Media Ilmiah Teknologi Pangan ©2014, PS Ilmu dan Teknologi Pangan

Vol. 1, No. 1, 24 – 30, 2014 Prog. Pasca Sarjana, Univ. Udayana

Identifikasi Transgene pada Tanaman Padi (oryza sativa var.

koshihikari) yang Ditransformasi dengan Bantuan Agrobacterium
tumefaciens, Menggunakan Metode Tanpa Teknik Kultur Jaringan.
Transgene Identification in Rice (oryza sativa var. koshihikari) which Transformed
Using Agrobacterium tumefaciens without Tissue Culture Technic.

I Putu Suparthana1＊, Masahiro Nogawa2 dan Mineo Kojima2

Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Udayana1
dan Department of Applied Biology, Faculty of Textile Science and Technology, Shinshu
University, 3-15-1 Tokida, Ueda, Nagano 386-8567, Japan2.

Diterima 15 Agustus 2014 / Disetujui 22 Agustus 2014

ABSTRAK
Metode transformasi tanaman dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens biasa
dilakukan dengan melibatkan teknik kultur jaringan, akan tetapi teknik kultur
jaringan memiliki beberapa kelemahan yaitu memerlukan suatu kondisi steril,
memakan banyak waktu, sering terjadi mutasi dalam proses kultur in vitro dan
sejumlah tanaman bersifat rekalsitran pada tahap regenerasi. Disisi lain metode baru
(in planta transformation system) yang dikembangkan dalam penelitian ini mampu
mengatasi kelemahan-kelemahan tersebut. Penelitian dilakukan pada tanaman padi
dengan bantuan A. tumefaciens sebagai inokulum namun tidak melibatkan teknik
kultur jaringan pada masa regenerasinya. Biji padi (Oryza sativa L. var. Koshihikari)
direndam dalam air selama 2 hari, dengan demikian embrionya yang mengandung
sel apikal meristem dapat diinokulasi dengan cara menusukkan jarum yang telah
dicelupkan dalam inokulum. Biji padi yang telah diinokulasi selanjutnya
ditumbuhkan dilapangan selayaknya pembenihan biasa tanpa perlakuan steril. Untuk
menentukan keberhasilan teknik ini, dua jenis strain mutan A. tumefaciens (M-21
dan LBA4404) digunakan dalam transformasi. Mutan M-21 mengandung Tn5
tersisip dalam gen iaaM dan mutan LBA4404 membawa binari plasmid vektor.
Transgen dari mutan M-21 dapat diidentifikasi dari perubahan fenotipe pada
tanaman padi transgenik sedangkan dari mutan LBA4404 dapat diidentifikasi
dengan uji histokimia dan ketahanan terhadap antibitik (hygromycin B).

Kata kunci: in planta transformation, A. tumefaciens, transformation method

*Korespondensi Penulis:
Email: [email protected]

