PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan yang saat ini telah banyak digunakan
dibandingkan metode lain seperti destilisasi, Kristalisasi, pengendapan, ekstraksi dan lain-lain
karena dalam pelaksanaan prosesnya lebih sederhana. Penggunaan waktu yang singkat
terutama, mempunyai kepekaan yang tinggi. Serta mempunyai kemampuan memisahkan yang
tinggi. Metode ini dapat digunakan jika dengan metode lain tidak dapat digunakan misalnya
karena jumlah cuplikan sangat sedikit atau campurannya kompleks.

Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh molekul Tewett (1903), Serang ahli Botani,
Rusia. Ia menggunakan kromatografi untuk memisahkan klorofil dan pigmen-pigmen lain dari
ekstrak tanaman dengan cara ini. Nama kromatografi diambil dari bahasa Yunani yaitu
(Choromos = penulisan) dan (Graver = Warna). Kromatografi berarti tulisan dengan warna.
Saat ini telah dikenal berbagai macam kromatografi. Namun istilah kromatografi yang
sebenarnya sudah tidak tepat lagi. Karena dengan kromatografi juga dapat dipisahkan
senyawa-senyawa yang tidak berwarna seperti gas.
Secara umum dapat dikatakan bahwa kromatografi adalah suatu proses migrasi diferensial
dinamis dalam sistem di mana komponen-komponen cuplikan dikatakan secara selektif oleh
fase diam.
Prinsip kromatografi adalah cara pemisahan pemukiman yang didasarkan atas perbedaan
distribusi dan komponen-komponen campuran tersebut di antara dua fase yaitu fase diam dan
fase bergerak. Untuk mengetahui penerapannya dari praktikum kromatografi yang
penerapannya sangat banyak di temukan dalam kehidupan sehari-hari.

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik
pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas
ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu
Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen
dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi
diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna bergerak kebawah
kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk
memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu
dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Perkembangan tentang kromatografi digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi
padatan cair (LSC). Akhir tahun 1930 an sampai tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) pada tahun 1938 oleh Izmailov dan
Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali
dari Martin dan Synge pada tahun 1941, tidak hanya mengubah kromatografi cair tetapi
seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas.
Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan kromatografi gas. Diantara tahun 1952
dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang
canggih.

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar. High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi
atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan
Modern = moderen) berhasil dikembangkan. Saat ini dengan teknik yang sudah matang dan
dengan cepat, KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

Kromatografi berkembang menjadi teknik pemisahan untuk zat kimiawi dengan sifat yang
sangat mirip, dan dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif dan penetapan kuantitatif
untuk zat-zat yang sudah dipisahkan. Keuntungan-keuntungan dari Kromatografi diantaranya
:

1. Kromatografi merupakan metoda pemisahan yang cepat, mudah dan

menggunakan peralatan yang murah serta sederhana, kecuali unt uk kromatografi
gas, hingga campuran yang kompleks dapat dipisahkan dengan mudah.

2. Kromatografi hanya membutuhkan campuran cuplikan . yang sangat sedikit

sekali, bahkan tidak menggunakan jumlah yang besar, disamping itu
kromatografi pekerjaannya dapat diulang.

B. Tujuan :
Adanya modul ini diharapkan peserta diklat dapat melakukan analisis kromatografi

C. Ruang Lingkup
Modul melakukan analisis kromatografi meliputi : menjelaskan dasar-dasar analisis
kromatografi, menyiapkan sampel dan standar, melaksanakan pemisahan kromatografi,
melaksanakan pengukuran analisis, melaksanakan perhitungan hasil analisis.
 BAB II
RANCANG BANGUN PEMBELAJARAN MATA DIKLAT/GBPP/SILABUS

Nama Diklat :Pengingkatan Kompetensi Guru Bidang Produktif Kimia Analis

Mata Diklat : Melakukan Analisis Kromatografi

Jenjang Diklat : Tingkat Menengah
Kode Kompetensi : TR.TK.KA.052.M.1
Alokasi Waktu : 14 X 45 Menit
Tujuan : Peserta diklat diharapkan mampu melakukan analisis kromatografi

Deskripsi Materi : :Melakukan analisis kromatografi meliputi materi : menjelaskan dasar-

dasar analisis kromatografi, menyiapkan sampel dan standar,
melaksanakan pemisahan kromatografi, melaksanakan pengukuran
analisis, melaksanakan perhitungan hasil analisis.

KOMPETENS MATERI KEGIATAN WAKT

I DASAR PEMBELAJARAN PEMBELAJARAN INDIKATOR PENILAIAN U SUMBER
JAM BELAJAR
1. Menjelaskan  Prinsip dasar  Menjelaskan  Jenis-jenis  Tes tulis 2  Job Sheet
dasar-dasar kromatografi prinsip dasar kromatografi  Observasi  Modul
analisis  Kasifikasi kromatografi dikenali  Laporan  Peralatan
 Tahap- praktek
kromatografi jenis  Mengklasifikasi
tahap analisis  SOP di Lab
kromatografi kan jenis kromatografi Kimia.
 Sifat kromatografi diketahui.
Kromatografi
 Mengenal alat
analisis
kromatografi
2. Menyiapkan  Identifikasi alat  Mengidentifikasi  Alat dan  Tes tulis 2  Job Sheet
sampel dan dan bahan alat dan bahan bahan  Observasi  Modul
standar analisis analisis disiapkan  Laporan  Peralatan
sesuai praktek
kromatografi kromatografi
kebutuhan  SOP di Lab
 Prefarasi  Melakukan Kimia
sampel prefarasi
analisis bahan/sampel
kromatografi
 Standarisasi
bahan kimia
(larutan)
3. Melaksanakan     
pemisahan
kromatografi
 BAB II
KEGIATAN PEMBELAJARAN

A. KEGIATAN PEMBELAJARAN 1. MENJELASKAN DASAR-DASAR ANALISIS

KROMATOGRAFI.

1. LEMBAR INFORMASI

1.1. DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

a. Prinsip Kromatografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan

kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Istilah kromatografi berasal
dari kata “chroma” (warna) dan “graphein” (menuliskan). Teknik pemisahan analitik
yang paling banyak digunakan ditemukan pada tahun 1903 oleh TSWETT, ia telah
menggunakan kromatografi untuk pemisahan s e n ya wa - s e n ya wa ya n g berwarna
dan nama kromatografi diambil dari senyawa yang berwarna.

b. Klasifikasi Kromatografi

Kromatografi

B. Kromatografi Gas A. Kromatografi Cair

Planar Kolom

Kertas Lapis Tipis Terbuka (Twsett) Tertutup (KCKT)

Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fasa

diam dan fasa gerak berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan.
Kromatografi dapat digunakan untuk preparatif atau analisa kualitatif dan kuantitatif.
Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa yaitu fasa tetap
(stationary) dan fasa bergerak (mobile), pemisahan- pemisahannya tergantung pada
gerakan relatif dari dua fasa tersebut. Persyaratan utama kromatografi adalah :
1). Ada fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam tidak boleh bereaksi dengan fasa
gerak.

2). Komponen sampel (contoh) harus larut dalam fasa gerak dan berinteraksi
dengan fasa tetap (diam).

3). Fasa gerak harus bisa mengalir melewati fasa diam, sedangkan fasa diam
harus terikat kuat di posisinya.

Berdasarkan cara kontak antara fasa diam dan fasa gerak, dikenal kelompok
kromatografi kolom dan kromatografi planar,sebagai berikut :

1. Kromatografi kolom : fasa diam ditahan dalam sebuah kolom sempit

(terbuka di kedua ujungnya). Fasa ger ak mengalir karena efek gravitasi
atau tekanan. Fasa diam umumnya berupa
padatan atau cairan. Fasa gerak umumnya berupa cairan atau gas dan
dialirkan terus menerus. Hasil pemisahan adalah spesi yang keluar dari
kolom.
2. Kromatografi planar : fasa diam didukung oleh (dilapiskan pada) plat
datar atau lembaran. Fasa gerak bergerak berdasarkan aksi kapiler atau gaya
gravitasi. Fasa diam umumnya adalah padatan, sedangkan fasa gerak
umumnya adalah cairan. Fasa gerak dialirkan hanya sampai mendekati
akhir bidang fasa diam. Hasil pemisahan berua spot-spot pada lintasan
(tract) yang dijalani oleh sampel.

Cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap, yang dapat
berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat maka cara tersebut dikenal
sebagai kromatografi serapan (absorption chromatography), dan jika zaf cair dikenal
sebagai kromatografi partisi (partition chromatography). Karena fasa gerak dapat berupa
zat cair atau gas maka semua ada empat macam sistem kromatografi. Keempat rnacam
sistem kromatografi tersebut adalah :
 1). Fasa gerak zat cair - fasa tetap padat : Komatografi penukar ion.

2). Fasa gerak gas - fasa tetap padat : Kromatografi gas padat

3). Fasa gerak zat cair - fasa tetap zat cair, dikenal sebagai
kromatografi partisi dan kromatografi kertas.
4). Fasa gerak gas - fasa tetap zat cair : Kromatografi gas -air dan Kromatografi
kolom kapiler.
Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada senyawa - senyawa yang
dipisahkan, sehingga terdistribusi sendiri diantara fasa gerak dan fasa tetap
dalam perbandingan yang sangat berbeda -beda dari satu senyawa terhadap
senyawa yang lain.

c. Kromatografi Partisi
Perbedaan yang pokok adalah terletak pada sifat dari penyerap, dimana dalam
kromatografi partisi berupa materi yang berpori, seperti kieselguhr, yang
dilapisi dengan lapisan dari zat cair sering menggunakan air. Fasa tetap adalah
lapisan zat cair dan zat padat yang berperan sebagai penyangga/penyokong. Jika
fasa -fasa bergerak dan tetap keduanya berupa zat cair maka akan diperoleh
kromatografi zat cair-cair.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen dari campuran tidak tergantung pada
kelarutannya dalam fasa tetap, yang berupa zat cair sehingga senyawa-senyawa
yang lebih larut akan bergerak lebih lambat turunnya dalam kolom daripada yang
kurang kelarutannya. Selama bergerak senyawa-senaywa mengalami partisi di
antara dua fasa, dan pemisahan terjadi karena perbedaan dalam koefisien partisi.

Kromatografi kertas merupakan partisi yang spesial, d imana lembaran kertas adalah
sebagai pengisi/pengganti dari kolom. Kromatografi campuran dari senyawa yang
dipisahkan membentuk suatu jalur dalam kolom.

1.2. Kromatografi Serapan/Kolom

a. Kolom Serapan
Untuk memisahkan suatu campuran, kolom seperti gambar l.a dapat digunakan dan
diisi dengan penyerap zat padat seperti alumina sebagai fasa tetap dan dialiri dengan
pelarut seperti benzena sebagai fasa gerak
 b a

Gambar I

1a. Pemisahan suatu campuran dengan kolom kromatografi. 1b. Jalur-jalur serapan

Sejumlah kecil cuplikan dari campuran dimasukkan melalui sebelah atas dari kolom yang
kemudian membentuk jalur-jalur serapan dari senyawa, seperti gambar Ib. Bila pelarut
dibiarkan mengalir melalui kolom ia akan mengangkut senyawa-senyawa yang
merupakan komponen-komponen dari campuran.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung pada berapa besarnya zat
terhambat/tertahan oleh penyerap di dalam kolom. Jadi suatu senyawa yang
diserap lemah akan bergerak lebih cepat daripada yang diserap kuat. Akan terlihat
bahwa jika perbedaan -perbedaan dalam serapan cukup besar maka akan terjadi
pemisahan yang sempurna, seperti terlihat pada gambar 1b.

Bentuk kolom serapan yang sederhana telah ditunjukkan seperti dalam garnbar 1a. Bentuk
ini merupakan jenis yang pertama-tama digunakan untuk pemisahan-pernisahan
kromatografi hingga sampai sekarang.

Kolom krornatografi dapat berupa pipa gelas yang dilengkapi dengan kran dan gelas
penyaring di dalamnya. Meskipun kolom-kolom dapat dibuat secara sederhana dari
tabung gelas, kadang-kadang buret pun dapat digunakan. Ukuran kolom tergantung pada
banyaknya zat yang akan dipisahkan. Untuk menahan penyerap yang diletakkan di dalam
kolom dapat digunakan gelas wool atau kapas, lihat gambar 2 a dan b.
 a

b.

Gambar 2
Kolom untuk kromatografi

a. Pengisian Kolom
Pengisian kolom adalah tidak mudah untuk mernperoleh pengisian kolom yang homogen,
tetapi perlu dicoba hingga mendapatkan hasil yang maksimurn. Pengisian yang tidak
teratur dari penyerap akan mengakibatkan merusak batas- batas pita krommatografi.
Putusnya penyerap dalam kolom biasanya disebabkan oleh gelembung-gelembung udara
selama pengisian. Untuk rnencegah hal-hal tersebut sedapat mungkin zat
pengisi/penyerap dibuat menjadi "bubur" dengan pelarut kemudian dituangkan perlahan-
lahan dalam tabung. Jika penyerap dibiarkan turun perlahan-lahan dapat ditolong dengan
mengguncang perlahan-lahan maka akan diperoleh pengisian yang homogen. Jika
besarnya partikel-partikel penyerap sama, akan lebih mudah untuk mendapatkan
pengisian yang homogen. Tetapi hal ini sangat jarang. Harus diperhatikan penyerap yang
telah dimasukkan jangan sampai ada bagian yang kering baik selama pengisian atau
selama pemisahan.

1.3. Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas termasuk dalam kelompok kromatografi planar, dimana
pemisahannya menggunakan medium pemisah dalam bentuk bidang datar yaitu
benuk kertas. Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau
cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran
bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang
berbeda pula.

Kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak
adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.

Berbagai jenis pemisahan yang sederhana dengan Kromatografi kertas telah

dilakukan dimana proses dikenal sebagai "analisa Kapiler". Metoda-metoda ini
sangat sesuai dengan kromatografi serapan, dan sekarang kromatografi kertas
dipandang sebagai perkembangan dari sistem partisi. Salah satu zat padat dapat
digunakan untuk menyokong fasa tetap yaitu bubuk selulosa.

Mula-mula telah dilakukan pemisahan asam -asam amino dan peptida- peptida
yang merupakan hasil hidrolisa protein wool dengan suatu cara di mana kolom
yang berisi bubuk diganti dengan lem baran kertas dan kemudian diletakkan
dalam bejana tertutup yang berisi uap jenuh larutan. Ini adalah merupakan jenis
dari sistem partisi dimana fasa tetap adalah air, disokong oleh molekul-molekul
selulose dari kertas, dan fasa bergerak biasanya merupakan campuran dari satu atau
lebih pelarut - pelarut organik dan air.

Suatu hal yang perlu diperhatikan disini adalah tentang peralatan. Pada
kromatografi Kertas peralatan yang dipakai tidak perlu alat-alat yang teliti atau
mahal. Hasil-hasil yang baik dapat diperoleh dengan peralatan dan materi-materi
yang sangat sederhana. Senyawa-senyawa yang terpisahkan dapat dideteksi pada
kertas da n dapat segera diidentifikasi. Bahkan komponen-komponen yang
terpisahkan dapat diambil dari kertas dengan jalan memotong-motongnya yang
kemudian dilarutkan secara terpisah.

Meskipun kromatografi kertas sangat mudah pengerjaannya, tetapi sangat sulit dijelaskan
apabila membadingkannya dengan kromatografi lapis tipis. Penjelasannya tergantung
tingkatan pemilihan pelarut yang anda gunakan, dan beberapa sumber untuk mengatasi
masalah secara tuntas. Jika anda telah pernah melakukannya, ini sangat membantu jika
anda dapat membaca penjelasan bagaimana kromatografi lapis tipis bekerja.
  Struktur dasar kertas

Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari gula sederhana, yaitu
glukosa.

Sangat menarik untuk mencoba untuk menjelaskan kromatografi kertas dalam kerangka
bahwa senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan yang berbeda pada permukaan
kertas. Dengan kata lain, akan baik menggunakan beberapa penjelasan untuk
kromatografi lapis tipis dan kertas. Sayangnya, hal ini lebih kompleks daripada itu!
Kompleksitas timbul karena serat-serat selulosa beratraksi dengan uap air dari atmosfer
sebagaimana halnya air yang timbul pada saat pembuatan kertas. Oleh karenanya, anda
dapat berpikir yakni kertas sebagai serat-serat selulosa dengan lapisan yang sangat tipis
dari molekul- molekul air yang berikatan pada permukaan. Interaksi ini dengan air
merupakan efek yang sangat penting selama pengerjaan kromatografi kertas.

1.3. Kromatografi Lapisan Tipis (Thin Layer Chromatography, TlC )

Teknik TLC/KLT fasa diam (terutama silika, alumina, dan selulosa) dilapiskan di
permukaan sebuah plat pendukung (umumnya dibuat dari bahan kaca atau
lembaran logam Al). Bila noda telah kering plat diletakkan secara vertikal dalam
bejana yang sesuai dengan tepi yang di bawah dicelupkan ke dalam fasa gerak,
maka pemisahan kromatografi penaikan akan diperoleh. Pada akhir perkembangan,
pelarut dibiarkan menguap dari plat dan noda-noda yang terpisah dilokalisir dan
diidentifikasi dengan cara fisika dan kimia seperti yang digunakan dalam
kromatografi kertas.

1) Metoda Kromatografi Lapisan Tipis

Kromatografi serapan dalam bentuk lapisan tipis yang dilekatkan pada suatu
penyokong telah diketengahkan dalam tahun 1938. Pertamakali dicoba untuk
memisahkan terpen-terpen. Pada "Cromatostrip" yang dibuat melapisi ` potongan
gelas kecil dengan penyerap yang dicampur dengan pati atau perekat sebagai
pengikat.

Perkembangan lebih lanjut STHAL telah mernbuat cara-cara pembuatan potongan gelas
dan cara melapiskannya serta menunjukkan bahwa kromatografi lapisan tipis dapat
digunakan untuk keperluan yang luas dalam pernisahan- pemisahan. Metoda kromatografi
kertas memberikan hasil pemisahan dengan waktu yang lebih cepat dan lebih baik.

2) Jenis Penyerap
Sifat-sifat umum dari penyerap untuk kromatografi lapisan tipis adalah mirip
dengan sifat-sifat penyerap untuk kromatografi kolom. Dua sifat yang penting dari
penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap
penyokong sangat tergantung pada jenis penyerap. Besar partikel yang biasa
digunakan adalah 1 - 25 mikron. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan
memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil
pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus. Sedangkan dalam
kolom partikel yang sangat halus akan mengakibatkan aliran pelarut men jadi
lambat, pada lapisan tipis butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih
cepat.

Beberapa contoh penyerap yang digu nakan untuk pemisahan dalam kromatografi lapisan
tipis adalah sebagai berikut dalam tabel 1.

Tabel 1. Jenis Penyerap untuk Kromatografi Lapisan Tipis

zat padat Digunakan untuk memisahkan
- Silika  Asam-asam amino, alkaloid, gula, asam-asam lemak,
lipida, minyak esensial, anion dan kation organik, sterol,
terpenoid
- Alumina  Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin- vitamin,
karoten, asam-asam amino
 Gula, oligosakarida, asam-asam dibasa, asam- asam
- Kieselguhr
lemak, Irigliscrida, asam-asam amino, steroid alkaloid,
nukleotida

-Bubuk selulosa
 asam-asam amino
- Pati
 asam-asam amino,protein
e. Kromatografi Gas
Kromatografi gas merupakan sekelompok teknik pemisahan kromatografi yang
menggunakan gas sebagai fasa gerak. Karena gas bersifat menyebar ke ruang
disekelilingnya. maka tidak ada kromatografi gas dalam bentuk planar, semua
kromatografi gas berbentuk kolom. Kolom untuk kromatografi gas biasanya dibuat
dari bahan logam nir-karat atau dari bahan gelas. Di dalam alur pemisahan, fasa
sampel juga berupa gas. Karena umumnya sampel untuk kromatografi gas berfasa
cair, maka sistem pemisahan kromatografi gas memerlukan pemanasan. Disisi lain,
stabilitas gas sangat dipengaruhi temperatur, sehingga walaupun sampel sudah berfasa
gas, sistem pemanasan untuk memungkinkan pengendalian temperatur tetap
diperlukan.

Kromatografi gas (Gas chromatography, disingkat GC) termasuk alat-alat analisa.

Analisa dapat dibagi menjadi :

1. Analisa Kualitatif, yaitu penentuan sifat-sifat dari suatu komponen atau campuran
dari komponen.

2. Analisa Kuantitati, yaitu penentuan jumlah dari suatu komponen atau komponen-
komponen dalam suatu campuran.

Kromatografi gas dijajarkan sebagai cara analisa yang dapat digunakan

untuk menganalisa senyawa-senyawa organik. Berdasarkan fasa diam,
dikena l ada dua tipe kromatografi gas yaitu :

1. Kromatograf i padat - gas (Gas So lid Cromatograph y, GSC).

2. Kromatograf i caira n - gas (Gas L iquid Cromato graph y, GL C).
Dalam kedua hal ini sebagai fasa gerak adalah gas (hingga keduanya disebut
kromatografi gas) tetapi fasa diamnya berbeda . Meskipun demikia n kedua
cara tersebut mempunyai banyak persa maan cara kerja . Pada GS C kita
mempunyai absorbsi (absorp si) dan d alam GLC kita mempunyai partisi (la
rutan). Pengoperasian GSC memerlukan tingkat keahlian yang lebih tinggi dari
GLC, shingga relatif jarang digunakan. penyebabnya adalah GSC berdasarkan fasa
diam padat, sehingga gaya tambat analit berdasarkan adsorpsi fisik. Gaya tambat ini
bersifat semi permanen terhadap molekul polar atau molekul aktif sehingga proses
adsorpsi bersifat tidak linier, akibatnya pik hasil elusi menjadi sangat berekor (tailing).
GLC relatif lebih mudah dioperasikan sehingga digunakan secara luas disegala bidang
sains, dan nama GLC sering disingkat menjadi Kromatografi Gas (GC).

a). Kromatografi padat -gas (Gas Sol i d Cr oma tography, GSC).

Kromatografi Gas adalah suatu teknik untuk memisahkan campuran zat yang mudah
menguap dengan cara melewatkan aliran gas pada suatu fasa diam (stationary phase).
Dasar kerja dari GSC adalah adsorbsi (serapan). Dengan alasan ini maka GSC sangat
sukar untuk digunakan secara berulang dengan hasil yang sama. Hal ini disebabkan
oleh kenyataan- kenyataan bahwa :

1. Aktivitas dari penyerap (adsorbent) tergantung pada cara

pembuatannya.
2. Juga aktivitas tergantung pada bagaimana ia diperlakukan setelah pembuatannya.
Keadaan 1 dan 2 sangat sukar untuk distandarisasi. Hal-hal inilah yang menyebabkan
"Reproducibility" yang rendah dari GSC. Yang sering dijumpai adalah :

a. Puncak-puncak berekor disebabkan permukaan aktif yang tidak

homogen dari penyerap.
b. Waktu retensi relatif panjang.
c. Waktu retensi sangat tergantung pada jumlah dari cuplikan.
d. Kernungkinan penyerap.dapat berperan sebagai katalisator yang aktif.

Itulah sebabnya pengguanaan dari GSC sangat terbatas, baik untuk senyawa yang
mempunyai titik didih yang rendah maupun tinggi. Meskipun demikian ada
keuntungan dari GSC bila dibandingkan dengan GLC. Fasa diam tidak dapat
diuapkan, karena tekanan uap dari padatan sangat rendah. Hingga dapat menggunakan
detektor-detektor yang sensitif, karena di sini tidak terjadi "column bleeding".

Dalam tahun akhir-akhir ini GSC menjadi lebih penting yaitu setelah diketemukannya
penyerap-penyerap yang lebih baik. Contoh-contoh penyerap adalah :

1) "grafite-coal" : dikenal sebagai "spheron", strukturnya sangat homogen

(dibandingkan dengan diamond) : ini digunaaan terhadap senyawa-senyawa polar
yang titik didihnya tinggi.

