ANATOMIA PATOLOGICA, LEZIONE 1 22/10/2018

Come prima lezione, partiamo da una definizione base, capire come funziona un laboratorio di anatomia
patologica, cosa si fa. In questo istituto, così come in altri istituti di anatomia patologica, arrivano tutti i
campioni bioptici e operatori, tutto ciò che deve ricevere una diagnosi. Prima di iniziare ad analizzare ad
esempio una biopsia del colon, il campione passa prima per l’accettazione, se è una persona esterna, si
paga prima un ticket, le persone addette all’accettazione verificano la perfetta corrispondenza tra i dati del
campione messi sulla provetta e quelli della scheda anagrafica di accompagnamento e solo dopo aver
verificato la congruità della cosa, viene assegnato un numero di protocollo. Successivamente parte l’iter
che seguirà il campione istologico. Come arriviamo dalla biopsia al vetrino: si passa dall’esame
macroscopico alla fissazione del campionamento, poi c’è la processazione e inclusione in paraffina,
l’allestimento dei vetrini che prevede taglio e colorazione e infine l’osservazione microscopica che
ovviamente porta alla diagnosi finale. Come abbiamo già detto, arrivano sia campioni operatori che
campioni bioptici. Cosa si intende per biopsia tissutale: è un prelievo di tessuto finalizzato all’allestimento
del preparato istologico (vetrino) su cui è necessaria fare la diagnosi. La diagnosi serve per sapere che cosa
ha il pz e alla fine solo la diagnosi istologica ovvero quella del vetrino è quella definitiva perché si va a
guardare in diretta il tessuto del pz, solo il patologo può sapere effettivamente cosa c’è. A monte di tutto, la
diagnosi del patologo, senza i dati del collega, non ha alcun senso, devono essere integrate in un quadro
clinico, anamnestico e strumentale coerente, se arriva una biopsia del duodeno e il patologo vede una
neoplasia strana e poi scopre che il campione era di un bambino di tre anni il cui campione è stato fatto
analizzare per sospetta celiachia, il patologo si deve fermare perché ci può essere stato uno scambio, un
errore. Questo per far capire che, sebbene il dato del vetrino sia quello definitivo, scaturisce dall’
integrazione degli altri dati mandati dai colleghi. Spesso quando al microscopio c’è il sospetto di una
diagnosi che non era prevista, si chiama il collega e ci si ragiona assieme. I tipi di biopsia che arrivano sono:
1) incisionale: si asporta un’incisione, è semplicemente una parte della lesione perché evidentemente non
si ha idea di che tipo di lesione sia e serve solo una parte di essa per capirne la natura;
2) escissionale: si porta via la totalità della lesione e ciò ha finalità sia diagnostica cioè voglio sapere la
natura di ciò che ho tolto, sia perché era una lesione che andava tolta a prescindere, tutto ciò che viene
tolto ad un pz va ad essere analizzato dal patologo, non esiste che una lesione non venga analizzata, anche
solo per una sicurezza in più;
3) ago-biopsia: è una biopsia sotto guida strumentale fatta attraverso un ago-cavo;
4)biopsia endoscopica: fatta su organi cavi con l’utilizzo dell’endoscopio (es. colon, cervice ecc)e il pezzo
operatorio ;
5) biopsia liquida: è un tipo di biopsia particolare che ha avuto uno sviluppo negli ultimi anni; consiste
nell’usare un liquido biologico, generalmente il sangue, che contiene DNA tumorale circolante che deve
essere sottoposto all’analisi molecolare per la ricerca di alterazioni genomiche (di ciò se ne occupa la
citopatologia).

