Tese Versão Final - PDF Final

Simone Stephanie Fortes da Graça
Efeito de diferentes terapêuticas citotóxicas na

expressão do CD133, Wnt/β-catenina no cancro do
colo do útero
Universidade do Algarve
Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina
2019
Simone Stephanie Fortes da Graça
Efeito de diferentes terapêuticas citotóxicas na

expressão do CD133, Wnt/β-catenina no cancro do
colo do útero
Mestrado em Oncobiologia–
Mecanismos Moleculares do Cancro
Trabalho efetuado sob a supervisão de:
Professora Doutora Maria Filomena Botelho
Professora Doutora Bibiana Ferreira
Universidade do Algarve
Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina
2019
i
Efeito de diferentes terapêuticas citotóxicas na expressão do CD133, Wnt/β-catenina
no cancro do colo do útero.
Declaração de autoria de trabalho
Declaro ser a autora deste trabalho, que é original e inédito. Autores e trabalhos consultados
estão devidamente citados no texto e constam da listagem de referências
incluída.__________________________________________________________________
Simone Graça
ii
Copyright Simone Stephanie Fortes da Graça
A Universidade do Algarve reserva para si o direito, em conformidade com o disposto no

Código do Direito de Autor e dos Direitos Conexos, de arquivar, reproduzir e publicar a
obra, independentemente do meio utilizado, bem como de a divulgar através de repositórios
científicos e de admitir a sua cópia e distribuição para fins meramente educacionais ou de
investigação e não comerciais, conquanto seja dado o devido crédito ao autor e editor
respetivos.
iii
“If you can't fly then run, if you can't run then walk, if you can't walk then crawl, but
whatever you do you have to keep moving forward.”
Martin Luther King Jr.
iv
v
Agradecimentos
Gostaria de agradecer a todos que me ajudaram a concluir mais esta etapa. Sem a vossa ajuda
nada disto seria possível.
À professora Doutora Maria Filomena Botelho (Instituto de Investigação Clínica e Biomédica
de Coimbra, Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra), orientadora desta
dissertação, pela oportunidade de trabalhar no seu grupo (Biofísica), pela partilha de
conhecimentos científicos e pela disponibilidade.
À professora Doutora Bibiana Ferreira (Centro de Investigação Biomédica, Departamento de
Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve), co-orientadora desta dissertação,
pela confiança, pelo apoio e pela partilha de conhecimentos científicos.
À Doutora Salomé Pires (Instituto de Investigação Clínica e Biomédica de Coimbra, Faculdade
de Medicina da Universidade de Coimbra), pelo apoio durante esta dissertação, pela partilha de
conhecimentos científicos, por estar sempre disposta a ajudar e pelo carinho em todos os
momentos.
Ao Doutor Paulo Matafome e ao mestre Tiago Rodrigues (Instituto de Investigação Clínica e
Biomédica de Coimbra, Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra), pela ajuda na
realização do ensaio western blot e por me receberem de braços abertos no vosso grupo
(Fisiologia).
À Doutora Ana Cristina Gonçalves (Instituto de Investigação Clínica e Biomédica de Coimbra,
Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra), pela ajuda na realização da citometria de
fluxo.
Ao Serviço Farmacêutico do Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra por ceder o fármaco
utilizado durante este trabalho.
Ao Serviço de Radiologia do Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra, pela simpatia e
pela cedência do espaço e equipamento utilizado nesta dissertação.
Aos mestres Ricardo Teixo, Rita Neves, Inês Marques e Beatriz Serambeque, pela ajuda
incansável na realização das tarefas, análise de resultados mesmo implicando um acréscimo de
trabalho, pela simpatia, pelas críticas que me ajudaram a crescer durante este tempo. Muito
obrigada!!
Às licenciadas Catarina Ferreira, Isabel Meireles, Rosana Martins e à mestre Catarina
Guilherme pela boa disposição, pela companhia, por partilharem momentos de estresse, pelo
incentivo e por todas as vezes em que soubemos ver o lado bom no meio as adversidades.
Às Doutoras Ericka Costa e Leisa Aguiar (Universidade de Campinas, Brasil) pela ajuda na
realização deste trabalho, orientação, partilha de conhecimentos e pelas críticas construtivas.
Um especial agradecimento à Ericka, pela companhia incansável, pela amizade, pelos
momentos de alegria e de choros vividos durante este percurso. De todo o meu coração desejo
que esta amizade prevaleça além-fronteiras.
Ao Paulo Teixeira, pela disponibilidade, pensamento positivo e pela ajuda na
imunocitoquimica.
Ao mestre André Salvada, pela ajuda, disponibilidade, pensamento positivo e pelos
conhecimentos partilhados ao longo deste trabalho.
vi
À Adriana Duarte, pela companhia na realização deste trabalho. Foram muitos os momentos
bons partilhados até aqui, mas como todo o caminho, nenhuma conquista se faz sem obstáculos.
Muito obrigada pelo apoio, espírito de equipa e principalmente pela amizade.
Ao turno 3, meus colegas de mestrado, Juliana Machado, Rute Salvador, Cátia Neto, André
Mestre pela amizade, por me fazerem sentir em casa em um ambiente que para mim era
completamente estranho, pelas palavras de apoio, pelos abraços nos momentos em que a
saudade de casa apertava, por todos os bons e maus momentos partilhados ao longo do nosso
percurso académico. Levo-vos pra vida!
Aos Doutores Fernando Mendes e António Gabriel, pela oportunidade, por cada palavra de
apoio e por sempre terem acreditado em mim.
Aos meus grandes professores, Benízia Timas, Carlos Sanches e Gilson Lopes, por todos os
conhecimentos que me serviram como base para chegar até aqui e por todo o carinho.
À Rosana Brandão, Irina Rocha e Christy Rocha por se fazerem presentes nos momentos mais
difíceis e importantes da minha vida cá em Coimbra. Pelo acolhimento, pelo carinho, pelos
conselhos, pelas pequenas brigas e pela amizade que até hoje mantemos mesmo estando longe.
Às minhas colegas de casa, Larissa Costa, Andrea Delgado e Benvinda Lima, só nós sabemos
o quão difícil é estar longe de casa e dos nossos em busca dos nossos sonhos. Sabemos melhor
ainda quão boa é a sensação de conseguir adaptar, criar raízes e construir amizades que temos
orgulho de chamar de família. Vocês agora também fazem parte da minha! Sem a vossa boa
disposição, companheirismo, amizade, brincadeiras, seria sem dúvida mais difícil e doloroso.
Um sincero e profundo especial obrigada à Benny, não só pela ajuda nesta dissertação, mas
também por se fazer sempre presente. “Agora vai!!”
À Elna Fernandes, Sara Santos, Cristy Medina, Ava Cardoso, Luis Andrade, Marco Monteiro
e Zé Maocha pela amizade de longa data e por todas as histórias vividas até aqui.
À tia Andreza, tia Leninha, muito obrigada por todo o carinho e por vibrarem comigo em todas
as conquistas.
À minha prima Vitália, por ter sido a minha companheira de toda a vida e por compartilhar
todos os momentos comigo.
Aos meus irmãos, Èzio Graça e Cleuder Graça pela proteção, por todo o amor, carinho e pelos
momentos em que também fizeram o papel de “pai” na minha vida. À Sheila, por me fazer
sentir que ser irmã é muito mais do que partilhar o mesmo sangue ou os mesmos pais.
Aos meus pais, a quem dedico todo o meu percurso. Palavras sempre serão insuficientes para
expressar a tamanha gratidão e amor que tenho por vós. Muito obrigada, por todo o sacrifício,
pelo carinho, pelos valores transmitidos e amor. Esta luta também é vossa. Amo-vos.
Ao saudoso poeta Eugénio Tavares, hoje mais do que nunca compreendo o sentido da frase: “Si
ka badu ka ta biradu”.
A Deus, por tudo.
vii
Resumo
O cancro do colo do útero é o quarto cancro mais comum a nível mundial. A

quimioterapia e a radioterapia aplicada estão associadas a uma notável toxicidade e
resistência. Postula-se que as células estaminais do cancro, assim como as vias associadas à
sua manutenção, proliferação sejam responsáveis por estes mecanismos de resistência. O
CD133 e a via Wnt/β-catenina estão associadas em alguns estudos a esta resistência.
Esta dissertação teve como objetivo avaliar a expressão da CD133, Wnt, β-catenina,
LRP6, pLRP6, Naked1 e Axin1 após a exposição à radiação-X e o tratamento com a cisplatina
tentando perceber se estas proteínas poderão ser utilizadas como alvo direto no tratamento,
minimizando a toxicidade. Após determinar a concentração inibitória (IC50) média e a dose letal
média (DL50) utilizaram-se concentrações e doses superiores, iguais e inferiores a estes valores,
isto é, concentrações correspondentes à IC80, à IC50 e à IC20 e doses de 10 Gy, de DL50 e de 2
Gy. Avaliou-se a morte celular, o ciclo celular, a produção de espécies reativas de oxigénio, a
glutationa reduzida e a expressão das proteínas (CD133, Wnt, β-catenina, LRP6, pLRP6,
Naked1 e Axin1).
Após o tratamento com a cisplatina observou-se aumento da expressão da pLRP6 e
diminuição da expressão da Naked1 e da Axin1 com o aumento da concentração do fármaco, o
que poderá levar a localização nuclear da β-catenina e induzir a transcrição de genes
responsáveis pela sobrevivência e pela proliferação das células tumorais. A exposição a
diferentes doses de radioterapia permitiu-nos observar que o aumento da expressão da β-
catenina está associada a uma menor morte celular e que a menor expressão da CD133 está
associada a uma maior morte celular. Estes resultados sugerem que estas proteínas são
importantes na resposta ao tratamento e que minimizar a toxicidade será possível em doentes
com esta neoplasia.
Palavras chaves: Cancro do colo do útero, células estaminais do cancro, cisplatina,

radioterapia, CD133, Wnt/β-catenina.
viii
ix
Abstract
Cervical cancer is the fourth most common cancer worldwide. Its incidence and
mortality vary according to the country's development index being more common in
developing countries. Conventional treatments (chemotherapy and radiotherapy) are
associated with high toxicity and resistance. It is postulated that the cancer stem cells as well
the pathways responsible for their maintenance and proliferation are involved in these
resistance mechanisms. CD133 and the pathway Wnt/ β-catenin are associated with these
resistances in some studies.
The objective of these thesis was to analyse the expression of Wnt, β-catenin, LRP6,
pLRP6, Naked1 and Axin1 after cisplatin and radiotherapy exposure in the attempt to
understand, if these proteins could be used as therapy targets in this cancer type. After
determining the mean inhibitory concentration (IC50) and the median lethal dose (LD50),
concentrations and doses above and below these values were used, namely, concentrations
corresponding to IC80, IC50 and IC20 and doses of 10 Gy, LD50 and 2 Gy. We analysed cell
death, cell cycle, reactive oxygen species, reduced glutathione and the expression levels of
CD133, Wnt, β-catenina, LRP6, pLRP6, Naked1 and Axin1.
After the treatment with cisplatin, we observed an increase in pLRP6 and a decrease
in Naked1 and Axin1 expression, which can lead to nuclear localization of β-catenin and
transcription of target genes. After radiotherapy we observed that increased β-catenin
expression could be associated with low cellular death. On the other hand, low CD133
expression could be associated with increased cell death. These results suggest that these
proteins are important in response to treatment and that minimizing toxicity will be possible in
patients with this neoplasia.
Keywords: Cervical cancer, cancer stem cells, cisplatin, radiotherapy, CD133, Wnt/β-catenin.
x
xi
Índice
Agradecimentos ......................................................................................................................... vi
Resumo .................................................................................................................................... viii
Abstract ...................................................................................................................................... x
Índice de figuras ...................................................................................................................... xiv
Índice de tabelas ...................................................................................................................... xvi
Lista de Siglas e Abreviaturas ................................................................................................ xvii
1-Introdução ............................................................................................................................... 1
1.1-Epidemiologia do cancro do colo do útero....................................................................... 1
1.2-Cancro do colo do útero .................................................................................................. 5
1.2.1- Papiloma vírus humano ............................................................................................ 6
1.2.2-Prevenção e rastreio ................................................................................................... 9
1.2.3-Tratamento ............................................................................................................... 10
1.3-Cisplatina........................................................................................................................ 11
1.3.1-Toxicidade ............................................................................................................... 12
1.3.2-Resposta celular à cisplatina .................................................................................... 14
1.4-Radioterapia ................................................................................................................... 15
1.4.1-Radioterapia e morte celular .................................................................................... 19
1.4.2-Radioterapia e cancro do colo do útero ................................................................... 20
1.5-Células estaminais do cancro ......................................................................................... 21
1.6-Hipótese .......................................................................................................................... 27
1.7-Objetivos ........................................................................................................................ 27
2-Materiais e métodos .............................................................................................................. 28
2.1-Cultura celular ................................................................................................................ 28
2.2-Ensaios de sobrevivência, proliferação e viabilidade celular ......................................... 29
2.2.1- Determinação das concentrações inibitórias de cisplatina ..................................... 29
2.2-Avaliação dos efeitos da terapêutica com raios-X...................................................... 30
2.3-Avaliação dos efeitos da quimioterapia e da radioterapia na linha celular HeLa .......... 33
2.3.1-Avaliação da viabilidade celular e do tipo de morte ............................................... 34
2.3.2-Avaliação do ciclo celular ....................................................................................... 36
2.3.3-Avaliação das espécies reativas de oxigénio e defesas antioxidantes ..................... 36
2.3.4- Determinação da expressão das proteínas .............................................................. 38
2.4-Análise estatistica ....................................................................................................... 42
3-Resultados ............................................................................................................................. 42
3.1-Efeitos da cisplatina na linha celular HeLa .................................................................... 43
xii
3.1.1-Proliferação celular .................................................................................................. 43
3.1.2- Viabilidade e morte celulares ................................................................................. 44
3.1.3-Ciclo celular ............................................................................................................. 46
3.1.4- Stresse oxidativo e espécies reativas de oxigénio .................................................. 47
3.1.5-Avaliação da expressão das proteínas (CD133, Wnt, β-catenina, LRP6, pLRP6,
Naked1 e Axin1) após a exposição à cisplatina. ............................................................... 51
3.2-Efeitos da radiação ionizante na linha celular HeLa ...................................................... 59
3.2.1-Sobrevivência celular .............................................................................................. 59
3.2.2- Viabilidade e morte celular ..................................................................................... 60
3.2.3- Stresse oxidativo e espécies reativas de oxigénio .................................................. 62
Naked1 e Axin1) após a exposição à cisplatina. ............................................................... 64
4-Discussão .............................................................................................................................. 71
5-Conclusão .............................................................................................................................. 85
6- Perspetivas futuras ............................................................................................................... 87
7-Referências bibliográficas ..................................................................................................... 88
8- Anexos ............................................................................................................................... 101
Anexo I ............................................................................................................................... 101
xiii
Índice de figuras
Figura 1. 1: Estimativa de novos casos e morte por sexo em países em desenvolvimento........ 2