2) “molecular sieves" : ini merupakan zeolit buatan (= Na- atau CaAI- silikat),
dengan pori-pori yang sangat kecil/halus di dalamnya. Ukuran dari diameter pori
dinyatakan dalam A°. Sebagai contoh "Linde", mempuyai ukuran dari 3A° hingga
13A°. Zeolit sangat stabil, pada suhu hingga 600°C. Molecular sieves hanya menyerap
molekul-molekul yang lebih kecil dari pori- porinya. Air sangat cepat diserap hingga
merupakan pengering yang sangat efisien. Molecular sieves mempunyai sifat
katalisator yaitu dapat merupakan zat dehidrator (dehydrating agents). Sebagai contoh
zeofit dapat mengubah alkohol menjadi hidrokarbon/gasolin : R-OH → R-H. Sebelum
digunakan biasanya molecular sieves diaktifkan dengan memanaskannya selama 12
jam pada suhu 150°C sambil dialiri gas H2 yang kering.

Kegunaan molecular pemisahan gas-gas seperti hidrokarbon-hidrokarbon menyerap

sangat kuat. CO2 dan prosesnya tidak dapat balik sehingga zeolit tidak digunakan bila
CO2 dipakai sebagai gas pengangkut.

Perkembangan dalam GSC pada saat sekarang yaitu digunakannya polimer- polimer
yang berpori seperti PORAPAK dan POLYPAK (nama perdagangannya) juga
CHROMOSORB.

Penyerap-penyerap ini sangat cocok untuk pemisahan :

1. Senyawa-senyawa yang sangat polar seperti H20, NH3, R-NH2, R-OH dan
glikol-glikol, dan asam-asam lemak rendah.
2. Juga untuk seperti CO2,N2O,O2 juga yang lainnya.
Kromatografi gas yang paling tua digunakan adalah GSC. Dalam tahun 1800
gas-gas telah dimurnikan dengan menyerapkan pada fasa diam yang berupa :
alumina (AI203), atau pada silica gel (Si O, pasir yang dimurnikan). Kadang-
kadang penyerap ini menjadi tidak aktif bila terkena oleh air.

b) Kromatografi gas-cair (GLC) atau Kromatografi Gas (GC)

Keuntungan-keuntungan yang ditunjukkan oleh GLC :

1. Kecepatan :
a. Gas yang merupakan fasa bergerak sangat cepat mengada - kan
kesetimbangan antara fasa bergerak dengan fasa diam.

b. Kecepatan gas yang tinggi dapat juga digunakan.Hingga waktu

pemisahan sangat cepat (diukur dalam menit).
2. Sederhana :

Alat GLC relatif sangat mudah dioperasikan. Interprestasi langsung dari data
yang diperoleh dapat dikerjakan. Harga dari alat GLC relatif murah.

3. Sensitif :

GLC sangat sensitif. Alat yang paling sederhana dapat mendeteksi

konsentrasi dalam ukuran 0,01% (= 10 0 ppm). Alat- alat GLC yang
lebih rumit dapat mendeteksi senyawa yang Konsentrasirrya hanya
beberapa

Alat yang tertentu sekarang dapat dibuat dengan kemampuan

mendeteksi"parts per billion", hingga dalam jangkauan pikogram= 10g.

Disebabkan sensitivitas yang tinggi dari GLC maka hanya memerlukan

sejumlah kecil dari cuplikan, biasanya dalam ukuran mikroliter.

4. Pemisahan : (resolution = performance).

Dengan GLC memungkinkan untuk memisahkan moleku -molekul dari suatu

campuran, dimana hal ini tidak mungkin dipisahkan dengan cara-cara yang
lain.

Misalnya pemisahan metil ester-metil ester dari :

1) Asam stearat dengan ttd 232°C pada tekanan 15 mmHg

CH3(CH,)t6 COOH.
2) Asam oleat dengan ttd 229°C pada tekanan 15 mm Hg
CH3(CH,)7CH = CH(CHZ)7COOH:

3) Asam linoleat dengan ttd 237°C pada tekanan I5 mm Hg CHj(CHZ)4 CH =

CH = CHCHZCH = CH (CH,)7COOH.
Senyawa-senyawa tersebut tak mungkin dipisahkan dengan cara distilasi atau
dengan ekstraksi, tetapi sangat mudah dipisahkan dengan GLC, yang hanya
membutuhkan waktu sekitar 23 menit.

5. Analisa dapat digunakan sebagai :

1) Analisa kualitatif yaitu dengan membandingkan waktu retensi.

2) Analisa kuantitatif yaitu dengan penghitungan luas puncak.
 3) Alat GLC dapat dipakai dalam waktu yang lama dan berulang- ulang.

c) Prinsip Krimatografi Gas-Cair (GC)

Prinsip kerja kromatografi gas adalah sampel (cuplikan/analit) diinjeksikan ke
dalam kolom dan diuapkan lalu dielusi oleh aliran gas inert (sebagai fasa gerak). Pada
kromatografi gas, fasa gerak tidak berinteraksi dengan molekul-molekul analit. Fungsi
fasa gerak, hanya berfungsi sebagai transpor analit atau cuplikan untuk bergerak di
sepanjang kolom. Proses pemisahan terjadi karena perbedaan interaksi analit dengan
fasa diam.

Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa cuplikan yang telah teruapkan masuk
ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen- komponen dari cuplikan.
Kemudian komponen-komponen dideteksi oleh detektor, dan sinyal dalam bentuk
puncak akan dihasilkan oleh pencatat.

f. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) adalah suatu metode kromatografi

yang mampu memisahkan campuran makromolekul, senyawa ionik, produk alam yang
labil, senyawa polimerik dan kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul
tinggi dengan cara penyarian berfraksi, penyerapan atau penukaran ion.

Ditinjau dari sistem peralatannya KCKT termasuk kromatografi kolom karena fasa
diamnya diisikan atau terpacking dalam kolom. Dan bila ditinjau dari proses
pemisahannya KCKT digolongkan dalam kromatografi adsorpsi atau kromatografi
partisi. KCKT/HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini
menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama
dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.

Pemisahan secara kromatografi dalam KCKT adalah hasil interaksi spesifik anatara
molekul sampel dengan fasa diam atau fasa gerak.

KTKC juga merupakan teknik kromatofrafi yang paling banyak digunakan, dengan
keunggulan-keunggulan:

1. Sensitif dan mudah disesuaikan untuk analisis kuantitatif,

2. Cocok untuk pemisahan spesi yang mudah menguap dan spesi yang mudah rusak
oleh panas,
3. Bisa dugunakan untuk indrsti, bebagai bidang sains dan keperluan publik seperti
untuk analisis asam-asam amino, protein, asam-asam nukleat, hidrokarbon,
karbohidrat, obat-obatan, terpenoid, pestisida, antibiotik, steroid, spesi metal
organik, dan berbagai senyawaan norganik.

KCKT menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau padatan, dan
bisa dilbagi menjadi menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau
padatan, dan bisa dilbagi menjadi 4 (empat) tipe utama yaitu:

1. Kromatografi Partisi (Luntuk solut senyawa polar tetapi bukan ionik berukuran
kecil)
2. Kromatografi Adsorpsi atau Kromatografi Padar-cairan (untuk pemisahan spesi
non-polar, isomer struktur,dan klasifikasi senyawa seperti pemisahan hidrokarbon
alifatik dari alkohol alifatik)
3. Kromatografi Ion (untuk spesi ionik ber-Mr rendah)
4. Kromatografi Eklusi-ukuran atau Kromatofrafi Gel (untuk solut dengan Mr
> 1000) yang bisa dipisahkan lagi menjadi filtrasi gel dan permiasi gel.
2. EVALUASI
1. Definisi kromatografi adalah :...
a. pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan
komponen dalam medium tertentu
b. Teknik pemisahan dengan menggunakan suatu pelarut
anorganik
c. Pemisahan antara satu komponen yang komplek
d. Pemisahan suatu zat dari senyawa yang tak dapat dipisahka n
e. Teknik Teknik pemisahan dari suatu sampel yang sangat
banyak jumlahnya

2. Persyaratan utama yang harus diperhatikan dalam kromatografi adalah :...

a. Fasa diam harus bereaksi dengan fasa gerak.
b. Adanya fasa diam dan fasa gerak
c. Fasa gerak tidak perlu mengalir melewati fasa diam
d. Komponen sampel tidak larut dalam fasa gerak
e. Fasa gerak tidak berinteraksi dengan fasa diam.

3. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa yaitu :

...
a. Fasa tetap dan fasa bergerak
b. Fasa tetap dan fasa diam
c. Fasa tetap dan stationary
d. Fasa mobile dan fasa cair
e. Fasa gas dan fasa cair

4. Fase diam dalam kromatografi kertas adalah :...

a. Kertas serap
b. Pelarut atau campuran pelarut yang sesuai
c. Medium plat
d. Lapisan tipis dalam kaca/plat
e. Membran
B. KEGIATAN PEMBELAJARAN 2. MENYIAPKAN SAMPEL DAN STANDAR

3. LEMBAR INFORMASI

1.1. Menyiapkan Sampel dan Standar untuk Kromatografi Kertas

a. Sampel dalam bentuk cair biasanya langsung di totolkan diatas kertas, seanndainya
sampel tersebut terlalu encer dilakukan penguapan sampai agak kental.

b. Sampel dalam bentuk padat sebelum dilakukan pemisahan dengan kromatografi

kertas harus dilakukan preparasi terlebih dahulu dengan cara dihaluskan dan
dilarutkan dengan pelarut organik misal khloroform/heksan/dietil eter/alkohol dan
lain-lain sampai diperoleh sampel yang siap untuk ditotolkan diatas kertas.

c. Langkah Kerja Kromatografi Kertas

Setetes dari larutan cuplikan yang mengandung campuran yang akan
dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tan da di atas
sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat.
Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai
dengan satu ujung dimana tetesan cuplikan ditempatkan dan tercelup dalam pelarut
yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena senyawa
yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas), lihat gambar 4a.

Pelarut bergerak melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler dan
menggerakkan komponen-komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak
dalam arah aliran pelarut. Perlu diperhatikan bahwa per- mukaan dari kertas
jangan sampai terlalu basah dengan pelarut karena hal ini tak akan memisahkan
sama sekali atau daerah-daerah noda akan menjadi kabur. Bila permukaan pelarut
telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah
ditentukan, maka kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan
pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering.
 Gambar 4. Kromatografi pita/noda.

Jika senyawa-senyawa tak berwarna maka mereka dideteksi dengan cara fisika dan
kimia. Cara yang biasa adalah menggunakan suatu pereaksi atau pereaksi-pereaksi
yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-
senyawa. Sering juga menggunakan cara deteksi dengan sinar ultra ungu atau
teknik radio kimia. Bila daerah- daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi,
adalah perlu untuk mengidentifikasi tiap-tiap individu dari senyawa.

Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari
noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Terutama pada
gugus-gugus yang besar dari senyawa-senyawa yang susunan kimianya mirip,
seperti asam-asam amino, harga Rf sangat berdekatan satu sama lain. Dalam hal
ini perlu melakukan teknik dua jalan. Kertas yang berbentuk persegi digunakan
dan cuplikan ditempatkan pada satu sudut. Pengembangan dengan campuran
pelarut 1, dengan ujung kertas AB dicelupkan, memberikan pemisahan sebagian
seperti ditunjukkan dalam gambar 5 a. Lembaran kertas diambil dan dikeringkan
dan kemudian dimasukkan dalam bejana kedua dengan ujung AC dicelupkan
dalam pelarut 2. Pengembangan dengan pelarut ini, diikuti dengan pengeringan
dan pemberian pereaksi tertentu akan memberikan noda-noda seperti gambar 5b.
 A B

Permukaan pelarut

C D

Pelarut 2

5. a 5. b

Gambar 5. kromatografi dua jalan

Kertas saring dapat digantungkan/diletakkan sehingga pelarut bergerak ke atas,

ke bawah atau mendatar. Hasil-hasil dari metoda pertama dan kedua adalah mirip
tetapi berbeda dari metoda ketiga.

Dalam metoda penaikkan (ascending) kertas dicelupkan hingga ujung di mana

aliran mulai bergerak terletak sedikit di atas permukaan dari pelarut dan pelarut
naik melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler. Di dalam metoda
penurunan (descending) ujung alas dari kertas dicelupkan dalam pelarut dan
mengalir, meskipun diawali oleh gaya kapiler diteruskan oleh gravitasi. Metoda
mendatar (horizontal) sangat berbeda dari kedua metoda di atas. Noda cuplikan
ditempatkan pada pusat dari kertas (biasanya kertas saring berbentuk bulat) dan
pelarut diteteskan juga di pusat kertas. Aliran juga oleh gaya kapiler, senyawa-
senyawa dalam campuran segera berkembang dengan pelarut.

Bila akan melakukan pemisahan dengan kromatografi kertas, maka hal- hal yang
perlu diperhatikan adalah :

1. Metoda (penaikan, penurunan atau mendatar)

2. Macam dari kertas
3. Pemilihan dan pembuatan pelarut (fasa bergerak)
4. Kesetimbangan dalam bejana yang dipilih
 5. Pembuatan cuplikan
6. Waktu pengembangan
7. Metoda deteksi dan identifikasi

Disamping sifat-sifat dari kertas dan pelarut, ada faktor-faktor penting yang
mempengaruhi pemisahan yaitu : suhu, besarnya bejana, waktu pengembangan
dan arah dari aliran pelarut.

d. Alat dan Teknik

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada
dibawah garis pada bercak diatasnya. Gambar berikutnya tidak menunjukkan
terperinci bagaimana kertas di gantungkan karena terlalu banyak kemungkinan
untuk mengerjakannnya dan dapat mengacaukan gambar. Kadang-kadang kertas
hanya digulungkan secara bebas pada silinder dan diikatkan dengan klip kertas
pada bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan posisi
berdiri pada bawah wadah.
Alasan penutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas
kimia terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara dalam gelas kimia
dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama halnyadengan pergerakan
pelarut pada kertas.

Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen yang berbeda

dari campuran tinta akan bergerak pada laju yang berbeda dan campuran
dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna. Gambar menunjukkan apa
yang tampak setelah pelarut telah bergerak
hampir seluruhnya ke atas.

Dengan sangat mudah dijelaskan melihat dari kromatogram akhir dari pena yang
ditulis pada pesan yang mengandung pewarna yang sama dengan pena 2. Anda
juga dapat melihat bahwa pena 1 mengandung dua campuran berwarna biru yang
kemungkinan salah satunya mengandung pewarna tunggal terdapat dalam pena 3.
Nilai Rf.
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang ditempuh
pelarut; beberapa lainnya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak tempuh
relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda
menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya jenis kertas dan komposisi
pelarut yang tepat. Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk
setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
jarak yang ditempuh oleh senyawa
Rf =
jarak yang ditempuh oleh pelarut

Misalnya, jika salah satu komponen dari campuran bergerak 9.6 cm dari garis
dasar, sedangkan pelarut bergerak sejauh 12.0 cm, jadi Rf untuk komponen itu:

Dalam contoh kita melihat ada beberapa pena, tidak perlu menghitung nilai Rf
karena anda akan membuat perbandingan langsung dengan hanya melihat
kromatogram. Anda membuat asumsi bahwa jika anda memiliki dua bercak pada
kromatogram akhir dengan warna yang sama dan telah bergerak pada jarak yang
sama pada kertas, dua bercak
tersebut merupakan senyawa yang hampir sama. Hal ini tidak selalu benar. Anda
dapat saja mempunyai senyawa-senyawa berwarna yang sangat mirip dengan
nilai Rf yang juga sangat mirip.

d. Bagaimana Jika Substansi yang Diidentifikasi Tidak Berwarna? Dalam

beberapa kasus, dimungkinkan membuat bercak menjadi tampak dengan
mereaksikannya dari beberapa pereaksi yang menghasilkan produk yang
berwarna. Contoh yang baik yaitu kromatogram yang dihasilkan dari campuran
asam amino.
Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin memisahkan asam
amino tertentu yang terdapat dalam campuran. Untuk menyederhanakan, mari
berasumsi bahwa anda telah mengetahui kemungkinan campuran hanya
mengandung lima asam amino yang umum.
Setetes larutan campuran ditempatkan pada garis dasar kertas, dan dengan cara
yang sama ditempatkan asam amino yang telah diketahui diteteskan
disampingnya. Kertas lalu ditempatkan dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan
seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M, dan asam amino yang
telah diketahui ditandai 1 sampai 5.
Posisi pelarut depan ditandai dengan pinsil dan kromatogram lalu dikeringkan
dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam
amino menghasilkan senyawa berwarna, utamanya coklat atau ungu.

Gambar di sebelah kiri menunjukkan kertas setelah dilalui pelarut hampir pada
bagian atas kertas. Bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan
apa yang mungkin tampak setelah penyemprotan ninhidrin.

Tidak diperlukan untuk menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat
membandingkan bercak dalam campuran dengan asam amino- asam amino
yang telah diketahui berdasarkan posisi dan warnanya.
Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino yang diberi tanda 1,4
dan 5. Bagaimana jika campuran mengandung asam amino lain selain dari asam
amino yang anda gunakan untuk perbandingan? Akan terdapat bercak dalam
campuran yang tidak sesuai dari asam amino yang telah diketahui. Anda harus
mengulangi percobaan menggunakan asam amino-asam amino sebagai bahan
perbandingan.

e. Kromatografi Kertas Dua Arah.

Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah
pemisahan substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa.
Pada senyawa-senyawa berwarna lebih mudah melihat apa yang terjadi. Anda
dapat mengerjakannya secara sempurna hal ini dengan senyawa-senyawa yang
tidak berwarna, tetapi anda harus menggunakan banyak imajinasi dalam
menjelaskan apa yang terjadi.

Kromatogram dibuat dari bercak tunggal dari campuran yang ditempatkan

kedepan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan dalam sebuah pelarut
sebelum dan sesudah sampai pelarut mendekati bagian atas kertas. Dalam
gambar, posisi pelarut ditandai dengan pinsil sebelum kertas kering. Posisi ini
ditandai sebagai SF1 yaitu pelarut depan untuk pelarut pertama. Kita akan
menggunakan dua pelarut yang berbeda

Jika anda melihatnya lebih dekat, anda dapat melihat bahwa bercak pusat besar
dalam kromatogram sebagian biru dan sebagian hijau. Dua pewarna dalam
campuran memiliki nilai Rf yang hampir sama. Tentunya, nilai-nilai ini bisa saja
sama, keduanya memiliki warna yang sama; dalam hal ini anda tidak dapat
mengatakan bahwa ada satu atau lebih pewarna dalam dalam bercak itu. Apa
yang anda kerjakan sekarang adalah menunggu kertas kering seluruhnya, dan
putar 90o C dan perlakukan kromatogram kembali dengan pelarut yang berbeda.
Gambar berikutnya menunjukkan apa yang mungkin terjadi pada berbagai
bercak pada kromatogram awal. Posisi pelarut kedua juga ditandai.
Tentunya anda tidak dapat melihat bercak-bercak dalam posisi awal dan akhir;
Bercak-bercak telah bergerak! Kromatogram akhir akan tampak seperti ini:

Kromatografi dua arah secara seluruhnya terpisah dari campuran menjadi empat
bercak yang berbeda. Jika anda akan mengidentifikasi bercak-bercak dalam
campuran, secara jelas anda tidak dapat melaksanakannya dengan perbandingan
substansi pada kromatogram yang sama seperti pada contoh sebelumnya
menggunakan pena atau asam amino-asam amino. Anda dapat berakhir dengan
kekacauan pada bercak-bercak yang tanpa arti. Meskipun demikian, anda dapat
bekerja dengan nilai Rf untuk setiap bercak-bercak dalam pelarut-pelarut, dan
kemudian membandingkan nilai-nilai yang anda telah ukur dari senyawa yang
telah diketahui pada kondisi yang tepat sama.

f. Jenis Kertas

Pekerjaan mula-mula dalam kromatografi kertas dilakukan dengan

menggunakan kertas saring Whatmann No, 1. Jenis kertas whatman dengan
berbagai nomer banyak digunakan dengan kemurnian yang tinggi dan tebal
merata. Kertas dalam pemisahan terutama mempunyai pengaruh pada
kecepatan aliran pelarut. Sedangkan fungsi dari kertas sendiri sangat kompleks.
Efek-efek serapan disebabkan oleh sifat polar dari gugus-gugus hidroksil.
Kecepatan aliran naik dengan penurunan kekentalan dari pelarut (dengan
kenaikan dalam suhu), tetapi aliran pelarut pada suhu yang tertentu ditentukan
 oleh kerapatan dan tebal dari kertas. Penurunan kerapatan atau kenaikan tebal
memberikan kecepatan aliran yang lebih tinggi. Kertas disediakan dalam
bermacam-macam standar lembaran, bulatan, gulungan dan dalam bentuk
tertentu. kertas harus disimpan ditempat jauh dari setiap sumber dari uap (terutama
ammunia yang mempunyai afinitas yang tinggi terhadap selulosa).

g. Jenis Pelarut

Fasa gerak merupakan campuran yang terdiri dari stu komponen organik
utama, air, dan berbagai tambahan misalnya asam-asam, basa atau pereaksi
komplek. Pelarut harus sangat mudah menguap, karena terlampau cepat
mengadakan kesetimbangan, keadaan lain volatilitas yang tinggi
mengakibatkan lebih cepat hilang meninggalkan lembaran kertas setelah
bergerak. Ion-ion anorganik dipisahkan sebagai ion-ion komplek dengan
beberapa kelarutan dalam pelarut-pelarut organik, misal besi membentuk ion
klorida kompleks yang larut dalam aseton berair, sedang nikel tidak segera
membentuk ion seperti besi sehingga besi dan nikel dapat dipisahkan dengan
pelarut ini, sejauh asam klorida berada untuk menstabilkan ion kompleks.
Beberapa contoh dari macam-macam campuran pelarut dapat dilihat seperti
pada tabel 3.

Untuk mendapatkan hasil campuran pelarut yang tak dapat diulang lagi maka harus
dibuat hati-hati meskipun hanya dengan gelas ukur. Pelarut jangan dipakai setelah
selang beberapa lama. Untuk pengembangan selama satu malam pelarut hanya
digunakan satu kali pakai. Untuk penggunaan pelarut-pelarut yang mudah menguap
maka pemakaiannya dalam keadaan yang baru saja dibuat.
Tabel 3. Jenis-jenis Pelarut untuk KromatografI Kertas

Pemi sahan Pel arut Perbandi ngan

Asam- asam atnino f enol/ air lar utan jenuh
n-but anol/as.cuka/ air 4: 1:5
n-but anol/as.cuka/ air 12:3: 5
n-bu O H/pir idin/air 1: 1:1
Kar bihidr at (gula) et il aset at/pir idin/air 2: 1:2
et il aset at/n- PrO H/air 6: 1:3
Etil asetat/ as. cuka/air 3: 1:3
Asam- asam lemak n-but anol/1, 5 M NH3 Larut an j enuh
Fe, CI, Hr, J
(gar am-garam Na) pir idin/air 90: 10
Hg, Pb, Cd, Cu. Bi
(klor ida-klor ida) n-but anol/3M HCl lar utan jenuh
h. Cara Penempatan Cuplikan pada Kertas

Larutan carnpuran yang akan dipisahkan ditempatkan pada kertas yang berupa noda.
la biasanya dibiarkan untuk berkembang membentuk suatu bulatan. Bagian dari
kertas yang ditetesi dibiarkan dalam keadaan mendatar, sehingga larutan tetap dalam
keadaan kompak dalam bentuk bulatan. Kertas jangan sampai tersentuh oleh zat-zat
yang tak dikehendaki. Besarnya noda tergantung pada percobaan, tetapi diameter
harus tak lebih dari kira-kira 0,5 cm. Diameter ini dihubungkan dengan tebal dan
karakteristik serapan dari kertas, tetapi biasanya noda yang lebih kecil akan
menghasilkan pemisahan yang lebih baik.

Dalam penempatan cuplikan dalam kertas yang penting bukan jumlah volume, tetapi
banyaknya campuran yang tertinggal bila pelarut telah teruapkan. Jika larutan terlalu
encer untuk ditempatkan sekali, maka [arutan dapat "dipekatkan" di atas kertas
dengan cara meneteskan berkali- kali pada tempat yang sama, dengan jarak waktu
setelah tetes yang per- tama kering baru tetes yang kedua dan seterusnya. Noda
sebaiknya dibiarkan kering dalam udara, tetapi bila mungkin dapat dikeringkan
dengan menggunakan kipas angin. Dalam pengeringan jangan menggunakan udara
panas, terutama jika larutan bersifat asam, karena ia dapat menyebabkan kertas
menjadi hitam.