CAMPIONE OPERATORIO: prima di arrivare al microscopio, c’è la fase macroscopica nella sala macro del
campionamento, tutto ciò che si registra all’ atto del campionamento è fondamentale perché dopo viene
analizzato al vetrino e perché ci sono degli aspetti che sono tipici di determinate lesioni e con l’analisi
macro possono essere già di un primo aiuto per l’analisi microscopica. Quando trattano di piccole biopsie,
c’è poco da descrivere, non è che si riesca a vedere qualcosa, però si deve riportare il numero dei
frammenti, per esempio biopsia incisionale costituita da 4 frammenti il maggiore di 03, nel caso delle ago-
biopsie si è soliti riportare tutto il numero dei fustoli ricevuti in modo che ci sia una perfetta corrispondenza,
il chirurgo sa che sono stati mandati tre fustoli di carcinoma mammario, se se ne ritrovano tre, c’è la
sicurezza che si sta guardando ciò che è stato mandato, se se ne ritrovano uno, c’è un problema. Alcune
cose sono intuitive perché sono classicamente legate ad un determinato tipo di diagnosi. In generale, di un
campione, si deve indicare il peso, la milza ad esempio viene pesata perché è un organo che in caso di
processi neoplastici o altro, va incontro ad una netta variazione di peso, si indicano inoltre la forma, le
dimensioni, tutto quello che viene in mente, tutti i sensi che si possono applicare tranne ovviamente il
gusto, ad esempio la vista, si deve notare il colore della lesione. In presenza di lesioni fuocali, è necessario
riportare il numero, la dimensione, il colore, già in sala macro è importante, ad esempio per una neoplasia
della mammella, è importante dire macroscopicamente quanto è lontana dal margine. I segmenti ossei alla
Federico II non ne arrivano molti, sono una patologia difficile, ad esempio un amenoblastoma che è una
lesione intraossea della mandibola, va sottoposta a trattamento decalcificante; mentre i campioni
normalmente a fresco o quelli che vengono già in formalina, i segmenti ossei devono andare a trattamento
decalcificante altrimenti quell’osso non lo si taglierà mai. Quindi, se arriva una mammella a fresco, prima si
descrive, poi si mette a fissare; il giorno dopo viene ripresa, si riverifica che la descrizione sia corretta
perché è fondamentale per il suo proseguimento e poi si decide dove direzionare il prelievo. Di solito,
organo per organo, patologia per patologia si hanno dei protocolli standard se il sospetto diagnostico
sembra essere uno standard, ci sono lesioni o campioni assurdi che sono difficili e non si sa come gestirli, in
quel caso si va a scaglioni, si chiede aiuto ai più esperti. Per una mammella classica, con un carcinoma
mammario classico, e risaputo che si devono fare i prelievi rappresentativi del tumore, i prelievi
rappresentativi del margine del parenchima mammario circostante per dimostrare che la lesione è
semplicemente quella descritta e non ci siano dei focus aldilà della neoplasia che la fanno diventare una
neoplasia multifuocale, rilievo dei margini, se ci sono i linfonodi, si prelevano anche quelli. Il numero dei
prelievi varia a seconda di ciò che si fa e si vede. Quando arriva il campione e dopo averlo descritto, prima
di fare i prelievi di sopra, si mette il campione a fissare.

FISSAZIONE: è quel processo mediante il quale si riesce ad arrestare i processi autolitici che normalmente
avvengono in tessuti privi di irrorazione sanguigna. E’ un passaggio fondamentale perché, per qualunque
cosa successiva alla fissazione, una volta che metto il campione in partenza, se non ho fatto un’adeguata
fissazione, è un processo intaccato dall’ inizio, avrò problemi di lettura all’ematolissilina, è un problema se
voglio chiedere un campione dell’immuno, sarà un campione alterato. Il tempo utile per una buona
fissazione varia a seconda dei tessuti da fissare, vista la diversa resistenza e i diversi processi trasformativi
in rapporto alla struttura, alla ricchezza degli enzimi, in rapporto anche alla quantità di sangue. Ci sono dei
tessuti che si portano come esempio di massima resistenza e di minima. Massima resistenza è l’osso che
addirittura dopo una prima fissazione si fa un processo a parte di decalcificazione con dei decalcificanti
come l’acido nitrico diluito al 5/10%; la cute anche ha molto resistenza. Tessuti come il nervoso, le biopsie
del gastroenterico, del colon vanno invece incontro a fissazione molto facilmente. Il rapporto di solito è
1:20, è quello standard che si usa per qualunque tessuto, è il rapporto minimo ed ottimale affinchè quel
tessuto venga fissato. Esistono fissativi chimici e fissativi fisici: i chimici sono costituiti dalla formalina che è
cancerogena per cui si usano in sala macro una serie di protezioni per usarla come le cappe aspiranti, le
mascherine ecc. E’ una formalina diluita al 10%, tamponata con un ph di 7, è un fissativo non coagulante,
non dissolve i lipidi, ha un elevato grado di penetrazione e stabilisce la formazione di punti aldeci tra le
proteine dei tessuti fissandoli nella posizione originale, fa una riebolazione. La cattiva fissazione, può essere
intesa sia in senso di ipo che di iper fissazione, anche una fissazione eccessiva non è buona. C’è un massimo
di 12 ore di fissazione, il campione viene tolto dalla formalina la mattina dopo averlo immerso, poi viene
sempre conservato in formalina ma verosimilmente non ce n’è più bisogno. La fissazione prolungata può
interferire negativamente creando dei legami aspecifici tra proteine di natura diversa che vanno a
interferire con l’interazione antigene-anticorpo che serve per l’immunoistochimica. I fissativi fisici sono
rappresentati da calore, essiccamento, raffreddamento e congelamento. Calore ed essiccamento vanno
applicate strisce di sangue in apposizione a midollo osseo, raffreddamento e congelamento vengono fatte
in particolare all’esame estemporaneo dove c’è la necessità di dare una prima risposta che si da nel giro di
10 min, alla quale seguirà poi quella definitiva, per cui non c’è il tempo per mettere il campione tutta la
notte in formalina, è il caso di un pz in intraoperatoria, detta anche estemporanea, cioè il pz è sul letto
operatorio. Mediante un criostato cioè un processo di raffreddamento immediato, si crea quel blocchetto
in paraffina con il congelamento. Dopodiché, parte la cosiddetta processazione.