Figura 1. 2: Incidência e mortalidade mundial do cancro do colo do útero. .............................. 3
Figura 1. 3: Taxa de mortalidade provocada pelo cancro do colo do útero por cada 100 000
habitantes em diferentes regiões de Portugal.. ........................................................................... 5
Figura 1. 4: : Evolução da infeção nas células do epitélio escamoso provocada pelo papiloma
vírus humano (HPV). ................................................................................................................. 8
Figura 1. 5: Efeito cancerígeno do HPV. ................................................................................... 9
Figura 1. 6: Biotransformação da cisplatina............................................................................. 12
Figura 1. 7: Marcadores e vias de sinalização envolvidos na resistência à terapêutica das
cancer stem cells... ................................................................................................................... 23
Figura 1. 8: Via de sinalização Wnt/β-catenina. ...................................................................... 25
Figura 2. 1: Caixa da irradiação construída em acrílico.). ..................................................... 31
Figura 2. 2: Distribuição da dose na caixa de irradiação.. ..................................................... 31
Figura 3. 1: Cisplatina diminui a proliferação celular na linha HeLa com o aumento da
concentração e tempo de tratamento. ....................................................................................... 43
Figura 3. 2: Aumento da concentração de cisplatina diminui a viabilidade celular na linha
HeLa.. ....................................................................................................................................... 45
Figura 3. 3: A cisplatina induz o aparecimento de características morfológicas de necrose com
o aumento da concentração na linha HeLa............................................................................... 46
Figura 3. 4: Cisplatina induz a progressão no ciclo celular da linha HeLa. ............................. 47
Figura 3. 5: Cisplatina induz o aumento da produção intracelular de superóxidos com o
aumento da concentração. ........................................................................................................ 48
Figura 3. 6: Cisplatina induz a alteração da produção intracelular de peróxidos. ................... 49
Figura 3. 7: Cisplatina induz o aumento da produção intracelular do glutationa reduzida com
aumento da concentração. ........................................................................................................ 50
Figura 3. 8: Aumento da proliferação celular na linha HeLa após o tratamento com cisplatina
e manitol (40mM)..................................................................................................................... 51
Figura 3. 9: Cisplatina induz a alteração da expressão da CD133 (117 kDa) na linha celular
HeLa, 48 horas após o tratamento. ........................................................................................... 52
Figura 3. 10: Cisplatina altera a expressão da Wnt na linha celular HeLa. ............................. 53
Figura 3. 11: Cisplatina induz a alteração da expressão da β-catenina (92 kDa) na linha celular
Figura 3. 12: A Cisplatina induz a diminuição da expressão da LRP6 (180,210 kDa) na linha
celular HeLa, 48 horas após o tratamento. ............................................................................... 55
Figura 3. 13: Cisplatina induz o aumento da expressão da pLRP6 (180,210 kDa) na linha
Figura 3. 14: Cisplatina induz a diminuição da expressão da Naked1 (59,61kDa) na linha
Figura 3. 15: Cisplatina induz a diminuição da expressão da Axin1 (110 kDa) na linha celular
Figura 3. 16: Exposição à radiação-X diminui a sobrevivência da linha celular HeLa com o
aumento da dose. ...................................................................................................................... 59
Figura 3. 17: Radioterapia diminui a viabilidade celular da linha HeLa, 48 horas após a
exposição.. ................................................................................................................................ 61
63
xiv
Figura 3. 18: Radioterapia induz o predomínio de características morfológicas de necrose
com o aumento da dose. ........................................................................................................... 62
Figura 3. 19: Radioterapia aumenta a produção intracelular de radicais superóxidos na linha
celular HeLa, 48 horas após a exposição. ................................................................................ 63
Figura 3. 20: Radioterapia aumenta a produção intracelular de peróxidos na linha celular
HeLa, 48 horas após a exposição.. ........................................................................................... 63
Figura 3. 21: Radioterapia altera a produção intracelular de glutationa reduzida na linha
celular HeLa, 48 horas após a exposição. ................................................................................ 64
Figura 3. 22: Radioterapia altera a expressão da CD133 (117 kDa) na linha celular HeLa, 48
horas após a exposição.. ........................................................................................................... 65
Figura 3. 23: Radioterapia induz o aumento da expressão da Wnt nas células HeLa com o
aumento da dose. ...................................................................................................................... 66
Figura 3. 24: Radioterapia altera a expressão da β-catenina na linha celular HeLa, 48 horas
após a exposição. ...................................................................................................................... 67
Figura 3. 25: Radioterapia diminui a expressão da LRP6 na linha celular HeLa, 48 horas após
a exposição. .............................................................................................................................. 68
Figura 3. 26: Radioterapia altera a expressão da pLRP6 (180,210 kDa) na linha celular HeLa,
48 horas após a exposição. ....................................................................................................... 69
Figura 3. 27: Radioterapia diminui a expressão da Naked1 na linha celular HeLa, 48 horas
após a exposição à radioterapia. ............................................................................................... 69
Figura 3. 28: Radioterapia altera a expressão da Axin1 na linha celular HeLa, 48 horas após a
exposição à radioterapia. .......................................................................................................... 70
xv
Índice de tabelas
Tabela 1. 1: Mortalidade provocada pelo cancro do colo do útero de 2010 a 2015 em Portugal.
Adaptado de: Programa Nacional para as Doenças Oncológicas. Direção Geral da Saúde. 2017 (15). . 4
Tabela 2. 1: Doses administradas em unidades de monitor (UM, do inglês monitor units, 1 MU=0,022
Gy), com a gantry posicionada a 270º e a 90º. ..................................................................................... 30
Tabela 2. 2: Número de células por cada condição. ............................................................................. 32
Tabela 2. 3: Anticorpos primários e condições utilizadas no protocolo. .............................................. 39
Tabela 3. 1: Determinação dos valores IC20, IC50 e IC80 para os diferentes tempos de exposição à
cisplatina e respetivos valores de R2. .................................................................................................... 44
Tabela 3. 2: Determinação do IC50 na linha HeLa 48 horas após o tratamento com cisplatina e com
cisplatina associada a manitol (40 mM) e respetivos valores de R2. ..................................................... 51
Tabela 3. 3: Resultados obtidos com recurso ao modelo linear quadrático para, α, β, α/β, DL50 e o fator
de sobrevivência com a dose de a 2Gy (Fs(2)) e respetivo R2 associado. ............................................. 59
xvi
Lista de Siglas e Abreviaturas
A DMSO: dimetilsulfóxido
ABC: ATP binding cassette Dvl: Dishevelled
ALDH: aldeído desidrogenase E
AI: apoptose inicial E: early protein
A.M.Lisboa: Área Metropolitana de Lisboa EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético

EpCAM/ ESA: molécula de adesão de
AT/N: apoptose tardia/necrose
células epiteliais / antigénio específico
APC: adenomatous polyposis coli
epitelial
ERO: espécies reativas de oxigénio
B
E2F: E2 transcription factor
BAK: Bcl-2 agonist killer
E6-AP: E6 associated protein
BAX: Bcl-2 associated protein
Bcl-2: B- cell lymphoma 2
F
BSA: bovine serum albumin
FBS: Fetal Bovine Serum
FDA: Food and Drug admnistration
C
FIGO: inglês International Federation of
CHUC: Centro Hospitalar e Universitário
Gynecology and Obstetrics
de Coimbra
FITC: fluorocromo isotiocianato de
CK1α: caseína quinase 1α
fluoresceína
Cl-: iões cloreto
Fs: fator de sobrevivência
CSCs: cancer stem cells
FZD: frizzled
CTL: controlo
G
D
GDP: guanosina difosfato
DCF: diclorofluoresceina
GLUT: glucose transporter
DCFH: diclorodihidrofluoresceina
GPx: GSH peroxidase
DSB: double- strand break
GSH: glutationa reduzida
DCFH2-DA: 2’,7’-
GSK: glicogénio sintase
diclorodihidrofluoresceínadiacetato
GSK3β: glicogénio sintase quinase 3β
DHE: dihidroetidina
GSSG: dissulfeto de glutationa
DL50: dose letal média
GTP: guanosina trifosfato
DMEM: dulbecco`s modified eagle médium
xvii
H NANOG: homeobox protein NANOG
HDAC6: histona desacetilase 6 N: necrose
HIF: Hypoxia-Inducible Factor NOX3: nicotinamide adenine
HIV: Human Immunodeficiency Virus dinucleotide phosphate oxidase 3
HPV: human papiloma virus O
HSIL: Lesão intraepitelial de alto grau OCT: organic cation transporter
H2O2: peróxido de hidrogénio OCT4: octamer-binding transcription
factor 4
I OH•: radical hidroxilo
IBM SPSS: Statistical Package for Social OMS: Organização Mundial de Saúde
Sciences O2 •−: anião superóxido
IC: inhibitory concentration
P
J PCP: Planar Cell Polarity pathway
K PCR: polymerase chain reaction
L PE: plate efficiency
L-late protein PET: positron emission tomography
LET: linear energy transfer PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinases
LQ: linear quadrático PKC: protein kinase C
LRP: Low density lipoprotein receptor- PLCβ: phospholipase C-β
related protein
P16: proteina 16
LSIL: Lesão intraepitelial de baixo grau P53: proteína p53
pRB: proteína retinoblastoma
M
PVDF: polyvynilidine fluoride
M: metástases à distância
Q
MIF: media de intensidade de
R
fluorescência
RAC: Ras-related C3 botulinum toxin
mTOR: mammalian target of rapamycin substrate
MTT:3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- R.A. Açores: Região autónoma dos Açores
diphenyltetrazolium bromide R.A.Madeira: Região Autónoma da
Mrps -multidrug resistance proteins Madeira.
N Rho: Ras homolog gene family member
N: envolvimento dos gânglios linfáticos RTK: receptor tirosina quinase
xviii
S U
SDS: sodium dodecyl sulfate UM: monitor units
SF: surviving factor
SNP: sistema nervoso periférico V
SOD: superóxido dismutase V: células viáveis
SSB: single strand break VIA: visual inspection with acetic acid
SRB: sulforodamina B
X
T Y
T: extensão do tumor primário Z
TCF/LEF: T-cell factor/lymphoid γ-GT: gama-glutamiltranspeptidase
enhancer factor
TEMED: tetrametiletilenodiamina
2vHPV: vacina bivalente contra o HPV
TUNEL: deoxynucleotidyl transferase-
4vHPV: vacina quadrivalente contra o
mediated dUTP nick end labeling
HPV
9vHPV: vacina nonavalente contra o HPV
xix
Efeito de diferentes terapêuticas citotóxicas na expressão do CD133, Wnt/β-catenina no cancro do colo do
útero.
1-Introdução
1.1-Epidemiologia do cancro do colo do útero

O cancro é um dos maiores problemas de saúde mundial e, de acordo com a
organização mundial de saúde (OMS), é uma das causas responsáveis pelo elevado número
de mortes (1,2). O aumento crescente da sua incidência deve-se não só ao aumento da
esperança média de vida à nascença mas também está associado a alguns fatores de risco
como o tabagismo, o sedentarismo, a obesidade e o estilo de vida, nomeadamente os maus
hábitos alimentares (1–3). Em 2018 estimou-se, 18,1 milhões de novos casos e 9,6 milhões
de mortes. Em relação ao cancro do colo do útero prevê-se, para 2025, 20 milhões de novos
casos (3,4). De acordo com os dados de 2014 da OMS, em Portugal, os cancros mais comuns
em mulheres são o cancro da mama, colorretal, corpo uterino, estômago e pulmão enquanto
que nos homens os mais comuns são o cancro da próstata, colorretal, pulmão, bexiga e
estômago (5).
A nível mundial o cancro do colo do útero é o quarto cancro mais comum nas
mulheres. Comummente é diagnosticado na quinta década de vida. Está associado a infeção
com o papiloma vírus humano (HPV, do inglês human papillomavirus), que usualmente é
contraído por via sexual, não estando limitada a sua disseminação apenas à atividade sexual
com penetração. O pico da infeção em homens e mulheres começa logo após o início da vida
sexual (3,6,7). No período de um ano, a probabilidade de um indivíduo de género masculino
ou feminino, sexualmente ativo, adquirir uma nova infeção causada pelo HPV é de 0,29 a
0,30%. Contudo, verificam-se diferenças na resposta imunológica entre os diferentes géneros
com as mulheres a mostrarem uma maior prevalência desta infeção (17,9%) quando
comparada com os homens (7,9%). Esta diferença pode ser justificada pela baixa resposta
imunológica nas mulheres comparativamente com a dos homens (8,9).
Em 2012 estimaram-se cerca de 528 000 novos casos e cerca de 266 000 mortes em
todo o mundo, sendo que cerca de 87% destes valores ocorreram nas regiões menos
desenvolvidas (10).
Para mulheres europeias, no período entre 2000 e 2007, a sobrevida relativa de cinco
anos foi de 62%, com valores de 57% na Europa oriental e de 67% no norte da Europa.
Porém, independentemente destes valores, a sobrevida diminui com o aumento da idade no
momento do diagnóstico. Entre os 15 e os 44 anos de idade a taxa de sobrevivência é de 81%
enquanto para mulheres com idade igual ou superior a 75 anos baixa para 34% (11).
1
útero.
A infeção genital pelo vírus do HPV é classificada epidemiologicamente, consoante

a associação com o cancro do colo do útero, em infeções por HPV de baixo risco e de alto
risco. As infeções de baixo risco pelo vírus do HPV (exemplo: HPV tipo 6 e tipo 11) são as
que podem causar alterações benignas do colo do útero ou de baixo grau enquanto as infeções
de alto risco pelo vírus do HPV (exemplo: HPV do tipo 16 e HPV do tipo 18) são as que
podem causar cancro genital, anal ou oral. As infeções de alto risco pelo vírus do HPV são
responsáveis por 99% dos casos de cancro do colo do útero, dos quais 75% estão associados
ao HPV do tipo 16 e ao HPV do tipo 18 (12).
A incidência e mortalidade por cancro do colo do útero variam consoante os índices
de desenvolvimento dos países. Em 2012, aproximadamente 270 000 mulheres foram
vítimas fatais desta neoplasia, em que mais de 85% destes casos ocorreram em países de
médio ou de baixo índice de desenvolvimento. Nos países em desenvolvimento esta
patologia ocupa o segundo lugar no género feminino, constituindo a terceira causa de morte
(Figura 1.1). A incidência é mais acentuada na África, Melanésia, América Latina e Caribe,
verificando-se uma menor incidência na Ásia Ocidental, Austrália e norte da América
(Figura 1.2). Esta grande diferença entre diferentes regiões geográficas deve-se a falhas na
implementação de programas de rastreio em países menos desenvolvidos (3).
Figura 1. 1: Estimativa de novos casos e morte por sexo em países em desenvolvimento. A

figura representa a relação estimada entre os novos casos e a morte associada a dez tipos de cancro
em países em desenvolvimento por sexo. Nos homens, o cancro do pulmão, brônquios e traqueia
está associado a uma maior ocorrência de novos casos assim como mortalidade. Nas mulheres o
cancro da mama ocupa o primeiro lugar relativamente ao aparecimento de novos casos e
mortalidade. O cancro do colo do útero ocupa o segundo lugar relativamente aos novos casos e o
terceiro lugar quando se refere a morte. Adaptado de Torre et al (3).
2
útero.
Contudo, o cancro do colo do útero constitui um problema de saúde pública mesmo

em países desenvolvidos. Só na Europa, mais de 58 000 casos são anualmente diagnosticados
e morrem por ano aproximadamente cerca de 24 000 pessoas (13).
Figura 1. 2: Incidência e mortalidade mundial do cancro do colo do útero. Paralelismo

entre a incidência e mortalidade do cancro do colo do útero a nível mundial. Em regiões como
a Àfrica oriental e Melanésia observa-se uma elevada incidência associada a uma elevada
mortalidade. Na América central apesar da elevada incidência a mortalidade é reduzida
quando comparada com os países anteriormente mencionados. Na Austrália verifica-se uma
baixa incidência e mortalidade. Isto pode ser devido a uma boa estratégia de rastreio e
tratamento implementada nos países desenvolvidos. Adaptado de: Torre et al (3).
3
útero.
Nos Estados Unidos, 12 000 mulheres são diagnosticadas por ano com cancro do colo
do útero. Em termos de saúde pública, cerca de 7% de mulheres com a idade compreendida
entre os 21 e os 65 anos nunca realizaram o teste de Papanicolau (14).
Em 2010, em Portugal a taxa de incidência do cancro do colo do útero foi de 13,5%
para cada 100 000 habitantes. Entre 2011 e 2015 verificou-se uma diminuição do número de
óbitos (Tabela 1.1), observando-se para o mesmo período um aumento na adesão aos
programas de rastreio (Figura 1.3). A mortalidade variou entre diferentes regiões de Portugal
verificando-se os maiores valores na região autónoma dos Açores e na área metropolitana de
Lisboa (Figura 1.4) (15,16).
Tabela 1. 1: Mortalidade provocada pelo cancro do colo do útero de 2010 a 2015 em Portugal.
Adaptado de: Programa Nacional para as Doenças Oncológicas. Direção Geral da Saúde. 2017
(15).
Cancro do colo do útero