Harus dicegah penempatan larutan terlalu banyak. Karena kelebihan setiap

komponen akan menyebabkan tidak akan tercapainya kesetimbangan partisi selama
ia bergerak, hingga ia akan mengakibatkan terjadinya kedudukan/lokasi yang kabur.
Ada beberapa cara pembuatan noda. Salah satu caranya adalah dengan menggunakan
gelas kapiler dengan diameter yang sama, di mana cara ini yang sering digunakan.
Sedangkan cara yang lain dapat menggunakan alat penyuntik.

Kedudukan dari permukaan pelarut yang terdapat pada kertas harus selalu diberi
tanda segera setelah lembaran kertas diambil dan kemudian dikeringkan, dengan cara
digantungkan. Penandaan dapat menggunakan pensil pada sisi samping kertas.
Pengeringan sebaiknya dibiarkan dalam udara, bila dikehendaki dapat menggunakan
kipas angin, jangan mengeringkan dengan menggunakan udara panas, karena dapat
merusak beberapa konstituen dari campuran. Aliran udara harus paralel terhadap
permukaan dari kertas.

Kebanyakan dari pelarut-pelarut kromatografi cepat menguap tanpa meninggalkan

residu. Hanya untuk fenol, di mana untuk menguapkan sempurna membutuhkan
waktu kira-kira empat jam. Harus diusahakan penghilangan pelarut secara sempurna,
hal ini untuk mencegah pengaruh pada penambahan pereaksi. Yang penting lagi
terutama dalam kromatografi dua jalan di mana jejak pelarut yang pertama harus
hilang sebelum penjalanan yang kedua. Untuk alasan ini adalah paling baik
menggunakan pertama-tama pelarut yang lebih mudah menguap (jadi, n-
butanol/asam cuka/air). Untuk mendapatkan hasil yang dapat diulang kembali maka
urutan pekerjaan harus dilakukan sama.

i. Deteksi Daerah-daerah Noda

Keberhasilan dari pemisahan kromatografi tergantung juga pada proses deteksi.

Senyawa-senyawa yang berwarna tentu saja terlihat sebagai noda- noda berwarna
yang terpisah pada akhir pengembangan. Un[uk senyawa- senyawa tak berwarna
memerlukan deteksi secara kimia clan fisika. Sering menjadi pekerjaan rutin bahwa
kromatogram-kromatogram diuji di bawah sinar ultra violet sebelum dan sesudah
setiap metoda dikerjakan.

Panjang gelombang yang digunakan biasanya 370 millimikron dan 254 millimikron.
Beberapa senyawa terlihat sebagai bintik fluoresence. Metoda fisika lainnya,
terutama hanya dapat dipakai terhadap senyawa-senyawa radioaktif, yaitu
berdasarkan autoradiografi dan pencacahan. Metode- metode kimia adalah
merupakan deteksi yang paling penting. Pereaksi- pereaksi yang digunakan biasanya
dinyatakan sebagai "pereaksi-pereaksi lokasi". Pereaksi lokasi menggunakan pelarut
yang baik, yang diikuti dengan penguapan. Pelarut yang ideal adalah semua
senyawa-senyawa yang terpisah tidak larut tetapi hal ini tidak mungkin. Cara
menggunakan untuk mendeteksi noda yaitu dengan jalan penyemprotan.

Penyemprotan dilakukan perlahan-lahan dari samping ke samping dan dari atas ke

bawah. Pelarut yang digunakan untuk penyemprotan harus tidak menguap. Tetapi di
lain fihak, penguapan yang cepat dari kertas diperlukan untuk mencegah difusi dari
noda-noda yang terpisah. Pelarut-pelarut yang digunakan adalah etanol, propanol, n-
butanol atau kloroform atau campuran daripadanya. Campuran berair dapat
digunakan, tetapi terlalu banyak air harus dicegah jika mungkin, karena dapat
memberikan efek melemahkan kertas. Penyemprotan kertas harus dilakukan dalam
lemari asam. Selesai penyemprotan alat harus dibersihkan untuk mencegah lobang
penyemprot menjadi buntu.

Pereaksi yang digunakan untuk mendeteksi asam-asam amino biasanya ninhidrin

(indanatrion hidrat). Pada suhu kamar pereaksi baru mernberikan warna pada asam-asam
amino kira-kira setelah dua puluh empat jam. Tetapi pada pernanasan pada 100°C warna
akan timbul setelah kira-kira empat menit.

Di dalam teknik pencelupan, larutan pereaksi dimasukkan dalam tempat bejana yang
dangkal, dan lembaran atau potongan kertas dicelupkan di dalamnya. Ada beberapa
keuntungan dalam pencelupan hanya membutuhkan bejana yang murah. Pelarut yang
lebih mudah menguap dapat digunakan, hingga dapat mengurangi waktu yang
dibutuhkan untuk pengeringan hingga mengurangi bahaya difusi dari noda-noda
selama pengeringan. Aseton dapat digunakan sebagai pelarut. Tetapi yang sering
terjadi adalah bahwa senyawa-senyawa yang terpisah sangat larut dalam pelarut yang
terbaik untuk pereaksi lokasi. Hingga metoda pencelupan sering menyebabkan
hilangnya materi maka dalam hal ini metoda penyem- protan sangat penting.

j. Identifikasi dari Senyawa-senyawa

Mengidentifikasi noda-noda dalam kertas menggunakan harga Rf (retordation factor)

yang didefinisikan sebagai :

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu :

1) Pelarut disebabkan pentingnya koefisien partisi, rnaka perubahan- perubahan
yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-
perubahan harga Rf.
2) Suhu.Perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan
aliran.
3) Ukuran dari bejana. Volume dari bejana mempenyaruhi homogenitas dari
atmosfer jadi mernpengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen
pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambat lebih
lama, seperti perubahan-perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas,
maka koefisien partisi akan berttbah juga. Dua faktor yaitu penguapan
clan kornposisi mempe-ngaruhi harga Rf.
4) Kertas. Pengaruh utama kertas pada harga -harga Rf timbul dari
perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam -macam kertas.
Kertas-kertas mempengaruhi kecepatan aliran dan akan mempengaruhi
pada kesetimbangan partisi.
5) Sifat dari rantpuran. Berbagai senyawa mengalami partisi di an - tara
volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir
selalu mempengaruhi karakteris tik dari kelarutan satu terhadap lainnya
hingga terhadap harga -harga Rf.
Untuk mengukur Rf perlu melokalisir permukaan pelarut. Harga -harga Rf
biasanya dinyatakan sebagai fraksi/bagian. Perbedaan dalam harga-harga Rf
untuk dua senyawa yang dipisahkan terg antung pada besarnya noda-noda dan
panjangnya aliran terlarut. Cara yang paling mudah dalam pengukuran Rf
adalah dengan menggunakan mistar. Ujung nol ditempatkan pada titik mula -
mula dan ujung yang lain direntangkan ke arah permukaan pelarut dan harga
Rf langsung dapat dibaca pada titik di mana angka mistar tepat pada noda.
Dalam penentuan Rf perlu mengukur dari pusat pita atau noda.

Biasanya identifikasi dari senyawa yang tak diketahui dilakukan pemisahan

berulang. Daerah yang mengandung senyawa yang ta k diketahui dipotong
dan senyawa dielusi dengan pelarut yang sesuai. Bila hanya diperoleh satu
noda dengan menggunakan lebih dari satu pelarut dengan menunjuk senyawa
yang sama maka dapat diambil kesimpulan bahwa kemungkinan keduanya adalah
identik

Cara lain untuk mengidentifikasi senyawa -senyawa yaitu dengan reaksi-reaksi

warna yang karakteristik. Reaksi kebanyakan sangat berguna dalam pemisahan
senyawa-senyawa anorganik, tetapi untuk senyawa organik sangat kecil kejadiannya,
karena kebanyakan konstituen-konstituen dari campuran mempunyai sifat -sifat
kimia yang mirip.
1.2. Menyiapkan Sampel dan Standar untuk Kromatografi Lapis Tipis

a. Sampel dipersiapkan sama seperti preparasi sampel untuk kromatografi

kertas, yaitu sampel padat dilarutkan dengan pelarut organik atau
diekstraksi.
b. Perlu membuat plat kromatografi, yaitu untuk membentangkan penyerap
dalam palisan tipis yang berguna sebagai penyokong yang inert. Penyerap
padat berbentuk bubuk halus dibuat menjadi bubur (slury) dengan air
(kurang umum dengan zat cair organik yang mudah menguap) dan
dibentangkan di atas plat gelas. Pembuatan lapisan tipis di atas kaca ada
beberapa cara yaitu dengan jalan menyemprotkan atau pencelupan, di
samping dikerjakan dengan tangan dapat juga dengan mesin. Plat yang telah
dilapisi dipanaskan atau di-"aktif'"-kan dengan jalan memanaskan pada

suhu kira-kira 100 °C selama beberapa waktu lamanya. Larutan cuplikan

dalam pelarut yang mudah menguap diletak kan di atas lapisan dengan
menggunakan pipet atau alat penyuntik.
c. Waktu rata-rata untuk kromatografi lapisan tipis dengan panjang 10 cm
pada silika gel adalah sekitar 20 - 30 menit (tergantung dari sifat fasa
bergerak), sedangkan pemisahan yang sama dengan memerlukan waktu dua
jam. Untuk pemisahan-pemisahan secara kualitatif pada plat yang kecil
memerlukan waktu sekitar 5 menit.

d. Hasil pemisahan yang baik ternyata bahwa penyerap dalam kromatografi

lapisan tipis mempunyai kapasitas yang lebih besar bila dibandingkan
dengan kertas. Keuntungan dari sistem serapan ialah dapat digunakan untuk
memisahkan senyawa -senyawa yang sifatnya hidrofobi, seperti lipida-lipida dan
hidrokarbon. Pemisahan dengan lapisan tipis banyak digunakan dalam kimia
organik dan beberapa dalam kimia anorganik.

e. Pembuatan Lapisan Tipis

Penyerap dibentangkan di atas permukaan plat kaca. Untuk pemisahan

secara kualitatif yang cepat sering digunakan gelas mikroskop (microscope
slide). Kebanyakan alat-alat digunakan dalam bentuk plat kaca dengan
ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap sebagai
 "standard" dan permukaan dari plat harus rata.
Flat-plat kaca sebelum dipakai dicuci dulu menggunakan detergent kemudian
dikeringkan. Pencucian terakhir dapat memakai aseton (jika perlu). Suatu hal
yang perlu diperhatikan jangan menyentuh permukaan dari plat yang bersih
dengan jari-jari.

f. Pada dasarnya ada empat cara yang digunakan dalam pembuatan lapisan tipis,

yaitu pembentangan, penuangan, penyemprotan dan pencelupan. Metoda-

pembentangan dan penyernprotan dapat dikerjakan dengan tangan atau dengan
alat. Banyak pemakai yang tak menggunakan metoda penuangan secara mekanik.
Jika penyerap sangat halus dan partikel-partikelnya homogen, dan jika tak
menggunakan pengikat, maka bubur dapat dituangkan di atas plat dan dibiarkan
hingga melapisinya. Pembuatan dengan penuangan biasanya mudah dengan
menggunakan jenis alumina, dan pembuatan buburnya tidak menggunakan air,
melainkan menggunakan cairan yang mudah menguap seperti etanol (atau
campuran etanol-air) atau etil asetat.

g. Pencelupan. Plat-plat yang kecil, seperti gelas mikroskop, dapat dilapisi dengan
pencelupan dalam bubur dari penyerap dalam kloroform atau zat cair mudah
menguap yang lain. Sekali lagi lebal lapisan yang pasti tidak diketahui dan
kemungkinan lapisan tak dapat dibuat dengan baik, meskipun demikian metoda
ini cukup memuaskan untuk membuat sejumlah dari plat-plat untuk pemisahan
secara kualitatif dengan cepat. Setelah pembentangan plat dibiarkan kering selama
kira-kira 5 -10 menit, ini bila dibuat dengan bubur yang berair, selanjutnya

dipanaskan dan di"aktif"kan dengan pemanasan pada suhu kira-kira 100°C

selama 30 menit. Plat-plat yang dibuat dengan zat-zat cair organik yang mudah
menguap tak perlu pemanasan lebih lanjut. Penyentuhan dengan jari-jari akan
merusak lapisan dan melepaskan partikel-partikel dari permukaan.

h. Fasa Bergerak dan Penempatan Cuplikan

Pemilihan fasa bergerak tergantung pada faktor-faktor seperti dalarn pemisahan
dalam kromatografi kolom serapan. Sebaiknya menggunakan campuran pelarut
organik yang mempunyai polaritas serendah mungkin, karena dapat mengurangi
serapan dari setiap komponen dari campuran pelarut. Jika komponen-kornponen
yang mempunyai sifat polar tinggi (terutama air) dalam campuran akan merubah
 sistem menjadi sistem partisi. Campuran yang baik memberikan fasa-fasa
bergerak yang mernpunyai kekuatan bergerak sedang, tetapi sebaiknya tidak
mencampur lebih dari dua komponen, karena campuran yang lebih kompleks
cepat mengalami perubahan-perubahan fasa terhadap perubahan suhu. Kemurnian
dari pelarut adalah lebih penting dalarn lapisan tipis daripada bentuk-bentuk
kromatografi lain, karena digunakan sejumlah materi yang sedikit.

Cara menempatkan cuplikan pada lapisan tipis seperti cara-cara yang digunakan
pada kromatografi kertas, yaitu dengan pipa kapiler atau mikro pipet. Pada
penempatan cuplikan ujung penetes dapat mengenai permukaan lapisan,
meskipun demikian harus diusahakan sedekat mungkin. Pelarut cuplikan
merupakan pelarut yang mudah menguap dan mempunyai polaritas yang rendah.

Kedudukan noda tak dapat diberi tanda dengan pensil, seperti dikerjakan pada
kertas, penunjuk noda dapat digunakan misal dengan penggaris yang diletakkan di
samping plat kaca. Penempatan noda di atas plat kira-kira 1 cm dari salah satu
ujungnya di mana ujung ini nanti dicelupkan dalam pelarut. Untuk plat kaca yang
mempunyai ukuran 20 x 20 cm, penempatan noda-noda kira-kira 1,5 cm dari
ujung bawah dan dimulai clan diakhiri kira-kira 0,5 cm dari samping kaca dan
noda-noda diteteskan masing-masing pada jarak kira-kira 1 cm dari masing-
masing pusat noda. Untuk pekerjaan pemisahan yang besar penempatan noda
dapat diteteskan hingga membentuk garis, lihat gambar 6.

Gambar 6. Plat Kaca Kromatografi Lapisan Tipis, Ukuran 20 x 20 cm

untuk Kromatografi Penaikan Satu Arah

Garis awal diberi tanda pada ujung dari plat dengan pensil dan garis akhir dapat
dibuat di bagian atas dengan menggoreskan pensil, yang menyebabkan goresan dari
aliran pelarut akan ditahan bila permukaan pelarut sampai pada garis. Jangan terlalu
lama mencelupkan plat dalam bejana bila permukaan pelarut telah mencapai garis
akhir, karena oleh pengaruh difusi dan penguapan dapat menyebabkan pemancaran
dari noda-noda yang terpisah. Ujung plat yang dicelupkan dalam fasa bergerak
jangan dibiarkan hingga rusak. Bila akan dilakukan pemisahan dua jalan, maka
lapisan dari dua sisi yang berdekatan tidak perlu dihilangkan.
i. Pengembangan Kromatografi dan Lokasi
Bila plat kromatografi telah disiapkan dan cuplikan telah ditempatkan di atasnya,
kemudian dimasukkan dalarn bejana yang cocok dengan ujung yang paling bawah,
di mana cuplikan ditempatkan, dicelupkan dalam fasa bergerak yang telah dipilih
sedalam kira-kira 0,5 - 1,0 cm. Biasanya dua plat dapat dimasukkan dalam bejana,
dalam hal ini akan diperoleh kromatografi penaikkan. Bejana diusahakan jangan
sampai bocor.

Sering tidak rnemerlukan waktu kesetimbangan, tetapi untuk meyakinkan

homogenitas dari atmosfer dalam bejana, maka dinding dalam bejana dapat dilapisi
dengan lembaran kertas saring yang ujungnya direndam dalam fasa bergerak.
Sedapat mungkin menggunakan bejana yang kecil sehingga atmosfer di dalam
bejana mempunyai volume sekecil mungkin. Untuk plat kaca yang kecil, microscope
slide, sebagai bejana dapat dipakai gelas piala yang mempunyai kapasitas sekitar 500
ml, juga dinding sebelah dalamnya dapat dilapisi dengan kertas saring yang
ujungnya dicelupkan dalam fasa bergerak.

Permukaan pelarut yang terdapat di dalam jangan sampai berhubungan dengan

atmosfer luar, karena dapat mengakibatkan komponen-komponen yang mudah
menguap. Kalau dikehendaki perkembangan dengan jenis penurunan atau mendatar,
maka alat yang digunakan menjadi agak sukar. Misal menghendaki perkembangan
jenis penurunan, maka tempat fasa bergerak ditempatkan di bagian atas dari bejana.
Dan untuk mengalirkan pelarut ke tempat plat diperlukan perantara yang dapat
berupa kapas atau gulungan kertas lihat gambar 7.

a. Tempat pelarut
b. Gulungan kertas
c. Lapisan kromatografi

Gambar 7. Kromatografi Lapisan Tipis Jenis Penurunan.

Setelah pengembangan, plat diambil dari bejana dan dibiarkan kering tanpa
pemanasan. Bila diperlukan, aliran udara dapat digunakan dan diarahkan pada
 permukaan yang mendatar. Seperti dalam kromatografi kertas, dalam pemisahan dua
jalan, maka pelarut yang pertama harus hilang sebelum pemisahan/pengembangan
berikutnya.

Pada umumnya metoda lokasi dari senyawa tak berwarna pada lapisan tipis adalah
mirip seperti dikerjakan dalam kromatografi kertas. Metoda- metoda fisika yang
sering digunakan meliputi fluoresensi sinar ultra ungu dan pencacahan radioaktif.
Jika pereaksi kimia digunakan untuk lokasi, maka dapat dilakukan dengan
penyemprotan dan tidak dengan pencelupan seperti diutarakan pada kromatografi
kertas. Senyawa-senyawa organik dapat dilokasi dengan penyemprotan
menggunakan asam sulfat pekat kemudian dipanaskan pada suhu sekitar 200°C
selama lebih kurang sepuluh menit. Noda dari senyawa akan menjadi hitam. Ini
merupakan cara lokasi yang efektif, tetapi sedikit meinberikan pertolongan dalam
identifikasi. Pereaksi lokasi yang lain untuk senyawa organik adalah Iod. Plat kaca
yang mengandung noda-noda dibiarkan terkena uap Yod, yaitu dengan jalan
meletakkan plat dalam bejana atau gelas piala yang tertutup yang berisi kristal Iod
untuk beberapa saat lamanya. Warna dari bejana akan menjadi ungu, untuk
senyawa-senyawa tak jenuh akan memberikan noda-noda yang tak berwarna, tetapi
banyak senyawa organik yang jenuh akan menimbulkan noda-noda yang berwarna
coklat. Semua warna ini akan cepat hilang dibiarkan diatmosfer.

j. Identifikasi dan Harga-harga Rf

Identifikasi dari snyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik
dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi-reaksi warna.

Untuk identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan

tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada kertas harga Rf
didefinisikan sebagai berikut:

Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal Jarak

Harga Rf =
yang digerakkan oleh palarut dari titik asal
Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-
harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh berlaku
untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar
dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat
diperoleh.

Pengukuran lain yang sering dipakai adalah menggunakan pengertian Rx

atau Rstd yang didefinisikan sebagai berikut :

Jarak yang digerakkan oleh senyawa yang tak diketahui

Rx atau Rstd =
Jarak yang digerakkan oleh senyawa standard yang diketahui

Senyawa standard biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip dengan senyawa
yang dipisahkan pada kromatogram. Misal perbandingan suatu hidrolisa protein
dengan glisin atau alanin.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi
lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga R f adalah :
1) Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
2) Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.(Biasanya aktifitas dicapai dengan
pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul- molekul air yang
menempati pusat-pusat serapan dari penyerap). Perbedaan penyerap akan
memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan
fasa bergerak dan solute yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan
hasil yang sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel
tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.
3) Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap, dalam prakteknya tebal lapisan tidak
dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata.
Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam
daerah yang kecil dari plat.
4) Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa bergerak. Kemurnian dari pelarut yang
digunakan sebagai fasa bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah
sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang
dipakai harus betul-betul diperhatikan.
5) Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
6) Teknik percobaan.
 Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya
diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran
penurunan dan mendatar juga digunakan).
7) Jumlah cuplikan yang digunakan.
8) Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran
noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan
lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.

9) Suhu. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini

terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang
disebabkan oleh penguapan atau perubahan- perubahan fasa.
10) Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalarn
kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh
dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh
dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi
pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fasa
bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.

1.3. Menyiapkan sampel dan Standar untuk Kromatografi Serapan/

Kolom

a. Sampel dipersiapkan sama dengan preparasi sampel untuk kromatografi kertas,

yaitu bila sampel padat diekstaksi terlebih dahulu.
b. Penyiapan pelarut atau pemilihan dari pelarut tergantung dari sifat
kelarutannya. Tetapi lebih baik untuk memilih suatu pelarut yang tak
tergantung pada kekuatan elusi, sehingga zat-zat elusi yang lebih kuat dapat
dicoba. "Kekuatan" dari zat elusi adalah daya penyerapan pada penyerap dalam
kolom. Biasanya untuk penyerap-penyerap yang polar seperti alumina dan
silika gel, maka kekuatan penyerapan naik dengan kenaikan polaritas dari zat
yang diserap.
Menurut TRAPPE, kekuatan elusi dari deret-deret pelarut untuk senyawwa-
senyawa dengan menggunakan silika gel akan diturunkan dalam urutan
sebagai berikut :
air murni < metanol < etsnol < propanol < aseton < etil-asetat < dietileter
< kloroform < rnetilena klorida < benzena < toluena < trikloroetilena <
karbon tetraklorida < sikloheksana < heksana.
 Kekuatan dari pelarut-pelarut yang berbeda menurut WILLIAMS, pada karbon
aktif dalam kolom untuk asam-asam amino dan sakarid diturunkan dalam
urutan :

etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol < air
murni.

Urutan ini adalah dari kenaikan polaritas atau penurunan panjang rantai dari
homolog. Sedangkan untuk alumina dan silika gel urutannya adalah
sebaliknya. Kemurnian dari pelarut-pelarut harus setinggi mungkin.

c. Penyiapan penyerap

Penyerap yang sering digunakan adalah alumina. Suatu pengertian yang

digunakan dalam hubungannya dengan penyerap-penyerap adalah "aktifasi".
Kadang-kadang dihubungkan dengan luas permukaan spesifik dari zat padat,
yaitu luas permukaan yang diukur dalam meter persegi tiap gram, dalam hal
karbon, silika gel dan alumina dapat dibuat menjadi aktif dengan memiliki
permukaan spesifik beratus-ratus meter persegi. Sedangkan seperti kalsium,
karbonat dan kalsium hidroksida, mempunyai permukaan spesifik yang
mempunyai ukuran dalam puluhan meter persegi atau kurang sampai
dikategorikan relatif tak aktif.

Banyak zat-zat padat yang telah digunakan sebagai penyerap, diantaranya

adalah sebagai berikut :

Zat padat Digunakan untuk memisahkan

Alumina/magnesia  Sterol-sterol, zat warna, vitamin-vitamin, ester-ester,

alkaloid-alkaloid, senyawa-senyawa anorganik.
Silika gel  sterol-sterol, asam-asam amino.

Karbon  Peptida-peptida, karbohidrat-karbohidrat, asam-asam amino

 Sterol-sterol, ester-ester, gliserida-gliserida, alkaloida-

Magnesium silikat alkaloida
 Porphirin,Karotenoida-karotenoida
Magnesium
karbonat  Karotenoida-karotenoida, xantofil
 Kalsium  Enzim-enzim, protein-protein, polinukleotida-
hidroksida polinukleotida

Kalsium karbonat  Sterol-sterol

Kalsium fosfat  Enzim-enzim
Aluminium silikat  Klorofil- Klorofil

Banyak penyerap seperti alumina, silika gel, karbon aktif dan magnesium
silikat dapat diperoleh diperdagangan. Penyerap tersebut sering memerlukan
aktivasi sebelum dipakai, hal ini dapat dilakukan dengan pemanasan dan
mungkin dengan pengurangan tekanan. Suhu optimum untuk aktivasi
aluminium biasanya sekitar 400°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam.
Untuk kebanyakan zat-zat padat, pemanasan pada suhu 200°C selama 2 jam.