PROCESSAZIONE: arriva il campione, viene descritto, si fa la fissazione, la mattina dopo si prende, si fa il

campionamento precedentemente detto e il ricavato, cioè i prelievi che si ritengono rappresentativi di quel
processo, di quel campione, va messo in delle biocassette. Successivamente questi prelievi messi nelle
biocassette, vanno alla fase di processazione. Questa fase ha la finalità di sostituire l’acqua con la paraffina
usando passaggi intermedi, viene svolta ormai automaticamente da dei dispositivi , la disidratazione
avviene usando una scala crescente di etanolo, si passa dal 70% al 100%. Perché è necessario fare ciò, la
motivazione è che il tessuto che è stato campionato nella formalina ecc, è ancora impregnato d’acqua, si
deve togliere l’acqua perché se non viene sostituita dall’alcool, la paraffina, che è quella che nel passaggio
successivo permette la formazione del blocchetto duro che può essere tagliato per essere studiato al
microscopio, non riuscirebbe a penetrare all’interno del tessuto con la presenza di acqua. La
diafanizzazione si ottiene sostituendo l’alcool con la paraffina. L’ultima fase è rappresentata dalla
permeazione cioè lo stazionamento del tessuto in paraffina liquida alla temperatura di 56°. Dopo la
processazione quindi, c’è l’inclusione di paraffina.

L’INCLUSIONE DI PARAFFINA: è fondamentale, è l’inclusione di un mezzo solido che conferisce ai tessuti di

diventare di una consistenza tale da impedirne la frammentazione al taglio assicurando il normale
mantenimento delle relazioni architetturali del campione. Il processo di inclusione avviene mediante l’uso
di inclusori automatici e dispensatori in paraffina. Da questo aggeggio, si fa uscire la paraffina liquida che va
nella biocassetta che viene messa a solidificare e raffreddare cosicché la paraffina diventi dura e possa
andare al taglio, pronta per essere sezionata con i microtomi. Si aprono, si preleva il frammento di tessuto
all’interno, si pone al fondo della vaschetta metallica che agisce come una sorta di formina che mantiene il
pezzo perché, se in macro è stato deciso di mettere il prelievo fatto con una determinata faccia vuol dire
che al vetrino è quella la parte che vuole essere vista e il tecnico alle inclusioni sa che in questo passaggio di
aprire e spostarla nella vaschetta metallica deve essere fatto mantenendo l’esatto orientamento originale,
stabilito in macro. La vaschetta viene riempita con paraffina fusa e posta su una piastra fredda per
solidificare rapidamente la paraffina. Una volta solidificata, si rimuove la formina metallica ottenendo il
blocchetto di paraffina che contiene il tessuto incluso. E’ importante che si mantenga l’orientamento o
della biopsia stessa come è stata mandata o che il patologo da in sala macro. Il blocchetto può finalmente
essere mandato al cosiddetto taglio.

TAGLIO: Viene effettuato mediante apparecchiature speciali che sono i microtomi. Il microtomo rotativo è
quello più usato che incontro il blocco porta-inclusione, che si muove in direzione alto-basso, c’è una lama
che taglia in maniera sequenziale strisce seriate, una sorta di nastro di sezioni che sono rappresentative del
pezzo che sta nel blocchetto di paraffina. Devono essere non più spesse di 4/6 micron le strisce e devono
contenere tutto, il lume più scuro corrisponde al pezzo, il resto corrisponde alla paraffina. Questo quadrato
deve stare esattamente al centro della sezione altrimenti vuol dire che non è stato tagliato bene il
blocchetto perdendo pezzi importanti e va a finire che non si riesce a fare la diagnosi. Il congelamento viene
usato più che altro negli esami estemporanei (quindi col pz sul letto operatorio). Col congelamento manca
tutto il processo di disidratazione e di inclusione, il prelievo è ricevuto fresco per l’intraoperatoria e si
mette nel microtomo particolare detto criostato a fresco, si tratta di un microtomo rotativo posto in una
camera e raffreddato fino a -45° che lo indurisce e ne consente il taglio mantenendo standard la
temperatura di fissazione. Dopo aver ottenuto le strisce di sezioni seriate, queste vengono adagiate con
l’aiuto di un pennellino sulla superficie dell’acqua contenuta in un bagnetto termostatato riscaldato alla
temperatura di circa 42°, il calore favorisce la distensione della sezione che verrà poi raccolta facendola
aderire alla superficie di un vetrino portaoggetti. Tale vetrino viene posto ad asciugare su una piastra
riscaldata e dopo in un termostato a 30/40°. Una volta che il vetrino viene messo ad ‘asciugare’, può essere
mandato alla colorazione.

