbagai bagian

spermatozoa Sapi FH dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Kualitas Spermatozoa Pasca Penembakan Laser Dioda

Parameter (x̅ ± SD)
Perlakuan Integritas DNA
Imotilitas (%) Keutuhan (%)
(%)
Kepala 100.00 ± 0.00a 9.38 ± 4.17b 100.00 ± 0.00
Leher 98.75 ± 2,32a 19.38 ± 10.5b 100.00 ± 0.00
Badan Ekor 95.00 ± 5.98a 85.00 ± 11.65a 100.00 ± 0.00
b
Ujung Ekor 86.88 ± 8.43 90.63 ± 6.78a 100.00 ± 0.00
Keterangan : Huruf berbeda yang mengikuti angka pada kolom yang sama
menunjukkan berbeda nyata (P<0.05).

Pada Tabel 3 dapat dilihat bahwa kualitas spermatozoa pasca penembakan

laser dioda memiliki rata - rata imotilitas tertinggi pada kepala (100.00 ± 0.00) tidak

21
berbeda nyata (P>0.05) dengan hasil penembakan pada leher (98.75 ± 2.32) dan

badan ekor (95.00 ± 5.98). Sedangkan penembakan pada ujung ekor (86.88 ± 8.43)

berbeda nyata (P<0.05) lebih rendah dibandingkan dengan penembakan pada

bagian kepala, leher dan badan ekor. Integritas DNA spermatozoa pasca

penembakan laser dioda (Gambar 8) pada bagian pada ujung ekor (90.63 ± 6.78)

dan badan ekor (85.00 ± 11.65) berbeda nyata (P<0.05) lebih tinggi dibandingkan

dengan penembakan pada bagian leher (19.38 ± 10.5) dan kepala (9.38 ± 4.17).

Berdasarkan hasil penembakan laser dioda pada kepala, leher dan badan

ekor menghasilkan presenatse imotilitas yang tinggi dan tidak berbeda nyata,

namun integritas DNA spermatozoa hasil penembakan laser dioda pada badan ekor

menghasilkan integritas DNA yang tinggi. Rink et al (1996) menyatakan bahwa

penembakan penembakan laser dioda dengan panjang gelombang 1,48 µm

memberikan pengaruh termal yang membuat spermatozoa tidak bergerak.

Selanjutnya Montag et al. (2000), menyatakan bahwa pengaruh termal akibat

penembakan laser memungkinan terjadinya denaturasi preotein dan permeabelisasi

membran ekor. Hasil penelitian ini menujukkan bahwa penembakan laser dioda

dengan panjang gelombang 1,48 µm pada badan ekor lebih sedikit mendapatkan

pengaruh negatif kerusakan membran yang mengakibatkan penurunan viabilitas.

Pada hasil penelitian ini juga memperlihatkan bahwa penembakan laser dioda pada

ujung ekor menghasilkan imotilitas dan integritas DNA yang tinggi, namun

imotilitasnya lebih rendah secara nyata dibandingkan pada badan ekor.

Keutuhan spermatozoa pasca penembakan laser dioda pada penelitian ini

tidak terdapat nilai yang berbeda pada semua bagian penembakan dengan nilai

(100.00 ± 0.00) berarti penggunaan laser dioda dengan panjang gelombang 1,48 µm

pada semua bagian penembakan tidak mempengaruhi keutuhan spermatozoa. Hasil

22
ini sejalan dengan penelitian Montag et al. (2000) menyatakan bahwa penggunaan

laser dioda dengan panjang gelombang 1,48 µl dapat menjaga keutuhan

spermatozoa.

Gambar 5. Fluorescence viabilitas spermatozoan menggunakan pewarnaan Hoecst.

Bar menunjukkan 20 um.
Gambar 8. Hasil pengamatan integritas DNA spermatozoa pasca penembakan laser
dioda menggunakan mikroskop flouresence. Bar menunjukkan 20 µm.

23
 PENUTUP

Kesimpulan

Hasil yang diperoleh dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa:

1. Penembakan laser dioda dengan panjang gelombang 1,48 µm pada bagian

badan ekor yang paling efektif dalam imobilisasi spermatozoa dengan

imotilitas sebesar 95.00 ± 5.98 dan integritas DNA sebesar 85.00 ± 11.65.

2. Penggunaan laser dioda dengan panjang gelombang 1,48 µm dapat

digunakan untuk imobilisasi spermatozoa sebelum ICSI.