Zat-zat aktif yang digunakan sebagai penyerap dalam kromatografi kolom

sering merupakan katalisator yang baik; ini rnerupakan bahaya yang perlu
mendapat perhatian. Alumina sering menimbulkan perubahan-perubahan kimia
dan menimbulkan reaksi-reaksi misal dapat menyebabkan kondensasi dari
aldehida-aldehida dan keton- keton, sehingga bila hal ini terjadi, maka harus
menggunakan alumina yang bersifat netral. Silika gel dapat menyebabkan
isomerisasi dari berbagai senyawa-senyawa seperti terpen dan sterol.

d. Kolom Partisi
Didalam kromatografi partisi, penyerap zat padat diganti dengan fasa tetap zat
cair, yang biasanya hanya sebagian dapat bercampur dengan zat cair yang
mengalir sebagai fasa bergerak. Zat yang dilarutkan (solute) akan
didistribusikan dengan sendirinya diantara dua fasa zat cair (tetap dan
bergerak) sesuai dengan koefisien partisinya. Disebabkan perbedaan-perbedaan
dalam koeffisien partisi dari berbagai komponen, maka campuran akan
terpisah dengan cara yang sama seperti pada sistem-sistem penyerap.

e. Fasa tetap harus disokong dalarn beberapa cara, yaitu fasa tetap zat cair
disokong pada zat padat yang bersifat inert terhadap senyawa- senyawa yang
akan dipisahkan. Zat padat yang menyokong ini
ditempatkan dalam kolom seperti pada kromatografi serapan. Kenyataan
sangat kecil sekali perbedaan antara dua macam jenis kromatografi ini. Zat
yang menyokong harus penyerap dan menahan fasa tetap dan harus membuat
luas permukaannya menjadi seluas mungkin untuk fasa yang mengalir. la harus
stabil, mudah diisikan dalam kolom bila menyerap fasa tetap zat cair dan harus
tidak merintangi aliran pelarut. Fasa bergerak dalam kromatografi partisi dapat
berupa zat cair atau gas. Hal hal yang perlu diperhatikan dalam kolom partisi
adalah :

(1) Zat-zat padat penyokong

Zat-zat penyokong yang digunakan kebanyakan ialah silika gel, bubuk selulosa
dan tanah diatome (kieselguhr, celit dan sebagainya) zat padat lainnya seperti
pati hanya digunakan secara terbatas. Silika gel hampir selalu digunakan
dengan air atau larutan berair sebagai bufer sebagai fasa tetap. Jumlah zat cair
yang digunakan kira-kira 0,6 ml untuk setiap gram silika gel.

(2) Peralatan

Kolom dan alat-alat lain yang digunakan untuk kromatografi partisi adalah
sama seperti yang digunakan dalam kromatografi serapan. Tabung-tabung
yang digunakan di laboratorium panjangnya antara 25 - 50 cm dengan diameter
hingga 4 cm. Aliran pelarut yang melalui kolom partisi mempunyai tendensi
agak lambat tetapi dapat dipercepat dengan menggunakan tekanan udara di
atas kolom seperti halnya pada kolom serapan.

(3) Cara memasukkan penyerap

Pengisian penyerap dalam kolom adalah sangat penting seperti dalam

kromatografi serapan. Pertama mencampur penyokong dengan fasa tetap
diaduk dengan sejumlah fasa bergerak yang digunakan. Bubur ini kemudian
dituangkan sedikit demi sedikit dalam tabung yang mengandung sedikit
zat cair yang sama. Setiap pemasukan bubur ke dalam tabung disertai
dengan penekanan dengan batang gelas yang ujungnya datar sedikit lebih
kecil daripada diameter tabung. Kelebihan dari pelarut dapat dibiarkan hingga
lepas melalui kolom atau diambil dengan pipet. Berhasilnya pemisahan
tergantung pada kekompakan pengisian dan keteraturan pita-pita kromatografi.
 (4) Pemasukan Cuplikan

Pemasukan cuplikan adalah menggunakan pipet seperti dilakukan pada

kolom serapan. Mula -mula melarutkan cuplikan dalam sejumlah fasa
bergerak dan me ncampurkan dengan sejumlah zat padat penyokong
hingga diperoleh bubuk yang kering. Bubuk ini kemudian diletakkan di
atas kolom dan sedikit fasa bergerak ditambahkan.

(5) Elusi

Teknik elusi yang digunakan dalam kolom partisi adalah sama seperti
yang di gunakan dalam kolom serapan. Jika fasa tetap adalah berair,
maka fasa bergerak yang digunakan zat cair organik atau campuran. Jika
penyokong yang digunakan tak suka air, maka fasa tetap berupa zat
organik dan fasa bergerak berair adalah menjadi mungkin. Ini dikenal
sebagai kromatografi “fasa berbalik” dan telah digunakan untuk
memisahkan senyawa-senyawa yang sangat larut dalam pelarut -pelarut
organik.

Tabel 2. Contoh Beberapa Pemisahan pada Kolom Partisi

Pemisahan Penyokong Fase Fase bergerak

tetap
Alkolurl-alkohol C1-C4 Calite Air CHCl3 atau CCl4
Asanrasam lemak Cz-C8 Silica gel Pati Air CHCl3/n -BuoH
Atam-asam amina Selulosa Air n-ProH atau n -
Fenol-fenol Silica gel Air BaOH/HCl
Lipida-lipida Air MeOH/n-
BaOH/CHCl3
Bermacam-macam
2. LEMBAR KEJA

I. LEMBAR KERJA : KROMATOGRAFI KOLOM

Acara : Menetapkan zat warna di dalam sampel dengan khromatografi kolom. Tujuan :
Melakukan penetapan zat warna dengan menggunakan khromatografi kolom
Alat :
 Beaker glas
 Batang pengaduk
 Mortal dan martil
 Corong
 Kolom
 Erlenmeyer kecil
Bahan :
 Minuman/makanan/daun-daunan/bunga yang berwarna.
 CaCO3
 n- Hexan
 Etanol
 Kertas saring
 Glass woll/kapas

Cara Kerja :
A. Penyiapan sampel :
1. Sampel/daun/wortel di ekstrak dengan pelarut organic (etanol atau n-Hexan).
2. Ekstrak disaring dengan kapas atau kertas saring, filtratnya diuapkan hingga diperoleh
larutan yang pekat (Jangan sampai kering).

B. Penyiapan kolom dan pembuatan penyerap.

1. Masukkan glass woll atau kapas ke dalam kolom hingga bagian bawah,
2. Masukkan serbuk CaCO3 perlahan-lahan hingga merata sampai 1/3 isi kolom, atau
serbuk CaCO3 dilarutkan dahulu dalam pelarut organik (Petroleum eter) hingga
diperoleh bubur.
3. Tuangkan bubur CaCO3 ke dalam kolom sampai 1/3 dari panjang kolom.
4. Beri kertas saring berbentuk bulatan diatas permukaan penyerap.
5. Teteskan larutan sampel (A) ke dalam kolom penyerap dengan menggunakan pipet,
berikut tambahkan pelarut, dan jaga jangan sampai di atas permukaan penyerap
kering.
6. Tunggu beberapa lama sampai diperoleh pita-pita yang berwarna terpisah.
7. Amati warna pita-pita yang terbentuk dan tuliskan warna apa yang terpisah tersebut.

II. LEMBAR KERJA : KROMATOGRAFI KERTAS

Acara : Penetapan zat warna yang terdapat dalam bahan dengan khrometografi kertas
menaik.

Tujuan : Melakukan penetapan zat pewarna yang terdapat dalam

ninuman/makanan/ekstrak daun dll.

Alat :
 Gelas piala
 Hot palte
 Bejana kromatografi
 Kertas kromatografi
 Mikropipet
 Mortar dan matil
 Corong gelas
 Cawan penguap
 Kertas saring

Bahan :
 Asam asetat
 Aquadest
 Etanol 50%
 Aseton
 Hexan
 Minuman fanta (merah), the botol, jelly, jenis daun (Hijau), kembang gula.
Cara Kerja :
A. Mempersiapkan sampel :
1. Minuman teh botol/minuman ringan ditambah asam asetat hingga bereksi asam.
2. Untuk kembang gula larutkan dalan aquadest dan asam asetat.

B. Mempersiapkan kertas kromatografi :

1. Potong kertas kromatografi dengan panjang dan lebar tertentu sesuai dengan bejana
kromatografi.
2. Buatlah garis dengan pinsil pada kertas khromatografi, sejajar dengan sisi kertas
bagian bawah dan berjarak 2 cm.
3. Pada garis tersebut buatlah noda atau bercak dengan mikro pipet atau jarum injek, dan
totolkan berturut-turut untuk masing-masing sampel dengan jarak 2 cm.
4. Sebelum kertas dimasukkan ke dalam bejana, bejana tersebut harus dijenuhkan dahulu
dengan uap pelarut.
5. Gantungkan kertas tersebut dalam bejana kromatografi dan tutuplah sampai bejana
jenuh dengan uap pelarut, kemudian celupkan kertas sampai tercelup setinggi 1 cm
6. Setelah pelarut menaik sampai jarak tertentu dari tempat noda, keluarkan kertas dan
berilah tanda dengan pensil, kemudian keringkan (diangin- anginkan).
7. Bandingkan noda sampel terhadap noda standar atau pembanding dan hitung Rfnya.

3. EVALUASI

1. Kekuatan dari pelarut-pelarut yang berbeda menurut WILLIAMS, pada karbon

aktif dalam kolom untuk asam-asam amino dan sakarid diturunkan dalam urutan

a. etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol < air murni
b. air murni < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol < asam asetat
c. dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol
d. aseton < etanol < rnetanol < asam asetat< air murni < dietil eter
e. air murni < dietil eter< rnetanol < asam asetat

2. Jika fasa tetap adalah air, maka fasa gerak yang digunakan
adalah : ...
a. Zat padat.
 b. Zat cair organik
c. Zat cair
d. Larutan
e. Gas

3. Zat-zat penyokong yang sering digunakan dalam kromatografi kolom adalah :...
a. Pasir, pati dan glas woll
b. Gula pasir, pati, dan sliika gel
c. Silika gel, bubuk selulosa dan tanah diatome
d. Pasir, tepung, dan pati
e. Silika gel, tepung dan gula

4. Zat-zat aktif yang digunakan sebagai penyerap dalam kromatografi kolom adalah
merupakan :
a. Reduktor
b. Kopaktor
c. Stabilisator
d. Katalisator
e. Oksidator

5. Silika gel merupakan zat padat yang digunakan sebagai penyerap, dalam
kromatografi kolom yaitu untuk memisahkan : ...

a. Karotenoid, sterol
b. Porphirin, karotenoid
c. Sterol-sterol, asam-asam amino
d. Enzim, protein, sterol
e. Enzim, pitamin dan sterol

6. Suhu optimum untuk aktivasi aluminium biasanya sekitar :...

a. 400°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam.
b. 400°C dan waktu pemanasan cukup selama 1 jam
c. 200°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam
d. 600°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam
e. 200°C dan waktu pemanasan cukup selama 1 jam
7. Salah satu cara untuk pembuatan noda pada kromatografi kertas adalah dengan menggunakan
:...
a. Gelas kapiler dengan diameter yang sama
b. Alat penyuntik dan gelas kapiler dengan diameter yang sama
c. Batang pengaduk dari gelas
d. Sendok atau batang dari kayu
e. Alat berupa kawat.

8. Dalam mengidentifikasi noda-noda dalam kertas dapat menggunakan harga Rf (retordation

factoryang) yang didefinisikan sebagai :...
a. Perbandingan antara jarak yang digerakkan oleh pelarut terhadap jarak yang digerakkan
oleh senyawa.
b. Jarak pelarut dan senyawa sama-sama bergerak ke satu arah
c. Perbandingan antara jarak yang digerakkan oleh senyawa terhadap jarak yang
digerakkan oleh pelarut.
d. Pelarut digerakkan ke arah yang samping dan pembawa digrakkan ke arah atas.
e. Persentase dari Perbandingan antara pelarut dan pembawa

9. Kertas sebagai fasa diam dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari gula
sederhana, yaitu :...

a. Sukrosa
b. Maltosa
c. Galaktosa
d. Fruktosa
e. Glukosa

10. Perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat

menyebabkan :...
a. Perubahan harga Rf.
b. Harga Rf sama dengan nol
c. Perubahan fasa gerak dan fasa diam
d. Harga Rf tidak terdeteksi
e. Perubahan jarak noda
b. Soal Essay

1. Jelaskan 3 faktor yang menentukan harga Rf pada kromatografi kertas!

2. Jika salah satu komponen dari campuran bergerak 10,8 cm dari garis dasar, sedangkan pelarut
bergerak sejauh 13,6 cm, hitunglah harga Rf untuk komponen tersebut!
3. Jelaskan hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemisahan dengan kromatografi kertas!
4. Tuliskan struktur kimia dari selulosa!
5. Mengapa penetesan larutan sampel pada kertas kromatografi tidak boleh terlalu banyak.
Jelaskan!
6. Sebutkan 5 jenis zat penyokong yang sering digunakan dalam kolom partisi!
7. Zat padat Alumina/magnesia yang digunakan sebagai penyerap
digunakan untuk memisahkan :...
8. Jelaskan urutan kekuatan elusi menurut TRAPPE dari deret-deret pelarut untuk
senyawwa-senyawa dengan menggunakan silika gel!
9. Jelaskan teknik elusi yang digunakan dalam kolom partisi!
10. Jelaskan bagaimana cara pembuatan lapisan tipis di atas kaca pada kromatografi
lapis tipis!
11. jelaskan apa yang dimaksud dengan Rx atau Rstd
12. jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis
yang juga dapat mempengaruhi harga Rf !
13. Jelaskan cara-cara yang digunakan dalam pembuatan lapisan tipis!
14. Zat padat kieselguhr adalah sebagai zat penyerap untuk kromatografi lapis tipis yang
digunakan untuk memisahkan :...
C. KEGIATAN PEMBELAJARAN 3. MELAKSANAKAN
PEMISAHAN KROMATOGRAFI

1. LEMBAR INFORMASI

Cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap, yang dapat
berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat maka cara tersebut dikenal
sebagai kromatografi serapan (absorption chromatography), dan jika zaf cair dikenal
sebagai kromatografi partisi (partition chromatography). Karena fasa gerak dapat
berupa zat cair atau gas maka semua ada empat macam sistem kromatografi. Keempat
rnacam sistem kromatografi tersebut adalah :
1). Fasa gerak zat cair - fasa tetap padat : Komatografi penukar ion.
2). Fasa gerak gas - fasa tetap padat : Kromatografi gas padat
3). Fasa gerak zat cair - fasa tetap zat cair, dikenal sebagai
kromatografi partisi dan kromatografi kertas.

4). Fasa gerak gas - fasa tetap zat cair : Kromatografi gas-air dan Kromatografi
kolom kapiler.

Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada senyawa - senyawa yang

dipisahkan, sehingga terdistribusi sendiri diantara fasa gerak dan fasa tetap
dalam perbandingan yang sangat berbeda -beda dari satu senyawa terhadap
senyawa yang lain.

a. Kromatografi Partisi
Perbedaan yang pokok adalah terletak pada sifat dari penyerap, dimana dalam
kromatografi partisi berupa materi yang berpori, seperti kieselguhr, yang
dilapisi dengan lapisan dari zat ca ir sering menggunakan air. Fasa tetap adalah
lapisan zat cair dan zat padat yang berperan sebagai penyangga/penyokong. Jika
fasa -fasa bergerak dan tetap keduanya berupa zat cair maka akan diperoleh
kromatografi zat cair-cair.
Kecepatan bergerak dari suatu komponen dari campuran tidak tergantung pada
kelarutannya dalam fasa tetap, yang berupa zat cair sehingga senyawa-senyawa
yang lebih larut akan bergerak lebih lambat turunnya dalam kolom daripada yang
kurang kelarutannya. Selama bergerak senyawa-senaywa mengalami partisi di
antara dua fasa, dan pemisahan terjadi karena perbedaan dalam koefisien partisi.
Kromatografi kertas merupakan partisi yang spesial, dimana lembaran kertas adalah
sebagai pengisi/pengganti dari kolom. Kromatografi campuran dari senyawa yang
dipisahkan membentuk suatu jalur dalam kolom.

b. Teknik-teknik Pemisahan
Untuk memperoleh pemisahan dari jalur-jafur komponen harus dikerjakan lebih
lanjut dengan melakukan satu dari tiga macam cara: analisa elusi, analisa frontal
atau analisa per pindahan gerakan.

I). Analisa elusi

Analisa elusi digunakan secara ekstensif dalam kromatografi partisi. Dalam elusi
aliran dari fasa bergerak (eluting agent) adalah terus menerus hingga campuran
terpisah sempurna menjadi komponen - komponennya. Harus diperhatikan bahwa
fasa bergerak yang dipilih harus tidak mempunyai efek terhadap fasa tetap atau
hanya sangat lemah diserap olehnya.

Pengaliran pelarut secara terus menerus melalui kolom disebut elusi. Elusi bisa
dilakukan dengan memanfaatkan gaya gravitasi, gaya kapiler, atau tekanan
mekanis. Selama proses elusi berlangsung, spesi sampel bisa berada didalam fasa
gerak (berarti ikut mengalir) atau berinteraksi dengan fasa diam (berarti tidak
bergera k). Tiap molekul satu jenis spesi akan bergantian masuk dan keluar
fasa diam dengan perbandingan waktu yang sama dan menghasilkan gerakan
kelompok yang sama. Waktu pergerakan spesi adalah waktu yang dihabiskan
oleh spesi ketika molekul spesi bera da dalam fasa gerak. Karena tiap spesi
memiliki perbandingan waktu yang khas untuk berada dalam fasa gerak
(ketika tidak berinteraksi dengan fasa diam), maka terjadi pemisahan kelompok-
kelompok spesi.

Elusi pertama-tama telah digunakan oleh TSWETT tahun 1903 untuk pemisahan
pigmen-pigmen daun, karena adanya warna maka cepat terlihat lokasinya dalam
kolom. Senyawa -senyawa tak berwarna dapat juga dilihat lokasinya, karena
flouresensi dalam sinar ultra -violet. Sekali pemisahan terjadi pita komponen
dapat diambil dengan jalan memotong dari bagian-bagian yang mengandung
berbagai komponen, kemudian diekstrak dengan pelarut yang sesuai. Cara lain,
aliran dari zat pengelusi dapat diteruskan hingga tiap -tiap komponen tercuci
sempurna dari kolom. Untuk mengetahui tiap-tiap komponen dapat dideteksi
dengan menggunakan pereaksi kimia yang cocok atau test fisika.

Ekor (tailing)yaitu kejadian yang selalu terjadi dalam kromatografi serapan bila
teknik elusi yang digunakan tidak sesuai. Ekor menaikkan kelebaran dari pita-
pita hingga ada tendensi untuk menimbulkan penindihan pita satu dengan pita lainnya
(overlap).

2). Analisa Frontal

Di dalam analisa frontal, larutan campuran ditambahkan terus menerus hingga
kolom jenuh. Larutan yang keluar dari kolom sebelah bawah diukur terus
menerus. Sebagai contoh, campuran yang mengandung tiga komponen A, B,
dan C. Anggaplah bahwa komponen A yang paling lemah diserap oleh penyerap
dalam kolom, sedang komponen C yang paling kuat diserap dan komponen B
lebih kuat daripada A tetapi lebih lemah diserap daripada C. Bila campuran
ditambahkan terus menerus maka A akan mempunyai tendensi keluar paling
dahulu daripada yang lainnya dan pada tingkat pertama akan diperoleh A yang
murni. Komponen B lebih kuat diserap daripada A dan leb ih lemah daripada C,
hingga ia akan bergerak yang tak akan mendahului A. Pada langkah kedua akan
diperoleh terutama B tetapi tercampur dengan A karena pemasukan yang terus
nienerus dari carnpuran. Sedangkan pada langkah ketiga akan terdiri atas
campuran a sal A + B + C. Dalam cara ini hanya pada langkah pertama akan
diperoleh kornponen yang murni. Pemisahan secara sempurna tidak dapat
diperoleh.

3) Analisa perpindahan gerakan

Analisa perpindahan gerakan mungkin dapat dipandang sebagai hibrida dari
analisa elusi dan frontal, seperti dalam metode elusi, sejumlah kecil dari
campuran diletakan di atas kolom, kemudian larutan senyawa yang lebih kuat
diserap daripada setiap komponen dari campuran ditambahkan terus menerus
dari atas kolom. Senyawa ini dikenal sebagai pengganti (displacer). Campuran
kemudian bergerak ke bawah pada kecepatan yang sama seperti pengganti yang
ditambahkan dan campuran akan terpisah sendiri menjadi pita-pita dari
komponen- komponen yang murni, urutan dari pita-pita merupakan urutan dari
kekuatan penyerapan pada penyerap. Tiap -tiap pita murni bekerja sebagai
pengganti untuk komponen-komponen yang mendahuluinya dan pita yang
paling akhir merupakan pita yang paling kuat diserap akan didorong oleh
pengganti.

c. Kromatografi padat- gas (Gas S o lid Cr omatogra ph y, G S C)

Kromatografi Gas adalah suatu teknik untuk memisahkan campuran zat yang mudah
menguap dengan cara melewatkan aliran gas pada suatu fasa diam (stationary phase).
Dasar kerja dari GSC adalah adsorbsi (serapan). Dengan alasan ini maka GSC sangat
sukar untuk digunakan secara berulang dengan hasil yang sama. Hal ini disebabkan oleh
kenyataan-kenyataan bahwa :
1. Aktivitas dari penyerap (adsorbent) tergantung pada cara pembuatannya.
2. Juga aktivitas tergantung pada bagaimana ia diperlakukan setelah
pembuatannya.
Keadaan 1 dan 2 sangat sukar untuk distandarisasi. Hal-hal inilah yang menyebabkan
"Reproducibility" yang rendah dari GSC. Yang sering dijumpai adalah :
1. Puncak-puncak berekor disebabkan permukaan aktif yang tidak homogen dari
penyerap.
2. Waktu retensi relatif panjang.
3. Waktu retensi sangat tergantung pada jumlah dari cuplikan.
4. Kernungkinan penyerap.dapat berperan sebagai katalisator yang aktif.

Itulah sebabnya pengguanaan dari GSC sangat terbatas, baik untuk senyawa yang
mempunyai titik didih yang rendah maupun tinggi. Meskipun demikian ada keuntungan
dari GSC bila dibandingkan dengan GLC. Fasa diam tidak dapat diuapkan, karena
tekanan uap dari padatan sangat rendah. Hingga dapat menggunakan detektor-detektor
yang sensitif, karena di sini tidak terjadi "column bleeding".

Dalam tahun akhir-akhir ini GSC menjadi lebih penting yaitu setelah diketemukannya
penyerap-penyerap yang lebih baik. Contoh-contoh penyerap adalah :
1) "grafite-coal" : dikenal sebagai "spheron", strukturnya sangat homogen
(dibandingkan dengan diamond) : ini digunaaan terhadap senyawa-senyawa polar yang
titik didihnya tinggi.

2) “molecular sieves" : ini merupakan zeolit buatan (= Na- atau CaAI-silikat), dengan
pori-pori yang sangat kecil/halus di dalamnya. Ukuran dari diameter pori dinyatakan
dalam A°. Sebagai contoh "Linde", mempuyai ukuran dari 3A° hingga 13A°. Zeolit
sangat stabil, pada suhu hingga 600°C. Molecular sieves hanya menyerap molekul-
molekul yang lebih kecil dari pori-porinya. Air sangat cepat diserap hingga merupakan
pengering yang sangat efisien. Molecular sieves mempunyai sifat katalisator yaitu
dapat merupakan zat dehidrator (dehydrating agents). Sebagai contoh zeofit dapat
mengubah alkohol menjadi hidrokarbon/gasolin : R-OH → R-H. Sebelum digunakan
biasanya molecular sieves diaktifkan dengan memanaskannya selama 12 jam pada suhu
150°C sambil dialiri gas H2 yang kering.