24
Suparthana dkk.. Media Teknologi Pangan

PENDAHULUAN metode ini, pertama-tama A. tumefaciens

diinokulasi pada jaringan tanaman yang
Agrobacterium-mediated transfor mengandung sel-sel embrio yang sedang
mation adalah suatu metode pengubahan aktif membelah, seperti misalnya kalus,
genetik (transformasi genetik) pada yang dilakukan di dalam sistem kultur
tanaman yang dilakukan dengan jaringan. Selanjutnya, A. tumefaciens
menggunakan bantuan dari dihilangkan dengan menggunakan
Agrobacterium tumefaciens. Metode ini antibiotik dan sel-sel embrio yang telah
telah berkembang menjadi sebuah metode ditransformasi diseleksi dengan
baku dan diterapkan di laboratorium- menggunakan media yang sesuai. Pada
laboratorium di seluruh dunia. A. tahap akhir embrio yang mulai tumbuh
tumefaciens pada habitat aslinya menjadi tanaman baru diregenerasi
merupakan bakteri penyebab penyakit dengan berbagai medium yang sesuai.
tumor crown gall pada tanaman dikotil. A. Walaupun Agrobacterium-mediated
tumefaciens secara alami memiliki transformation di dalam sistem kultur
kemampuan mengubah susunan genetik jaringan telah digunakan secara luas oleh
inangnya dengan cara memindahkan para peneliti, namun metode ini memiliki
(transfer) suatu materi genetik dari beberapa kelemahan yaitu memerlukan
plasmidnya ke dalam genom tanaman suatu kondisi steril, memakan banyak
inangnya. Rekayasa genetik yang waktu, sering terjadi mutasi dalam proses
dilakukan pada plasmid A. tumefaciens kultur in vitro dan sejumlah tanaman
tetap dapat ditransfer ke dalam genom dan bersifat rekalsitran pada tahap regenerasi.
dapat diekspresi di dalam sel tanaman Disisi lain, berbeda halnya dengan
inangnya. Penemuan inilah yang transformasi tanaman di dalam sistem
kemudian mengantarkan bioteknologi kultur jaringan, suatu metode transformasi
tanaman berkembang dengan pesat dan tanaman yang tidak menggunakan kultur
diaplikasi oleh peneliti-peneliti di seluruh jaringan (in planta transformation system)
dunia. dapat mengatasi kelemahan-kelemahan
Diawal tahun 1990an Hiei (1994) yang disebutkan diatas. In planta
melakukan suatu terobasan besar dengan transformation system tidak menggunakan
keberhasilannya melakukan transformasi kultur in vitro, yang menjadi keunggulan
genetik pada tanaman padi dengan dari metode ini.
bantuan A. tumefaciens. Sejak itu Sejauh ini transformasi pada tanaman
kemudian Agrobacterium-mediated padi dengan bantuan A. tumefaciens
transformation pada tanaman padi menggunakan sistem in planta baru
menjadi sebuah metode yang rutin pertama kali dilakukan dalam penelitian
dilakukan di berbagai laboratorium di ini dan penelitian sejenis belum pernah
seluruh dunia. Metode ini pada dasarnya dilaporkan oleh peneliti lain.
sama dengan metode yang telah umum
dilakukan pada tanaman dikotil. Pada

25
Vol.1, No.1, 2014 Identifikasi Transgen pada in planta transformation system

Pada penelitian ini apical meristem pada cara memutasi A. tumefaciens virulen
biji padi yang telah direndam beberapa A208 menggunakan transposon 5 (Tn5).
hari diinokulasi dengan A. tumefaciens, Tn5 menyisipi gen yang terlibat dalam
selanjutnya ditumbuhkan selayaknya biosintesa IAA yaitu gen tryptophan
menanam padi di lapangan. Agar dapat monooxygenase (iaaM) yang terdapat di
diverifikasi terjadinya transformasi dalam T-DNA region pada Ti-plasmid.
genetik pada tanaman padi tersebut, kami Strain ini menjadi avirulen karena gagal
menggunakan strain A. tumefaciens. M-21 mengintegrasikan T-DNA nya ke dalam
dan LBA4404. Strain M-21 adalah strain genom sel inang.
mutan yang bersifat avirulen karena Gen Strain LBA4404 mengandung plasmid
iaaM yang terlibat dalam biosintesa binary pIG121-Hm yang dikonstruksi oleh
indoleacetic acid (IAA) termutasi oleh Ohta et.al. Di dalam plasmid binary ini
penyisipan Tn5, sementara gen-gen terkandung gen ketahanan terhadap
lainnya pada T-DNA region termasuk gen kanamycin (nptII), gen ketahanan
yang terlibat dalam sintesa sitokinin (ipt) terhadap hygromycin (hpt) dan gen ß-
masih tetap utuh. Adapun konsekuensi glucuronidase (GUS) yang diekspresi di
penggunaan strain M-21 adalah dalam sel tanaman inang.
dihasilkannya tanaman padi yang Transformasi
memproduksi lebih banyak sitokinin Strain-strain A. tumefaciens
sehingga menampakkan perubahan ditumbuhkan pada media LB mengandung
fenotip yang cukup dramatis yang antibiotika kanamycin (50 µg/ml) dan
disebabkan oleh ketidakseimbangan rifampicin (10 µg/ml) untuk M-21, dan
hormon dalam sel tanaman tersebut. Ini streptomycin (50 µg/ml), kanamycin (50
merupakan indikasi yang diharapkan µg/ml) dan rifampicin (10 µg/ml) untuk
sebagai petunjuk keberhasilan metode LBA4404 pada suhu 28oC selama 2 hari.
transformasi dengan in planta Bakteri ini diambil dengan menggunakan
transformation system. Sementara itu loop dan disuspensi dalam air steril
pada strain LBA4404 terkandung plasmid dengan kepekatan 1,0 x 109 sel /ml.
binary yaitu pIG121-Hm yang dapat Biji padi disterilisasi dengan
diditeksi dengan system histokimia dan menggunakan ethanol dan sodium
seleksi ketahanan terhadap hygromycin B hypochlorite lalu direndam dalam air
karena dalam plasmid ini terdapat gen steril selama 2 hari pada suhu 20oC. Air
GUS (ß-glucuronidase) dan gen ketahanan diganti sekali selama proses perendaman.
terhadap hygromycin B. Setelah 2 hari perendaman, bagian embrio
akan berubah menjadi putih. A.
BAHAN DAN METODE tumefaciens diinokulasikan ke dalam
embrio dengan menusukkan jarum steril
Strain A. tumefaciens dan binary vector (kedalaman 1-1,5 mm) yang telah
A.tumefaciens yang digunakan dalam dicelupkan ke dalam inokulum A. tumefa-
penelitian ini adalah strain mutan M-21
dan LBA4404. Strain M-21 dibuat dengan