2011 2012 2013 2014 2015
Número de 247 214 204 210 201
óbitos
Taxa de 3,2 2,8 2,5 2,6 2,4
mortalidade
padronizada
Taxa por 100 000 habitantes.
4
útero.
Figura 1. 3: Evolução da adesão aos programas de rastreio. Aumento da adesão ao programa de

rastreio de 2009-2016. Adaptado de: Programa Nacional para as Doenças Oncológicas. Direção Geral
da Saúde. 2017 (15).
Figura 1.4: Taxa de mortalidade provocada pelo cancro do colo do útero por cada 100 000
habitantes em diferentes regiões de Portugal. Maior taxa de mortalidade na Região autónoma dos
Açores (R.A. Açores) seguido da Área Metropolitana de Lisboa (A.M.Lisboa). Menor taxa de
mortalidade na R.A.Madeira; R.A.Madeira: Região Autónoma da Madeira. Adaptado de: Programa
Nacional para as Doenças Oncológicas. Direção Geral da Saúde. 2017 (15).
1.2-Cancro do colo do útero

De acordo com a OMS, o cancro do colo do útero pode ser dividido em três tipos:
escamoso, glandular e outros (como por exemplo: carcinoma adenoescamoso e tumores
neuroendócrinos). O carcinoma escamoso corresponde a 70-80% dos casos do cancro do
colo do útero enquanto o adenocarcinoma corresponde a 20-25%. Normalmente, em estádios
precoces o cancro do colo do útero é assintomático. Em estádios localmente avançados os
sintomas podem ser hemorragia vaginal, dor pélvica e corrimento vaginal, podendo ocorrer
dor após o coito (13). Os fatores de risco associados a este tumor maligno são as infeções
5
útero.
persistentes de alto risco pelo vírus HPV, grande número de parceiros sexuais,
imunossupressão, co-infeção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV, do inglês
Human Immunodeficiency Virus) e hábitos tabágicos (17).
O estadiamento do tumor é realizado de acordo com a Federação Internacional de
Ginecologia e Obstetrícia (FIGO, do inglês International Federation of Gynecology and
Obstetrics) (anexo I) juntamente com a classificação TNM na qual T corresponde à extensão
do tumor primário, N ao envolvimento dos gânglios linfáticos e M às metástases à distância.
As dimensões do tumor, o envolvimento vaginal ou parametrial, a extensão para o reto ou
para a bexiga e a metastização à distância são igualmente fatores importantes para o
estadiamento (13).
A palpação, a colposcopia, a curetagem endocervical, a histeroscopia, a cistoscopia e
a proctoscopia são exames que auxiliam no estadiamento. A radiologia, a urografia
intravenosa e outros estudos de imagem como a tomografia computorizada, a ressonância
magnética e a tomografia por emissão de positrões (PET, do inglês positron emission
tomography) ajudam no diagnóstico e no estadiamento do tumor. Para além disso, estes
estudos de imagem ajudam a selecionar a melhor abordagem terapêutica entre a cirurgia, a
quimioterapia ou a radioterapia (9,11,13). A confirmação histológica também é
indispensável (11).
A análise das dimensões, da profundidade da invasão tumoral, do estádio, da invasão
dos gânglios linfáticos e do tipo histológico constituem fatores importantes para o
prognóstico da doença, sendo os mais importantes a invasão e o número de gânglios
linfáticos envolvidos (13).
Neste tumor, os locais mais comuns de metastização à distância são os gânglios
linfáticos do mediastino, o pulmão, a cavidade peritoneal e o osso (11).
A morte provocada por este cancro está relacionada com a persistência ou com a
recorrência em estádios localmente avançados (18). A disseminação local provoca a
obstrução uretral e dor (19). A sobrevida livre de doença aos 5 anos é de 50 a 70% para os
estádios IB2 e IIB, 30–50% para o estágio III e 5–15% para o estágio IV (9).
1.2.1- Papiloma vírus humano

O papiloma vírus humano é um grupo de vírus que se apresenta com cadeia dupla de
DNA e sem envelope, cujo virião tem um tamanho de aproximadamente 55 nm de diâmetro
(20,21). Este vírus tem a capacidade de infetar células do epitélio escamoso, que após um
trauma consegue aceder à camada basal. A sua interação com as células hospedeiras faz-se
6
útero.
através dos recetores de superfície como o sulfato de heparano e a alfa 6 integrina (20,21).
De acordo com a análise da sequência do DNA existem mais de cem tipos deste vírus,
estando cada tipo associado a infeções em diferentes epitélios (22). Cerca de um terço
infetam as células epiteliais do trato genital, e provocam infeções de baixo risco ou de alto
risco. As infeções de alto risco estão associadas com o desenvolvimento de cancro anogenital
enquanto que as de baixo risco estão associadas a alterações benignas. Os sub-tipos de HPV
associados a infeção de alto risco são o 16, o 18, o 31, o 33 e o 45 e os de baixo risco são o 6
e o 11 (17).
Geralmente esta infeção é adquirida após o contato sexual, sendo normalmente
assintomática e com resolução em 90% dos casos em 2 anos após o estabelecimento da
infeção. Em alguns casos pode resultar no aparecimento de verrugas ou de cancro (Figura
1.5) (6,7,23). Esta infeção correlaciona-se com o cancro do colo do útero, da vagina, da
vulva, da cabeça e pescoço, do ânus e do pénis. Está associado a mais de 90% dos cancros
anais e cervicais, 70% dos cancros vaginais, da vulva e da orofaringe e mais de 60% dos
casos de cancro do pénis (21). A infeção persistente por este vírus está relacionada com o
aparecimento do cancro do colo do útero como o carcinoma escamoso e adenocarcinoma
(forma menos comum), sendo que em 99% dos casos se deteta a presença do HPV 16 e/ou
do HPV 18 (13,17). O carcinoma escamoso e as suas lesões precursoras estão
maioritariamente associados ao HPV 16, enquanto que o adenocarcinoma do colo do útero
está etiologicamente associado ao HPV do tipo 18 (13).
Figura 1. 5: Evolução da infeção nas células do epitélio escamoso provocada pelo papiloma
vírus humano (HPV). A maioria das infeções provocadas pelo HPV são transientes e tendem a ser
eliminadas pelo sistema imune até dois anos após o estabelecimento da infeção (seta verde). Quando
não é eliminada, a infeção poderá levar ao estabelecimento de lesão intraepitelial de baixo grau
(LSIL) podendo progredir para lesão intraepitelial de alto grau (HSIL) ou até chegar ao carcinoma
invasivo (seta vermelha). Adaptado de: Shanmugasundaram S, You J (23).
7
útero.
A infeção por este vírus induz a expressão de seis proteínas precoces (E, do inglês
early protein) não estruturais regulatórias (E1, E2, E4, E5, E6, E7) e duas proteínas tardias
(L, do inglês late protein) estruturais da cápside (L1 e L2) (20). As proteínas E1 e E2 são
necessárias para a replicação e tradução viral. A proteína E2 atua como repressor da E6 e da
E7 e controla a sua expressão enquanto a E4 e a E5 ajudam no crescimento viral e as proteínas
L1 e L2 formam a cápside (20,21). Após a integração do vírus no genoma humano ocorre a
desregulação da proteína E2 que, por sua vez, determina o aumento da expressão das
proteínas E6 e E7 (21).
O efeito carcinogénico do HPV deve-se à expressão das oncoproteínas E6 e E7, que
inativam os genes supressores tumorais, TP53 e RB1, o que provoca um crescimento celular
exacerbado e um aumento da expressão da proteína 16 (P16) (24). As oncoproteínas virais,
E6 e E7 ligam-se à proteína P53 (proteína p53) e pRB (proteína retinoblastoma) /P21
(proteína p21) respetivamente. O E6 ao ligar-se à P53 promove a sua degradação através da
formação de um complexo com a P53 e a enzima de ubiquitinização E6-AP (do inglês, E6
associated protein) resultando na transferência da ubiquitina da E6-AP para a proteína P53.
Desta forma, a P53 fica marcada para a degradação no proteossoma. Além de inibir a ação
da P53, a E6 inibe também a ação da BAK/BAX (BAK, do inglês Bcl-2 agonist killer e BAX,
do inglês Bcl-2 associated protein) inibindo, desta forma, a apoptose e induzindo a
instabilidade cromossomal. A E7 ao se ligar a pRB e à P21 promove a transcrição de fatores
importantes na progressão do ciclo celular. A ligação da E7 à proteína pRB inibe a interação
entre a pRB e a E2F (do inglês, E2 transcription factor) o que leva à ativação de genes
responsáveis pela proliferação celular. Desta forma as células malignas têm a capacidade de
ultrapassar a fase G1 como se pode verificar na figura 1.6 (25–27).
8
útero.
Figura 1.6: Efeito cancerígeno do HPV. A E6 (proteína precoce da região 6) promove a ligação da
ubiquitina ligase E6-AP (do inglês E6 associated protein) que transfere ubiquitnas para a proteína p53,
sendo posteriormente degradada no proteossoma. A proteína E7 (proteína precoce da região 7) ao se
ligar à proteína do retinoblatoma (pRB) impede a interação do pRB com o factor de transcrição E2F (do
inglês, E2 transcription factor). Desta forma ocorre a transcrição do E2F que irá atuar sobre genes que
permitirão a transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular. Adaptado de: Yim E and Park J (26).
1.2.2-Prevenção e rastreio
A prevenção primária, ou seja, a vacinação contra o vírus do HPV, é responsável por
prevenir cerca de 70% do cancro cervical. Outra estratégia importante é o rastreio que
permite identificar lesões precursoras do cancro do colo do útero (14).
Os programas de rastreio têm por objetivo detetar a doença em estádios ainda
precoces, assintomáticos, em populações aparentemente saudáveis, de forma a minimizar a
mortalidade (28,29). Estas estratégias são promissoras para o combate desta neoplasia
porém, os programas de rastreio carecem de uma estrutura que se adeque às necessidades e
recursos humanos capacitados. Por outro lado, o programa de vacinação envolve elevados
custos principalmente para países em desenvolvimento (30). O sucesso ainda está
dependente de um programa que promova a igualdade e a qualidade no acesso aos serviços
de saúde (28).
De acordo com a OMS, os métodos de rastreio comummente utilizados são a citologia
(teste de Papanicolau), o teste para o HPV, a inspeção visual com recurso ao ácido acético
(VIA, do inglês visual inspection with acetic acid) (31).
Atualmente estão disponíveis e aprovadas três vacinas contra o HPV: a vacina
9
útero.
bivalente (2vHPV), a quadrivalente (4vHPV) e a nonavalente (9vHPV). Todas conferem

proteção contra o HPV 16 e o HPV 18. A vacina quadrivalente ainda confere proteção contra
o vírus do HPV tipo 11, tipo 6 e contra a proteína estrutural da cápside L1. A vacina
nonavalente confere uma proteção mais alargada (HPV 16, 18, 11, 6, 31, 33, 45, 52 e 58)
(8,13).
A vacina bivalente demonstrou ser eficaz contra os HPV dos tipos 16 e 18 e é eficaz na
prevenção da displasia cervical (13). Já a vacina quadrivalente além de ser eficaz contra o
HPV dos tipos 16, 18, 6 e 11 é eficaz na prevenção de lesões de alto grau, vulvar, anal e
vaginal e ainda, confere proteção contra os condilomas relacionados com os HPV 6 e HPV
11. A vacina nonavalente tem a capacidade de aumentar a proteção contra o cancro cervical
numa percentagem de 70% a 90% (8,32,33).
1.2.3-Tratamento
As opções de tratamento variam desde a cirurgia, a quimioterapia, a radioterapia ou
a combinação destas diferentes abordagens (13). A cirurgia é uma opção terapêutica utilizada
em estádios precoces podendo variar desde a conização, a traquelectomia ou a histerectomia
dependendo do estádio do tumor e da vontade da doente de continuar fértil (13). Em doentes
em estádio precoce (IA-IB) o tratamento consiste em histerectomia radical, disseção dos
gânglios linfáticos e/ou radioterapia com ou sem quimioterapia. Já em doentes com cancro do
colo do útero localmente avançado o tratamento inclui a radioterapia externa em combinação
com a cisplatina e a braquiterapia (19).
Na quimioterapia, o tratamento standard é a cisplatina, administrada na concentração
de 40mg/m2 (34,35). Nas doentes em estádios avançados, com metastização à distância, ou
quando deixam de ser sensíveis ao tratamento com a cisplatina, a combinação com outros
quimioterapêuticos constitui uma opção. Nestas circunstâncias, a associação do
bevacizumab com a cisplatina/paclitaxel ou a associação do bevacizumab com o
topotecan/paclitaxel são opções possíveis (36).
Outros fármacos também utilizados no tratamento desta neoplasia são a carboplatina e o
pembrolizumab (37).
10
útero.
1.3-Cisplatina
A cisplatina foi descoberta por Michele Peyrone em 1844. Após ser aprovada pela
FDA (do inglês, Food and Drug Admnistration) em 1978, tem sido utilizada no tratamento
de diversas neoplasias como o cancro da cabeça e pescoço, do pulmão, do ovário e cancro
do colo do útero (34,38–41).
A cisplatina é um agente alquilante, constituído por um átomo de platina, ligado a
duas amidas e a dois cloretos. Após administração intravenosa em solução salina
rapidamente se difunde pelos tecidos e cerca de 90% liga-se as proteínas no plasma o que
inativa grande parte deste fármaco. Após entrar na célula por difusão passiva ou por difusão
facilitada, no citoplasma (baixa concentração de cloreto) uma ou duas moléculas de cloreto
são substituídas por moléculas de água tornando-se biologicamente ativa (Figura 1.7). Na
sua forma ativa, tem a capacidade de se ligar a proteínas como o RNA ou o DNA,
fosfolípidos da membrana, filamentos do citoesqueleto e glutationa reduzida (GSH).
Posteriormente, é excretada pela via biliar, intestinal e renal (42–44).
Apenas 1% da cisplatina intracelular tem a capacidade de se ligar ao DNA. A sua
ligação ao DNA dá-se de forma covalente formando aductos entre as purinas, localizadas na
mesma cadeia ou em cadeias diferentes, o que impede desta forma a transcrição e a síntese
de DNA. Também se consegue ligar a duas guaninas adjacentes (65%), a uma adenina e a
uma guanina (25%) ou a duas guaninas separadas por uma ou mais bases (10%) (42,43). Ao
detetar a formação de aductos, a célula ativa uma cascata de transdução de sinal a fim de
reparar os danos no DNA, levando desta forma ao bloqueio no ciclo celular que tanto poderá
ocorrer na fase S, na fase G1 ou na fase G2 e quando não é possível reparar ocorre a indução
da morte celular (45–47).
11
útero.
Figura 1. 7: Biotransformação da cisplatina. O meio intracelular e o meio extracelular possuem