Kegunaan molecular pemisahan gas-gas seperti hidrokarbon-hidrokarbon menyerap

sangat kuat. CO2 dan prosesnya tidak dapat balik sehingga zeolit tidak digunakan bila
CO2 dipakai sebagai gas pengangkut.
Perkembangan dalam GSC pada saat sekarang yaitu digunakannya polimer- polimer
yang berpori seperti PORAPAK dan POLYPAK (nama perdagangannya) juga
CHROMOSORB.
Penyerap-penyerap ini sangat cocok untuk pemisahan :
1. Senyawa-senyawa yang sangat polar seperti H20, NH3, R-NH2, R-OH dan glikol-
glikol, dan asam-asam lemak rendah.
2. Juga untuk seperti CO2,N2O,O2 juga yang lainnya.

d. Kromatografi gas-cair (GLC) atau Kromatografi Gas (GC)

Keuntungan-keuntungan yang ditunjukkan oleh GLC :
1. Kecepatan :
a. Gas yang merupakan fasa bergerak sangat cepat mengadakan kesetimbangan
antara fasa bergerak dengan fasa diam.
b. Kecepatan gas yang tinggi dapat juga digunakan.Hingg a waktu pemisahan
sangat cepat (diukur dalam menit).
2. Sederhana :
Alat GLC relatif sangat mudah dioperasikan. Interprestasi langsung dari data
yang diperoleh dapat dikerjakan. Harga dari alat GLC relatif murah.
3. Sensitif :
GLC sangat sensitif. Alat yang paling sederhana dapat mendeteksi
konsentrasi dalam ukuran 0,01% (= 100 ppm). Alat -alat GLC yang lebih
rumit dapat mendeteksi senyawa yang Konsentrasirrya hanya beberapa alat
yang tertentu sekarang dapat dibuat dengan kemampuan mendeteksi "parts
per billion", hingga dalam jangkauan pikogram = 10 g. Disebabkan
sensitivitas yang tinggi dari GLC maka hanya memerlukan sejumlah kecil
dari cuplikan, biasanya dalam ukuran mikroliter.
4. Pemisahan : (resolution = performance).
Dengan GLC memungkinkan untuk memisahkan moleku -molekul dari suatu
campuran, dimana hal ini tidak mungkin dipisahkan dengan cara-cara yang lain.
Misalnya pemisahan metil ester-metil ester dari :
1. Asam stearat dengan ttd 232°C pada tekanan 15 mmHg CH3(CH,)t6COOH.
2. Asam oleat dengan ttd 229°C pada tekanan 15 mm Hg CH3(CH,)7CH =
CH(CHZ)7COOH:
3. Asam linoleat dengan ttd 237°C pada tekanan I5 mm Hg CHj(CHZ)4 CH
= CH = CHCHZCH = CH (CH,)7COOH.
Senyawa-senyawa tersebut tak mungkin dipisahkan dengan cara distilasi atau
dengan ekstraksi, tetapi sangat mudah dipisahkan dengan GLC, yang hanya
membutuhkan waktu sekitar 23 menit.

5. Analisa dapat digunakan sebagai :

1. Analisa kualitatif yaitu dengan membandingkan waktu retensi.
2. Analisa kuantitatif yaitu dengan penghitungan luas puncak.
3. Alat GLC dapat dipakai dalam waktu yang lama dan berulang-ulang.

a. Prinsip Krimatografi Gas-Cair (GC)

Prinsip kerja kromatografi gas adalah sampel (cuplikan/analit) diinjeksikan ke dalam
kolom dan diuapkan lalu dielusi oleh aliran gas inert (sebagai fasa gerak). Pada
kromatografi gas, fasa gerak tidak berinteraksi dengan molekul- molekul analit. Fungsi
fasa gerak, hanya berfungsi sebagai transpor analit atau cuplikan untuk bergerak di
sepanjang kolom. Proses pemisahan terjadi karena perbedaan interaksi analit dengan fasa
diam.

Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa cuplikan yang telah teruapkan masuk ke
dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-komponen dari cuplikan. Kemudian
komponen-komponen dideteksi oleh detektor, dan sinyal dalam bentuk puncak akan
dihasilkan oleh pencatat.

b. Bagian alat kromatografi gas

Injektor Detektor
(FID/TCD)

GC

Kolom

Oven
Gas

Gambar 1. Skema alat GC

Alat GLC atau GC terbentuk atas 7 bagian yang pokok seperti pada gambar bagian-
bagian alat berikut. Tujuh bagian pokok dari kromatografi gas seperti pada gambar
:
1. Silinder tempat gas pembawa/pengangkut
2. Pengatur aliran dan pengatur tekanan
3. Tempat injeksi cuplikan
4. Kolom
5. Detector
6. pencatat
7. Terminal untuk 3, 4 dan 5
 Injektor Oven Detektor Rekorder

Pemasok kolom
Gas

Gas kromatografi terdiri dari :

 Suatu aliran gas,
 Suatu tempat injeksi,
 Suatu kolom pemisah
 Suatu detektor

Bagian-bagian dari kromatografi gas adalah :

(1) Gas pengangkut
Gas pengangkut (carrier gas) ditempatkan dalam silinder bertekanan tinggi. Biasanya
tekanan dari silinder sebesar 150 atm. Tetapi tekanan ini sangat besar untuk
digunakan secara Iansung.
Gas pengangkut harus memenuhi persyaratan :
a. Harus inert, tidak bereaksi dengart cuplikan, cuplikan-pelarut, dan material dalam
kolom.
b. Murni dan mudah diperoleh, serta murah.
c. Sesuai/cocok untuk detektor.
d. Harus mengurangi difusi gas.
Gas-gas yang sering dipakai adalah : helium, argon, nitrogen, karbon dioksida dan
hidrogen. Gas helium dan argon sangat baik, tidak mudah terbakar, tetapi sangat
mahal. H2 mudah terbakar, sehingga harus berhati-- hati dalam pemakaiannya.
Kadang-kadang digunakan juga C02.
Pemilihan gas pengangkut atau pembawa ditentukan oleh ditektor yang digunakan.
Tabung gas pembawa dilengkapi dengan pengatur tekanan keluaran dan pengukur
tekanan. sebelum masuk ke kromatograf, (harusnya) ada pengukur kecepatan aliran
gas serta sistem penapis molekuler untuk memisahkan air dan pengotor gas lainnya.
Pada dasrnya kecepatan alir gas diatur melalui pengatur tekanan dua tingkat yaitu
pengatur kasar (coarse) pada tabung gas dan pengatur halus (fine) pada kromatograf.
Tekanan gas masuk ke kromatograf (yaitu tekanan dari tabung gas) diatur pada 10 s.d
50 psi (di atas tekanan ruangan) untuk memungkinkan aliran gas 25 s.d 150 mL/menit
pada kolom terpaket dan 1 s.d 25 mL/menit untuk kolom kapiler.
 (2). Pengatur aliran dan pengatur tekanan
Ini disebut pengatur atau pengurang Drager. Drager bekerja baik pada 2,5 atm, dan
mengalirkan massa aliran dengan tetap. Tekanan lebih pada tempat masuk dari
kolom diperlukan untuk mengalirkan cuplikan masuk ke dalam kolom. Ini
disebabkan, kenyataan lubang akhir dari kolom biasanya mempunyai tekanan atmosfir
biasa. Juga oleh kenyataan bahwa suhu kolom adalah tetap, yang diatur oleh
thermostat, maka aliran gas tetap yang masuk kolom akan tetap juga.
Demikian juga komponen-komponen akan dielusikan pada waktu yang tetap yang
disebut waktu penahanan (the retention time), tR. Karenakecepatan gas tetap, maka
komponen juga rncmpunyai volume karakteristik terhadap gas pengangkut = volume
penahanan (the retention volume), vr. Kecepatan gas akan mempengaruhi effisiensi
kolom.
Harga-harga yang umum untuk kecepatan gas untuk kolom yang memiliki diameter
luar.
1/4" O.D : kecepatan gas 75 ml/min 1/8"
O.D : kecepatan gas 25 ml/min.
Kita akan meninjau bagaimana cara untuk mendapatkan harga kecepatan aliran yang
optimum untuk suatu pemisahan tertentu.

HETP

HTEP min

Kecepatan aliran optimum

Kecepatan aliran
ml/min

(3). Tempat injeksi (The injection port)

Dalam pemisahan dengan GLC cuplikan harus dalam bentuk fasa uap. Gas dan uap
dapat dimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa organik berbentuk
cairan dan padatan. Hingga dengan demikian senyawa
yang berbentuk cairan dan padatan pertama-tama harus diuapkan. Ini mem- butuhkan
pemanasan sebelum masuk dalam kolom. Panas itu terdapat pada tempat injeksi seperti
pada gambar 2. bagan injektor.

Tempat injeksi dari alat GLC selalu dipanaskan. Dalam kebanyakan alat, suhu dari
tempat injeksi dapat diatur. Aturan pertama untuk pengaturan suhu ini adalah batiwa
suhu tempat injeksi sekitar 50°C lebih tinggi dari titik didih campuran dari cuplikan yang
mempunyai titik didih yang paling tinggi. Bila kita tidak mengetahui titik didih
komponen dari cuplikan maka kita harus mencoba- coba. Sebagai tindak lanjut suhu dari
tempat injeksi dinaikkan. Jika puncak- puncak yang diperoleh lebih baik, ini berarti
bahwa suhu percobaan pertama terlalu rendah. Namun demikian suhu tempat injeksi
tidak boleh terlalu tinggi, sebab kemungkinan akan terjadi perubahan karena panas atau
peruraian dari senyawa yang akan dianalisa.

Tempat injeksi (injektor):

Pengarah jarum
injektor
Septum
Baut Septum
Purge

Gas
pembawa
Split
Glass insert

Adaptor Kolom

Gambar 2. Bagan injektor GC

Kolom GC

Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui tempat

injeksi. Hal ini dapat dilakukan dengan pertolongan jarum injeksi yang sering disebut "a
gas tight syringe".

Perlu diperhatikan bahwa kita tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu banyak,
karena GC sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan pada waktu kita
mengandakan analisa 0,5 -50 ml gas dan 0,2 - 20 ml untuk cairan seperti pada gambar 3.
 Tempat injeksi (injektor):

Syringe
(10 L)
Pengarah jarum
Septum
injektor
Baut Septum
Purge

Gas
pembawa

Split
Untuk Untuk
Cairan gas
Glass insert

Adaptor Kolom

Kolom GC

3. Bagan injektor GC

(4). Kolom
Kolom merupakan jantung dari kromatografi gas. Bentuk dari kolom dapat lurus,
bengkok, misal berbentuk V atau W, dan kumparan/spiral. Biasanya bentuk dari kolom
adalah kumparan. Kolom selalu merupakan bentuk tabung. Tabung ini dapat terbuat dari
:
tembaga (murah dan mudah diperoleh)
plastik (teflon), dipakai pada suhu yang tidak terlalu tinggi.
baja (stainless steel), (mahal)
alumunium
gelas
Perhatian : meskipun tembaga agak murah, tetapi tidak selalu dapat digunakan karena
kadang-kadang dapat menimbulkan serapan yang tidak diinginkan atau dapat bereaksi
dengan senyawa-senyawa organik seperti amina, asetilena, terpen dan stereoid.

Panjang kolom dapat dari 1 m sampai 3 m. Diameter kolom rnempunyai berbagai

ukuran, biasanya pengukuran berdasarkan diameter dalam dari kolom gelas yaitu
antara 0,3 mm hingga 5 min. kebanyakan kolorn yang digunakan berupa staninles steel
dengan diameter luar (OD) dari I/S atau 1/4 inch (0,3 atau 0,6 cm). Pada GSC kolom
diisi dengan penyerap (adsorbent), sedangkan pada GLC kolom diisi dengan "solid
support" (padatan pendukung) yang diikat oleh fasa diam.
 JENS KOLOM (FASA DIAM)

KOLOM KEMAS (PACKED) KOLOM KAPILER (CAPPILARY)

1–5m 15 – 30 m

LAPISAN
ADSORBEN FASA DIAM
(FS DIAM)

Gambar 4. Kolom GC

Pada GC, dikenal dua tipe kolom, yaitu kolom kemas (Packed) dan kolom kapiler
(tabung terbuka/cappilary).

1. Kolom Kemas (Packed)

Kolom kemas terbuat dari bahan gelas atau logam dengan ukuran diameter dalam (ID,
Internal Diameter) 1 s.d 8 mm, dan panjang antara 2 s.d 20 m. Kolom kemas yang
sering dijumpai memiliki nilai perbandingan volume fase diam per volume fase gerak,
VS/VM antara 15 s.d 20 dan terdiri dari 100 s.d 1000 plat teoritis per kaki (foot). Cukup
banyak kolom terpaket yang memiliki jumlah plat teoritis yang lebih tinggi. kolom
terpaket yang baik memiliki jumlah plat teoritis sampai 20.000 plat per kaki (1 foot =
12 inchi = 30,48 cm).

KOLOM KEMAS (PACKED)

 
 
 

 Biasanya 1/8” diameter (3,2 mm O.D, 22 mm I.D),

Panjang 1 – 2 m

 Kecepatan alir maksimum 1 mL/menit atau 8 cm/menit

2. Kolom Kapiler
Kolom kapiler dibagi menjadi 2 tipe dasar yaitu :
a. “Wall Coated Open Tubular – WCOT” : kolom kapiler yang dilapiskan dengan
lapisan tipis fasa diam. Bahan kolom adalah baja nirkarat, aluminium, tembaga,
plastik dan gelas. Kolom WCOT produk tahun
 1990 an dibuat dari leburan silika yang disebut juga kolom FSOT – Fused Silica
Open Tubular Column) yang diperkuat dengan lapisan poli-amida di bagian
luarnya, bersifat sangat pleksibel sehingga dapat digulung dengan diameter
beberapa inchi. Kapasitas sampel sangat rendah (<0,01µL).
b. “Support Coated Open Tubular – SCOT” : Permukaan dalam kapiler dilapiskan
dengan lapisan tipis (~30 µm) fasa pendukung, seperti tanah diatome, grfit,
oksida metal atau silikat. Tipe ini mampu menahan fasa diam beberapa kali lebih
banyak dari tipe WCOT sehingga kapasitas sampelnya lebih besar. Secara umum
efisiensi kolom SCOT lebih kecil dari kolom WCOT tetapi lebih besar dari
kolom terpaket.

KOLOM KAPILER
Fasa Diam Penyangga padat dila Partikel fasa diam
Cair pisi fasa diam cair padat

Dinding kolom

Wall-coated Support-coated Porous-layer

open tubular open tubular open tubular
column column column
(WCOT) (SCOT) (PLOT)

Gambar 5. Jenis kolom kapiler

Kolom kapiler memiliki diameter dalam antara 0,3 – 0,5 mm, di bagian dalam
kolom dilapiskan dengan fasa diam cairan yang sangat tipi (~ 1 µm). Penurunan
tekanan di dalam kolom kapiler bisa diabaikan, sehingga bisa dibuat sangat
panjang (lebih dari 100 m). Perbandingan volume fasa diam VS.volume fasa
gerak, VS/ Vm diantara 100-300, sehingga sangat efisien. kolom kapiler dengan
ratusan ribu jumlah pelat teori juga sudah dibuat. kolom terbuat dari baja
nirkarat, gelas, leburan silika, atau teflon. Supaya bisa dimasukkan ke dalam
oven, kolom digulung dengan diameter gulungan antara 10 – 30 cm.
 Isi kolom
(a). Padatan pendukung.
Padatan pendukung berfungsi mengikat fasa diam. Kebanyakan zat ini berupa tanah
diatorne yang telah dipanaskan/dikeringkan. Pendukung ini disebut "diatomite".
Diatomite terdiri dari satuan ganggang bersel satu yang disebut diatom yang pori-
porinya sangat kecil. Luas permukaan dari struktur berpori sekitar 20 m2/g. Luas
permukaan yang besar ini d i b u t u h k a n u n t u k mendistribusikanfasa diam yang
bersifat cairan dalam GC.
Persyaratan dari padatan pendukung yang baik :
1. Inert (tidak menyerap cuplikan).
2. Kuat, stabil pada suhu-suhu yang tinggi.
3. Memiliki luas permukaan yang besar : 1 - 20 m2/g.
4. Perrnukaan yang teratur, ukuran yang sama; ukuran pori sekitar l ON
5. Harus mernpunyai tahanan yang rendah terhadap gas pengangkut. Padatan
pendukung yang biasa digunakan adalah kiesel guhr
(forementionned - diatomaceous earth). Nama dalam perdagangan :
 Aluminium
 Diatoport
 Chromosorb.

Padatan pendukung ini terutama terdiri dari Si02 :

91 % - Si02
5 % - Al203
2 % - Fe203
0,5 % - CaO, dan oksida-oksida lainnya

OH OH OH
l l l
struktur : ─ Si ─ O ─ Si ─ O ─ Si ─
polimer silicon-oksigen

Ada beberapa jenis chromosorb :

a. Chromosorb G : luas permukaan yang kecil (0,5 m 2/g), hanya dapat digunakan
untuk mengikat faSa cair dalam jumlah yang sedikit (± So1o), merupakan materi
yang sangat keras; baik untuk pemisahan senyawa-senyawa yang polar. Ini
merupakan padatan pendukung hingga yang bersifat universal.
b. Chromosorb P : berwarna kemerah-merahan (P = pink), biasanya
digunakan untuk senyawa-senyawa yang apolar, terutama hidrokarbon.
c. Chromosorb W : berwarna putih, agak mudaan digunakan untuk senyawa-
senyawa polar.

Chromosorb-chromosorb yang kotor dapat bereaksi dengan cuplikan; hal ini akan
menyebabkan puncak berekor. Interaksi utama antara padatan pendukung dengan
molekul-molekul cuplikan adalah ikatan hidrogen melalui gugus-gugus OH dari
chromosorb. Untuk mencegah hal ini, chromosorb harus direaksikan terlebih dahulu
hingga ia menjadi kurang aktif.

Pengaruh permukaan penyangga

a. Gusus hidroksil tunggal

- HCl CH3

- Si – OH + (CH3)2 Si Cl2 - Si – O – Si – Cl

Dimetildiklorosilan CH3
(DMCS)

CH3 - HCl CH3

- Si – O - Si - Cl + CH3OH - Si – O – Si – O – CH3

CH3 CH3

b. Gugus hidroksil berdampingan

CH3 CH3
Si
OH OH O O

- Si - O – Si - + (CH3)2 Si Cl2 - Si - O - Si - + 2 HCl

Ukuran dari padatan pendukung yang digunakan adalah :

 Untuk kolom I/8 inch : 100/120 atau 80/I00 mesh
 Untuk kolom 1/4 inch : 60/80 atau 40/60 mesh
100/ 120 mesh - 0,15 - 0,13 mm; 80/ 100 mesh ti 0,18 - 0,15 mm 60/80
mesh ti 0,25 - 0,18 mm; 40/60 mesh - 0,40 - 0,25 mm.
 (b). Fasa d i a m
Dalam GC fasa diam berupa cairan. Pada fasa cairan inilah pemisahan
komponen-komponen dari cuplikan terjadi. Dasar kerja adalah Partisi antara
fasa cairan dan fasa bergerak ( = gas). Seperti telah dibicarakan di muka
bahwa proses GC adalah mirip dengan proses ekstraksi. Dalam GC fasa diam
disebut juga fasa cair atau mudahnya pelarut/solvent.

Persyaratan untuk fasa cair yang baik adalah sebagai berikut :

1. Cuplikan-cuplikan harus menunjukkan koefisien distribusi yang
berbeda.
2. Cuplikan-cuplikan harus mempunyai kelarutan yang tertentu
dalam pelarut (= fasa cair).
3. Fasa cair harus mempunyai tekanan uap yang sanga t rendah pada suhu-
suhu yang tinggi : 0,01 - 0., 1 mm Hg.
4. Secara kimia ia harus stabil dan inert.
5. Harus mempunyai kekentalan yang rendah, sehingga tidak
mengikat gas.
6. Harus dengan baik tersebar dan mengikat pada padatan pen - dukung.
7. Harus larut dengan baik pada pelarut organik yang mempunyai titik
didih rendah. Ini penting dalam pembuatan kolom.

Meskipun banyak pcrsyaratan, namun dcmikian cukup banyak pelarut-pelarut

organik yang dapat digunakan. Kenyataan, ketepatan dan sefektivitas dari
GLC/GC tergantung pada pemilihan dari pelarut- pelarut yang tersedia.
Biasanya persentase dari fasa cair pada padatan pencfukunL adalah I0% dari
berat.
1). Senyawa (dari cuplikan) terpisah berdasarkan atas kelarutan
mereka (= afinitas) dalam fasa cair.
2). Padatan pendukung harus memiliki luas permukaan yang besar untuk
mengikat fasa cair. Sehingga padatan pendukung mengikat fasa cair yang ditempatkan
dalam kolom. Bila hal ini tidak terjadi maka fasa cair akan terlepas oleh tekanan gas.
(5) Detector
Puluhan jenis detektor sudah dikembangkaan dan digunakan untuk GC. Karakteristik
detektor ideal untuk GC adalah :
1. Cukup sensitif
2. Sifat ksetabilan dan sifat pengulangan (reproducibilility) yang baik
3. Tanggap linier terhadap kuantitas analit.
4. Rentang temperatur dari temperatur ruang s.d 400°C.
5. Waktu tanggap yang pendek.
6. Kehandalan yang tinggi.
7. Mudah digunakan.
8. Tidak merusak sampel.

Detektor yang paling banyak digunakan adalah :

a. Detektor ionisasi Nyala (FID, Flame Ionization Detektor)
Prinsip kerja FID adalah sebagai berikut :
1. Eluen dari kolom dicampur dengan gas hidrogen dan udara, kemudian
dinyalakan dengan api listrik.
2. Komponen organik dari sampel yang masuk ke nyala akan mengalami pirolisis,
menghasilkan ion-ion dan elektron yang akan memberikan sifat hantaran listrik
pada nyala.
3. Ratusan volt tegangan listrik dc dipasangkan diantara ujung pembakar dengan
elektroda kolektor yang ditempatkan di atas nyala.
4. Arus listrik yang dihasilkan (dalam pA ~ 1012 Ampere) dimasukkan ke sebuah
penguat operasional berimpedansi tinggi.

FID
Flame Ionization Detector (Detektor Pengionan Nyala)

Penutup tower
Probe sinyal

Silinder pengumpull

+
Ujung nyala
-

Probe penyulut

Gas H 2 + udara
(300-400 mL/menit)

Gambar 8. Bagan FID Gas pembawa

b. Detektor konduktivitas Thermal (TCD, Thermal Conductivity Detector)

TCD disebut juga Katharometer. TCD adalah detektor yang bekerjanya berdasarkan
perubahan sifat hantaran panas eluen dalam keadaan murni dan dalam keadaan
tercampur spesi lain seperti analit. Elemen pengindera TCD adalah kawat halus yang
dibuat dari Pt, Au, W atau termistor semi konduktor yang dipanaskan secara listrik.
Perubahan sifat hantaran panas gas akan menyebabkan perubahan efektivitas
pemindahan energi panas dari kawat halus ke gas sehingga temperatur kawat halus
menjadi berubah. Perubahan temperatur kawat halus akan mengubah nilai resistansi
kawat halus.

TCD
Thermal Conductivity Detector (Daya hantar panas)

Sambungan ke sumber
Tenaga listrik dan rangkaian

Aliran gas

Aliran gas

Filamen

Gambar 7a. Bagan TCD

c. Detektor Penangkap Elektron (ECD, Electron Capture Detector)

ECD bekerja seperti penghitung proporsional pada pengukuran radiasi sinar-

x. Eluen dari kolom dilewatkan melalui pemancar sinar-β (seperti nikel-63
atau tritium yang diabsorb ke permukaan platina atau titanium). ECD memiliki
respons selektif dan sangat peka terhadap gugus fungsional yang bersifat
elektronegatif seperti halogen, peroksida, kuinon, dan gugus nitro. ECD tidak
sensitif terhadap gugus amina, alkohol dan hidrokarbon. ECD digunakan
untuk analisis insektisida yang mengandung klor dan ECD tidak merusak
sampel.
Keuntungan ECD :
 Mempunyai limit deteksi cukup rendah = 10-15 g/s untuk berbagai senyawa
terhalogenasi (PCB, DDT dll.)

 Rentang dinamiknya 104

 Kelemahan ECD :
 Menggunakan sumber radioaktif Ni-63
 Mudah terkontaminasi oleh O2, H2O, overload sampel
 Perlu pemeliaharaan tinggi
 Mempunyai variabilitas tinggi respon terhadap zat terhalogenasi
 Dapat menyebabkan sakit kepala bila digunakan untuk
mendeteksi CH2Cl2 dengan adanya CCl4.