Saran

Dibutuhkan penelitian lanjutan untuk melihat kemungkinan keberhasilan

fertilisasi menggunakan penembakan laser dioda dengan panjang gelombang 1,48

µm.

24
 DAFTAR PUSTAKA

Adriyani, Y. H. Suhartini, Aunorohman, Prayitno dan A. Priyono.1980. Pengantar

Ilmu Peternakan. Fakultas Peternakan Universitas Jenderal Soedirman,
Purwokerto.

Agarwal, A. & T.M. Said. 2011. Interpretation of basic semen analysis and
advanced semen testing. 9 hlm.

Algarubi, S.M. 2014. Effect of sperm quality of beef cattle on percentage. IJSR
3(11): 790—793.

Alters, S. 2000. Biology understanding life.Jones and Bartlett Publishers, Canada:

834 hlm.

Applegate, E. 2011. The anatomy and physiology learning system. 4th ed. Saunders
Elsevier, USA: 467 hlm.

Arifiantini, L., T.L. Yusuf, Dan Yanti D. 2005. Kaji Banding Kualitas Semen Beku
Sapi Friesian Holstein Menggunakan Pengencer Dari Berbagai Balai
Inseminasi Buatan Di Indonesia. Animal Production 7(3): 168-176.

Blakely, J., dan Bade, D. H. 1998. Ilmu Peternakan Edisi ke Empat. Penerjemah:
Srigandono, B. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Hal: 351-352.

Boediono, A., 2001. Sperm immobilization prior to introcytoplasmic sperm

injection (ICSI) and oocyte activation improves early development of
microfertilized goat oocyte. Reprotech. 1:29-34.
Budai, C., I. Egerszegi., J. Oalah., A. Javor, & A. Kavacs. 2014. Application of
semen evaluation techniques. Agrartudomanyi Kozlemenyek 59(1): 1—
10.

[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2005. Semen Beku Sapi.

Chen HH, Feng GX, Zhang B., Shu JH, Gan XY, Zhou H., 2015. Successful
pregnancy following laser-assisted selection of viable but immotile
spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection: a report of 2 cases.
Zhonghua Nan Ke Xue 2015; 21:988–991.

Chenoweth, P. J., and Lorton, S. P. 2014. Animal Andrology Theories And

Applications. CABI. UK.

Chian, R. & P. Quinn. 2010. Fertility cryopreservation. Cambridge University

Press, United Kingdom: xiii + 260 hlm.

Cochran, P.E. 2011. Veterinary anatomy & physiology. 2nd ed. Cengage Learning,
USA: xii + 357 hlm.

25
Cochran, R., Meintjes, M., Roggio, B., and Hylan, D., 1998. Live foals produced
from sperm injected oocytes derived from pregnant mares. J.Equine.Vet.
Sci. 18:736-740.

Donnelly ET, Steele EK, McClure N, Lewis SE. 2001. Assessment of DNA
integrity and morphology of ejaculated spermatozoa from fertile and
infertile men before and after cryopreservation. Hum Reprod 16: 1191-
1199.

Dozortzev, D., Rybouchkin, A., Sutter, P., Qian, C., and Dhont, M., 1995. Human
oocyte activation following intracytoplasmic sperm injection: the role of
the sperm cell. Hum. Repord. 10:403-407.

Edwards, RG., Steptoe, P.C., and Purdy J.M.,1980. Estanlishing full-term human
pregnancies using cleaving embryos grown in vitro. Br.j.Obstet.Gynaecol.
87:737-756.

Gomez, M.C., Catt, J.W., Evans, G., and Maxwell, W.M.C., 1998. Cleavage,
development and competence of sheep embryos fertilized by
intracytoplasmic sperm injectionand in
vitro fertilization. Theriogenology. 49:1143-1154.

Gunawan, M., R.D.A. Putri & E.M. Kaiin. 2015. Evaluation of quality sexing sperm
Frisian Holstein (FH) post thawing. Pros Sem Biodiv Masy Biodiv Indon
1(8): 2057—2061.

Hamano, K., Li, X., Qian, X.Q., Funauchi, F., Furudate, M., and Minato, Y.,
1999. Gender preselection in cattle with intracytoplasmically injected,
flow cytometrically sorted sperm heads. Biol. Reprod. 60:1194-1197.