COLORAZIONE: La colorazione base con cui si ha a che fare è la colorazione ematossilinosina, non c’è
nessuna diagnosi che possa uscire senza passare prima a visiona di una banale ematossilinosina, a questa
ematossilina si possono aggiungere altri tagli seriati, colorazioni speciali in istochimica, la biologia
molecolare o altro, ma si parte dalla morfologia, cioè dall’analisi dell’ematossilinosina. I coloranti usati non
sono solubili in paraffina quindi, quelle sezioni ottenute dal taglio, sono sezioni in paraffina: dopo il taglio,
devono essere sparaffinate in xiloro e reidratate prima di essere colorate. I coloranti più usati sono
l’ematossilinosina, coloranti basici ematossilina e acidi eosina , poi esistono anche dei coloranti neutri.
L’ematossilinosina è la colorazione base, quella routinaria, si basa su un’interazione acido-base:
l’ematossilina è un colorante basico che da il colore blu intenso ai nuclei e ai nuclei delle cellule, quindi,
stiamo guardando un tessuto fatto di cellule che hanno il citoplasma, il nucleo lo vedrò mano mano più blu
se è tutto normale, con una neoplasia si va incontro ad un’alterazione del nucleo nel citoplasma quindi il
nucleo non lo vedrò così blu ma intercromatico ecc.; la eosina è un colorante artificiale acido che colora di
rosa le proteine del citoplasma e della matrice cellulare. Dopo averli colorati, si estraggono dal coloratore
automatico, si deve montare il vetrino perché non può essere messo così com’è al microscopio; il
montaggio del vetrino non consiste altro che nell’apposizione di un vetrino copiaoggetto che mi protegge
quella sezione colorata. Abbiamo detto che vengono disidratate, diafanizzate, su questo vetrino con la
sezione colorata disidrata e diafanizzata, applico una goccia del mezzo di montaggio e dopo su questa
goccia applico il vetrino copiaoggetto che aderirà perfettamente alla sezione consentendo la visione al
microscopio. Questa è la colorazione di routine. Dall’accettazione alla colorazione, in un mondo ideale, ci
vorrebbero 24/48h, nella pratica reale è diverso. Esistono poi delle colorazioni che non sono di routine
dette speciali o istochimiche chiamate così perché sono finalizzate ad evidenziare specifici costituenti delle
cellule e dei tessuti il cui riconoscimento ci può essere utile per formulare una diagnosi. Vanno ad
evidenziare particolari sostanze mediante reazioni chimiche tra colorante e substrato, di solito per
colorazione speciale si intende una colorazione istochimica. Le colorazioni istochimiche più usate in
laboratori di anatomia patologica sono:

1) il PASS che ha un valore fondamentale per l’evidenziazione dei carboidrati, le sostanze reattive
appaiono colorate in varie tonalità di rosso magenta; spesso vengono usate nelle patologie
gastrointestinale;
2) la colorazione speciale di VAN GIESON è una colorazione per il tessuto connettivo che identifica le
diverse fibre del connettivo, le fibre collagene sono colorate di rosso, le muscolari di giallo e le
reticolari non vengono colorate;
3) il METODO DI GOMORI di impregnazione argentica che evidenzia fibre reticolari che legano i Sali
d’argento e si colorano in nero, spesso è richiesta per le biopsie epatiche quando le fibre
reticoliniche normalmente presenti nel tessuto epatico devono essere valutate perché un loro
ispessimento è già sinonimo di un’alterazione patologica;
4) colorazioni TRICROMICHE come la tricromica di Masson per le fibre collagene, muscolari e i nuclei,
le collagene in verde, i nuclei in blu scuro e le muscolari in rosso; 5) colorazione speciale di GIEMSA
che si usa di routine alla Federico II nelle biopsie dello stomaco che arrivano per sospetta gastrite
 da helicobacter pylori, in questo caso, non si guarda prima l’ematossilinosina e poi chiedo la
colorazione del GIEMSA, in questo istituto, di routine, quando viene fatta partire la biopsia dello
stomaco per sospetta gastrite, quando viene tagliata la sezione di ematossilina, viene fatta
direttamente anche quella per essere colorata con GIEMSA questo perché è una colorazione che mi
evidenzia batteri gram positivi, mi evidenzia l’helicobacter che quasi sempre non è facilmente
identificabile sulla sola ematossilinosina. Patologi esperti o in caso di una evidente gastrite, quasi
sempre si vedono i segni indiretti, andare a definire che ci sia effettivamente il batterio non è
facilissimo, il GIEMSA diversamente dall’ematossilina aiuta molto. E’ necessario perché la gastrite
da helicobacter, oltre ad essere una possibile precancerosi a livello dello stomaco ha bisogno di un
trattamento antibiotico molto importante.