ECD
Flame Ionization Detector (Detektor Pengionan Neale)
+
-
Arah keluar

Sumber
Radioaktif Ni-63

Gas pembawa
Gambar 9. Bagan ECD

d. Detektor Thermionik (TID, Thermionic Detector)

TID bersifat selektif untuk senyawa organik yang mengandung fosfor dan
nitrogen. respon terhadap P, 10 kali respon terhadap N, 10.000 s.d 1.000.000
kali respons terhadap atom C, dan 500 kali respons P oleh FID. TID digunakan
untuk pestisida yang mengandung P.

e. Detektor Emisi Atomik, (AED, Atomic Emission Detector)

AED adalah detektor GC mutakhir yang ada di pasar komersial. Detektor ini
bekerja berdasarkan emisi atomik. Eluen dimasukkan ke dalam plasma He
yang mendapatkan energinya dari gelombang mikro yang digabungkan dengan
sebuah spektrometer emisi optik “diode array”.

(6) Rekorder atau Sistem Data

Sinyal analitik yang dihasilkan detektor dikuatkan oleh rangkaian elektronik agar bisa
diolah oleh rekorder atau sistem data. Sebuah rekorder bekerja dengan menggerakkan
kertas dengan kecepatan tertentu. di atas kertas tersebut dipasangkan pena yang
digerakkan oleh sinyal keluaran detektor sehingga posisinya akan berubah-ubah
sesuai dengan dinamika keluaran penguat sinyal detektor. Hasil rekorder adalah
sebuah kromatogram berbentuk pik-pik dengan pola yang sesuai dengan kondisi
sampel dan jenis detektor yang digunakan.

Rekorder biasanya dihubungkan dengan sebuah elektrometer yang dihubungkan

dengan sirkuit pengintregrasi yang bekerja dengan menghitung jumlah muatan atau
jumlah energi listrik yang dihasilkan oleh detektor. Elektrometer akan melengkapi
pik-pik kromatogram dengan data luas pik atau tinggi pik lengkap dengan biasnya.
Sistem data merupakan pengembangan lebih lanjut dari rekorder dan elektrometer
dengan melanjutkan sinyal dari rekorder dan elektrometer ke sebuah unit pengolah
pusat (CPU, Central Procesing Unit).

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) adalah suatu metode kromatografi mampu
memisahkan campuran makromolekul, senyawa ionik, produk alam yang senyawa polimerik dan
kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi de cara penyarian berfraksi,
penyerapan atau penukaran ion.
Ditinjau dari sistem peralatannya KCKT termasuk kromatografi kolom karena fasa diamnya
diisikan atau terpacking dalam kolom. Dan bila ditinjau dari proses pemisahannya KCKT
digolongkan dalam kromatografi adsorpsi atau kromatografi partisi. KCKT/HPLC adalah alat
yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan
penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi
kolom. Pemisahan secara kromatografi dalam KCKT adalah hasil interaksi spesifik antara
molekul sampel dengan fasa diam atau fasa gerak. KCKT juga merupakan teknik
kromatofrafi yang paling banyak digunakan, dengan keunggulan-keunggulan:
1. Sensitif dan mudah disesuaikan untuk analisis kuantitatif,
2. Cocok untuk pemisahan spesi yang mudah menguap dan spesi yang mudah rusak oleh
panas,
3. Bisa dugunakan untuk indrsti, bebagai bidang sains dan keperluan publik seperti untuk
analisis asam-asam amino, protein, asam-asam nukleat, hidrokarbon, karbohidrat, obat-
obatan, terpenoid, pestisida, antibiotik, steroid, spesi metal organik, dan berbagai
senyawaan norganik.
KCKT menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau padatan, dan bisa
dilbagi menjadi menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau padatan,
dan bisa dilbagi menjadi 4 (empat) tipe utama yaitu:
1. Kromatografi Partisi (Luntuk solut senyawa polar tetapi bukan ionik berukuran kecil)
2. Kromatografi Adsorpsi atau Kromatografi Padar-cairan (untuk pemisahan spesi non-polar,
isomer struktur,dan klasifikasi senyawa seperti pemisahan hidrokarbon alifatik dari
alkohol alifatik)
3. Kromatografi Ion (untuk spesi ionik ber-Mr rendah)
4. Kromatografi Eklusi-ukuran atau Kromatofrafi Gel (untuk solut dengan Mr > 1000) yang
bisa dipisahkan lagi menjadi filtrasi gel dan permiasi gel.

Teknik pemisahan dalam KCKT berdasarkan fasa diam dan fasa geraknya :
1. Kromatografi Partisi
Komponen sampel (linarut) dibagi antara fasa gerak cair dengan cairan yang tidak bercampur
yang dilapiskan pada suatu partikel padat sebagai fasa diam. Fasa diam dapat berupa cairan
yang disalutkan pada partikel penyangga. Komponen sampel yang terikat lebih banyak di fasa
diam akan tertahan lama dalam kolom. Bila fasa diam lebih polar daripada fasa gerak maka
disebut fasa normal (Normal phase). Dan bila fasa gerak lebih polar daripada fasa diam maka
disebut fasa terbalik (Reverse phase).

2. Kromatografi Adsorpsi
Fasa diam yang digunakan pada umumnya adalah bahan alam polar seperti partikel silika atau
alumina hidrat. Fasa gerak dan komponen sampel (linarut) berkompetisi terhadap lokasi aktif
adsorpsi pada partikel fasa diam. Komponen yang terikat lebih kuat akan bertahan lebih lama
dalam kolom. Waktu retensi bergantung pada kepolaran sampel. Retensi ini dapat diatur dengan
mengatur kepolaran fasa gerak (eluen).

3. Kromatografi Penukar Ion

Prinsip kerja berdasarkan partisi ion antara fasa gerak dan fasa diam pada lokasi penukaran.
Lokasi ion ini biasanya dimobilisasi pada butiran kecil suatu resin yang dibentuk melalui
polimer silang. Kation diipisahkan dalam resin penukar kation yang mengandung gugus fungsi
yang bermuatan negatif seperti -SO3- dan –COO-, sedangkan anion dipisahkan dalam resin
penukar anion yang bermuatan positif seperti –CH2N+(CH3)3, suatu ion amonium kuartener.
Pemisahan terjadi akibat partisi ion dalam derajat yang berbeda-beda.
a. Pelaksanaan HPLC
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.
Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan
tinggi sampai dengan 400m. Ini membuatnya lebih ceHPLC memperbolehkan penggunaan
partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana
akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-
molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari
komponen-komponen dalam campuran. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi
kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini
sangat otomatis dan sangat peka.

b. Beberapa efek utama pada KCKT

Efek Ukuran Partikel Paket. Koefisien trasfer massa, CM merupakan fungsi dari kuadrat
diameter partikel yang membentuk paket. Karena itu, efisiensi kolom meningkat sangat
nyata jika ukutan pertikel diperkecil.
Pelebaran zona Ekstra Kolom. Pada kromatografi cair, pelebaran zona yang signifikan sering
terjadi diluar paket kolom. Pelebaran zona ini disebut pelebaran zona ekstra kolom, dan terjadi
ketika fasa gerak membawa sampel pada daerah yang tidak ada fasa diam seperti pada sistem
injeksi, daerah detektor, dan sistem sambungan perpipaan. Akibatnya bagian tengan pita solute
bergerak lebih cepat dari daerah pinggiran. Padakromatografi gas, pelebaranzona ekstra kolom
menjadi kurang significan karena tertutupi oleh pelebaran zona karena difusi. Pada
kromatografi cairan, pelebaran zona kerena difusi relatilf lebih lambat sehingga bisa
diabaikan.
Efek Jumlah Sampel pada tinggi Plat. HETP (dalam mm) akan naik jika ug sample/g paking
meningkat. Peningkatan semakin nyata jika faktor kapasitas solut meningkat. Peningkatan
HETP pada kromatografi partisi relatif lebih besar dari kromatografi fasa terbalik. Perhatikan
bahwa peningkatan HETP berarti penurunan jumlah plat atau plenurunan efisiensi kolom.

c. Instrumentasi HPLC/KCKT
Instrumentasi KCKT, secara umum, dapat disimak pada skema/diagram alir
KCKT/HPLC. Perhatikan bahwa instrumentasi itu terdiri dari :
 Penampung Fasa Gerak dan Sistem Penangan Solven,
 Setem Pemompaan,
 Sistem Injeksi Sample,
 Kolom,
 Detektor

Bahan dasar peralatan kromatografi umumnya terbuat dari bahan stainless steel yang tahan
terhadap korosi asam, basa dan pelarut organik. Bahan lain yang sering digunakan adalah
polytetrafluoroethylene (PTFE), gelas dan beberapa jenis plastik.

Skema/diagram alir HPLC :

a. Skema peralatan HPLC

b. Diagram alir HPLC

d. Penampung fasa Gerak dan Sistem Penanganan Solven
Penampung fasa gerak terbuat dari gelas atau baja nirkarat dengan volume 500ml atau lebih.
Penampung fasa gerak dilengkapi dengan alat pembuang gas (terutama udara) terlarut.
Sistem pembuangan gas bisa menggunakan teknik vakum, distilasi, pemanasan dan
plengadukan,l atau pengusiran gas terlarut menggunakan aliran gas lain ylang memiliki
kelarutan sangat rendah. Silstem ini juga dilengkapi dengan sistem filter untuk menyaring
debu dan partikulat lain dari dalam solven. Teknik praktis untuk membuang ga dan partikulat
adalah dengan cara menyarilng solven melalluail sarinagn milipore dan tekni vakum.

Pemisahan yang dilakukan dengan satu jenis solven dengan campuran yang tetap disebut
elusi isokratik. Seringkali efisiensi pemisahan bisa ditingkatkan dengan penggunaan 2 atau
lebih solven dengan plerbedaan sifat kepolaran yuang signifikan secara bertahap. Teknik ini
desebut elusi gradien. Percampuran dua solven atau lebih pada teknik gradien bisa dilakukan
dengan perubahan linier atau secara eksponensial terhadap waktu.

e. Sistem Pemompaan
Pompa berfungsi untuk mendorong fasa gerak dan sampel masuk ke dalam kolom. Tekanan
pompa yang diperlukan untuk memompa fasa gerak harus cukup tinggi karena ukuran fasa
diam di dalam kolom sangat kecil.

Syarat pompa :
 Dapat memompakan fasa gerak secara konstan
 Dapat memberikan tekanan cukup tinggi
 Memberikan fluktiasi tekanan seminimal mungkin
 Memberikan noise yang rendah
 Cara kerja sederhana
 Cukup inert terhadap pelarut-pelarut yang digunakan

Sistem pemompaan solven pada KCKT memerlukan syarat-syarat sebagai berikut :

 Tekanan harus bisa mencapai 6000 psi
 Keluaran harus bebas pulsa
 Keceplatan alir antara 0,1 s.d. 10ml per menit
 Pengulangan pengaturan kecepatan alliran tidak berbeda lebih dari0,5%
 Terbuat dari bahan tahan korosi

Ada tiga tipe pompa KCKT; pompa balas (reciprocating pumps), pompa pemindah (displacement
pumps), dan pompa pneumatic pumps).

1. Pompa balas (reciprocating pumps) adalah pompa KCKT yang paling banyak
digunkan. Pompa lini memiliki ruangan kecil erisi soven yang dipompakan dengan
gerakan maju-mundur sebuah piston yang digerakkan oleh motor listrik. Aliran diatur
oleh dua buah katup bola yang bergantian membuka dan menutup. Piston bisa kontak
langsung dengan solben atau melaluli sebuah diafragma yang menerukan tekanan piston
ke solven.

Kelemahan pompa balas ini adalah aliran yang dihasikan masih berpulsa, sehingga harus
diredam menggunakan teknik pengoperasian dua buah pompa secara paralel (tetapi
berbeda fasa, maksudnya ketika pompa yang satu memompa pompa yang lain berpindah
ke posisi siap memompa) dengan pengaturan kecepatan tertentu.

Keunggulan teknik ini adalah volume internal pompa yang relatif rendah (35 – 400 uL),
tekanan kelua yang tinggi (sampai 10.000 psi), mudah diadaptasi untuk elusi gradien,
dan kecepatan aliran yang tetap (tidak dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan
solven).

2. Pompa pemindah (displacement Pumpls) biasanya terdiri dari sebuah ruanan berukuran
relatif besar dengan bentuk seperti syringe dan berisi solven. Sebuah selinder plencelup
(plunger) yang diaktifkan oleh mekanime pemutar skrup yang digerakkan oleh motor
langkah (Lstepper motor), dimasukkan ke dalam ruang solven. Akibatnya akan ada
bagian solven yang didorong (dipompa) keluar. Pompa ini juga menghasilkan aliran
llyang tidak dipengaruhi oleh viskosits dan tekanan balik, namun keluarnya bebas pulsa.
Kelemahannya adalah keterbatasan kapasitas solven (~250 mL) yang ditentukan oleh
ukuran selinder plencellupl dan penggantian solven yang relatif sulit ( karena solven
lama harus dikosongkan dan dibersihkan dari dalam poompa dan solven baru
dilmasukkan ke dalam pompa.
 f. Pompa pneuematik (pneumatic pump) palling sederhana, fasa gerak dimasukkan ke
dalam wadah elastik dan dimasukkan lagi ke dalam wadah yang bisa ditekan menggunakan
gas. Tekanan gas akan menekan wadah elastik dan sehingga solven yang ada didalamnya
akan dipompa keluar. Pompa jenis ini menghasilakann aliran bebas pulsa dan berharga
murah. Kelemahannya adalah keterbatasan kapasitas dan tekanan keluaran dan
ketergantungan plada viskositas dan tekanan balik yang dihasilkan kolom.
Umumnya sistem pompa pada KCKT dilengkapi dengan pengaturan aliran dan sistem
pemrograman terkomputerisasi. Beberapa instrumen memiliki fungsi pencampuran solven
secara berkesinambungan atau secara bertingkat sehingga bisa memvariasikan. Pada gambar
ini pencampuran eluen dilakukan oleh katup pengatur. Pada sistem yang lain tiap solven
dialirkan menggunakan satu sistem pompa. Sistem elusi seperti ini disebut dengan sistem
gradien.

g. Injeksi sampel
Sampel yang diinjeksikan ke kolom KCKT hanya dianta 0,x – 500 uL, dsan harus diinjeksikan
tanpa menurunkan tekanan kolom. Kondisi ini menyulitkan penginjeksian dalam jumlah tetap,
jika dilakukan secara manual. Cara menginjeksikan sampel yang paling banyak digunakan
adalah menggunakan sistem simpul (sampling loops).

 Perhatikan bahwa sampel diinjeksikan pada tekanan normal dalam jumlah berlebih.
Sebagian sampel akan keluar melalui ‘vent’ dan sebagian lagi tersisa di awal simpul.
 Ketika simpul disambungkan ke sistem aliran fasa gerak, tekanan sampel langsung
berubah dan jumlah sampel yang masuk ke dalam sistem adalah volume simpul ylang
tersambung ke sistem aliran.
 Sistem simpul yang umum dijumpai memungkilnkan injeksi dalam jumlah 5 – 500 uL,
tekanan mencapai 700 psi, dengan kesalahan relatif dalam permil. Sistem simpul injeksi
sampel mikro memungkilnkan injeksi samplel sebanyak 0,5 – 5 uL.
 Ingat bahwa pernyataan ini berdasarkan buku ajar tahun 1992. Dalam 10 tahun terakhir
peningkatan teknologi sudah memungkilnkan sintem ilnjeksi yang jauh lebih baik.

h. Kolom dan pelarut

 Kolom KCKT umumnya dibuat dari pipa baja nirkarat namun ada juga yg terbuat dari pipa
kaca berdinding tebal. Kolom kaca memiliki kemampuan tekanan maksimum 600 psi.
 Panjang kolom umumnya antara 10 – 30 cm dan berbentuk lurus. Jika diperlukan kolom yang
lebih panjang, beberapa kolom bisa disambung secara serial. Diameter dalam kolom
umumnlya antara 4 – 10 mm, dengan ukuran partikel 3,5 dan 10 um. Kolom KCKT yang
paling banyak digunakan adalah panjang 25 cm, diameter 4,6 mm, dengan ukuran partikel 5
um. Kolom ini memiliki 40.000 s.d. 60.000 plat per meter.

 Sudah diproduksi kolom kinerja tinggi dan kecepatan tinggi dengan ukuran lebih kecil. Kolom
jenis ini bisa memiliki samplai 100.000 plat per meter dan menggunakan eluen dalam jumlah
jauh lebih sedikit. Sebellum kolom analitik, sering dipasangkan kolom penjaga (quard
colomn) berukuran kecil yang berflungsil sebagai pemisah partikulat dan kontaminan dari
solven. Kolom lpenjaga juga berflungsi sebagai penjenuh fasa gerak dengan fasa diam. K
omposisi fasa diam di dalam kolom penjaga harus sama dengan komposisi fasa diam di dalam
kolom analitik.

 Partikel berpori dengan diameter sangat homogen ( ukuran plartikel di antara 3 – 10 um).
Partikel berpori ini kerapkali dilapiskan dengan lapisan tipis senyawan organik yang terikat
(secara fisik atau kimik) ke permukaan butiran. Ada dua perbedaan fase dalam KCKT, yang
mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.

1. Fase normal KCKT. Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang
kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai fase normal, hal
ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari KCKT. Kolom diisi dengan partikel silika
yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana
memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150
sampai 250 mm.

 Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom diperlukan. Namun

kromatogram yang berkualitas lebih baik seringkali memerlukan pengaturan templertur.
Karena itu ada KCKT yang dilengkapi dengan oven thermostat dengan templeratur yang bisa
mencapi 1500C. Pemanasan di bawah temperatur didih air bisa dilakkukan dengan
mengglulnakan mantel air yuang dialirkan dari plamanas thermostat.
 Pengepakan kolom KCKT dapat dibagi menjadi dua tipe yaitu pellicular dan partikel
berpori.
 Tipe Pellicular berupa resin penukar ion, silika atau alumina yang diendapkan membentuk
lapisan berpori di atas butiran-butiran polimer atau gelas yang tidak berpori yang berbentuk
sferis. Fase diam berikutnya (cairan) bisa diikatkan pada lapisan pertama.
  Tipe partikel berplori terdiri dari silika, alumina atau resin berbentuk akan melekat lebih
lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu,
senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

2. Fase balik KCKT. Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi
non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara
sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan
berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi
yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom.
Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang
berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu,
molekul- molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak
bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung
membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals.
Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan
pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam
molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan
menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti
bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balikKCKT
adalah bentuk yang biasa digunakan dalam KCKT.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak
mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnyaTetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap
dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya, metanol,
menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm.
Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan
panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari
pelarut.
 Berbeda dengan GC, KCKT tidak memiliki detektor yang bersifat umum dengan kehandalan
tinggi seperti FID dan TCD. Karakteristik detektor ideal untuk KCKT sama dengan
karakteristik untuk detektor ideal GC, kecuali rentang temperatur tidak perlu terlalu lebar,
tetaplli detektor KCKT harus memiliki volume internal yang rendah (untuk mengurangi
pelebaran zona).

Detektor KCKT dapat dikelompokkan ke dalam dua tipe yaitu:

1. Detektor yang berdasarkan sifat curah fasa gerak seperti fasa gerak, indeks refraksi,
konstanta dielektrik dan kerapatan,
2. Detektor yang berdasarkan sifat solute seperti serapan ultraviolet, pendaran, atau arus diffusi,
yang tidak dimiliki oleh fasa gerak.

j. Jenis-jenis Detektor pada KCKT

1. Detektor serapan
Detektor serapan yang banyak digunakan adalah sel dilalui aliran (flow through) berbentuk Z
untuk mengukur serapan eluen yang keluar dari kolom.Untuk menekan pelebaran zona,
volume sel dibatasi hanya antara 1 – 10 uL dengan panjang jalur serapan 2 s.d 10 mm. Sel
seperti memiliki batas tahan tekanan sebesar 600 psi. Cukup banyak yang berkas ganda, baik
yang dilengkapi dengan pencacah (chopper) atau dengan filter. Instrumen berkas tunggal
biasanya memiliki sistem pengingat terkomputerisasi.

Detektor serapan paling sederhana adalah detektor serapan UV dengan filter. Sumber UV
berasal dari sebuah lampu Hg dengan intensitas sinar terbanyak pada 254 nm yang diisolasi
menggunakan filter. Garis spektra pada 250, 313, 334 dan 365 nm, juga sering digunakan
dengan cara mengganti filter.

Kebanyakan KCKT menggunakan detektor serapan UV yang dilengkapi moonokromator

dengan kemampuan pemindaian (scanning). Bahkan banyak yang dilengkapi dengan cahaya
tampak. Deketror jenis ini bisa diatur dengan beberapa model seperti keseluruhan
kromatografi dibuat berdasarkan panjang gelombang tertentu, atau tiap kemunculan suatu pik
panjang gelombang yang digunkan disesuaikan dengan sifat pik bersangkutan. Lamdha yang
sesuai dapat dicari dengan cara pemindaian pik bersangkutan pada suatu analisis
pendahuluan. Untuk keperluan ini peralatan bisa diprogram melalui perangkat lunak
komputer.
Detektor sinar yang paling kuat untuk KCKT adalah diode array yaitu sekumpulan (bisa
mencapai 1024 buah) fotodiode yang disusun membentuk barisan yang menangkap spektrum
sekaligus untuk semua panjang gelombang.
Detektor serapan infra merah juga banyak yang dibuat secara komersial. Teknik yang
diterapkan, mulai dari penggunaan filter, sampai ke sistem transformasi fourier.

2. Detektor pendar
Pada deketor pendar, sinar pendaran diukur menggunakan detektor fotoelektrik yang
ditempakan pada posisi 900 terhadap sinar pengeksitasi. Detektor pendar paling sederhana
menggunakan sumber sinar pengeksitasi dari lampu Hg yang dilengkpi filter. Instrumen yang
lebih baik menggunakan sumber lampu xeon dan monokromator kisi difraksi. Detektor
pendar modern menggunkan sinar pengeksitasi dari sumber laser yang bisa diatur.

3. Detektor indeks refraksi

Detektor indek refraksi dapat digunakan hampir untuk semua solute, sehingga menjadi
detektor universal seperti halnya FID pada GC. Detekor ini tidak dipengaruhi oleh kecepatan
alir sehingga hasil ukuran dapat dipercaya. Sayangnya detektor ini tidak sensitif seperti
detektor lainnya, tetapi peka terhadap perubahan temperatur sehingga harus distabilkan pada
tingkat ketelitian sampai beberapa perseribu (0,00x) 0C.

4. Detektor
Pada detektor ini, efluen dari kolom dimasukkan ke dalam nebuliser dan diubah menjadi
kabut halus oleh aliran gas nitrogen atau uadara. Kabut halus dialirkan ke tabung yang
bertemperatur terkontrol untuk menguapkan fasa gerak sehingga dihasilkan uap analit.
Partikel uap analit kemudian dialirkan melalui jalur sinar laser. Radiasi hamburan diukur
plada sudut tegak lurus menggunakan fotodiode. Detektor ini baru dikembangkan dan
diharapkan bisa menjadi detektor umum untuk KCKT (seperti FID pada DC).

5. Detektor elektrokimia
Kelompok detekor ini berdasarkan empat metode elektroanalitik yaitu amperometri,
voltametri, kulometri dan konduktometri. Detektor berdasarkan potosiometri kurang praktis
untuk keperluan KCKT karena elektrode potensiometer memerlukan waktu adaptasi yang
relatif lama.
6. Detektor spektrometrik massa
Efluen dari KCKT tidak dimasukkan langsung ke dalam spektrometer massa karena volume
fasa gerak relatif sangat besar jika dibanddingkan dengan analit, melainkan melalui suatu
antarmuka. Pada salah satru antar muka, aliran eluen dari kolom dipecah, dan hanya sebagian
kecil saja yang diinjeksikan ke dalam spektrometer massa. Pada antar muka yang lain, efluen
dari kolom dibawa ke ruang penguapan menggunakan sitem ban berjalan. Setelah solven
diupkan, analit dimasukkan ke dalam ruang pengion dan diionkan dengan teknik desorpsi
medan.