26
Suparthana dkk.. Media Teknologi Pangan

ciens. Biji padi yang telah diinokulasi Ekspresi gen GUS dalam sel tanaman
diletakkan diatas kertas saring di dalam padi diuji dengan metode yang kenalkan
cawan petri (dibungkus alumunium foil) oleh Kapila et.al. Seluruh bagian tanaman
yang telah diisi tanah steril. Biji padi yang berumur 4 hari di rendam dalam
didalam cawan petri ini selanjutnya larutan pewarnaan histokimia.
diinkubasi dalam ruang tertutup pada suhu
23oC selama 9 hari. Pada masa inkubasi HASIL DAN PEMBAHASAN
ini 70-75% biji padi akan berkecambah
yang selanjutnya kecambah-kecambah Transformasi menggunakan A.
padi tersebut di rendam dalam larutan tumefaciens strain mutan M-21.
mengandung cefotaxime (1000 ppm) Tanaman transgenik yang
selama 1 jam pada suhu ruang. Pada ditransformasi dengan A. tumefaciens
bagian akhir, kecambah-kecambah padi strain mutan M-21 diharapkan dapat
ini kemudian ditanam dalam pot menunjukkan adanya suatu perubahan
selayaknya menanam padi di lapangan. fenotipe yang disebabkan oleh
Tanaman padi transgenik ini ditumbuhkan ketidakseimbangan produksi hormon
dan dirawat seperti biasa hingga pertumbuhan di dalam selnya. Dengan
didapatkan biji-biji padi sebagai T1 nya. dasar pertimbangan tersebut dalam
Untuk tanaman kontrol, saat inokulasi biji penelitian ini pertama-tama kami
padi, jarum hanya dicelupkan pada air mentransformasi tanaman padi dengan
steril sebelum ditusukkan pada bagian menggunakan A. tumefaciens strain mutan
embrionya. M-21 dan menentukan apakah terjadi
perubahan fenotipe pada tanaman
Penentuan Resistensi Terhadap transgenik dan apakah perubahan ini
Hygromycin pada Tanaman Padi dibawa pada keturunan T1 nya. Hasil
Transgenik penelitian menunjukkan bahwa tanaman
Kecambah tanaman padi dibersihkan transgenik (T0) yang ditransformasi
kulitnya lalu disterilisasi dengan ethanol dengan A. tumefaciens strain mutan M-21
dan sodium hypocloride (1%). Bibit menampakkan adanya perubahan fenotipe
tanaman padi ini kemudian dibilas tiga sebagaimanan ditunjukkan pada gambar 1,
kali dengan air lalu ditumbuhkan pada panel A.
kondisi steril dalam air (kedalaman 2-3 Tanaman transgenik mempunyai
mm) mengandung hygromycin B ketinggian melebihi tanaman kontrolnya.
o
(20µg/ml) pada suhu 28 C selama 16 jam Perubahan fenotipe yang ditunjukkan oleh
dengan sinar dan 8 jam tanpa sinar. tanaman transgenik (T0) ini belum dapat
Ketahanan terhadap hygromycin B dinilai dipastikan apakah memang benar
setelah 6 hari kemudian. disebabkan oleh adanya
ketidakseimbangan hormon di dalam
Uji Histokimia Aktifitas ß- selnya. Akan tetapi yang dapat dipastikan
glucuronidase (GUS)

27
Vol.1, No.1, 2014 Identifikasi Transgen pada in planta transformation system

A B

Kontrol (T0) Transgenik (T0) Kontrol (T1) Transgenik (T1)