Henkel RR, Schill WB. 2003. Sperm preparation for ART. Reprod Biol Endocrinol
1:108.

Hewitson, L.C., Dominiko, T., Takahashi, D., Martinovich, C., Ramalho-Santos, J.,
Sutovsky, P., Fanton, J., Jacob, D., Monteith, D., Neuringer, M., Battaglia,
D., Simerly, C., and Schatten, G., 1999. Unique checkpoints during the first
cycle of fertilization after intracytoplasmic sperm injection in rhesus
monkey. Nat.Med. 5:431-433.

Hiramoto, Y. 1966. Microinjection of the live spermatozoa into see urchin eggs.
Exp.Cell.Res. 27:416-426.

Hosoi, Y., Miyake, M., Utsumi, K., and Iritani, A., 1988. Development of rabbit
oocytes after microinjection of spermatozoa. In: Proceedings of the
11th International Congress on Animal Reproduction and Artificial
Insemination. Abst.Pp.331.

Iritani, A., 1989. Micromanipulation of oocyets and embryos. In: Proceedings of

13rd World Congress on Fertility and Sterility, Marrakech,
Morocco, Oct.1-5, 1989. Parthenon Publishing, Karnforth, UK.

26
Karlinah, N., E. Yanti, & N. Arma. 2015. Bahan ajar embriologi manusia.
Deepublish, Yogyakarta: xii + 447 hlm.

Kimura, Y., and Yanagimachi, R., 1995. Intracytoplasmic sperm injection in the
mouse. Biol. Reprod. 52:709-720.

Kondracki, S., D. Banaszewska, A. Wysokinska, & J. Chomicz. 2005. Sperm

morphology of cattle and domestic pigs. Reproductive Biology 6(2): 99—
104.
Kuretake, S., Kimura, Y., Hoshi, K. and Yanagimachi, R. 1996. Fertilization and
Development of Mouse Oocytes Injected with Isolated Sperm Heads. Biol.
Reprod. 55:789-795.

Legato, M.J. 2004. Principles of gender-specific medicine. Elsevier Academic

Press, USA: xvii + 1241.

Martin, M.J., 2000. Development of in vivo matured porcine oocytes following

intracytoplasmic sperm injection. Biol.Reprod. 63:109-112.

Metz, C.B. & A. Monroy. 1967. Fertilization: comparative morphology,

biochemistry, and immunology. Academic Press, USA: xiii + 457 hlm.

Montag M, Rink K, Delacrétaz G & van der Ven H. (2000) Laser-induced

immobilization and plasma membrane permeabilization in human
spermatozoa. Hum Reprod 15, 846–852.

Oliveira, P.F. & M.G. Alves. 2015. Sertoli cell metabolism and spermatogenesis.
Springer, London: 75 hlm.

Palermo, G, H. Joris, P. Devroey, and A.C.V. Steirteghem. 1992. Pregnancies after

intracytoplasmic injection of single spermatozoa into an oocyte. Lancet.
340:17-18.

Pasupuleti, V. 2007. Role of glycolysis and respiration in sperm metabolism and

motility. 55 hlm.

Pope, C.E., Johnson, C.A., McRae, M.A., Keller, G.L., and Dresser, B.L., 1998.
Development of embryos produced by intracytoplasmic sperm injection of
domestic cat oocytes. Anim.Reprod.Sci. 53:221-236.

Ramu, S. & R.S. Jeyendran. 2012. The hypo-osmotic swelling test for evaluation
of sperm membrane integrity. Spermatogenesis 927: 21--25.

Rink, K., Delacre ́taz, G., Salathe ́, R. et al. (1996) Non-contact microdrilling of
mouse zona pellucida with an objective-delivered 1.48 µm diode laser.
Lasers Surg. Med., 18, 52–62.

Rouge, M. 2004. Sperm morphology. Springer, London.

27
Said T, Agarwal A, Grunewald S, Rasch M, Baumann T, Kriegel C,
Li L, Glander HJ, Thomas AJ Jr & Paasch U. 2006. Selection of non
apoptotic spermatozoa as a new tool for enhancing assisted reproduction
outcomes: an in vitro model. Biol Reprod 74, 530–537.

Said, S., Saili, T., Tappa, B., 2003. Pengaktifan dan pembuahan sel telur tikus
setelah disuntik kepala spermatozoa. Hayati. 10:96-99.