TECNICHE ANCILLARI: sono tecniche di supporto alla diagnostica morfologica che sono in grado di
completare il contenuto informativo dell’osservazione morfologica, sono tecniche di patologia molecolare
come l’immunoistochimica che è una sorta di morfologia molecolare in situ, l’immunofluorescenza,
l’ibridazione in situ e la biologia molecolare vera e propria. La tecnica di patologia ultrastrutturale è la
microscopia elettronica.
L’IMMUNOISTOCHIMICA: tra le tecniche ancillari sopra citate, l’immunoistochimica è sicuramente la tecnica
fondamentale. E’ una tecnica di morfologia molecolare che mi consente di valutare contemporaneamente
l’informazione morfologica e quella molecolare, perché, a differenza di altre tecniche molecolari, come la
biologia molecolare vera e propria, oppure il DNA che estraggo da x campione, in questo caso la sezione del
tessuto che ho già valutato con l’ematossilinosina e che viene colorata per ematossilina dando la
colorazione specifica che si vede, si riconosce il carcinoma che è stato diagnosticato, si integra la morfologia
che vedo al dato dell’immunoistochimica. Si basa sul principio di coniugazione antigene-anticorpo in
addizione a sistemi di rivelazione, enzimatici o fluorescenti. Questi sistemi di rivelazione consentono
appunto di rivelare la reazione e di vederla al microscopio. La storia dell’immunoistochimica parte da molto
lontano, è una componente fondamentale dell’attività routinaria in anatomopatologia. Perché è cosi tanto
usata, prima di tutto perché vi è una elevata disponibilità di anticorpi specifici, perché abbiamo sistemi di
rivelazione sensibili, vi è una rapidità di esecuzione, nel giro di poche ore posso avere l’anticorpo con
l’immunoistochimica che è stato chiesto. E’ una metodica che si può fare a mano anche se ci sono le
macchine che la fanno e soprattutto, ha dei costi contenuti che è importante. Per la colorazione, servono i
reagenti. I reagenti che vengono usati in immunoistochimica sono la sonda che è rappresentata
dall’anticorpo, monoclonale o policlonale, e il sistema di rivelazione che non è altro che una sostanza legata
all’anticorpo che permette l’evidenziazione al microscopio dell’avvenuta reazione che è la cosa che importa,
verificare che sia avvenuta la reazione anticorpo-antigene per vedere che ci sia quell’antigene in quel
tessuto. Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali. Monoclonali sono prodotti da un solo clone
di cellula B e hanno tutti la stessa specificità cioè riconoscono un solo epitopo come antigene usato per
l’immunoinduzione (l'epitopo, o determinante antigenico, è quella piccola parte di antigene che lega
l'anticorpo specifico. La singola molecola di antigene può contenere diversi epitopi riconosciuti da
anticorpi differenti). Gli anticorpi policlonali sono isolati da sieri di animali immunizzati, raggruppano
anticorpi diretti contro diversi epitopi dell’antigene e non solo uno come i monoclonali, che viene usato
per l’immunoinduzione. Una volta usati i reagenti, serve qualcosa che aiuti a verificare che la reazione sia
avvenuta e ciò lo fanno i sistemi di rivelazione che appunto visualizzano se è avvenuto o meno il legame. Le
molecole usate per marcare gli anticorpi sono fluorescenti o molecole enzimatiche. Possono essere
attaccate all’anticorpo primario mediante un metodo diretto o indiretto. Il metodo indiretto è il più usato,
quello che si deve legare all’anticorpo per vedere che sia avvenuta la reazione mediante una metodica di
tipo indiretto. L’anticorpo che riconosce l’antigene è definito anticorpo primario e viene visualizzato grazie
ad una seconda sonda anticorpale, il cosiddetto anticorpo secondario, coniugato con un enzima. L’avvenuta
reazione anticorpo-antigene (Ag-Ab) sarà testimoniata dalla precipitazione di un cromogeno che è
modificato dall’enzima nel sito della reazione. Gli enzimi sono la perossidasi e la fosfatasi alcalina. Tra i due
enzimi cambia il risultato cromatico dell’immunoistochimica: con la perossidasi si ottiene una colorazione
marrone, con la fosfatasi alcalina si ottiene una reazione che da una colorazione in ‘red’. Perché si può
voler vedere qualcosa con un segnale marrone o un segnale in rosso? Le lesioni melanocitiche pigmentate
di una cute, per esempio, sono lesioni della cute intensamente pigmentate, aldilà del nevo classico (il nevo
è un tumore benigno dell’epidermide molto elementare), i nevi blu per esempio sono intensamente
pigmentati e, vedere qui una reazione immunoistochimica, per esempio con l’indice di proliferazione ki67,