Gambar 1. Panel A adalah tanaman transgenik (T0) yang menunjukkan perubahan fenotipe
(tinggi tanaman) yang dihasilkan dari transformasi in planta menggunakan strain M-21.
Panel B, perubahan fenotipe tanaman transgenik diwariskan pada turunannya (T1).

adalah perubahan fenotipe ini dapat transformasi dengan strain ini. Sebanyak
diwariskan pada keturunannya (T1) 30 biji tanaman padi (T1) yang dihasilkan
sebagaimana ditunjukkan pada gambar 1, dari tanaman transgenik induk (T0) dipilih
panel B. Adanya pewarisan sifat berupa secara acak untuk dianalisa dengan
perubahan fenotipe (tinggi tanaman) dari metode pewarnaan histokimia. Sementara
tanaman padi transgenik T0 diturunkan itu sebagai pembanding, sebanyak 30 biji
pada tanaman padi transgenik T1 padi (T1) yang dihasilkan dari tanaman
menunjukkan suatu indikasi keberhasilan yang ditransformasi dengan air dianalisa
transformasi yang dilakukan dengan dengan metode yang sama. Gambar 2,
metode transformasi tanaman yang tidak panel A menunjukkan bahwa dari 30 biji
menggunakan kultur jaringan (in planta tanaman padi yang dites, 13 diantaranya
transformation system). bereaksi positif terhadap uji gen GUS.
Sementara itu seluruh biji tanaman padi
Transformasi menggunakan A. hasil transformasi menggunakan air
tumefaciens strain LBA4404 yang berekasi negatif terhadap uji gen GUS
mengandung binari plasmid pIG121- (Gambar 2, panel B).
Hm. Ketahanan tanaman padi transgenik
Binari plasmid vektor pIG121-Hm terhadap hygromycin di uji dengan cara
mengandung gen GUS yang disisipi intron perkecambhan biji padi pada media air
dan gen ketahanan terhadap hygromycin yang mengandung hygromycin B (20
di dalam T-DNAnya sehingga pengujian ppm). Dari 17 biji padi (T1) yang berasal
dengan metode pewarnaan secara dari induk (T0) tanaman padi transgenik
histokimia dan ketahanan terhadap yang dikecambahkan pada media air yang
hygromycin dapat dilakukan terhadap mengandung hygromycin B, 12
tanaman transgenik yang dihasilkan dari diantaranya dapat berkecambah dengan

28
Suparthana dkk.. Media Teknologi Pangan

Panel A, transgenik Panel B, kontrol Panel A, transgenik Panel B, kontrol

1 3

2 4

Gambar 2. Panel A, expresi transgen (GUS)

Gambar 3. Panel A, biji padi transgenik
dapat dideteksi dengan uji histokimia pada
(T1).tetap mampu berkecambah pada media
perkecambahan tanaman transgenik (T1).
mengandung hygromycin B (1), sebagaiman
Panel B, expresi transgen berupa gen GUS
perkecambahan pada media air (2). Panel B,
tidak ditemukan pada perkecambahan
biji padi kontrol (T1).sangat terganggu
tanaman kontrol (T1).
perkecambahannya pada media
mengandung hygromycin B (3), sementara
baik (Gambar 3, panel A-1), sebagaimana pada media air dapat berkecambah dengan
biji padi transgenik yang dikecambahkan baik (4).
pada media air (.Gambar 3, panel A-2).
Sementara itu 15 biji padi (T1) yang berasal memiliki ketahanan terhadap antibiotik
dari induk (T0) tanaman kontrol tidak dapat hygromycin B sehingga dapat
berkecambah dengan baik pada media air berkecambah dengan baik pada media air
yang mengandung hygromycin B (Gambar 3, mengandung hygromycin B.
panel B-3), sedangkan 16 biji padi (T1) Efisiensi metode transformasi yang
lainnya yang dikecambahkan pada media air dikembangkan dalam penelitian ini
tanpa antibiotik dapat tumbuh dengan baik mencapai 43% pada analisis transgen (gen
(Gambar 3, panel B-4). GUS) dengan uji histokimia. Nilai
Dari keseluruhan hasil yang diperoleh efisiensi ini tampak jauh lebih besar
dari penelitian ini, empat jenis pembuktian dibandingkan hasil-hasil penelitian yang
dapat memverifikasi keberhasilan metode telah dilaporkan oleh Hiei et.al., 1997;
transformasi yang dikembangkan dalam Park et.al., 1996 dan Cheng et.al., 2004
penelitian ini. Pertama, transformasi yang menggunakan metode in vitro.
menggunakan strain M-21 dapat Walaupun demikian kenyataan ini cukup
menghasilkan tanaman transgenik yang beralasan mengingat A. tumefaciens di
mengalami perubahan fenotipe berupa tinggi alam adalah bakteri patogen yang dapat
tanaman. Kedua, perubahan fenotipe ini menimbulkan penyakit tumor melalui
dapat diwariskan pada keturunannya (T1). kemampuannya mentransfer materi
Ketiga, transgene berupa gen GUS dapat genetik kedalam genom tanaman inangnya
dideteksi dengan metode histokimia pada yang tidak lain adalah merupakan proses
perkecambahan biji padi transgenik (T1). trasformasi secara alami. Ketika A.
Keempat, biji padi transgenik (T1) tumefaciens strain A208 yang merupakan