Saili, T., Said, S., Setiadi, M. A., Agungpriyono, S., Toelihere, M. R. dan Budiono,
A. 2005. Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) Sebagai T eknik
Reproduksi Bantuan Unggulan. Sain. Vet. 1:53-59.

Storey, B.T. 2008. Mammalian sperm metabolism: oxygen and sugar, friend and
foe. Int. J. Dev. Biol. 52: 427--437.

Sujoko, H. M.A. Setiadi, &A. Boediono. 2009. Seleksi spermatozoa domba garut
dengan metode sentrifugasi gradien densitas percoll. Jurnal Veteriner
10(3): 125--132.

Susilawati, T. 2011. Spermatologi. Unversitas Brawijaya Press, Malang: xviii + 176

hlm.

Sutama, I.K., B. Setiadi, P. Situmorang, U. Adiati, Budiarsana, T. Kostaman,

Maulana, Mulyawan, & R. Sukmana. 2000. Uji kualitas semen beku
kambing peranakan Etawah dan kambing Boer. Laporan Bagian Proyek
Rekayasa Teknologi Peternakan: 88—111.

Wright, D. 2000. Human physiology and health. Heinemann, Oxford: 280 hlm.

Yanagida K. 2009. Identification and characterization of a novel lysophosphatidic

acid receptor, p2y5/LPA6. Department of Biochemistry and Molecular
Biology, Faculty of Medicine, Univerfsity of Tokyo, Tokyo, Japan.
284(26):17731-41.

Yanagimachi, R. 2001. Gamete manipulation for development: new methods for

conception. Reprod.Fertile.Dev. 13:3-14.

28
 LAMPIRAN

1. Data Kualitas Spermatozoa Pasca Thawing

Parameter
n
Motilitas (%) Viabilitas (%) Abnormalitas (%) MPU (%)
1 50.00 71.00 19.00 74.00
2 47.90 76.00 13.67 74.00
3 52.37 73.30 15.00 73.00
4 49.67 73.67 11.00 73.00
5 45.96 72.34 8.34 72.00
6 50.44 74.67 11.00 72.67
7 49.56 73.33 9.67 72.33
8 47.90 73.33 11.33 73.00
x̅ ± SD 49.23 ± 1.94 73.46 ± 1.48 12.38 ± 3.40 73.00 ± 0.71
Keterangan:
n = Pengulangan
x̅ = Rata-rata
SD = Standar Deviasi

2. Data Kualitas Spermatozoa Pasca Swim Up

Parameter
n
Motilitas (%) Viabilitas (%) Abnormalitas (%) MPU (%)
1 55.00 70.67 19.67 74.00
2 51.00 74.67 15.00 73.00
3 61.67 71.00 16.00 74.00
4 52.36 72.34 12.33 72.00
5 51.85 72.00 9.00 71.00
6 53.49 73.00 13.34 71.34
7 52.36 75.00 11.33 72.00
8 51.00 72.33 13.00 71.33
x̅ ± SD 53.59 ± 3.52 72.63 ± 1.56 13.71 ± 3.23 72.33 ± 1.19
Keterangan:
n = Pengulangan
x̅ = Rata-rata
SD = Standar Deviasi

3. Analisis Data Kualitas Spermatozoa Pasca Penembakan Laser Dioda

Uji Analisis Variansi (ANAVA) satu faktor terhadap data presentase

imotilitas dan integritas DNA spermatozoa pasca penembakan laser dioda.

Hipotesis:

29
 Ho(1) : Nilai rata-rata data presentase imotilitas spermatozoa pasca

penembakan laser pada berbagai bagian spermatozoa (kepala,

leher, badan ekor dan ujung ekor) tidak berbeda nyata.

Ha(1) : Nilai rata-rata data presentase imotilitas spermatozoa pasca

penembakan laser pada berbagai bagian spermatozoa (kepala,

leher, badan ekor dan ujung ekor) berbeda nyata.

Ho(2) : Nilai rata-rata data presentase integritas DNA spermatozoa

pasca penembakan laser pada berbagai bagian spermatozoa

(kepala, leher, badan ekor dan ujung ekor) tidak berbeda nyata.

Ha(2) : Nilai rata-rata data presentase integritas DNA spermatozoa

pasca penembakan laser pada berbagai bagian spermatozoa

(kepala, leher, badan ekor dan ujung ekor) berbeda nyata.

Taraf nyata:

Nilai yang digunakan ∝ adalah 0.05 (∝=0.05)

Pengambilan keputusan:

• Jika P>0.05 maka Ho diterima.