col marrone, è complicato perché è già di base marrone grazie alla melanina che resta
nell’immunoistochimica, mi rende difficile la lettura. In questo tipo di lesione, si può chiedere la stessa
immunoistochimica in rosso, così so che il segnale immunoistochimico lo si valuta col rosso. Una volta che si
ottiene il vetrino colorato in immunoistochimica, non basta vedere il vetrino. Quando si chiede una
metodica di immunoistochimica, non è che si ci aspetta per forza una reazione positiva, ci sono dei casi, se
il sospetto diagnostico del patologo è giusto, in cui, per esclusione, ci sono degli anticorpi che sono sinonimi
di altro e quindi devono uscire negativi. Se si ci aspetta una positività per confermare una diagnosi o per
valutare l’assetto recettoriale per esempio di un carcinoma della mammella, si valuta il pattern di
quell’espressione. Se si ha un carcinoma mammario mandato in immunoistochimica per estrogeno che
serve per la terapia della pz, non mi basta vedere che ci sono delle strisce marroni sul vetrino che indicano
l’avvenuta reazione antigene-anticorpo, deve essere un segnale specifico, nel caso dell’estrogeno, deve
essere un segnale nucleare, altrimenti non è specifico. Il pattern di colorazione può essere nucleare,
citoplasmatico o di membrana. Nel caso in cui si verifichi un problema, dopo aver avuto il vetrino, il
patologo si deve fermare per cercare di arrivare alla fase in cui qualcosa è andato storto anche per evitare
che ci possano essere problemi in altri campioni. Possono esserci criticità legate alle diverse fasi che
riguardano il procedimento di immunoistochimica:
-CRITICITA’ DELLA FASE PRE-ANALITICA: legate alla fissazione, quindi alterazioni della fissazione, spesso
date da fissazione tardiva cioè che da effetti di ischemia fredda, si deve ripetere la fase; si può avere
l’ipofissazione che determina una fissazione disomogenea, mista o anche l’iperfissazione che determina
maggiore difficoltà al taglio, indurisce il pezzo talmente tanto da essere difficile da tagliare e può
determinare un mascheramento antigenico maggiore, c’è difficoltà a smascherare gli antigeni;
-CRITICITA’ FASE ANALITICA: riguarda appunto lo smascheramento antigenico, i processi di fissazione detti,
che sono necessari per arrivare alla lettura di un preparato, alterano in vario modo la struttura degli
antigeni, dalla completa perdita dei determinanti antigenici a modificazioni irreversibili. Queste alterazioni
rendono gli antigeni inaccessibili e quindi, in teoria, non riconoscibili dall’anticorpo, per cui si attuano
metodiche di smascheramento antigenico che permettono di liberare le molecole di antigene dalle
modifiche dovute dal fissativo che si doveva applicare per forza. Il smascheramento antigenico si fa col
trattamento termico e con la predigestione enzimatica, sono talmente tanti passaggi che, se non sono
automatizzati e controllati, ci può essere l’errore ovunque. Col trattamento termico, i vetrini vengono
immersi in soluzioni tamponate ed esposti ad alte temperature; o si mettono in un forno a microonde, o in
bagnetto termostatato o in pentola a pressione. La predigestione enzimatica consiste nell’utilizzo di enzimi
proteolitici, che digeriscono i legami aldeidici istituiti nel corso della fissazione. Sempre nella fase analitica,
possiamo avere il blocco degli enzimi endogeni che sono gli enzimi che stanno normalmente nel tessuto e
che possono dare luogo ad una colorazione non specifica, quindi che non è quella che si sta cercando, non è
quella legata alla reazione antigene-anticorpo. L’inibizione della perossidasi (enzima endogeno) è possibile,
si fa mediante una pre-incubazione delle sezioni prima che venga aggiunto l’anticorpo primario con
perossido di idrogeno o in acqua. Il blocco della fosfatasi alcalina è invece possibile mediante l’aggiunta di
levamisole a 1 mM al substrato. Invece, il blocco delle reazioni non specifiche prevede blocco degli enzimi
che si usano per la reazione che potrebbero dare reazioni non specifiche, blocco di queste reazioni non
specifiche attraverso la colorazione di fondo, tipo l’estrogeno, aldilà che ci sia o meno il segnale nucleare, si
comincia a vedere tutta la sezione colorata di un marroncino aspecifico, chiaro e senza significato, questa è
una colorazione di fondo. Si può prevenire esponendo il campione ad una soluzione proteica inerte prima
di applicare l’anticorpo primario, la proteina inerte va a saturare i siti carichi e non lascerà spazio per
l’assorbimento dell’anticorpo primario.