7. Detektor spektrometerik massa

Detektor spektrometerik massa secara mutlak memerlukan sistem terkomputerisasi untuk
menyimpan dan mengolah data serta untuk mengontrol sistem kerja antarmuka dan
sepektrometer massa.

k. Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak
mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang mengontrol kondisi kolom, dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu
mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya sudah mengukur senyawa-senyawa
murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama. Mengukur kuantitas dari senyawa
yang dihasilkan dapat menggunakan puncak.
Contoh :
 Senyawa tertentu, X, jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa
murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat
merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan
jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor,
dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung
sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
 Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu
 retensi akan sama. Misalnya gambar yang dihasilkan :

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk

mengetahui berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.
Meskipun demikian, harus berhati-hati.
 Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y),
dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda
menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah
puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama
karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding
dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini
akan hanya memberikan puncak yang kecil.
2. LEMBAR KERJA

3. EVALUASI
1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan waktu retensi. dan bagaimanan cara
pengukurannya terhadap sampel yang dianalisis dengan KCKT!
2. Jelaskan perbedaan dua fase dalam KCKT, sehingga tergantung pada
polaritas relatif dari pelarut dan fase diam!
3. Jelaskan fungsi dan syara-syarat pompa pada KCKT!
4. Apa yang dimaksud dengan Pompa balas (reciprocating pumps) dan jelaskan
kelemahan dan keunggulannya!
5. Sebutkan 5 jenis ditektor KCKT
D. KEGIATAN PEMBELAJARAN 4. MELAKSANAKAN PENGUKURAN
ANALISIS

1. LEMBAR INFORMASI

a. Analisa Kualitatif pada GLC

Tujuan dari analisa kualitatif pada GLC adalah i d e n t i f i k a s i dari suatu komponen
atau lebih dari suatu cuplikan. Hal ini terutama dilakukan dengan membandingkan
dengan senyawa-senyawa referensi standard. Pada dasarnya kita dapat menyatakan
satu hal secara absolut dalam analisa kualitatif dalam GLC.

Dua senyawa tidak sama jika mereka mempunyai karakteristik GLC berbeda. Jika suatu
senyawa yang tak/belum diketahui adalah kemungkinan senyawa A, dan kemudian
meninjeksikan senyawa murni A sebagai senyawa referensi, makam akan mendapatkan
dua kemungkinan :

1. Data GLC, kebanyakan menggunakan retensi, adalah tidak sama, maka kesimpulannya :
senyawa-senyawa tersebut tidak sama.
2. Data GLC adalah sama : kedua senyawa mungkin mirip/sama, tetapi dapat berbeda
sungguh-suugguh. Sehingga keduanya tidak sama.
Jika kita ingin menguji dengan GLC bahwa dua senyawa adalah sama, maka kita
memerlukan :

a. Melakukan analisa dua kali pada dua kolom yang berbeda.

b. Dua analisa yang lain pada dua suhu yang bcrbeda.
Juga perlu untuk suatu teknik yang disebut " S p i k i n g " di mana Jika kemudian ternyata
bahwa waktu retensinya sama, maka kita dapat mengatakan bahwa dua senyawa adalah
sama. Pada dasarnya pekerjaan ini kita menambahkan cuplikan standard. Pada dasarnya
kita dapat membandingkan waktu retensi. Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan
untuk mengelusikan senyawa setelah diinjeksikan. Waktu retensi dari suatu senyawa
dapat diulang dengan hasil yang sama. Tetapi tidak terkoreksi jarang digunakan, karena
tergantung pada :

1) Panjang dan diameter kolom

2) fasa cair (jenis clan jumlah)
3) suhu kolom
4) kecepatan aliran
5) jenis dari gas pengangkut
6) "dead volume" dari peralatan.

Waktu retensi yang diatur hanya untuk pengaturan "the instrument's dead volume". Hal
inipun juga jarang digunakan untuk identifikasi.

Cara yang paling baik adalah menggunakan waktu retensi relatif. Waktu retensi ini
relatif terhadap suatu senyawa standar. Yang lebih baik digunakan adalah waktu retensi
relatif yang terkoreksi (diukur dari puncak udara) :

t’A

tA
t’X

tX

injeks
Senyawa standar Tak diketahui

A= X=

tX

hingga waktu retensi relative = 

t’X

waktu relative terkoreksi (adjusted) = 

Waktu retensi relatif (adjusted) hanya tergantung pada :

1) suhu kolom ,
2) jenis dari fasa diam.

b. Analisa Kuantitatif dalam GLC

Analisa kuantitatif dalam GLC berarti menentukan jumlah (%) dari komponen-
komponen yang terpisah dari suatu cuplikan. Hal ini didasarkan pada suatu
kenyataan bahwa pencatat menghasilkan sinyal atau puncak yang sebanding dengan
 suatu sifat dari molekul-molekul cuplikan. Pada katharometer yaitu tahanan panas,
dalam detektor ionisasi nyala yaitu ionisasi, dan dalam EC yaitu penangkapan
elektron-elektron oleh molekul- molekul cuplikan.

Respon/jawaban detektor, dibuat nyata oleh pencatat, dapat diubah menjadi

konsentrasi atau berat dari suatu komponen dari cuplikan. GLC merupakan bagian
yang paling besar digunakan dalam penentuan konsentrasi atau berat dari senyawa-
senyawa.

1. Batasan-batasan dalam Analisa Kuantitatif pada GLC

Kisaran konsentrasi adalah sangat terbatas bandingkan sebagai contoh,
pengukuran-pengukuran konsentrasi pada U.V. (hukum Lambert-Beer 0,5 <E
<1.0).
Demikian juga dalam detektor GC berada dalam jangkauan linier, hanya dalam
kisaran konsentrasi iertentu. Ini berarti, misalnya jika kita mendapatkan puncak
dengan luas 20 mm2 dari senyawa 10 pg, maka kita harus mernperoleh luasan
puncak sebesar 40 mm2 untuk 20 pg, jika kita berada dalam kisaran linier, meskipun
demikian tidak berarti bahwa 10 mg akan menghasilkan luasan puncak 20.000
mm2. Mengapa ? Kita harus mengetahui kisaran linier suatu detektor.

Kisaran linier detektor adalah perbandingan dari konsentrasi yang terbesar dengan
yang terkecil.

Detektor Kisaran linier Sensitivitas

- T.C.D. 104 6.10I°g/det

- F.I.D. 107 10'1 g/det

- E.C.D. 102 10-14 g/det

2. Respon Jawaban detektor

Jenis detektor yang berbeda akan memberikan reaksi yang berbeda terhadap
komponen-komponen dari cuplikan. Ini berarti bahwa respon dari TCD terhadap 20
mg hexan akan berbeda bila kita menggunakan FID. Juga untuk hexan sebanyak
20mg.
Tetapi ternyata juga satu jenis detektor akan memberikan respon yang bcrbcda
terhadap senyawa-senyawa yang berbeda. Sehingga TCD (atau FID atau ECD)
dapat memberikan luasan puncak yang berbeda terhadap
20 mg hexan dan 20 mg etanol. Itulah sebabnya kita harus menstandarisasi, seperti
yang akan dibicarakan kemudian. Tetapi sebelumnya kita perlu mengetahui
bagaimana cara mengukur puncak- puncak pada suatu kromatogram.

3. Pengukuran Puncak (pik)

a. Ketinggian puncak
Ini merupakan cara yang paling mudah dan cepat. Kita dengan mudah
mengukur..ketinggian dari atas suatu puncak sampai ke garis dasar. Untuk
memperoleh garis dasar kita harus menarik garis yang paling baik antara permulaan
dan akhir dari puncak.

1. Pengukuran ketinggian

Ketinggian selalu dinyatakan dalam mm. Cara ini dapat dipertanggung jawabkan
untuk cuplikan sebanyak < 10 Pg.

2. Luas puncak
Cara ini merupakan cara yang paling banyak digunakan baik dengan tangan atau
dengan mesin/secara otomatik, yang dikenal juga dengan nama integrator.

a. Tinggi x lebar pada setengah tinggi

Puncak-puncak pada kromatogram mirip seperti segi tiga. Cara
ini mendekatkan puncak (bentuk bel) sebagai segi tiga :
 w = lebar pada ½ H
Luas = H x W (dalam mm2 atau cm2 )
Dasar puncak normal tidak diberikan karena dapat terjadi deviasi yang besar pada
puncak-puncak yang tidak simetris.

b. Penimbangan
Integrator, lntegrator-integrator menghitung secara otomatis luas permukaan dari
puncak-puncak. Ada dua macam integrator yaitu :
1. Integrator piringan yang bekerja secara mekanik.
2. Integrator digital/angka elektronik merupakan integrator yang paling baik,
tetapi agak mahal. Alat ini mulai dan berhenti mengintegrasi secara otomatik,
memberikan harga-harga untuk luasan dan kadang-kadang mencatat juga waktu
retensi.

4. Faktor-fak(or Koreksi
Faktor-faktor koreksi harus ditentukan karena senyawa-senyawa yang berbeda
mempunyai respon terhadap detektor berbeda pula. Faktor- relatif, misal : terhadap
benzena atau terhadap kornponen lain dari cuplikan. Faktor yang terakhir ini
merupakan bilangan sembarang terhadap 1.0.

benzan Komponen cuplikan

pelarut
yang diukur
 Cara :
1. Timbang secara teliti campuran benzena + cuplikan (W).
2. Masukkan/injeksikan dan ukur luasan puncak (A).
3. Hitung A/W untuk puncak cuplikan dan untuk puncak bezana
4. Faktor koreksi untuk puncak cuplikan, relative untuk bezana

Sejauh kertas pencatat mempunyai homogenitas yang tinggi sehingga berat dari suatu
puncak sesuai dengan berat dari komponen cuplikan. Kita dengan mudah
menggunting puncak-puncak

A/W (cuplikan)
=
A/W (benzena)

Untuk cuplikan dan detektor yang spesifik faktor-faktor koreksi berikut ini selalu
dapat digunakan.

Contoh :
untuk FID senyawa faktor koreksi
benzena 1.00
anilin 0.46
asam asetat etanol 0.24
0.75

5. Standardisasi
Disebabkan respon-respon yang berbeda dari detektor tertentu terhadap senyawa-
senyawa organik, maka harus menggunakan senyawa standar. Dengan standar dapat
menghitung faktor-faktor koreksi. Persyaratan terhadap standar adalah :
1. sangat murni
2. inert
3. bercampur dengan cuplikan
4. tidak mudah menguap
5. stabil.

Dua cara standardisasi yang biasanya digunakan :

a. Standardisasi eksternal
b. Internal,
 a. Standardisasi eksternal

Standarisasi eksternal jumlah yang pasti dari cuplikan murni diinjeksikan. Harga-harga
dari luasan puncak kemudian digambarkan lawan berat-berat senyawa yang diketahui
dan diinjeksikan.

Luas
puncak

Berat cuplikan

Dalam praktek kita mengerjakan sebagai berikut :

1. Buat larutan 10 % dari cuplikan A
2. Buat dari larutan ini : larutan-larutan 5 : 1 : 0,5 : 0,1%.
3. Injeksikan larutan tersebut , hitung luasan-luasan puncak
4. Buat kurva kalibrasi

catatan : Perhatikan kelinieran dari sistem GLC untuk larutan-larutan tersebut. lni
berarti bahwa :
area/luas
= konstan (c); untuk semua larutan
Konsentrasi

Konsentrasi dari cuplikan A yang tidak diketahui, sekarang dapat ditentukan dari
kurva kalibrasi, atau dari perumusan
Ketidak keuntungan dari cara ini adalah
1. Jumlah yang tepat dari cuplikan harus diinjeksikan
2. Penginjeksian yang dapat hasil-ulang (reproducible)
3. Kalibrasi adalah waktu yang diperlukan.
4. Sensitifitas detector harus tetap konstan

b. Standardisasi internal
Cara ini mempunyai keuntungan utama yaitu tidak memerlukan volume yang
diketahui untuk diinjeksikan. Sehingga tidak membutuhkan penginjeksian yang dapat
diulang
Cara standardisasi internal memberikan persentase berat yang sangat tepat terhadap
komponen-kornponen cuplikan. Caranya adalah sebagai berikut : Cara ini tidak
sensitif relatif terhadap perubahan-perubahan dalam sistem kromatografi (aliran,
kolom, detektor). Standar internal yang dipilih harus mempunyai syarat :
a. kira-kira sifat kimia yang sama seperti cuplikan,
b. kira-kira waktu retensi yang sama seperti senyawa cuplikan, waktu retensi tidak
tepat sama (tidak bersamaan dengan suatu komponen dari cuplikan).
c. Waktu retensi tidak sama (tidak bersamaan dengandengan suatu komponen dari
cuplikan)

Cara standarisasi internal memberikan prosentase berat yang sangat tepat terhadap
komponen-komponen cuplikan. Caranya adalah :
1. Tambahkan pada cuplikan dengan berat yang tepat sejumlah standar internal,
juga berat yang tepat dengan konsentrasi kira sama (biasanya 10%).
2. Tentukan faktor-faktor koreksi dalam suatu analisa yang terpisah, untuk semua
komponen cuplikan yang diukur.
3. Persen berat dari setiap komponen cuplikan dapat dihitung dengan :

luas senyawa x berat standar int. x 100

% berat =
faktor koreksi x luas standar int. x Berat cuplikan
6. Kesalahan-kesalahan dalam Analisa Kuantitatif
Kemungkinan kesalahan-kesalahan pada analisa GLC dapat timbul dari :
I. Cara penyiapan cuplikan
a. Penginjeksian yang baik adalah merupakan "seni" yang harus
dipelajari.
b. Cuplikan dapat berubah dalam GLC : hilangnya komponen yang dihasilkan
dalam analisa kuantitatif yang jelek.
2. Penampilan detektor
Detektor-dctektor menjadi kotor atau pengaturannya yang tidak baik
3. Penampilan : Pencatat harus berada dalam kisaran linier (zero-set)
4. Cara kuantitatif
5. Penghitungan
Dari 1 - 4 telah banyak kita bicarakan, sekarang kita akan meninjau kesalahan-
kesalahan yang disebabkan oleh penghitungan. Didalam penghitungan GLC kita
sering bekerja dengan :
pengukuran-pengukuran yang ditambahkan
Harga rata-rata (X) :
jumlah total pengukuran

Deviasi standar : σ =

Deviasi standar menunjukkan pengukuran-pengukuran yang lebih baik

daripada penghitungan rata-rata.
Deviasi standar relatif didefinisikan sebagai :

σ
σ rel = x 100%
X

7. Analisis Berdasarkan Tinggi Pik

Tinggi pik kromatografi dapat diperoleh dengan menghubungkan garis dasar
(base line) di kedua sisi pik dengan satu garis lurus dan mengukur jarak garis
ini ke puncak pik, pengukuran ini bisa dilakukan dengan tingkat presisi yang
cukup tinggi. Perlu diperha tikan bahwa tinggi pik dipengaruhi oleh pelebaran
zona, yaitu tinggi pik berbanding terbalik dengan lebar pik. Pengukuran
 berdasarkan tinggi pik hanya bisa dilakukan jika lebar pik standar dengan
lebar pik sampel relatif sama. Untu memperoleh kondisi ini yang perlu diatur
adalah temperatur kolom, kecepatan alir fasa gerak dan rentang injeksi sampel.
Jumlah sampel yang diinjeksikan tidak melampaui batas maksimal (tidak
overload).

2. LEMBAR KERJA

Peserta dibagi menjadi 3 kelompok, setiap kelompok mendiskusikan tugas

dibawah ini :

1. Diskusikan dengan teman Anda apa yang akan terjadi jika dalam analisis
dengan GLC jumlah sampel yang diinjeksikan melampaui batas maksimal
(tidak overload).
2. Tinggi pik kromatografi dapat diperoleh dengan menghubungkan garis dasar
(base line) di kedua sisi pik dengan satu garis lurus dan mengukur jarak garis
ini ke puncak pik, pengukuran ini bisa dilakukan dengan tingkat presisi yang
cukup tinggi. Gambarkan dengan kromatogram, sehingga luas pik dapat
dihitung dengan cara menghitung luas segitiga yang terbentuk dari alas pik
dan puncak pik.
3. Kromatografi gas telah digunakan secara berhasil terhadap sejumlah besar
senyawa-senyawa dalam berbagai bidang. Dan digunakan baik terhadap senyawa-
senyawa organik dan anorganik. Jelaskan beberapa contoh kegunaan kromatografi
gas pada bidang-bidang yang besar ruang lingkupnya.
4. Diskusi kelompok diberi waktu 20 menit, dan setiap kelompok mempresentasikan
hasilnya selama 10 menit.

3. EVALUASI
1. Jelaskan tujuan dari analisa kualitatif pada GLC!
2. Kemungkinan-kemungkinan apa saja yang dapat menimbul kankesalahan pada
analisa dengan GLC!
3. Jelaskan cara standardisasi internal dapat memberikan persentase berat yang sangat
tepat terhadap komponen-kornponen cuplikan!
4. Jelaskan syarat-syarat standarisasi internal yang dipilih dalam sistem kromatografi
(aliran, kolom, detektor)!
E. KEGIATAN PEMBELAJARAN 5. MELAKSANAKAN PERHITUNGAN ANALISIS
1. LEMBAR INFORMASI

a. Dasar kerja Kolom GLC

Meskipun teori GLC agak sukar namun demikian dasar kerjanya sangat mudah.
Pemisahan komponen-komponen dari cuplikan terjadi di antara gas pengangkut dan fasa
cair. Berikut adalah apa yang terjadi yang dinyatakan dalam skala waktu.
Cuplikan yang dimasukkan mengandung komponen A+B+C

A
Waktu nol B
C

B A
2 menit C A terpisah dari B
dan C

4 menit C B A Sekarang A,B

dan C terpisah

Bagaimana pemisahan ini dapat terjadi ?

Kenyataan proses GLC adalah mirip dengan ekstraksi. Proses pemisahan dapat
dipandang sebagai serangkaian dari partisi di mana cuplikan masuk ke dalam larutan
dari fasa dan selang beberapa waktu akan teruapkan lagi.

Molekul
cuplikan
● *▪

● ▪
Fasa bergerak
Fasa cair

Padatan pendukung
Molekul-molekul yang
teruapkan

Molekul cuplikan dalam fasa

cair
Jadi fasa cair menahan molekul-molekul cuplikan. Gerakan dilakukan oleh fasa
bergerak. Afinitas cuplikan terhadap fasa cair menentukan berapa lama cuplikan
dItahan. Senyawa-senyawa yang mempunyai afinitas rendah (tidak suka) terhadap
fasa diam akan keluar dari kolom pertama. Sedangkan senyawa-senyawa dengan
afinitas besar (larut dengan baik) terhadap fasa diam akan keluar dari kolom
berikutnya.
Afinitas ini didasarkan pada kelarutan dari cuplikan terhadap fasa diam:
2. Fasa diam melarutkan cuplikan.
3. Semua molekul cuplikan bergerak dengan kecepatan absolut yang sama melalui
kolom, yaitu sesuai dengan kecepatan gas pengangkut.
4. Kecepatan relatif dari molekul-molekul cuplikan adalah berbeda,
disebabkan afinitas yang berbeda.
Jika kita masukkan senyawa tunggal ke dalam GLC, maka senyawa tersebut akan
teruapkan dan terlarut (tercampur) dalam gas pengangkut. Jika senyawa ini masuk ke
dalam kolom, ia akan ditarik oleh fasa cair (stasioner). Kemudian, akan dipartisikan
sesuai dengan hukum NERNST.
Hukum NERNST menyatakan :
konsentrasi senyawa dalam fasa diam
K=
konsentrasi senyawa dalam fasa bergerak

Harga K tergantung pada :

1. Volatilitas kemudahan menguap dari senyawa.
2. Afinitas dari cuplikan terhadap fasa diam.
Keterangan :
1. Volatilitas terutama tergantung pada titik didih dari senyawa.
2. Afinitas didasarkan pada interaksi antara cupCkan senyawa dengan fasa diam.

Interaksi-interaksi tersebut merupakan gaya molekular. Gaya yang kita kenal

adalah :
a. Gaya van der Waals = gaya dispersi (non polar).
b. Ikatan hidrogen = gaya Keesom (merupakan interaksi antara dua dipol yang
permanen).
c. Interaksi dipol terinduksi (gaya Debye), merupakan hasil interaksi antara dipol
 permanen dengan dipole terinduksi.
d. Gaya interaksi spesifik, seperti ikatan kimia atau pembentukan komplek

Ikatan hidrogen (b) merupakan gaya yang penting dalam GLC, sedangkan
(d) hampir tidak terdapat pada GLC, tetapi penting terutama dalam kromatografi
penukar ion.
Jika harga k tetap pada kisaran konsentrasi yang besar, maka kita akan mendapatkan :
LINEAR GLC.
Kondisi untuk GLC linier yang ideal diperoleh jika :
1. Kesetirnbangan dicapai sangat cepat pada setiap saat.
2. Molekul-molekul cuplikan hanya bergerak oleh gaya dari gas
3. Pengangkut; sehingga tidak ada difusi.
4. Pengisian dari kolom harus sama/uniform (setiap bagian mengandung jumlah
sama fasa diam clan fasa bergerak).

Dalam hal cuplikan mengandung lebih dari satu senyawa, maka setiap senyawa akan
mempunyai harga k sendiri-sendiri. Sebagai contoh, bayangkan suatu cuplikan
mengandung molekul-molekul A, B, C, dan D, maka kita akan memperoleh 4 harga
K, : kA, kB, kC, dan kD.
Kecepatan di mana molekul-molekul tersebut bergerak melalui kolom sama dengan
hasil kali kecepatan gas clan bagian dari waktu dalam mana komponen-komponen
tersebut dalam fasa gas. Bayangkan kromatogram berikut :

Senyawa dalam fasa cair

Senyawa bergerak dalam masa
ini

Senyawa bergerak Senyawa tetap

Udara (N2) mempunyai titik didih yang sangat rendah, tidak ditahan oleh fasa cair.
tR = waktu aatam mana senyawa tetap tinggal.
tR - f' R = waktu dalam mana senyawa bergerak.
 Di dalam GLC kita akan banyak bee-bicara tentang dalam mana cuplikan ditahan
oleh kolom; ini disebut pe,7ahanan (the retention time) = tR. Kromatogram gas dari
GLC linier yang ideal untuk hasil analisa empat senyawa A, B, C, dan D akan
memberikan gambaran seperti berikut :
hingga ia

A C
B

waktu
D

waktu

Kita selalu mempunyai G1.C linier yang tidak ideal, karena kolom yang ideal tidak
terdapat. Kalau kita lihat pada kromatogram gas normal, tidak ada puncak-puncak
kecil, tetapi berupa bentuk-bentuk kurva, yang disebut kurva- kurva Gauss, (pelebaran
puncak), atau bila keadaannya lebih jelek akan menghasilkan puncak-puncak berekor
atau pemanjangan di muka.
Hal ini disebabkan adanya :
1. Difusi eddy (olakan) : difusi ini disebabkan oleh kenyataan bahwa kecepatan gas
pengangkut tidak sama di dalam seluruh kolom. Ini disebabkan oleh kenyataan
bahwa bagian-bagian dari pori yang dilalui tidak sama panjang :"MULTIPATH -
EFFECT" (pengaruh jalan berganda).

2. Difusi molekuler : terutama dalam fasa gas, molekul-molekul cuplikan dapat

bergerak dalam arah yang salah yang disebabkan oleh difusi.
3. Kesetimbangan yang lambat : beberapa molekul tetap tinggal lama, lainnya
sebentar dalam fasa diam (hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan-perbedaan
suhu yang kecil).
4. Harga k tidak tetap : ini disebabkan perbedaan rasio distribusi dalam kolom.

Keempat faktor ini menyebabkan perbedaan puncak. Faktor- Faktor 1,2,3 menyebabkan
faktor puncak yang simetris. Faktor 4 menyebabkan pelebaran puncak yang tidak
simetris.
Pelebaran-pelebaran puncak terjadi dalam berbagai cara/metoda analisa (misal dalam
spektroskopi). Dalam keadaan yang paling buruk dapat menyebabkan puncak-puncak
saling tindih.
Kita mendifinisikan pemisahan R (resolution), sebagai pemisahan nyata
antara dua puncak berdekatan :

R= 2d dalam hal dua puncak dengan luas sama.

WI+W2
Jika R = 1 pemisahan adalah 98%.
Untuk pemisahan yang baik R harus : R > 1,5, ini berarti pemisahan > 99,7%a.