• Jika P<0.05 maka Ho ditolak.

Hasil Perhitungan:

Analisis Variansi (ANAVA) perlakuan terhadap data presentase

data imotilitas spermatozoa pasca penembakan laser dioda.

Jumlah Kuadrat
Db F P
Kuadrat Tengah
Perlakuan 839.8 3 279.95 9.99 0.000

Error 784.4 28 28.01

Total 1624.2 31

30
 Nilai P = 0.000

Karena P<0.05 maka Ho ditolak.

Analisis Variansi (ANAVA) satu faktor terhadap data presentase

data integritas DNA spermatozoa pasca penembakan laser dioda.

Jumlah Kuadrat
Db F P
Kuadrat Tengah
Perlakuan 42666 3 14221.9 91.94 0.000

Error 4331 28 154.7

Total 46997 31
Nilai P = 0.000

Karena P<0.05 maka Ho ditolak.

Kesimpulan:

1) Nilai rata-rata data presentase imotilitas spermatozoa pasca

penembakan laser pada berbagai bagian spermatozoa (kepala, leher,

badan ekor dan ujung ekor) berbeda nyata.

2) Nilai rata-rata data presentase integritas DNA spermatozoa pasca

penembakan laser pada berbagai bagian spermatozoa (kepala, leher,

badan ekor dan ujung ekor) berbeda nyata.

Uji Fisher LSD terhadap data presentase imotilitas dan integritas

DNA spermatozoa pasca penembakan laser dioda.

Taraf nyata:

Nilai yang digunakan ∝ adalah 0.05 (∝=0.05)

Hasil Perhitungan:

Uji Fisher LSD terhadap data presentase imotilitas spermatozoa

pasca penembakan laser dioda.

31
 Perlakuan N Mean Kelompok
Kepala 8 9.38 b
Leher 8 17.50 b
Badan Ekor 8 81.25 a
Ujung Ekor 8 90.63 a

Uji Fisher LSD terhadap data presentase integritas DNA

spermatozoa pasca penembakan laser dioda.

Perlakuan N Mean Kelompok

Kepala 8 9.38 b
Leher 8 17.50 b
Badan Ekor 8 81.25 a
Ujung Ekor 8 90.63 a

Kesimpulan:

1) Terdapat perbedaan yang nyata antara penembakan laser dioda pada

kepala, leher dan badan ekor dengan ujung ekor pada data presentase

imotilitas pasca penembakan laser dioda.

2) Terdapat perbedaan yang nyata antara penembakan laser dioda pada

kepala dan leher dengan badan ekor dan ujung ekor terhadap data

integritas DNA spermatozoa pasca penembakan laser dioda.

32
 4. Dokumentasi

Proses Thawing dan Evaluasi Kualitas Spermatozoa Pasca Thawing

Pembuatan Medium

Imobilisasi Sperma dan Evaluasi Kualitas Spermatozoa Pasca Penembakan

Laser

33
 RIWAYAT HIDUP

Athhar Manabi Diansyah Lahir di Palopo pada tanggal 13

November 1997 sebagai anak pertama dari 3 bersaudara.

Anak dari pasangan bapak Dr. Ir. Syahruddin Said, M. Agr

dan ibu dr. Rosdiana Rasyidi, MARS. Jenjang pendidikan

formal yang pernah ditempuh adalah SDN Sukadamai 3

Kota Bogor lulus tahun 2009, kemudian setelah lulus SD melanjutkan kejenjang

SMPN 1 Kota Bogor Lulus tahun 2012 dan melanjutkan sekolah menengah atas

SMAN 1 Kota Bogor lulus pada tahun 2015, setelah menyelesaikan tingkat SMA,

penulis diterima di Perguruan Tinggi Negri (PTN) Fakultas Peternakan, Universitas

Hasanuddin, Makassar dan penulis mengikuti beberapa lembaga kemahasiswaan

diantaranya Himpunan Mahasiswa Produksi Ternak Universitas Hasanuddin

(HIMAPROTEk-UH), Himpunan Mahasiswa Islam (HmI), Ikatan Senat

Peternakan Indonesia (ISMAPETI) dan Senat Mahasiswa Peternakan Universitas

Hasanuddin (SEMA FAPET-UH) yang sekarang sedang menjabat sebagai

Sekertaris Umum.

34