diferenças na concentração de cloreto. A concentração de iões cloreto (Cl-) é maior no meio extracelular
do que no meio intracelular. A cisplatina ao entrar na célula, os iões cloretos são substituídos por
moléculas de água, desta forma a cisplatina já não consegue sair para o ambiente extracelular. Esta
substituição permite ainda que a cisplatina se torne biologicamente ativa. Na sua forma ativa é capaz de
interagir com componentes celulares.
1.3.1-Toxicidade
A cisplatina é um dos agentes quimioterapêuticos mais usados no tratamento de
neoplasias em tumores sólidos. A formação de aductos causa citotoxicidade não só nas
células tumorais como nas células normais em divisão. Possui um efeito nefrotóxico,
ototóxico, neurotóxico, elevado efeito emetogénico, além de ser necessário uma hidratação
constante (44,47–49). Estes efeitos colaterais limitam a qualidade de vida dos doentes,
podendo levar à redução da concentração ou mesmo à descontinuação do tratamento (50).
Apesar de atuar nas células em divisão, as células quiescentes do túbulo contornado proximal
renal sofrem grandes danos com o uso deste fármaco. Após uma única administração cerca
de 25% a 35% das doentes tratadas com cisplatina têm uma diminuição da função renal (51).
A nefrotoxicidade da cisplatina deve-se a dois fatores principais: a acumulação da cisplatina
a nível renal e ao sistema de transporte tubular renal (51). A cisplatina é maioritariamente
excretada por via renal porém, é também no rim que se acumula uma grande parte deste
fármaco. Nas células do túbulo contornado proximal renal a concentração de cisplatina é
cinco vezes maior do que no soro. A citotoxicidade renal é dose-dependente limitando o
aumento da concentração durante o tratamento (51).
12
útero.
A difusão passiva e a difusão facilitada mediada por transportadores, são mecanismos

que possibilitam a acumulação da cisplatina nas células tubulares renais. O transportador
catiónico orgânico 2 (OCT, do inglês organic cation transporter) é o principal transportador
a nível renal, responsável por aumentar a concentração deste fármaco e promover a
nefrotoxicidade (44).
No adulto, as células do túbulo contornado proximal renal não estão em divisão, pelo
que não se pode atribuir aos danos no DNA a causa da nefrotoxicidade. Acredita-se que
grande parte da nefrotoxicidade gerada pela cisplatina se deve à formação de espécies
reativas de oxigénio (ERO) como o radical hidroxilo e o peróxido de hidrogénio (52,53).
No fígado, a cisplatina conjuga-se com a GSH e no rim, pela ação da gama-
glutamiltranspeptidase (γ-GT), é clivada em metabolitos reativos capazes de induzir a
nefrotoxicidade (54). Estes metabolitos reativos são capazes de provocar danos na
mitocôndria e induzirem a produção de espécies reativas de oxigénio, inflamação e,
consequentemente, a morte do tecido renal. Assim, em doentes tratados com cisplatina é
comum ocorrer diminuição na taxa de filtração glomerular, diminuição da reabsorção de
sódio e de água e aumento de proteínas e de eletrólitos na urina (55,56).
Para a redução destes efeitos adversos é recomendável a hidratação constante e a
administração de diuréticos como por exemplo o manitol, que tem a capacidade de inibir a
reabsorção de sódio, de cloro e de outros solutos (56).
A toxicidade auditiva causada pela cisplatina normalmente é bilateral e irreversível
variando de acordo com a idade dos doentes, a dose, o número de ciclos e a duração do
tratamento. Os sintomas mais comuns são a perda da audição, dor auditiva e zumbidos
(57,58). A toxicidade auditiva provocada pela cisplatina não ocorre somente pela produção
de ERO, mas também pela diminuição das defesas antioxidantes e pela ativação da
nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase 3 (NOX3, do inglês nicotinamide
adenine dinucleotide phosphate oxidase 3). A NOX3 quando ativada origina ERO que
poderão, por sua vez, inativar proteínas, reagir com os ácidos gordos da membrana
citoplasmática, inativar enzimas antioxidantes e levar à morte celular por apoptose (50,59).
Por vezes a ototoxicidade é detetada apenas quando o problema na fala se torna percetível,
o que poderá implicar gravemente com a qualidade de vida do doente quer a nível social quer
emocional. Têm-se proposto estratégias que promovam a proteção auditiva, porém, nenhuma
ainda foi adotada a nível clínico (58).
A neurotoxicidade periférica, outro efeito adverso relacionado com a cisplatina, é
13
útero.
referenciada em 50% dos doentes tratados com este fármaco. A neuropatia periférica resulta
de danos no sistema nervoso periférico (SNP), impedindo ou diminuindo a correta
comunicação entre o SNP e o sistema nervoso central (60,61). A neurotoxicidade induzida
pela cisplatina pode resultar de diversos tipos de efeitos, como a morte neuronal por
apoptose, a ligação ao DNA mitocondrial, a inibição da síntese e da transcrição de proteínas
mitocondriais, a redução da função mitocondrial ou ainda por aumento da expressão da
ciclina D1 (62–64).
Devido a estas toxicidades houve a necessidade de desenvolver fármacos que também
fossem eficazes, mas com menor toxicidade. A carboplatina é um análogo da cisplatina que
possui menor toxicidade e que também é utilizada no tratamento do cancro do colo do útero
(37,65).
1.3.2-Resposta celular à cisplatina

A cisplatina é um agente citotóxico com capacidade de provocar morte celular por
apoptose e por necrose. Quando se utilizam baixas concentrações deste fármaco as células
apresentam uma morfologia característica da apoptose enquanto que com altas concentrações
as células apresentam características necróticas (66). A apoptose é caracterizada pela
condensação do DNA, fragmentação da cromatina, retração celular, formação de corpos
apoptóticos, enquanto a necrose é caracterizada pela perda da integridade da membrana
citoplasmática, aumento do volume celular, libertação do conteúdo celular e inflamação
(67,68).
Este fármaco também é capaz de promover a paragem no ciclo celular, uma vez que
quando a célula deteta a presença dos aductos fica parada no ciclo celular para reparar o dano
(46). Sugere-se que o check-point existente na fase G2/M está envolvido na indução da apoptose
após o tratamento com a cisplatina (69). Além disso a apoptose também pode ser induzida pela
expressão da P53 (70).
Como já referido anteriormente, os principais efeitos adversos provocados pela
cisplatina estão associados à produção de ERO, como a nefrotoxicidade e a ototoxicidade
(50,53). A cisplatina além de causar danos no DNA nuclear, pode acumular-se na
mitocôndria e formar aductos com o DNA mitocondrial e com proteínas. A mitocôndria além
de ser responsável pela produção de energia é a maior fonte endógena de ERO (71). A
formação de ERO é capaz de provocar a peroxidação lipídica que, por sua vez, poderá induzir
alterações enzimáticas, alterações na estrutura das proteínas e promover a apoptose (71).
14
útero.
Apesar da cisplatina ser o agente quimioterapêutico standard utilizado na clínica do

cancro do colo do útero, além da sua alta toxicidade, a resistência a este fármaco também
constitui um desafio. Em alguns casos a neoplasia responde inicialmente à terapêutica e,
posteriormente, deixa de responder (resistência adquirida) mas em outros casos a resistência é
primária (34,37,65).
A célula tumoral pode desenvolver vários mecanismos de resistência a este fármaco
desde a diminuição da captação do fármaco, o aumento do efluxo, a indução da
destoxificação por ligação covalente à glutationa ou a metaloproteínas e a reparação do DNA
(47). No cancro do colo do útero reporta-se ainda o aumento da reparação do DNA, a
inativação da apoptose, a ativação da transição epitélio-mesênquima e a alteração do padrão
de metilação (65).
A sobrexpressão de transportadores pertencentes à superfamília ATP binding cassette
(ABC), constitui um mecanismo de resistência à cisplatina já referido em alguns estudos,
levando a diminuição da concentração intracelular do fármaco por aumento das proteínas de
extrusão (72,73).
A cisplatina pode-se ligar à GSH, à metionina, às metalotioneínas e a outras proteínas
ricas em cisteína de onde pode resultar na diminuição das reservas antioxidantes e no
aparecimento de stresse oxidativo. Por outro lado, estas proteínas podem atuar como
sequestradores deste fármaco diminuído, assim, a quantidade de cisplatina reativa (47). A
cisplatina, quando conjugada com a GSH, é exportada para fora da célula com ajuda dos
transportadores ABC diminuindo, assim, a sua eficácia (72).
Em linhas celulares resistentes à cisplatina verifica-se que, mesmo com a formação de
aductos inter- e intra-cadeias, as células conseguem escapar à apoptose, quer por aumento da
reparação do DNA quer por aumento da expressão de proteínas anti-apoptóticas (65). O estudo
realizado por Chao et al. demonstrou que a linha celular de cancro de colo do útero HeLa
resistente à cisplatina adquiriu maior capacidade de reparação do DNA (74). Brozovic et al.
verificou que a expressão da Bcl-2 (do inglês, B-cell lymphoma 2) se manteve mais elevada na
linha HeLa resistente à cisplatina do que na linha não resistente (75).
1.4-Radioterapia
A radioterapia é uma terapia altamente utilizada no tratamento do cancro, estimando-se
que 50% dos doentes precisarão desta abordagem terapêutica durante a evolução da doença.
Esta percentagem poderá variar com o estádio da doença, tipo de tumor maligno e o perfil da
população. É utilizada com intenção de cura ou como terapêutica paliativa, podendo ser
15
útero.
aplicada isolada ou combinada com outro tratamento de forma neoadjuvante, concomitante e

adjuvante (76).
A radiação ionizante é a radiação que tem a capacidade de ionizar átomos ou moléculas
(77). Promove a formação de iões que participarão em reações químicas, sendo que em tecidos
vivos a ionização poderá levar a alteração de funções resultando em morte celular ou em cancro
(77). A radiação ionizante divide-se em dois tipos: a radiação eletromagnética e a radiação sob
a forma de partículas. Os raios-X, os raios gama são tipos de radiação eletromagnética enquanto
que no tipo de radiações sob a forma de partículas podemos considerar, entre outras, as
partículas alfa, as partículas beta, os positrões e os neutrões (77).
A radiação X foi descoberta em 1895 por Rontgen. Os raios-X são fotões de alta energia,
produzidos quando ocorre reajustamento eletrónico nas orbitais de um átomo ou por interação
entre partículas carregadas com o núcleo (77,78). A modalidade mais frequente de
telerradioterapia utiliza raios-X, e a entrega de dose é, maioritariamente, de forma fracionada
(76,79).
Diferentes tipos de células possuem diferentes graus de sensibilidade à radiação (78).
As células tumorais como têm capacidade de proliferação mais elevada do que as células não
tumorais, tornam-se mais sensíveis à radioterapia. Porém, relatam-se alguns efeitos colaterais
causados pela radioterapia como a dermatite rádica, toxicidade hematológica e alterações do
trato gastrointestinal (80,81).
Com o intuito de reduzir estes danos, a radioterapia tem sofrido melhorias constantes
devido a uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na sensibilidade e
resistência a este tratamento (80).
Por não ser um procedimento seletivo e afetar as restantes células adjacentes à massa
tumoral, a manipulação de fatores como o tempo, o número de doses, o volume de tecido normal
irradiado, a transferência linear de energia (LET, do inglês linear energy transfer), o
desenvolvimento de técnicas imagiológicas e o uso de colimadores permitiram minimizar os
danos causados nos tecidos normais e limitar as áreas irradiadas de forma a possibilitar com
maior precisão a deposição da dose (78,80).
A radioterapia divide-se em: radioterapia externa, interna e sistémica. Na radioterapia
externa utiliza-se uma fonte externa que emite os feixes de radiação, na radioterapia interna a
fonte da radiação, liquida ou sólida, é colocada no interior do organismo junto ao alvo a irradiar
enquanto que a radioterapia sistémica consiste na administração de radiofármacos (79,82–85).
16
útero.
O fracionamento da dose permite, em grande parte, a redução dos efeitos colaterais em