29
Vol.1, No.1, 2014 Identifikasi Transgen pada in planta transformation system

induk dari mutan M-21 yang digunakan

dalam penelitian ini, diinokulasikan pada KESIMPULAN
daun tanaman cocor bebek (Kalanchoe
daigremontiana) yang ditanam dalam pot Kami telah mentransformasi tanaman
dengan cara menggoreskan tusuk gigi padi melalui bijinya dengan metode in
yang telah dilumuri inokulum pada planta sebagaimana dilaporkan dalam
permukaan daunnya, gall tumor dapat hasil penelitian ini dan telah pula
terbentuk (100%) pada luka-luka bekas melakukan beberapa kali pengulangan.
goresan tersebut setelah 6 minggu Hasil yang kami dapat dari seluruh
(Majumder et.al., 2001). Efisiensi infeksi ualangan tersebut adalah sama seperti
semacam ini, dalam hal ini adalah hasil dalam laporan (artikel) ini. Hal ini
transformasi, pada tanaman yang menunjukkan keberhasilan in planta
diinokulasi mungkin dipengaruhi oleh transformation sistem yang dikembangkan
sejumlah faktor seperti auxin, sitokinin dalam penelitian ini.
dan sejumlah faktor lain yang belum
dapat diidentifikasi, yang dibutuhkan DAFTAR PUSTAKA
untuk pembentukan gall pada waktu yang
tepat, konsentrasi yang optimal dan Hiei, Y., Ohta, S., Komari. T. and Kumashiro
kombinasi yang tepat. Hal lainnya adalah T. (1994). Efficient transformation of rice
sel-sel atau jaringan dari tanaman utuh (Oryza sativa L.) mediated by
yang digunakan dalam in planta Agrobacterium and sequence analysis of
the boundaries of the T-DNA. Plant J., 6,
transformation system tentunya memiliki
271-282.
ketahan yang cukup kuat terhadap
Majumder, P., Shioiri, H., Nozue, M. and
patogen dan stres, kapasitas diferensiasi, Kojima, M. (2001). Isolation and
regenerasi dan lainnya yang cukup tinggi characterization of a new virulence gene
dibandingkan sel-sel atau jaringan sel (abvA) of Agrobacterium tumefaciens. J.
yang digunakan pada sistem kultur Gen. Plant Phathol., 67, 124-133.
jaringan. Infeksi A. tumefaciens pada Cheng, M., Lowe, B. A. Spencer, T. M., Ye,
tanaman utuh menyerupai metode X. and Armstrong, C. L. (2004): Factors
transformasi yang dikembangkan dalam influencing Agrobacterium-mediated
penelitian ini; kami menginokulasi A. transformation of monocotyledonous
tumefaciens pada biji yang telah direndam species. In vitro Cell Dev. Biol. - Plant 40,
31- 45.
selama 2 hari, kemudian
Kapila, J., Ryke, R. D., Montagu, M, V. and
menumbuhkannya dalam pot tanpa
Angenon, G. (1977). An Agrobacterium-
perlakuan steril selayaknya mediated transient gene expression system
menumbuhkan tanaman biasanya. Oleh for intact leaves. Plant Science. 122, 101-
karena itu in planta transformation system 108.
yang dikembangkan dalam penelitian ini
menyerupai proses infeksi yang dilakukan
A. tumefaciens secara alami. Hal inilah
yang mendukung tingginya efisiensi
transformasi yang dikembangkan dalam
penelitian ini.

30