-CRITICITA’ FASE POST-ANALITICA: gli artefatti che si cerca di evitare o di riconoscere sono: i precipitati che
non sono nella positività reale del campione, sono precipitati i granuli di cromogeno che non hanno reagito
e si ritrovano sfusi nella sezione. Si riconoscono perché non hanno quel pattern di localizzazione detto
prima, non sono né nel nucleo, né nel citoplasma, né nella membrana, stanno sparsi. Oppure si hanno
artefatti tissutali, spesso una sezione di immunoistochimica può rappresentare un punto in cui sembra di
vedere un segnale di sezione maggiormente marrone; quando si controlla, si nota che in realtà era un pezzo
di sezione che, a meno che non abbia sempre la specificità detta prima, può essersi semplicemente piegata
e che, andando incontro a colorazione, appare più colorata solo perché è più spessa, non ha nessun
significato reale. Gli artefatti cellulari cioè dati dalle cellule. Quando si valuta l’immunoistochimica, per
definizione e routine, si evitano le aree necrotiche, se si deve valutare un anticorpo su quella sezione di
carcinoma, non lo si valuta dove c’è necrosi perché la necrosi si positivizza, le cellule necrotiche all’interno
per esempio di un’isola neoplastica di una mammella, sono nere ma non hanno significato, non sono cellule
vitali, sono detriti. Ultimo artefatto è la colorazione di fondo specifica, il fondo detto prima non è specifico
ma ci sono delle cellule come i macrofagi che si colorano a prescindere ma la cellula si riconosce.
Questa parte di anatomia patologica è importante perché, se non si conosce il funzionamento anche
tecnico dell’ immunoistochimica, come si ci può difendere dall’eventualità che un’immunoistochimica sia
venuta male, come si può essere sicuri dell’interpretazione dati se non si capisce il meccanismo di fondo.
Serve per fare una valutazione corretta. E’ una parte che non fa il patologo, c’è un compartimento
altamente specializzato che fa l’immunoistochimica.
Per essere sicuri di star guardando una metodica di immunoistochimica uscita bene (si deve essere sicuri
perché sono indicazioni che verranno date ad altri, è servita per fare una diagnosi e comunica che quella è
una neoplasia in un senso o nell’altro oppure si comunica ai colleghi quale terapia può applicare al pz perciò
è necessario essere sicuri che l’immuno sia fatta bene), esistono controlli positivi e controlli negativi.
Controllo positivo: la reazione immunoistologica deve essere sempre accompagnata da un tessuto di
controllo positivo trattato allo stesso modo del campione in esame, è un sistema per confermare la validità
della metodica;
Controllo negativo: -dalla metodica: è rappresentato da un tessuto negativo che esclude la presenza di falsi
positivi dovuti alla metodica; -dal campione: è rappresentato da un vetrino sul quale l’aggiunta
dell’anticorpo specifico è stata sostenuta con l’aggiunta di un tampone. L’eventuale presenza di positività
sarà in questo caso non considerata specifica.