células normais, diminui a progressão local do tumor, uma vez que entre o intervalo de cada
dose as células têm um tempo para recuperar os danos ocorridos no DNA (78,80,86). Após a
exposição à radiação a célula tenta reparar os danos. A radioterapia quando aplicada, as células
poderão estar em diferentes fases do ciclo celular, sendo que as células na fase G2/M são mais
sensíveis à radiação enquanto que células na fase S são mais resistentes. Com a progressão no
ciclo celular as células que tenham sobrevivido por estarem numa fase mais resistente aos
efeitos da radiação podem agora estar numa fase mais sensível. O intervalo de tempo entre uma
fração e outra permitirá atingir uma maior morte celular. Nos cancros sólidos, devido à
arquitetura dos neovasos sanguíneos existem regiões com pouco aporte sanguíneo e,
consequentemente, pouco oxigénio, ou seja, regiões em hipoxia. Esta diminuição da pressão
parcial de oxigénio confere radiorresistência à célula. Com o fracionamento da dose, as células
poderão ter tempo para reoxigenar e voltar a dividir o que poderá constituir um desafio uma
vez que aumenta a sobrevivência e proliferação celular. Além destes fatores a
radiossensibilidade intrínseca de cada célula também é um fator importante a ter em conta.
Todos estes fatores determinam a base biológica da radioterapia, os chamados cinco R’s da
radioterapia (reparação, redistribuição, reoxigenação, repopulação e radiossensibilidade)
(78,87,88).
Os efeitos biológicos da radiação são classificados como efeitos diretos e efeitos
indiretos. Os efeitos diretos resultam da interação direta entre a radiação e importantes
componentes celulares como enzimas, RNA e/ou DNA. O efeito indireto é através da formação
de radicais livres que funcionam como fontes de espécies reativas de oxigénio e de nitrogénio,
que têm a capacidade de provocar, secundariamente, danos no DNA.
As lesões no DNA podem verificar-se a nível de uma única cadeia (SSB, do inglês
single-strand break) ou a nível das duas cadeias (DSB, do inglês double-strand break) (88,89).
Esses danos são passiveis de serem reparados, porém se a célula for incapaz de efetuar a
reparação inicia-se o processo de morte celular programada (90,91). As células vizinhas das
células irradiadas também sofrem danos causados pela radiação. As células irradiadas
comunicam-se com as células adjacentes por junções aderentes e por fatores libertados no meio
levando as células não irradiadas a responderem da mesma forma. Esta resposta mimetiza os
efeitos da radiação, como o aumento da apoptose, de mutações e de quebra de ligações nas
cadeias do DNA. Esta resposta denomina-se efeito bystander (88,92). Os efeitos indiretos da
radiação dão-se pela radiólise da água havendo a formação de ERO, em especial o radical
17
útero.
hidroxilo e peróxido de hidrogénio. Estas espécies radicalares têm a capacidade de reagir com
moléculas na célula, principalmente com o DNA, alterando a sua estrutura (88).
Os danos nas duas cadeias do DNA são mais difíceis de serem reparados do que os
danos numa única cadeia. As células respondem aos danos no DNA através da ativação de
checkpoints do ciclo celular na fase G1/S ou G2/M. A fase do ciclo celular em que a célula se
encontra está relacionada com a radiossensibilidade uma vez que na fase G2/M a célula é mais
sensível à radiação enquanto que as células que estão na fase S são mais resistentes (67,88).
Esses checkpoints permitem que a célula pare em determinada parte do ciclo a fim de tentar
corrigir o erro. Caso não seja possível corrigi-lo, a célula acaba por morrer, frequentemente,
por apoptose (67,90).
A expressão da proteína P53 é muito importante na resposta celular a radioterapia. A
ativação da proteína P53 inicia várias respostas celulares como a senescência, a apoptose, a
paragem no ciclo celular e a reparação do DNA (93). As células que escapam à apoptose, após
danos irreparáveis do DNA, sofrem catástrofe mitótica ou então ficam paradas no ciclo. A
paragem no ciclo celular dependente da P53 e dá-se através da ativação da P21 impedindo,
desta forma, a célula de entrar na fase S (93,94).
Devido à diferente sensibilidade das células à radioterapia, desenvolveram-se modelos
para explicar as diferenças na sobrevivência após a exposição a este tratamento (88). Quando
uma célula sobrevive ao tratamento e esta mesma célula isolada tem a capacidade de formar
colónias, diz-se que esta célula conseguiu manter a sua capacidade proliferativa ou capacidade
clonogénica (77). A avaliação da capacidade clonogénica, através do ensaio clonogénico,
permite obter informações sobre a radiossensibilidade celular (67).
O modelo mais utilizado na clínica é o modelo linear quadrático (LQ). Este modelo
assume que para ocorrer a morte celular a célula deve possuir mais do que um alvo que devem
ser atingidos, num curto período de tempo, a fim de não ocorrer a reparação (77).
O modelo LQ possui duas componentes, a componente linear α e a componente
quadrática β. A relação α/β traduz a dose em que a componente linear e a componente
quadrática contribuem da mesma forma para a sobrevivência. Valores baixos de α/β (1-5)
indicam que a célula é radiorresistente ou responde tardiamente à radiação enquanto valores
elevados de α/β (6-12) indicam que a célula é radiossensível ou responde precocemente (77).
18
útero.
1.4.1-Radioterapia e morte celular

O objetivo principal da radioterapia é inibir o potencial proliferativo das células e
provocar a morte celular (68,95). Estes processos poderão ocorrer por apoptose, necrose,
catástrofe mitótica, indução da senescência e autofagia (68,96).
A apoptose é caracterizada como uma morte celular programada com uma sequência de eventos
ocorrendo em cascata. É caracterizada pela condensação do DNA, fragmentação da cromatina,
retração celular, formação de prolongamentos na membrana celular (blebs), formação de corpos
apoptóticos que posteriormente serão fagocitados por macrófagos (67,68). A apoptose está
relacionada com a ativação de caspases que poderão ativar a via intrínseca (via mitocondrial)
ou a via extrínseca da apoptose (68).
A necrose é caracterizada por um aumento do volume celular, perda da integridade da
membrana citoplasmática, libertação do conteúdo celular e inflamação (67).
A catástrofe mitótica é a morte celular que resulta de uma mitose inapropriada, isto é,
quando a célula entra em mitose com danos no DNA ou quando esses danos são mal reparados.
A catástrofe mitótica resulta na formação de células poliploides, fusão de células e falha na
citocinese o que poderá levar à morte celular por apoptose, necrose, senescência ou autofagia
(96).
A autofagia é um processo pelo qual as células dissolvem parte do seu próprio
citoplasma com o objetivo de obter moléculas pequenas e energia. A autofagia é controlada por
mais de vinte proteínas que iniciam a formação de autofagossomas que posteriormente se
fundem com os lisossomas para iniciarem o processo de degradação e produção de energia (96).
A senescência está relacionada com a perda permanente da capacidade de divisão das
células. À medida que a célula vai envelhecendo ocorre o encurtamento dos telómeros, com
perda da capacidade de se replicar. Esta senescência replicativa pode também ser induzida
precocemente pela ação da radioterapia (96).
As células reagem de forma diferente à radioterapia pelo que, em alguns tipos de células,
a morte pode ocorrer algumas horas após a exposição à radiação enquanto que a grande maioria
morre muito tempo após a exposição (96). Desta forma, de acordo com o momento em que a
célula morre pode-se classificar a morte celular em dois tipos: morte celular precoce e morte
celular tardia. Na morte precoce ocorre a ativação de vias após os danos causados pela
radioterapia. A indução da apoptose após danos no DNA é um exemplo de morte celular
precoce. A ativação da morte celular precoce pode resultar também de danos causados em
outras estruturas celulares sem ser o DNA. Relativamente à morte celular tardia, ela ocorre após
a divisão celular. A catástrofe mitótica constitui um exemplo de morte celular tardia (96).
19
útero.
A radioterapia atua a nível celular de forma direta ou indireta. Nos efeitos indiretos
ocorre a formação de radicais livres, fundamentalmente, através da radiólise da água (88). As
espécies reativas de oxigénio formadas são por exemplo: o anião superóxido (O2•−), o radical
hidroxilo (OH•) e o peróxido de hidrogénio (H2O2) (97).
As espécies reativas de oxigénio são importantes em funções biológicas como a fagocitose,
produção de energia, regulação do crescimento celular e ainda atuam como segundos
mensageiros (97,98). Porém em excesso são prejudiciais podendo provocar danos no DNA,
RNA, proteínas e peroxidação dos lípidos (98). O excesso de radicais livre é combatido pelas
defesas antioxidantes endógenas ou adquiridos na dieta (98). Esses antioxidantes podem ser a
superóxido dismutase (SOD), a catalase e a GSH (97).
As ERO estão envolvidas na proliferação celular, na sinalização e na metastização das
células cancerígenas, sendo por isso consideradas oncogénicas. Por outro lado, a radioterapia,
quimioterapia e terapia fotodinâmica promovem a formação de espécies reativas de oxigénio o
que provocará a morte celular (99).
1.4.2-Radioterapia e cancro do colo do útero

No tratamento do cancro do colo do útero as formas de radioterapia utilizadas são a
radioterapia externa e a braquiterapia (19).
A braquiterapia é utilizada no tratamento de doentes em estádios avançados. É um tratamento
standard utilizado em combinação com a radioterapia externa sempre que possível (19).
Permite a deposição de altas doses no centro do tumor poupando as estruturas adjacentes (19).
A braquiterapia é administrada em 3 a 5 frações de 5 a 7Gy cada em combinação com a
radioterapia externa (45 a 50Gy de dose total) (100). Alguns estudos relatam o aumento da
sobrevida livre de doença quando a radioterapia é associada a braquiterapia (101,102).
Na radioterapia externa a radiação provém de uma fonte externa (79). A passagem da
radiação através da pele pode provocar lesões dérmicas rádicas. As estruturas adjacentes como
a vagina, os ovários e/ou a bexiga também podem ser afetadas. Quando a radioterapia é
administrada em conjunto com a quimioterapia os sinais e os sintomas como a fadiga, as
náuseas e a anemia tornam-se mais acentuados (103).
Quando o cancro do colo do útero é diagnosticado em estádios avançados a combinação
da radioterapia externa, com a braquiterapia e a quimioterapia constituem opções terapêuticas
(104). Em estádios precoces a radioterapia é uma opção terapêutica com alta taxa de cura (18).
Quanto mais avançado for o estádio, menor a taxa de sobrevivência. A sobrevivência aos cinco
anos é de 66%, 40%, 42% e 22% em estádios IIB, IIIA, IIIB e IVA respetivamente (105). Em
20
útero.
estádios avançados, após a terapêutica com a radioterapia, relata-se recorrência locorregional

em 50 a 70% das doentes (18).
A diminuição da sobrevivência dos doentes poderá ser um possível indicador de que são
necessárias melhorias no tratamento em estádios avançados (105). Além disso, doentes com o
mesmo prognóstico nem sempre respondem da mesma forma ao tratamento, o que poderá estar
relacionado com a variabilidade genética dos doentes (104). A radiossensibilidade pode ser
afetada por fatores intrínsecos e extrínsecos (106). Alguns fatores como a hipoxia, a ativação
de oncogenes, a inativação de supressores tumorais, a reparação no DNA, a apoptose, o ciclo
celular, as células estaminais, a sobrexpressão de algumas moléculas de sinalização estão
descritas como mecanismos de resistência envolvidos no cancro do colo do útero (18,106).
A formação de radicais livres de oxigénio é um dos principais mecanismos de atuação
da radioterapia, o que faz com que células em áreas em hipoxia sejam mais resistentes a este
tratamento (107). A hipoxia estimula a produção do fator indutor de hipoxia (HIF, do inglês
hypoxia-inducible factor). A sua ativação promove a formação de novos vasos, a angiogénese,
e alterações no metabolismo celular (107). Alguns estudos já foram realizados no cancro do
colo do útero com intuito de avaliar o impacto deste fator de transcrição nesta neoplasia. No
estudo realizado por Bachtiary et al., os autores observaram que a sobrexpressão do HIF-1α
está associada a baixa progressão livre de doença (107,108). Em outro estudo realizado por
Dellas et al., os autores observaram que a expressão do HIF-1α está associada a baixa sobrevida
(109).
As alterações no metabolismo da glicose como a sobrexpressão de transportadores
também estão descritos como mecanismos de resistência à radioterapia (106). A sobrexpressão
da família dos transportadores da glicose (GLUT, do inglês glucose transporter) promove o
aumento da glicose no citoplasma de células cancerígenas e está relacionada com o aumento da
glicólise aeróbica no cancro. Em condições hipóxicas HIF-1α induz a expressão do GLUT-1,
aumentando a entrada de glicose na célula (110). Huang et al. observaram que a sobrexpressão
de GLUT-1 está associado a uma baixa progressão livre de doença (106).
1.5-Células estaminais do cancro

As células estaminais são células com capacidade de auto-renovação, de
diferenciação e de proliferação. Têm a capacidade de se diferenciarem em diferentes tipos
de células, desde células que poderão dar origem a todos os tipos de tecidos ou em células
específicas de um determinado tecido, na dependência do microambiente e dos estímulos
durante o processo de diferenciação/desdiferenciação (111,112).
21
útero.
Sabe-se que a maioria dos tecidos humanos, possuem células estaminais. Num tecido
normal a célula tem uma capacidade de proliferação limitada, obedecendo a sinais de forma
a manter a homeostasia. Quando se fala em células tumorais o panorama torna-se diferente,
estas têm a capacidade de desregular estes sinais e crescer de forma exacerbada (113,114).
No que se refere à patologia tumoral acredita-se que a falha a diferentes terapêuticas
está relacionada com a heterogeneidade intratumoral associada à presença de células
estaminais do cancro (do inglês cancer stem cells, CSCs). As CSCs constituem uma pequena
população de células cancerígenas com capacidade de auto-renovação e de proliferação (115–
117). Sustentam a progressão tumoral permitindo haver sempre clones, crescimento e
proliferação celular, metastização mesmo em microambientes com condições pouco favoráveis.
Têm a capacidade de evadir o sistema imune, interagem com as células vizinhas de forma a
obterem nutrientes e conseguem permanecer quiescentes durante longos períodos. Para além
disso, permitem a progressão tumoral inibindo a apoptose, silenciando genes supressores
tumorais e silenciando ou transcrevendo miRNA (118–120). As CSCs residem em nichos
compostos por fibroblastos, células do sistema imunitário, células endoteliais, perivasculares,
citocinas, fatores de crescimento e matriz extracelular. Fazem também parte deste nicho outras
CSCs e células tumorais. O nicho mantém as propriedades estaminais das CSCs, protege-as do
sistema imunitário e facilita a metastização (120). Devido a presença das CSCs muitos cancros
são resistentes à radiação e à quimioterapia o que determina a recidiva. Por outro lado, a
exposição a estes tratamentos poderá ainda ser útil no seu isolamento e identificação
(115,119,121,122). A resistência a estes tratamentos poderá explicar a recorrência e as
metástases à distância. Posto isto, as CSCs ou o seu nicho, poderão ser alvos diretos para o
tratamento (120,123).
A resistência associada à presença de CSCs, deve-se ao facto de elas conseguirem
sobreviver com alterações genéticas que escapam aos mecanismos de senescência e de morte
celular, levando à diversidade genética do tumor (124). Como mecanismo de defesa ao
tratamento relata-se ainda a alta expressão de transportadores associados à extrusão de
fármacos, elevada ativação de vias de sinalização como a Wnt/β-catenina, maior capacidade
de recuperação dos danos no DNA e resistência à morte por apoptose (125–127).
As CSCs podem ser identificadas pela função enzimática, capacidade de formação de
esferas e pela expressão de marcadores de superfície (123). Conhecem-se alguns marcadores
de CSCs tais como o CD44, o CD133, o recetor tirosina quinase (RTK), a aldeído desidrogenase
(ALDH), a molécula de adesão de células epiteliais/antigénio específico epitelial
22
útero.
(EpCAM/ESA) e a subfamília G membro 2 da ATP-binding cassette ABCG2 indicados na

Figura 1.8 (115).
EpCAM CD133 CD44 ALDH
PI3K mTOR
Wnt
AKT
GSK
3β
β-catenina Bad
Sobrevivência Apoptose
Figura 1. 8: Marcadores e vias de sinalização envolvidos na resistência à terapêutica das

cancer stem cells.. EpCAM- molécula de adesão de células epiteliais/antigénio específico
epitelial; PI3K - fosfatidilinositol 3-quinases ; Gsk- glicogénio sintase quinase; mTOR-
mammalian target of rapamycin; ALDH- aldeído desidrogenase. Adaptado de: Ranji P (115).
O CD133 (prominin-1) pertence a família da glicoproteína transmembranar (128).