Pemisahan dari puncak-puncak dalam Kromatografi erat hubungannya dengan dua

faktor:

1. Ejfisiensi kolom : pelebaran puncak merupakan hasil dari bentuk kolom dan
kondisi operasi.
2. Effisiensi pelarut : hasil dari interaksi antara cuplikan dengan fasa diam,
effisiensi pelarut menentukan kedudukan relatif dari jalur- jalur solute
pada sebuah kromatogram

a. Effisiensi Kolom
Effisiensi kolom diukur sebagai jumlah pelat teoritis : N. Kita berbicara
tentang "The height equivalent to a theoretical plate, the HETP" (ketinggian
ekuivalen terhadap pelat teoritis) dan didefinisikan sebagai :

L
HETP =
N

N = jum(ah pelat teoritis dari suatu kolom L =

 panjang (cm) dari kolom tersebu.
Effisiensi kolom tergantung pada :
 pelarut = fasa diam
 solute/zat yang dilarutkan = cuplikan
 suhu
 kecepatan aliran (dari gas pengangkut)
 ukuran dari cuplikan.

Banyak faktor yang mempengaruhi N (atau HETP). Tetapi secara kuantitatif teori
yang menyatakan efek-efek tersebut adalah sangat sukar. Kita akan membicarakan
dua teori :
A. Teori pelat
B. Teori kelajuan/kecepatan.

b. Teori Pelat
Konsep tentang pelat adalah imaginasi : suatu kolom GLC tidak memiliki
pelat-pelat, tetapi merupakan penggambaran dari partikel-- partikel (bentuk
bulatan) yang tertarik/terikat fasa cair seperti halnya dalam GLC. Dasar teori
pelat adalah dari distribusi.
Pelat, atau lebih baik HETP, adalah tinggi (atau panjang) dari kolom yang
cukup untuk tercapainya kesetimbangan antara solute dalam fasa gas
bergerak dan fasa cair yang tetap. Lebih banyak pelat yang dimiliki oleh
kolom, akan memberikan puncak yang lebih kecil, atau efisiensi kolom lebih
baik.

Contoh : Pelat teoritis N.

Efisiensi kolom naik jika jumlah pe lat teoritis lebih.
Dari tabel berikut kita dapat melihat harga dari kromatografi gas sebagai alat analisa :
Ettsiensi Panjang Jumlah
umumnya pelat
Vigreux 2,5/ft 2 ft 5
Spinning band 75 /ft 2 ft 150
Kolom GLC 500 /ft 6 ft 3.000
Kapiler gelas GLC 200 /ft 150 ft 30.000
Pelat teoritis berhubungan dengan pelebaran puncak pada kromatogram.
Sehingga mudah menghitung jumlah pelat, N dari kromatogram.

di mana :
x = jarak dari injeksi ke puncak maksimum.
y = panjang dari garis dasar yang terpotong oleh tangen-tangen dari kurva pada
titik-titik pertemuan (biasanya 2/3 dari tinggi).
perumusan yang disederhanakan ini berasal dari hasil teori pelat :
xN = x 2 , dimana σ = deviasi standar dari a

a= ∑(x-x)
n-1

hingga N = x , = x2 (n-1)
∑ (x-x) 2 ∑ (x-x) 2
n-1

dimana ∑ x = harga rata-rata perhitungan dari x

n = jumlah yang terhitung
W = 2.30 q dimana W = lebar puncak pada I/2 H
Bila W = 2,36 disubstitusikan dalam memberikan N = X2
2,36 X O2
N=( 2
) = 5,57 ( )2
W W

Perumusan ini lebih teliti untuk menghitung N daripada perumusan :

X X
N = 16 ( )2; ini berasal : N=( )2
y W
dimana y = 4 σ

Dari kromatogram kita kemudip.n dapat menghitung HETP dengan rumus :

L σ2
HETP = = L
N X2

(L selalu spesifik untuk suatu kolom).Jumlah pelat teoritis tiap meter dari panjang kolom
disebut :" Performance" dari kolom.

c. Teori kelajuan dan percepatan

Teori kelajuan telah dikembangkan oleh seorang Belanda Van Deemter,
persamaan yang diturunkannya disebut : Persamaan Van Deemter.

Bentuk persamaan tersebut adalah :

HEPT=A+B/µ + C.µ

Persamaan ini memberikan jawaban bagaimana untuk meningkatkan peranan

kolom Kromatografi.

µ adalah kecepatan linier gas (atau kelajuan ali ran) melalui kolom; µ
diukur dengan :
panjang kolom (dalam cm)
µ=
waktu penahanan udara (dalam detik)

Besaran-besaran A, B. dan C penyebab utama terjadinya pelebaran puncak : (A). Difusi

olakan (the eddy diffusion) = (efek jalan ganda)
 Penggambaran perbedaan panjang jalan dalam suatu kotom. (B). Difusi

molekuler; pendefusian solute dalam gas pengangkut.

gas
pengangkut Fasa cair

kolom
Defuse molekul solute

(C). Penahanan terhadap perpindahan massa

Ini adalah ukuran dari jumlah atau kekentalan dari fasa diam (cair) di dalam kolom GLC.
Jika harga-harga A, B, dan C tertentu, maka kita dapat melihat persamaan dasar van
Deemter harus terdapat kecepatan kelajuan gas pengangkut optimum, di mana kita akan
bekerja pada keadaan tersebut.
Katakanlah dengan HETP minimum :

HETP = A + B/µ + C.µ

HETP Min = A+ 2B.C

Besaran-besaran yang tepat A, B, dan C dapat ditentukan dari penurunan persamaan van
Deemter. Namun hanya akan meringkas secara praktis agar supaya meningkatkan
efisiensi kolom.
1. Padatan pendukung harus terbuat dari partikel-partikel yang kecil, ukurannya sama;
biasanya dari tanah diatomea yang mempunyai ukuran 100 - 120 mesh.
2. Kecepatan alir gas pengangkut adalah optimum pada HETP minimum.
3. Gas pengangkut dengan berat molekul besar, biasanya N2, untuk analisa yang cepat
dapat digunakan He atau H2
4. Fasa diam yang digiznakan harus mempunyai kekentalan rendah.
5. Banyaknya/jumlah fasa diam yang dipakai biasanya 1 -10% dari berat padatan
pendukung.
6. Perbandingan antara gas pengangkut yang masuk dan yang keluar harus rendah;
tekanan yang masuk 1,5 - 2,5 atm.

7. Pemisahan akan lebih baik pada suhu kolom yang rendah tetapi dengan demikian
waktu analisa menjadi lama.
8. Diameter kolom yang kecil memberikan pemisahan lebih baik (I/8" atau 1/16
inch).
Delapan aturan tersebut akan menaikkan efisiensi kolom, sehingga puncak- puncak
yang terjadi akan sekecil mungkin. Tetapi masih mempunyai dasar lain untuk
menaikkan pemisahan dalam GLC.

d. Efisiensi Pelarut
Suatu hal yang penting dari GLC, bahwa GLC dapat memisahkan senyawa - senyawa
dengan tekanan uap yang sama, yaitu yang mempunyai titik didih yang sama. Pekerjaan
tersebut tak mungkin dilakukan dengan distilasi.

Hal ini dirnungkinkan oleh kenyataan bahwa GLC memiliki fasa cair, yaitu pelarut (fasa
diam). Seperti telah kita ketahui, pelarut mempunyai interaksi yang spesifik dengan
cuplikan. Gaya-gaya ini rnenentukan kelarutan hingga dengan demikian pemisahan dapat
terjadi. Pemisahan tergantung pada harga-harga koefisien partisi K.
Efisien pelarut didefinisikan sebagai : perbandingan dari koefisien-koefisien partisi, atau
waktu-waktu retensi yang teratur.

x, , x = waktu retensi (volume) dari puncak 1, 2.

x,, x, = waktu retensi terkorelasi atau diatur dari puncak 1, 2.
 x2 k2
Efisiensi pelarut, a = =
x 1’ k1
x2
Kita juga mendefinisikan : Faktor Pemisahan, SF=
x2

Koefisien distribusi (= partisi), k, tergantung pada suhu. Harga k turun dengan kenaikan
suhu, karena molekul-molekul akan lebih lama berada dalam fasa gas pada suhu yang
lebih tinggi.
k2
Karena efisiensi pelarut, α = , α tetap pada kisaran suhu tertentu.
k1

Meskipun demikian, pada suhu-suhu yang relatif tinggi, harga k menjadi sangat kecil,
hingga pemisahan akan menurun, karena pemisahan hanya terjadi dalam fasa cair. Dan
pada harga-harga k kecil, kebanyakan molekul- molekul solute berada dalam fasa gas.
Sehingga untuk mencapai pemisahan- pemisahan GLC yang lebih baik suhu-suhu yang
lebih rendah harus digunakan.
Waktu minimum yang dihabiskan dalam fasa cair rata-rata 50% dari waktu retensi. Ini
berarti bahwa tR adalah lebih dari dua kali harga dari waktu retensi udara. Hingga
kromatogram yang baik mempunyai bentuk seperti ini :

injeksi Puncak
Daerah kromotogram untuk
Udara pemisahan puncak yang baik

Disini tidak ada

Sekarang kita mendefinisikan faktor kapasitas untuk suatu pemisahan :

waktu retensi terkoreksi x2
K2’=
waktu retensi udara
 X2 ’
x

injeksi
Puncak

Dari perumusan berikut kita akan dapat menghitung pelat teoritis yang dibutuhkan, jadi
panjang yang dibutuhkan untuk pemisahan yang baik, adalah menghitung jumlah suatu
kolom, yang baik :
α K2’ + 1
N yang dibutuhkan = 16 R2 ( )2 = ( )2
α-n K2’

R = pemisahan (resolution)
α = efisiensi pelarut.

e. Suhu Kolom
Suhu kolom merupakan hal yang penting dalam pemisahan-pemisahan GLC. Tetapi
suhu kolom tidak dapat dipilih. Koefisien partisi, k, sangat tergantung pada suhu.
Sebagai aturan umum dapat dinyatakan sebagai berikut : Kenaikan sebesar 30o C dalam
suhu kolom akan menurunkan setengah harga k, jadi menurunkan juga setengah dari
waktu retensi, hingga suhu-suhu kolom yang lebih tinggi akan menurunkan waktu
analisa. Tetapi, biasanya pemisahan dapat ditingkatkan dengan penurunan suhu kolom.
Ini berarti harus ada suhu kolom optimum dalarn analisa GLC.
Pada umumnya ada aturan yaitu : Suhu kolom yang paling baik adalah harga rata-rata
dari titik didih dari cuplikan. Tentu saja hal inipun masih tergantung pada persentase dari
fasa cair pada padatan pendukung. Jumlah yang tinggi dari fasa cair akan memerlukan
suhu kolom yang lebih tinggi.
Dalam menentukan suhu kolom harus memperhatikan suhu maksimum yang
diperbolehkan dari fasa cair yang digunakan, terjadi"colum bleeding" (= penguapan dari
fasa diam). Meskipun demikian setiap suhu yang digunakan harus di atas titik lebur dari
senyawa atau cuplikan.

GLC berkembang sangat cepat, saat sekarang telah ada beberapa ratus fasa diam.
Karena banyaknya jenis fasa diam sering kesukaran dalam memilih fasa cair yang
dipersyaratkan untuk pemisahan.
f. Pemilihan yang tepat fasa diam untuk GLC
Pendugaan secara kuantitatif terhadap waktu retensi tetap merupakan persoalan yang
sangat sukar dalam teori GLC. Di dalam praktek tidak membutuhkan pendugaan
tersebut, karena dalam kebanyakan analisa GLC bekerja dengan senyawa-senyawa yang
tidak diketahui.
Untuk pemisahan dengan GLC terhadap senyawa-senyawa organik bekerja dengan
kaidah/aturan yang agak sederhana : "like dissolves like" (Latin Similia similibus
solventur). Keadaan ini sesuai dengan aturan dalam pemilihan pelarut untuk sejenis
senyawa organik yang tertentu.
Dalam GLC hal ini terutama didasarkan pada cuplikan larutan dalam fasa cair. Dimana
polaritas dari komponen cuplikan dan fasa diam harus sama untuk memperoleh
pemisahan GLC yang baik. Sehingga senyawa polar akan terpisah dengan baik pada
fasa cair yang polar dan senyawa-senyawa yang non-polar akan terpisah dengan baik
pada fasa cair non-polar.
Berikut kita bagi fasa diam menjadi tiga kelompok :
1. Non polar
2. Semi polar (antara I dan 3)
3. Polar.

1. Fasa cair non polar

a. Fasa cair non polar yang terkenal adalah : APIEZON. Apiezon merupakan suatu
campuran dari alkana-alkana dengan titik didih yang sangat tinggi; CnH2n+2, di mana
n sangat besar.
b. Juga sangat dikenal : Squalane. Ini adalah hidrokarbon : hexametil tetrakosaan,
C3pH62,
c. Juga banyak digunakan karet silikon yang disebut : SE - 30; yang merupakan
polimer.
Pada umumnya fasa -fasa cair non polar memisahkan kumponen - komponen
cuplikan sesuai dengan titik didihnya.

2. Fasa cair semi polar

Fasa cair semi polar terdiri dari rantai non polar yang terikat pada gugus-gugus
polar atau dapat menjadi polar, yang sering digunakan adalah ester-ester dari
asam ftalat dan alkulrol-alkohol tinggi; misal dionilftalat.
 O Kerangka non polar yang
‫װ‬
-
C O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 -
CH3

C-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
‫װ‬
O
Gugus yang dapat terpolarisasi

Fasa cair yang dikenal dengan nama dagang ; SAE -52, merupakan
polimer dengan silikon dengan struktur :

Fasa semi polar ini ternyata mempunyai kemiripan dengan fasa -fasa non polar, yang
memisahkan senyawa-senyawa polar dan non polar sesuai dengan berat molekul, jadi
sesuai juga dengan titik didihnya.

Campuran dari senyawa-senyawa polar dan non polar juga terpisahkan sesuai
dengan berat molekulnya. Hingga jika titik didih senyawa tersebut sama, maka
senyawa yang polar akan mempunyai waktu retensi yang paling rendah/pendek.
Ini disebabkan dengan ti tik didih yang sama, senyawa yang polar akan
mempunyai berat molekul yang paling rendah.

2. Fasa Cair Polar

Fasa-fasa cair polar mengandung gugus-gugus polar. Fasa cair polar yang
terkenal adalah polieter. Carbowax termasuk dalam golongan ini. Carbowax
mempunyai struktur sebagai berikut :

R R
Ι Ι
H O - CH - CH 2 -(0- CH - CH 2 )n - OH

Jenis Carbowax tergantung pada harga dari n (= derajad polimerisasi) dan gugus
R, misal : Carbowax 20 M. Poliester juga termasuk dalam golongan fasa-fasa cair
polar. Sering digunakan ester -ester dari asam- asam di karboksilat alifatik atau
aromatik.dan etilen glikol.

Fasa-fasa cair polar dapat mempunyai sifat baik sebagai penerima (acceptors)
maupun pemberi (donor) ikat an hidrogen. Sehingga fasa cair tersebut dapat
memisahkan campuran senyawa -senyawa polar dan non polar dalam suatu
cuplikan yaitu dengan menahan komponen - komponen polar.

Pembagian fasa cair Berdasarkan Ikatan Hidrogen

Pengertian ikatan hidrogen : Misal R - O - H, dapat memberi, tetapi juga dapat

menerima ikatan hidrogen.

Penerima pemberi

Atom-atom penerima biasanya :O, N, F.

Atom-atom pemberi adalah H aktif

Senyawa-senyawa yang paling polar dapat menerima dan memberi ikatan-ikatan

hidrogen. Sedangkan senyawa organik yang kurang polar (= non polar) tidak
dapat menerima maupun memberi ikatan hidrotren.

Dengan cara ini kita akan membagi/mengklasifikasikan solute sebagai berikut :

Klas 1 (sangat polar) Klas 2 (Polar)

Scnyawa-senyawa yang Solute mengandung baik atom
sangat polar, dapat penerima dan atom H aktif
membentuk ikatan hydrogen
- air -alkohol-alkohol
- glikol, gliserol, dsb -asam-asam lemak
- amino alkohol -fenol-fenol
- asam-asam hidroksi -amino primer dan sekunder
-poli penol -oksim
-Asam-asam di basa -senyawa-senyawa nitro dengan atom- atom H
–a
-nitrit-nitrit dengan atom-atom H-a
-NH3, HF NZH4, HCN
 Klas 3 (Polaritas medium) Klas 4 (Polaritas rendah)
Seyawa-senyawa ini hat?ya Senyawa-senyawa ini hanya mengan- dung
mengandung atom-atom atom H aktif, tidak memiliki atom penerima.
penerima tetapi atom H aktif.

- eter - CHCL3, CH2, CL2

- keton - CH3 CHCL2, CH2CI CH2CI
- aldehida - CH2CI CH2CI2, dsb.
- amina tersier - hidrokarbon aromatik
-senyawa-senyawa nitro yang lain.
- hidrokarbon olefin
- nitrit-nitrit yang lain
Klas 5 (non Polar)
Senyawa-senyawa ini tidak dapat
membentuk ikatan hidrogen
- hidrokarbon-hidrokarbon jenuh
- CS2
- merkaptan
-senyawa-senyawa
halokarbonyang lain (CCl4)

Fasa-fasa cair juga dikelompokkan/dibagi menjadi beberapa klas, dalam hai ini
menjadi 4 klas, jika didasarkan atas polaritas; akan membentuk ikatan - ikatan
hidrogen. Pada umumnya urutan berikut untuk menyatakan ikatan H yang diterima
menurun :

O R
R-O-R R-C RC C=O R-CN R-NO 2
OR R

Klas A (Untuk klas 1) Klas B (Untuk klas 2)

 FFAP  Tetrasianoetil penta hidtrol

 20M-TPA  Zonyl E-7
 Veons  Ethofat
 Versamid 900  β.β oksidipropiontil
 Hall comid  XE - 60
 Quadrol  XF - 1150
 Theed  Sianoetil sukrosa
 Mannitol  Amine 220
 Castorwax  Epon 1001
 Digliseroi  Sioneotil sukrosa
 Klas C (Untuk klas 3) Klas D (Untuk klas 4, 5)

 semua polyester  SE - 30
 Dimetil sulfolan  SF - 96
 Dibutil tetra kloroftolat  DC - 200
 SAIB  DOQ - 11
 Trieresil fosfat  Squalane
 STAP  Hexadecane
 Densil sianida  Apikson
 H exan  V-1
 Propiler Karbonat
 Q F-1
 Poligenil eter
 OV-17

Berikut adalah tabel "campuran" klas yang perlu diketahui. tabel inipun didasarkan
pada "like dissolves like" :

Interaksi fasa cair-solute Pengaruh pada retensi

3 -- C Sistem ideal : solut terpisah

4-D sesuai dengan titik didih
5–C
4-C Solute ditahan dengan baik oleh
dasa cair.Fasa fasa Cair
spesifik
1,2,3- A,B (dalam semua Biasanya solute ditahan oleh
gabungan) fasa cair
2-D 4,5-A Solute tidak ditahan oleh fasa cair :
Kelarutannya sangat kecil

Ada tiga contoh yang akan dikemukakan di sini :

1). Kompleksperaknitrat
Ion-ion perak membentuk hasil addisi yang dapat balik dengan olefin - olefin. Hingga
dengan demikian senyawa-senyawa olefin dalam cuplikan dapat ditahan secara selektif.

2). Padatan pendukung dari kolom GLC dapat ditambah den -Ran KOH. Dengan
cara ini penyerapan dapat terjadi. Misal, pemisahan terhadap O, M dan p toluidin.

CH3 I
3). Fasa diam yang sedang dikembangkan adalah : Durapak.

Di sini padatan pendukung terikat secara kimia pada fasa cair. Struktur dari
Durapak adalah sebagai berikut :

Biasanya solute ditahan oleh fasa cair.

Solute tidak ditahan oleh fasa cair : Kelarutannya sangat kecil

padatan pendukung

Dalam hal ini "Colum-bleeding" tidak mungkin terjadi.

b. Suhu Tempat Injeksi

Ada tiga macam suhu yang penting untuk pemisahan yang baik dalam kromatografi
gas/GLC/GC, yaitu :

a). Suhu Tempat Injeksi

Yang disimpulkan sebagai berikut :

1. Harus cukup tinggi untuk menguapkan cuplikan.

2. iasanya = 50°C lebih tinggi daripada titik didih dari komponen dari cuplikan. Harus
dicoba hingga diperoleh bentuk puncak yang paling baik.
3. Tidak terlalu tinggi, sebab kalau terlalu tinggi akibatnya kemungkinan terjadinya
perubahan oleh panas atau peruraian dari molekul-molekul.
b). Suhu kolom

1. Dalam semua hal di atas titik lebur dari fasa cair, tetapi di bawah suhu
maksimum yang diperbolehkan dari fasa cair.

2. Dalam praktek suhu kolom berdasarkan atas kompromi, Suhu-suhu yang rendah
memberikan pemisahan lebih baik, ictapi waktu retcnsi Iebih panjang. Kompromi :
kira-kira sama dengan rata-rata dari titik didih dari cuplikan.

3. Waktu retensi mcnjadi lipat dua untuk sctiap 30°C penurunan suhu kolom.
c). Suhu detektor

Cukup tinggi untuk mencegah kondensasi dari cuplikan. Keadaan ini dapat dilihat pada
kromatogram dengan adanya pelebaran puncak atau hilangnya puncak.

- Dengan TCD, suhu detektor harus tetap dijaga, tetap : ± 0,1 °C.

- Untuk FID pengontrolan suhu tidak begitu penting.

Suhu yang diprogram

Suhu kolom dalam GLC dapat dibuat tetap atau dapat divariasi/diprogram. Yang
terakhir disebut kromatografi gas dengan suhu yang diprogram (Programmed
Temperature Gas Chromatography = PTGC).

Pada pemisahan-pemisahan dengan GLC dengan suhu yang tetap (isothermal), hanya
dapat memisahkan komponen-komponen dari cuplikan dengan perbedaan titik didih
maksimum kira-kira 100°C. Akibatnya waktu- waktu retensi sangat tinggi untuk
komponen-komponen yang memiliki titik didih yang paling tinggi. Lebih lanjut
bentuk puncak yang diperoleh menjadi jelek.

Pada kromatografi gas dengan suhu yang diprogram kita dapat bekerja mula- mula
dengan suhu kolom rendah dan kemudian secara otomatis suhu dinaikkan. Bila
digambarkan mempunyai bentuk seperti :

Catatan :

Suatu campuran dengan titik didih tinggi akan membeku dalam kolom pada suhu
permulaan yang rendah, sehingga tidak boleh memasukkan/menginjeksikan cuplikan.
Alternatif rnengubah senyawa tersebut menjadi turunannya yang mempunyai titik didih
yang rendah.
2. LEMBAR KERJA

3. EVALUASI

1. Jelaskan hal-hal apa saja yang dapat menyebabkan pada kromatogram gas normal,
tidak ada puncak-puncak kecil, tetapi berupa bentuk-bentuk kurva, yang disebut
kurva-kurva Gauss, (pelebaran puncak), atau bila keadaannya lebih jelek akan
menghasilkan puncak-puncak berekor atau pemanjangan di muka!
2. Jelaskan apa yang dimaksud dengan "like, dissolves like" pada GLC!
3. Jelaskan 4 kondisi untuk GLC linier yang ideal!
4. Jelaskan apa yang dimaksud dengan effisiensi kolom yang diukur sebagai
jumlah pelat teoritis : N. atau "The height equivalent to a theoretical plate, the
HETP" (ketinggian ekuivalen terhadap pelat teoritis)!

5. Polaritas dari komponen cuplikan dan fasa diam harus sama untuk memperoleh
pemisahan GLC yang baik, jelaskan pembagian fasa diam tersebut berdasarkan
tingkat kepolaran!
6. Sebutkan 3 jenis fasa cair non polar yang anda ketahui!
7. jelaskan pembagian fasa cair berdasarkan Ikatan Hidrogen!
8. Sebutkan tiga macam suhu yang penting untuk pemisahan yang baik dalam
kromatografi gas/GLC/GC!
 DAFTAR PUSTAKA

1. McNair & E.J.Bonelli, 1988, Dasar Kromatografi Gas, Penerbit ITB Bandung
2. Skoog, Doughlas, A and James J Leary, 1992, Principles of Instrumental Analysis,
Saunders College Publishing, New York.
3. Mulya Suryadarma, dkk. 2004, Pengembangan Metode Analisis, Airlangga Press,
Surabaya.