Nella pratica spesso basta un controllo positivo interno alla stessa sezione ovvero, se c’è un carcinoma della
mammella, ne mando una sezione dove c’è carcinoma infiltrante ove si valuta se esprime o meno recettori
e c’è un po’ di mammella normale attorno. Quando si vedrà estrogeno, progesterone, il ki67 e il Siem
negativi, come si fa ad essere sicuri, senza aver visto fondo e le altre cose dette prima, che sia uscita bene,
si usa il controllo interno alla sezione ovvero i prodotti mammari normali circostanti al carcinoma che di
base esprimono l’estrogeno, se quel dottino normale intorno alla neoplasia ha estrogeno positivo mentre il
resto è negativo, allora è una neoplasia negativa all’istogenesi, se invece anche quello è negativo, sorge il
dubbio e si inizia il processo di analisi di criticità delle fasi. Si usa per l’individuazione di antigeni e agenti
patogeni nei tessuti, per la discriminazione di neoplasie di diversa istogenesi melanocitaria,
linfoproliferativa, epiteliare, oppure per la caratterizzazione di neoplasia all’interno della stessa famiglia
tipo, neoplasia linfoproliferativa ok ma ci sono 400000 linfomi, si deve dare una caratterizzazione. Serve per
l’identificazione dell’origine di una metastasi, su quella neoplasia si testano una serie di anticorpi che
dirigono anche l’indagine del collega che non sa dove mettere le mani per esempio una metastasi
laterocervicale da primitività occulta o una metastasi cistica di tipo squamoso, ci può pensare a carcinomi
squamosi del testa-collo, si fa un A.P.16 legata all’espressione del papilloma virus che si manifesta anche
nel testa-collo, se c’è una metastasi con quelle caratteristiche morfologiche dalle quali non si può
prescindere e un A.P.16 nera, potrebbe essere un carcinoma squamoso a livello dell’orofaringe. Serve
ancora per la valutazione di marker prognostici e predittivi e la ricerca.

APPLICAZIONI DELL’IMMUNOISTOCHIMICA ESEMPI:

ANALISI DEL LINFONODO SENTINELLA : melanoma di spessore superiore al millimetro va incontro alla
ricerca del linfonodo sentinella, una volta fatto, non basta dire che sull’ematossilinosina è negativo perché
ci sono delle micrometastasi che sono inferiori al millimetro e parliamo anche di 3 o 4 che sono confondibili
col resto dei linfonodi per cui non si ha la certezza dell’ematossilinocina e quindi si fanno le colorazioni, in
questo caso l’istochimica specifica per marker melanocitari perché si sta cercando un’eventuale
micrometastasi da melanoma. Non è raro che si riscontrino poi delle cellule positive a tale metodica che
non erano distinguibili sull’ematossilinosina.
VALUTAZIONE DEI MARKER PROGNOSTICI: è l’esempio dell’ A.P.16 dell’orofaringe di prima, sono
prognostici perché aldilà del fatto che con una metastasi si aiuta l’iter diagnostico del pz, prognostici perché
questo tipo di neoplasie (carcinoma squamoso dell’orofaringe) vanno molto meglio in termine di prognosi
rispetto alle neoplasie di cavo orale correlate al fumo per esempio; quindi l’oncologo, con questa eziologia,
con questa patogenesi, con uno stadio adeguato, può decidere anche di non usare trattamenti a dosi molto
elevate ma, per questi pz, scalare le terapie normalmente usate perché di per se comportano già una
buona prognosi, cercherà di evitare un over-trattamento, ma deve averlo detto il patologo di aver visto
lA.P.16 nera che può far pensare a carcinoma orofaringeo, altrimenti non ha senso.
MARKER PREDITTIVI DI RISPOSTA ALLA TERAPIA: Assetto recettoriale di carcinoma alla mammella. La
valutazione del patologo di estrogeno, progesterone, ki67 condiziona la terapia delle pz nel senso che fa
decidere all’oncologo quale terapia applicare.
L’immunoistochimica ha dei vantaggi obiettivi: un’elevata riproducibilità, ciò che si fa su una sezione di
tessuto, la deve saper fare qualunque patologo, ciò che si legge di quell’estrogeno per esempio lo dovrebbe
leggere uguale qualsiasi patologo; standardizzazione dei protocolli di colorazione (i colori delle colorazioni
sono uguali ovunque); uso ottimizzato dei reagenti; tempistiche ridotte (se richiedo ora l’immuno, è pronta
in 12 ore); maggiore controllo su eventuali errori. Oggi c’è la digital patology, la possibilità dell’analisi
digitaledi tali risultati, sono effettuati dei veri e proprio immuno-score, sistemi automatici, computer di
digitalizzazione delle immagini che possono aiutare, si identifica una determinata sezione che si vuole
valutare nell’immunoistochimica, esistono dei sistemi compiuterizzati che mi dicono che in questo campo
selezionato quante cellule positive ci sono. Si possono fare anche delle doppie colorazioni, si possono
cercare due antigeni contemporaneamente o addirittura multiple, tre quattro antigeni per volta, varierà il
colore, il sistema usato per ogni diverso anticorpo