Localiza-se nas microvilosidades e protusões da membrana e possui um peso molecular de
117 KDa. Foi descrito como um marcador de células estaminais cancerígenas em células
hematopoiéticas, mas posteriormente foi também identificado como marcador das células
estaminais em outros tecidos (126,129,130). Está associado a regeneração, diferenciação,
metabolismo e tumorigênese (131). O aumento da expressão desta proteína é utilizado como
marcador em tumores sólidos incluindo tumores escamosos da cavidade oral. Em alguns
casos permanece controverso a sua utilização como marcador, uma vez que alguns tumores
CD133 negativos apresentam maior capacidade tumorigénica. Porém, em casos de
leucoplaquia oral com expressão de CD133, a probabilidade de evolução da doença é três
23
útero.
vezes maior do que em casos sem expressão de CD133. A expressão desta proteína aumenta
com a agressividade da transformação, isto é, apresenta-se em menores níveis em tecidos
normais e em níveis mais elevados nos tecidos tumorais (129). Diversos estudos realizados
sugerem que a sobrexpressão deste marcador está envolvido na sobrevivência, na invasão,
na metastização e na resistência ao tratamento (122,132,133).
Whang et al. observou que uma população isolada da linha celular HeLa, exibia uma
maior capacidade de proliferação, de diferenciação e de formação de colónias. Apesar da
baixa expressão de CD133 nesta população, apresentava maior capacidade de resistência à
quimioterapia e à radioterapia quando comparada com a população que não expressava este
marcador (134). Por sua vez, Javed et al. ao estabelecerem culturas primárias a partir de
amostras de cancro do colo do útero invasivo de doentes não tratados, observaram que as
células que expressavam CD133 tinham maior capacidade de formação de esferas e exibiam
maior expressão de genes de pluripotência, como o OCT4 (do inglês, octamer-binding
transcription factor 4) e o NANOG (do inglês, Homeobox protein NANOG) (135). No estudo
realizado por Zhang et al. em células da cavidade oral, verificou-se que as CSCs que
expressavam CD133 tinham maior capacidade de formação de tumor, de invasão e de
resistência à quimioterapia (122). Em alguns estudos já se verificou a interação entre o
CD133 e a β-catenina (128,136) . No estudo realizado por Mak et al., verificou-se que o
CD133 interagiu com a desacetilase das histonas HDAC6 promovendo a estabilização da β-
catenina, molécula central da via canónica do Wnt (136). Rappa et al. observou que a
diminuição da expressão de CD133 em células do melanoma aumentava a capacidade de
metastização e da expressão de inibidores da via Wnt (137). Posteriormente, verificaram que
após a diminuição da expressão da prominin-1 ocorria a diminuição da expressão nuclear da
β-catenina em células de melanoma (128).
Participam na sinalização mediada por Wnt, 19 glicoproteínas envolvidas na via
canónica (via dependente da β-catenina) e na via não canónica (via não dependente da β-
catenina). Esta sinalização está envolvida na regulação epitelial tanto do tecido normal como
do tumoral. Esta via está envolvida na regulação do desenvolvimento embrionário, na auto -
renovação e na proliferação das CSCs, no ciclo celular, na inflamação, na polaridade celular,
na migração, na diferenciação e na sobrevivência celular (138–141).
A β-catenina desempenha um papel importante nas junções celulares estando
associada a E-caderina que desempenha um papel importante nas junções aderentes,
ajudando a manter a estrutura das células epiteliais e impedindo a metastização. Quando
24
útero.
ocorre a perda da E-caderina é frequente ocorrer a translocação nuclear da β-catenina e

transcrição de genes (140).
Na via Wnt/β-catenina quando Wnt não se liga ao seu receptor frizzled (FZD), a β-
catenina é fosforilada pela caseína quinase 1α (CK1α) e pelo glicogénio sintase quinase 3β
(GSK3β) existente no complexo formado pela APC (do inglês adenomatous polyposis coli),
GSK3β, Axin e CK1α. Quando fosforilada pela GSK3 fica marcada para a degradação no
proteossoma. A sua degradação impede a transcrição de genes alvos como o c-Myc, a ciclina
D1 e a sobrevivência celular. Por outro lado, quando o Wnt se liga ao receptor FZD e ao co-
receptor proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP, do inglês
Low density lipoprotein receptor-related protein), ocorre a ligação da Dishevelled (Dvl) ao
receptor (FZD) e posterior recrutamento da Axin. O LRP é fosforilado pela CK1α e GSK3β
e ocorre a ligação da Axin ao LRP fosforilado e disrupção do complexo de destruição da β-
catenina (138–140,142–146). Desta forma a β-catenina acumula-se no citoplasma e
posteriormente transloca-se para o núcleo ligando-se ao domínio fator de célula T/fator
potenciador linfoide (TCF/LEF, do inglês T-cell factor/lymphoid enhancer factor) (Figura
1.9) (140).
Figura 1. 9: Via de sinalização Wnt/β-catenina. Na via Wnt/β-catenina quando Wnt não se liga ao
seu receptor frizzled (FZD), a β-catenina é fosforilada pela caseína quinase 1α (CK1α) e pelo
glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β) existente no complexo formado pela APC (do inglês
adenomatous polyposis coli), GSK3β, Axin e CK1α e posteriormente é degradada no proteossoma.
Quando o Wnt se liga ao receptor FZD e ao co-receptor Low density lipoprotein receptor-related
protein (LRP), o LRP é fosforilado e ocorre a disrupção do complexo de destruição. Desta forma a
β-catenina entra no núcleo e promove a transcrição de genes alvos. Adaptado de: MacDonald et
al.(146).
25
útero.
Nesta via de sinalização as proteínas Naked e Axin funcionam como inibidores (147).
Nos vertebrados existem duas isoformas de Naked, a Naked1 e a Naked2. A Naked1 participa
em quase todas as sinalizações mediadas pela via Wnt durante o desenvolvimento e está
sobrexpressa em tumores com mutação na via Wnt/ β-catenina. A Naked2 além de estar
envolvida na sinalização Wnt, também está associada a outras moléculas envolvidas na
polarização celular. Desta forma acredita-se que a Naked1 seja específica da via Wnt/β-
catenina (147). A Naked1 tem a capacidade de interagir com a β-catenina de forma direta
impedindo a sua acumulação nuclear. Além disso, também tem a capacidade de inibir a ação
Dvl, um regulador positivo da via (147,148). Zhang et al. demonstraram que a diminuição
da expressão da Naked1 em células do cancro do pulmão levou ao aumento da expressão da
β-catenina e da Dvl1. Observaram que a sua baixa expressão está associada a estádios mais
avançados do tumor, menor diferenciação, pior prognóstico e maior metastização (148).
Posteriormente, no estudo realizado por Lv et al. observou-se que a baixa expressão de
Naked1 no cancro da mama estava relacionado com a pouca diferenciação, a metastização
ganglionar e diminuição da sobrevivência (149).
A proteína Axin possui duas isoformas, a Axin1 e a Axin2, com funções idênticas.
Ambas são capazes de se ligarem à β-catenina e induzirem a sua degradação (149). Esta
proteína funciona como um scafold que possui sítios de interação com diversas outras
proteínas envolvidas nesta via, como β-catenina, a GSK, a CK1, a APC, a Dvl e o receptor
LRP. Por formar este complexo, facilita a interação entre a β-catenina e a GSK 3β, havendo
a posterior degradação da β-catenina (150,151). A via não canónica (não dependente da β-
catenina) encontra-se menos associada ao desenvolvimento tumoral. Está maioritariamente
associada à migração, à diferenciação e à polarização, estando dividida em duas vias: a
polaridade planar celular (PCP, do inglês planar cell polarity pathway) e a via dependente de
cálcio (140,141).
Na via PCP, após a ligação do Wnt ao FZD ocorre o recrutamento da Dvl e ativação
de duas rotas diferentes: a Rho (do inglês, Ras homolog gene family member) GTPase e ao
substrato de toxina botulínica C3 relacionado a Ras (RAC, do inglês Ras-related C3
botulinum toxin substrate) GTPase. A ativação desta via leva a modulação do citoesqueleto
e ativação da transcrição de genes responsáveis pela adesão e migração (141).
Na via dependente de cálcio, quando o Wnt se liga ao FZD, este complexo ligando-
receptor associa-se a uma proteína G heterotrimérica, formada pela subunidade α,
subunidade β e subunidade γ. Posteriormente, a subunidade α liberta a guanosina difosfato
26
útero.
(GDP) e liga-se à guanosina trifosfato (GTP) o que resultará na ativação da fosfodiestarase.

Por outro lado, as subunidades β e γ ativam a fosfolipase C (PLCβ, do inglês
phospholipaseC-β) resultando na ativação da proteína quinase C (PKC, do inglês protein
kinase C) e aumento de cálcio (140).
1.6-Hipótese
De uma forma geral, e de acordo com os conhecimentos obtidos na parte Introdução deste
trabalho, surgem as seguintes hipóteses:
1) Se a proteína CD133 é responsável pela resistência à quimioterapia e à radioterapia
então após o tratamento com a cisplatina e a exposição à radioterapia a sua expressão
manter-se-á constante ou irá aumentar.
2) Se as CSCs estão associadas à resistência à quimioterapia e à radioterapia e a via Wnt/

β-catenina está associada a manutenção e a proliferação das células estaminais então é
expectável que a expressão destas proteínas esteja alterada após o tratamento com a
cisplatina e a exposição à radioterapia.
1.7-Objetivos
O cancro do colo do útero é um dos principais cancros ginecológicos femininos,
responsável por uma mortalidade acentuada principalmente em países em desenvolvimento. A
heterogeneidade tumoral é uma das principais razões pela qual as células que constituem o
tumor são capazes de escapar aos tratamentos convencionais (quimioterapia e radioterapia)
tornando-se resistentes e eventualmente induzir a recaída. Além do mais, os tratamentos
convencionais estão associados a alta toxicidade por não serem terapias diretamente dirigidas
a um único alvo/marcador. Acredita-se que as CSCs assim como a sustentação de vias
responsáveis pela sua manutenção, proliferação sejam responsáveis por estes mecanismos de
resistência. Desta forma, a presente dissertação teve como principal objetivo avaliar a expressão
da CD133, Wnt, β-catenina e outras proteínas envolvidas nesta via (LRP6, pLRP6, Naked1 e
Axin1) após a exposição à radioterapia e o tratamento com a cisplatina na tentativa de perceber
se estas proteínas poderão ser utilizadas como alvo direto no tratamento, de forma a minimizar
a toxicidade. Como objetivo secundário pretendeu-se perceber se a alteração da expressão da
CD133 irá interferir com a expressão da β-catenina. Para o efeito, estabeleceram-se dois
objetivos concretos:
27
útero.
1) Numa primeira abordagem pretendeu-se avaliar o efeito da cisplatina na linha celular

HeLa. Estudou-se o efeito anti-proliferativo, alterações no stresse oxidativo, na morte
celular, ciclo e avaliaram-se as expressões proteicas da CD133, Wnt, β-catenina, LRP6,
pLRP6, Naked1 e Axin1.
2) Numa segunda abordagem, pretendeu-se avaliar o efeito da radioterapia na linha celular
HeLa. Avaliou-se a capacidade clonogénica, alterações no stresse oxidativo, na morte
celular e avaliaram-se as expressões proteicas da CD133, Wnt, β-catenina, LRP6,
pLRP6, Naked1 e Axin1.
2-Materiais e métodos
2.1-Cultura celular
A linha celular HeLa (ATCC® CCL-2™), derivada do cancro do colo do útero
(adenocarcinoma) foi cedida pela professora Doutora Carmen Lima da Universidade
Campinas, São Paulo, Brasil. A linha celular foi propagada em culturas aderentes em
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma D5648) suplementada a 5% com soro
bovino fetal (do inglês Fetal Bovine Serum, FBS, Sigma F7524), 1% de antibiótico (Sigma
A5955, constituído por 10 000 U/mL de penicilina, 10 µg/mL de estreptomicina e 25 µg/mL
de anfotericina B) e 0,25 mM de piruvato de sódio (Gibco 11360-039) e incubada numa
atmosfera humidificada com 5% de CO 2 a 37ºC na incubadora Binder (Binder®, CB60).
Com a finalidade de se obter uma suspensão celular o meio de cultura (DMEM) foi removido,
e o frasco foi lavado com uma solução tampão de fosfato (do inglês, phosphate buffered
saline,PBS, pH a 7,4), constituída por 137 mM de cloreto de sódio (Sigma S7653), 2,7 mM de
cloreto de potássio (Sigma P9333), 0,8 mM de fosfato de sódio monohidratado (Sigma S9638),
1,5 mM de fosfato de potássio monobásico (Sigma P0662) e 0,54 mM de ácido etilenodiamino
tetra-acético (EDTA, Ameresco M101). De seguida, descartou-se o PBS e adicionaram-se 2
mL de tripsina-EDTA (0,25%, Sigma T4049) para destacar as células, e durante 5 minutos
permaneceram na incubadora. De seguida procedeu-se à inativação da tripsina-EDTA seguida
de desagregação mecânica com 5 mL de DMEM. Posteriormente, para se obter a suspensão
celular com a quantidade de células necessárias para cada experimento efetuou-se a contagem
celular recorrendo-se à técnica do azul tripano (Sigma T0776) na diluição de 1:20 em água
ultra-pura. Para este procedimento, adicionaram-se 20 µL da suspensão celular a 20 µL do azul
tripano e contaram-se as células utilizando uma câmara de neubauer no microscópio óptico
invertido (Nikon eclipse TS100), numa ampliação a 10x.
28
útero.
2.2-Ensaios de sobrevivência, proliferação e viabilidade celular
2.2.1- Determinação das concentrações inibitórias de cisplatina

O ensaio de sulforodamina B (SRB) utilizado para avaliar a citotoxicidade in vitro,
baseia-se na ligação eletrostática entre o corante SRB com os resíduos de aminoácidos das
células que foram previamente fixadas. A quantidade de corante ligado é proporcional à massa
celular, ou seja, quanto maior for o número de células maior será a quantidade de corante e
maior será a absorvância medida, o que permitirá extrapolar a proliferação celular. Este ensaio
é caracterizado por ser simples, sensível, reprodutível e de baixo custo (152–156).
Este ensaio foi utilizado com a finalidade de determinar as diferentes concentrações
inibitórias (IC, do inglês inhibitory concentration), nomeadamente a IC20, a IC50 e a IC80. Para
tal, preparou-se uma suspensão celular na concentração de 0,05×10 6 células por mililitro em
DMEM, distribuindo-se 500 µL por poço, numa placa de 48 poços (Costar® 3548). Após 24
horas, as células foram incubadas com cisplatina (1 mg/mL, TEVA 93.150.834-D) com
concentrações crescentes (0,5-33 µM) durante 24, 48 e 72 horas. Cada ensaio foi realizado
em triplicado e ainda se realizaram dois controlos, um com as células não tratadas e outro
com o solvente (solução salina estéril a 0,9%).
Após o período de incubação com os diferentes fármacos, eliminou-se o meio de
cultura dos poços, lavaram-se as células com PBS e procedeu-se à fixação das células pela
adição de 200 µL de ácido acético a 1% (Sigma 33209) em metanol (Sigma 32213) a cada
poço, ficando a incubar durante 2 horas a 4ºC. Após este período, eliminou-se o ácido acético
a 1% em metanol e adicionaram-se 200 µL de SRB 0,5% (Sigma S9012) em ácido acético a
1% após a placa estar seca. Posteriormente, incubou-se a placa durante 40 minutos a
temperatura ambiente e ao abrigo da luz. De seguida, as células foram lavadas com água
corrente e, após remover o excesso, adicionaram-se 200 µL de TRIS-NaOH (10 mM,
pH=10). Após homogenização, as suspensões celulares foram transferidas para uma placa
de 96 poços (Costar 3596®). Efetuou-se a leitura da absorvância com o comprimento de
onda de 540 nm com um filtro de referência de 690 nm no espectrofotómetro ELISA
(Biotek® Synergy HT, EUA). A percentagem de inibição de proliferação foi calculada para
as células tratadas, após normalização ao respetivo controlo. Os dados obtidos permitiram
traçar as curvas de proliferação e determinar o IC 20, o IC50 e o IC80 recorrendo ao software
OriginPro 8.0.
29
útero.
2.2-Avaliação dos efeitos da terapêutica com raios-X

Para irradiar a linha celular HeLa preparou-se uma suspensão celular com a
concentração final de 0,5×106 células por mililitro, utilizando eppendorfs com um volume
final de 600 µL, tendo sempre em atenção perfazer o volume total de modo a minimizar a
presença de ar. As suspensões foram irradiadas com diferentes doses entre 0,5 Gy e 10 Gy
no acelerador linear acelerador Varian Clinac 600C (Varian, California, EUA), com raios-X
de energia de 4 MeV no Serviço de Radioterapia do Centro Hospitalar e Universitário de
Coimbra (CHUC). Realizou-se ainda, um controlo que acompanhou todo o processo com
exceção da irradiação.
Para garantir que a distribuição das doses fosse homogénea e a irradiação reprodutível,
utilizou-se uma caixa de irradiação em acrílico com paredes de 1 cm de espessura, com marcas
para o posicionamento gravadas em relevo possibilitando, assim, o alinhamento em paralelo
com os feixes da gantry de acordo com o referenciado em Mendes et al. (figura 2.1) (157). A
caixa foi construída no Departamento de Física da Faculdade de Ciências e Tecnologia da
Universidade de Coimbra, encontra-se certificada e foi submetida a um estudo dosimétrico por
imagens de tomografia computorizada igual à executada nos doentes, como demonstrada a
figura 2.2.
O procedimento iniciou-se por colocar a caixa em cima da mesa de tratamento, que
posteriormente foi enchida com água, a 37ºC de forma a garantir a homogeneidade das doses e
os eppendorfs previamente marcados para cada condição, foram completamente submersos
em água, com exceção do controlo que foi mantido fora da sala durante o processo de
irradiação. A caixa foi alinhada longitudinalmente, horizontalmente e verticalmente com o
feixe de luz da gantry. De seguida, as doses foram depositadas, com a gantry posicionada a
270º e a 90º de forma a perfazer os 0,5 Gy num campo de 40×40 cm. As doses foram
cumulativas até à dose de 10 Gy (270º e 90º). As doses para cada condição encontram -se na
tabela 1 abaixo indicada:
Tabela 2. 1: Doses administradas em unidades de monitor (UM, do inglês monitor units, 1

MU=0,022 Gy), com a gantry posicionada a 270º e a 90º.
Dose 0,5 Gy 1 Gy 1,5 Gy 2 Gy 3 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy 10 Gy
270º 23 UM 23 UM 23 UM 23 UM 47 UM 47 UM 93 UM 93 UM 93 UM
90º 23 UM 23 UM 23 UM 23 UM 46 UM 46 UM 92 UM 92 UM 92 UM
30
útero.
Figura 2. 1: Caixa da irradiação construída em acrílico. Marcas para o posicionamento gravadas

em relevo, plano sagital (A) e plano frontal (B).
Figura 2. 2: Distribuição da dose na caixa de irradiação. Representação dos planos transversal

(A), frontal (B) e sagital (C) com distribuição da dose, determinada por tomografia computorizada.
A azul distribuição mínima da dose correspondendo a 95% e a vermelho a distribuição máxima
correspondendo a 106%. Mendes et al (157).
2.2.1- Determinação da dose letal

O ensaio clonogénico é um ensaio que avalia a capacidade de uma única célula formar
colónias, considerando-se uma colónia um grupo com pelo menos 50 células. Permite avaliar
a viabilidade e a sobrevivência celulares em células submetidas a radiação ionizante ou
expostas a agentes citotóxicos (152,158,159). Para a realização deste ensaio, as placas de 6
poços (Costar 3516) foram revestidas com poli-D-lisina (Sigma P6407). Este revestimento
foi feito por se ter verificado um aumento no destacamento celular com o decorrer do ensaio.
Para tal preparou-se uma solução de poli-D-lisina, numa concentração final de 0,1 mg/mL.
31
útero.
Adicionou-se 1 mL dessa solução por poço e, após 10 minutos, removeu-se o excedente por
lavagem dos poços com água ultrapura estéril. Após a lavagem, as placas permaneceram na
câmara de fluxo durante a noite expostas a radiação ultravioleta. Posteriormente foram
seladas e mantidas a 4ºC até ao momento da utilização. Após a irradiação, ao chegar à sala
de cultura, as suspensões celulares foram diluídas em eppendorfs previamente marcados para
cada condição de forma a obter uma concentração final de 0,1×10 6 células por mililitro. De
seguida as células foram plaqueadas em placas de 6 poços, em triplicado, com o número de
células por poço respetivas a cada condição como mostra a tabela 2. Adicionaram-se três
mililitros de meio de cultura DMEM em cada poço e, posteriormente, as placas foram
incubadas durante 10 dias a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2. Durante este período
mudaram-se os meios das respetivas placas duas vezes. Após o período de incubação o meio
das placas foi descartado, as placas foram lavadas com PBS, fixadas com 2 mL de metanol
durante 20 minutos. Descartou-se o metanol e, após deixar secar as placas, adicionou-se um
mL de violeta de cristal (Sigma C3886) a 0,5% em metanol durante cinco minutos. Efetuou-
se a remoção do excesso de corante e após as placas estarem secas, efetuou-se a contagem
das colónias formadas. Desta forma, foi possível calcular a eficiência da placa (PE, do inglês
plate efficiency) e o fator de sobrevivência (SF, do inglês surviving factor) de acordo com a
Equação 1 e com a Equação 2, respetivamente.
Tabela 2. 2: Número de células por cada condição.

Controlo 0,5 Gy 1 Gy 1,5 Gy 2 Gy 3 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy 10 Gy
1200 1200 1200 1200 1200 1400 1400 1600 1600 2500
Eficiência da placa (PE, do inglês plate efficiency) (%)
Equação 1
Número de colónias contadas
PE = × 100
Número de colónias semeadas
32
útero.
Fator de sobrevivência (%)
Equação 2
PE amostras tratadas
SF = × 100
PE amostras controlo
Relacionando as doses de radiação com o fator de sobrevivência (Fs) foi possível

estabelecer uma curva dose-resposta, utilizando o modelo linear quadrático.
Fator de sobrevivência
Equação 3
2
𝑆𝐹 = 𝑒 −𝛼𝐷−𝛽𝐷
onde D corresponde à dose de radiação, 𝛼 ao parâmetro linear e 𝛽 ao parâmetro
quadrático de ajuste.
2.3-Avaliação dos efeitos da quimioterapia e da radioterapia na linha celular HeLa

Após a obtenção da DL50 e da IC50 e para determinar a radiossensibilidade utilizaram-
se doses acima (10 Gy), inferior (2 Gy) e igual à DL50 e concentrações superiores (IC 80),
inferiores (IC20) e iguais à IC50, após um período de incubação de 48 horas.
Para analisar o efeito da cisplatina na linha celular, por citometria de fluxo, distribui-se
uma suspensão celular com 2,5×106 células por mililitro e adicionou-se meio (DMEM) de modo
a perfazer o volume final de 12 mL. Após 24h, incubaram-se as células em frascos de 75 cm2,
com a respetiva concentração dos fármacos previamente calculada para corresponder à IC20, à
IC50 e à IC80. Após 48 horas, removeu-se o meio de cultura dos frascos, as células foram lavadas
com PBS e posteriormente destacadas com tripsina-EDTA, após incubação durante 5 minutos
numa atmosfera com 5% de CO2. De seguida, realizou-se uma centrifugação a 2500 rpm
durante 5 minutos (Heraeus, multifuge 1LR). Após a centrifugação, decantou-se o sobrenadante
e adicionou-se um mililitro de PBS para cada condição. Após ressuspender o pellet, distribuiu-
se a suspensão pelos respetivos tubos de citometria (Sarstedt 55.1579) e voltou-se a centrifugar
a 2500 rpm durante 5 minutos, com exceção dos tubos destinados à avaliação do stresse
33
útero.
oxidativo e das defesas antioxidantes. Cada condição foi efetuada em duplicado, realizando-se
no mínimo 3 experiências independentes.
Para avaliar o efeito da radioterapia na linha celular, por citometria de fluxo, a suspensão
celular foi preparada como referida anteriormente, mas utilizando um eppendorf de 2 mililitros,
tendo sempre em atenção de perfazer o volume total do eppendorf de forma a minimizar a
presença de ar. Para a condição controlo, 2 Gy e 3 Gy foram necessários quatro eppendorfs e
para a condição de 10 Gy cinco eppendorfs. Após a irradiação, as suspensões celulares
irradiadas para cada condição foram colocadas nos respetivos frascos, previamente marcados,
e após 48 horas realizaram-se os estudos abaixo indicados.
De seguida iniciaram-se os protocolos para avaliar a morte celular, a viabilidade celular,
o ciclo celular, o stresse oxidativo e as defesas antioxidantes.
2.3.1-Avaliação da viabilidade celular e do tipo de morte

Com o intuito de avaliar a viabilidade celular e a morte celular provocada pela cisplatina
e pela radioterapia utilizou-se a dupla marcação com anexina V acoplada ao fluorocromo
isotiocianato de fluoresceína (FITC) e com iodeto de propídeo. A apoptose é uma forma de
morte programada que pode ser desencadeada por diversos fatores como, por exemplo,
agentes quimioterapêuticos e ativação de receptores de morte celular. Este processo é
caracterizado pela exposição da fosfotidilserina na membrana celular, formação de corpos
apoptóticos, fragmentação da membrana nuclear e diminuição do volume celular. A
exposição da fosfotidilserina pode ocorrer tanto num processo inicial (apoptose inicial) ou
tardio (apoptose tardia). Estando a fosfatidilserina exposta na membrana, a anexina V
consegue-se ligar a este fosfolípido o que permite identificar células em apoptose (160). Na
necrose e na apoptose tardia ocorre a quebra da membrana citoplasmática possibilitando a
entrada do iodeto de propídeo na célula. O iodeto de propídeo tem a capacidade de se ligar
aos ácidos nucleicos, sendo a fluorescência emitida proporcional à quantidade de ácidos
nucleicos. Posto isto, é possível identificar quatro populações: a população das células
viáveis (duplamente negativas para a anexina V e o iodeto de propídio), a população das
células em apoptose inicial (positivas para a anexina V), a população das células em apoptose
tardia/necrose (duplamente positivas para a anexina V e o iodeto de propídeo) e a população
das células em necrose (positivas para o iodeto de propídeo) (160,161). Para a realização
deste protocolo, decantaram-se os sobrenadantes e adicionaram-se ao pellet de células, após
ressuspensão, 100 µL de tampão de ligação (1×) constituído por 139,9 mM de cloreto de
sódio (Sigma S7653), 7 mM de HEPES (Sigma H7523) e 3,3 mM de cloreto de cálcio (Sigma
34
útero.
C4901). Posteriormente adicionaram-se 2,5 µL de anexina V (Immunostep s.l) e 1 µL de

iodeto de propídeo (Immunostep) e homogenizou-se no vórtex. Os tubos foram incubados
durante 15 minutos, no escuro e à temperatura ambiente. Seguidamente. adicionaram-se
novamente 400 µL de tampão de ligação (1×) e, após agitação suave no vórtex, foram
avaliados recorrendo ao citómetro FACSCalibur nos comprimentos de onda excitação de
488 nm e de emissão de 530 nm para AnV-FITC e de 640 nm para o iodeto de propídeo. Os
resultados, em percentagem, correspondem às células marcadas presentes em cada
população, isto é, células viáveis, células em apoptose inicial, células em apoptose
tardia/necrose e células em necrose.
Adicionalmente, avaliou-se a morfologia celular com recurso à microscopia, para
identificar os diferentes tipos de morte, utilizando a coloração May-Grünwald-Giemsa. Esta
coloração permite avaliar a estrutura celular com os núcleos a corar de vermelho-violeta e o
citoplasma de rosa a azul.
Para a realização deste ensaio foram plaqueadas 0,01×10 6 células por mililitro em
placas de doze poços. Após 24 horas, adicionaram-se a cada poço os fármacos a testar, nas
concentrações correspondentes ao IC 20, ao IC50 e ao IC80. Realizou-se cada condição
(controlo, IC20, IC50 e IC80) em triplicado.
Para avaliar o efeito da radioterapia, após expor as células ao tratamento plaquearam-
se 0,01×106 células por mililitro em placas de doze poços, realizando-se cada condição
(controlo, 2Gy,3Gy e 10Gy) em quadriplicado.
Após 48 horas dos tratamentos acima mencionados, removeu-se o meio de cultura dos
poços, lavou-se cada poço com PBS e de seguida as células foram destacadas. Para cada
condição o meio, o PBS e as células foram adicionadas ao falcon previamente marcado
minimizando assim a exclusão das células (vivas e mortas) do ensaio. As suspensões celulares
foram centrifugadas a 2500 rpm durante 5 minutos. Descartaram-se os sobrenadantes,
adicionaram-se 2 mililitros de PBS e realizou-se uma nova centrifugação nas mesmas condições
mencionadas anteriormente. O pellet foi ressuspenso e adicionaram-se 20 µL de suspensão de
cada condição na lâmina. De seguida, as células foram fixadas em metanol (Ficher chemical,
M/4000/FP21) durante cinco minutos. Após a fixação utilizou-se o corante May-Grünwald
(Merck, Darmstadt, 25% v/v em metanol) durante três minutos. De seguida incubaram-se as
lâminas com Giemsa (Merck, Darmstadt, 5,56% v/v em água) durante dez minutos.
Posteriormente as lâminas foram lavadas em água corrente durante cinco minutos.
35
útero.
2.3.2-Avaliação do ciclo celular

Para avaliar a distribuição das células pelo ciclo celular utilizou-se o iodeto de
propídeo com RNAse. Neste ensaio a quantidade de luz emitida é proporcional à quantidade
de DNA ligado, o que permite distinguir células na fase G0/G1, na fase S ou na fase G2/M.
Com esta metodologia é ainda possível identificar células na fase pré-G0/G1, que
correspondem a células em apoptose (162). Para a realização deste protocolo, procedeu-se à
decantação dos sobrenadantes e adicionaram-se 200 µL de etanol a 70% com os tubos em
agitação constante no vórtex. De seguida, foram incubados durante 30 minutos no escuro a
4ºC. Posteriormente, adicionaram-se 2 mL de PBS (1×) e centrifugaram-se a 2500 rpm
durante 5 minutos. Novamente, decantaram-se os sobrenadantes e adicionaram-se 200 µL de
iodeto de propídeo com RNAse (PI/Solução de RNase, Immunostep). Realizou-se uma nova
homogeneização no vórtex e de seguida uma incubação durante 15 minutos no escuro à
temperatura ambiente. Posteriormente, foram agitados no vórtex e efetuou-se a leitura com
os comprimentos de onda de excitação de 488 nm e de emissão de 640 nm. Os resultados
foram quantificados com recurso ao software ModFit LT™, Verity, Software House e
apresentados como percentagem de células no pico apoptótico e em cada fase do ciclo celular
nomeadamente G0/G1, S e G2/M.
2.3.3-Avaliação das espécies reativas de oxigénio e defesas antioxidantes

Para avaliar as espécies reativas de oxigénio e as defesas antioxidantes analisou -se,
por citometria de fluxo, a produção de peróxidos, o radical superóxido e a glutationa reduzida
respetivamente. Para tal recorreu-se ao uso da DCFH2-DA (2’,7’-
diclorodihidrofluoresceínadiacetato), da DHE (dihidroetidina) e do alaranjado de mercúrio,
respetivamente. Para analisar a influência do radical hidroxilo na proliferação celular, realizou-
se o ensaio SRB na presença do manitol (inibidor do radical hidroxilo).
2.3.3.1-Avaliação da produção intracelular dos peróxidos

A DCFH2-DA é uma sonda que tem a capacidade de atravessar a membrana celular.
Ao entrar na célula é clivada pelas esterases originando a 2’,7’ diclorodihidrofluoresceina
(DCFH). Posteriormente a DCFH é oxidada pelos peróxidos originando o composto
fluorescente 2’,7’-diclorofluoresceina (DCF). O DCF emite uma fluorescência na zona do
verde, proporcional à quantidade de peróxido de hidrogénio (H2O2) (163,164). Para a realização
deste protocolo adicionou-se 1 µL de DCFH2-DA numa concentração de 5 µM, dissolvida em
dimetilformamida a 1 mM (Molecular Probes®, D-399). De seguida, os tubos foram
36
útero.
homogeneizados no vórtex e incubados durante 45 minutos no escuro a 37ºC. Após este

tempo de incubação adicionaram-se 2 mL de PBS (1×) sendo posteriormente centrifugados
a 2500 rpm durante 5 minutos. Posteriormente decantaram-se os sobrenadantes e
adicionaram-se 400 µL de PBS (1×). Novamente, voltou-se a homogeneizar os tubos no
vórtex. De seguida efetuou-se a leitura no citómetro FACSCalibur nos comprimentos de
onda de excitação de 488 nm. Os dados obtidos estão expressos como a razão da média das
intensidades de fluorescência (MIF), normalizadas pelo controlo.
2.3.3.2-Avaliação da produção intracelular do radical superóxido

O DHE quando oxidado pelo superóxido origina um composto vermelho fluorescente
que tem a capacidade de se ligar ao DNA (165,166). Para a análise do radical superóxido
adicionaram-se 5 µL de DHE dissolvido em DMSO (dimetilsulfóxido) numa concentração
final de 5 µM. De seguida, os tubos foram homogeneizados no vórtex e incubados durante
15 minutos no escuro a 37ºC. Posteriormente adicionaram-se 2 mL de PBS (1×).
Centrifugaram-se os tubos a 2500 rpm durante 5 minutos, decantaram-se os sobrenadantes e
adicionaram-se 400 µL de PBS (1×). Novamente, homogeneizaram-se os tubos e efetuou-se
a leitura com os comprimentos de onda de excitação de 620 nm. Os dados obtidos estão
expressos como MIF, normalizadas pelo controlo.
2.3.3.3-Avaliação da produção intracelular do glutationa reduzida

A GSH desempenha um papel importante na proteção das células contra os efeitos do
stresse oxidativo. Apesar da sua função na proteção celular, em níveis elevados a GSH pode
constituir um mecanismo de resistência a fármacos, pelo que a sua análise se torna
importante para avaliar a capacidade antioxidante da célula. Para a determinação dos níveis
da GSH utilizou-se o alaranjado de mercúrio. Este composto tem a capacidade de formar
aductos com os grupos sulfidril presentes na GSH (167–169). Para este ensaio, adicionou-se
1 µL de alaranjado de mercúrio (Sigma, M7750) numa concentração de 40 µM e de seguida,
os tubos (previamente homogeneizados no vórtex) foram incubados durante 15 minutos a
37ºC. Adicionaram-se 2 mL de PBS (1×). Posteriormente foram centrifugados a 2500 rpm
durante 5 minutos, decantaram-se os sobrenadantes e adicionaram-se 400 µL de PBS (1×).
Novamente voltou-se a homogeneizar os tubos no vórtex. Posteriormente, efetuou-se a
leitura no citómetro com o comprimento de onda de excitação de 620 nm. Os dados obtidos
estão expressos como MIF, normalizadas pelo controlo.
37
útero.
2.3.3.4-Avaliação da influência do radical hidroxilo na proliferação celular

Na tentativa de perceber a ação citotóxica da cisplatina, além de se avaliarem as ERO
também se avaliou o inibidor do radical hidroxilo, o manitol. Esta avaliação foi realizada por
não ser possível quantificar diretamente o radical hidroxilo. Este radical é conhecido por ser
o radical mais biologicamente ativo (causa danos no DNA, lípidos e proteínas) (170–173).
Para a realização deste ensaio seguiu-se o protocolo referenciado na determinação
das concentrações inibitórias. Após 24 horas mudou-se o meio de cultura e adicionaram-se
em cada poço 500µL de meio com 40 mM de manitol (Sigma, M9647) como referido na
literatura (171). Realizaram-se três controlos, um em que ao meio com manitol (40mM) se
adicionaram 5 µL de soro fisiológico (solvente), o segundo com meio com 40 mM de manitol
e terceiro com apenas o meio. Posteriormente, os restantes poços foram tratados com
cisplatina com concentrações crescentes (0,5-33µM) e após 48 horas efetuou-se o restante
protocolo acima referido (determinação das concentrações inibitórias).
2.3.4- Determinação da expressão das proteínas

De modo a perceber os efeitos causados pela ação da cisplatina e da radiação
ionizante procedeu-se à avaliação das proteínas CD133, Wnt e β-catenina por
imunocitoquímica e da CD133, da Wnt, da β-catenina, da LRP6, da pLRP,6 da Axin1 e da
Naked1 por western blot.
2.3.4.1- Avaliação da expressão por imunocitoquímica

A imunocitoquímica assim como a imunohistoquímica tem por base a deteção de
antigénios com recurso a anticorpos específicos. Diferenciam-se pela natureza da amostra,
pois a primeira deteta anticorpos em amostras citológicas e a segunda deteta anticorpos em
tecidos (174,175).
Para a realização deste ensaio as células foram preparadas e tratadas como referido
anteriormente na citometria. Após um período de incubação de 48 horas com os respetivos
fármacos, as quatro condições (controlo, IC 20, IC50 e IC80) foram tripsinizadas e
centrifugadas a 1500 rpm durante 5 min. Posteriormente adicionaram-se 2 mL de PBS e
centrifugaram-se novamente a 1500 rpm durante 5 min. De seguida as células foram fixadas
com 2 mL de etanol a 96 %.
Como controlo foram utilizadas amostras de tecido humano, sem patologia
conhecida, da amígadala, do apêndice, do fígado, do pâncreas, da próstata, do rim, da
placenta e do pulmão. Estas amostras funcionaram como controlo multitecido dos anticorpos
38
útero.
de referência. Estas amostras foram fixadas em formol neutro tamponado a 4% (FNT 4%,
VWR 9713.9010) à temperatura ambiente durante 24 horas. Posteriormente foram
processadas overnight no processador Leica ASP300 (Leica Biosystems, Nussloch,
Alemanha) de acordo com a rotina do Serviço de Anatomia Patológica do Centro Hospitalar
e Universitário de Coimbra. De seguida, foram incluídas em blocos de parafina. Os cortes
histológicos de 4 µm de espessura (micrótomo Leica RM2125 RTM) foram avaliados
morfologicamente após a coloração por Hematoxilina-Eosina. Para promover a adesão dos
mesmos à lâmina Superfrost Plus (Thermo Scientific, J1800AMNZ) foram colocados na estufa
(Memmerth UFE500, Schwabach, Alemanha) a 80°C durante 20 minutos. Após a adesão e
arrefecimento da lâmina, adicionaram-se 50 µL de cada condição e deixou-se secar durante 20
minutos. Os cortes foram desparafinados com xilol (VWR chemical 100%, álcool absoluto). A
recuperação antigénica dos cortes foi realizada na solução tampão de EDTA-Tris, (CC1,
Ventana Medical Systems, 950-124, EUA, pH=8) a 95°C, durante 8 min num módulo de pré-
tratamento PT Link (Dako, Glostrup, Dinamarca). De seguida as lâminas foram colocadas
no equipamento Benchmark Ultra (Ventana Medical Systems, Arizona, EUA) para
completar o restante protocolo de imunocitoquímica. Utilizaram-se os seguintes anticorpos
abaixo indicados na Tabela 2.3.
Tabela 2. 3: Anticorpos primários e condições utilizadas no protocolo.

Anticorpo Clone Período de Diluição Fabricante Referência
incubação
(minuto)
CD133 pAb 12 1/150 GeneTex GTX1022109
Texas,EUA
Wnt pAb 40 Pronto a Spring 053034478001

usar biosciences
California,EUA
β-catenina p120 4 Pronto a Ventana 790-4517

usar medical
Arizona, EUA
systems
39
útero.
2.3.4.2-Avaliação dos níveis proteicos (LRP6, pLRP6, β-catenina, Axin1, Naked1 e

CD133) na linha celular
O western blot é uma técnica que permite separar e identificar proteínas de acordo
com o seu peso molecular. É composto por três etapas principais: separação por tamanho,
transferência para um suporte sólido e marcação por anticorpo primário e secundário de
interesse (176).
Para realizar este ensaio plaquearam-se 0,3×106 células por poço numa placa de 6
poços (SPL life sciences) com um volume final de dois mililitros para os diferentes
tratamentos, radioterapia e quimioterapia, para as condições controlo, IC 20, IC50, 2 Gy, 3 Gy
em duplicado. Para a condição IC 80 e 10 Gy plaquearam-se 0,6×106 células por mililitro em
frascos de 25 cm2 em triplicado perfazendo o volume final de quatro mililitros. Cada
experiência foi realizada de forma independente 4 vezes.
Na quimioterapia após 24 horas das células serem plaqueadas, as placas e os frascos
foram incubados com as respetivas concentrações de cisplatina correspondendo ao IC 20, ao
IC50 e ao IC80. Após um período de exposição (48 horas) aos tratamentos (radioterapia e
quimioterapia) obtiveram-se os extratos proteicos.
O protocolo iniciou-se por remover o meio de cultura das respetivas condições, de
seguida lavaram-se os poços e frascos com um mililitro de PBS (1×) a 4ºC. Após remover o
PBS, efetuou-se a lise com 200 µL de tampão de Laemmli 1× constituído por 3,13 mM de
Tris-HCl (Nzytech MB01610), 54 mM de glicerol (Sigma G9891), 17,3 mM de dodecil
sulfato de sódio (do inglês, sodium dodecil sulfate, SDS, Nzytech, MB18101), 1,6 mM de β-
mercaptoetanol (Sigma M6250) e 0,037 mM de azul de bromofenol (Sigma B8026-5G). Com
o auxílio de um raspador soltaram-se as células do poço e do frasco, que foram transferidas
para um eppendorf e centrifugadas (centrífuga, Sigma 3-16K) a 14 000 rpm durante vinte
minutos a 4ºC. De seguida transferiram-se os sobrenadantes para eppendorfs previamente
identificados e foram armazenados a -20ºC até ao momento de utilização. Antes da
utilização, as amostras foram sonicadas (sonics vibra cell) durante 5 segundos e aquecidas
durante 5 minutos em banho-maria a 100 ºC. Aos poços adicionaram-se 20µL de condição,
normalizando-se o volume com o controlo de carga usado (calnexina, sicgen AB0037).
40
útero.
2.3.4.2.1-Preparação dos géis

Utilizou-se o gel de migração (resolving gel) a 8% constituído por 0,75 mM de Tris-
HCl, SDS a 0,2%, pH=8,8 em que se adicionaram 1120 mM de acrilamida (Grisp Gb
16.4029), 33 mM de persulfato de amónia (APS, Honeyweel 248614-100G) e 4,2 mM
tetrametiletilenodiamina (TEMED, Nzytech MB03501). O gel de migração foi colocado no
suporte de 1 mm de espessura (Biorad). Após polimerização, adicionou-se o stacking gel
constituído por 0,25 M de Tris, SDS a 0,2%, pH=6,8, em que se adicionaram previamente
645 mM de acrilamida, 2,69 mM de APS e 9,1 mM de TEMED.
Posteriormente, após polimerização do stacking gel, removeram-se os pentes e
carregaram-se os poços com o marcador de peso molecular (Precision Plus Protein
Standard, Biorad) e as respetivas amostras. De seguida, realizou-se a corrida da eletroforese
vertical para separar as proteínas consoante o peso molecular com o tampão de corrida (125
mM de Tris-base, 480 mM de glicina, SDS a 1%, pH=8,8) a 60 V durante trinta minutos e
posteriormente a 120 V. Posteriormente, as membranas de polyvynilidine fluoride (PVDF)
foram ativadas passando sucessivamente por metanol, H2O-miliQ e tampão de transferência
(50 mM de CAPS, NaOH a 2%, metanol a 10%, pH=11). A transferência das amostras do
gel para as membranas foi realizada com o auxílio do Biorad Trans-Bolt ® Cell durante 1
hora e meia a 250 mA até 120 V com tampão de transferência. Após a transferência, as
membranas foram bloqueadas com albumina sérica bovina (do inglês, bovine serum albumin,
BSA, Sigma) a 5% durante duas horas. De seguida, foram incubadas com os anticorpos
primários de interesse, LRP6 total, LRP6 fosforilado (pLRP6), Naked1, Axin1 (Wnt
Signaling Antibody Sampler Kit #2915; Cell signaling), CD133 (GTX1022109), calnexina
(AB0037, sicgen) diluídos a 1:1000 em tampão TBS Tween (250 mM de Tris, 1,5 mM de
NaCl, Tween20 a 1%, pH=7,6 suplementada com 5% soro bovino fetal) durante a noite.
Posteriormente, foram lavadas em tampão TBSTWeen a 0,5% durante 1 hora em agitação
constante para se remover o excesso de anticorpos. Após a lavagem as membranas foram
incubadas com o respetivo anticorpo secundário (anti-rabbit, Cell signalling; anti-goat
611620 Invitrogen 1:5000) durante 2 horas. Novamente as membranas foram lavadas com
TBSTween a 0,5% durante duas horas em agitação constante. A leitura das membranas foi
realizada no equipamento versadoc system Biorad e a quantificação foi efetuada com recurso
ao programa Imagequant5.0.
41
útero.
2.4-Análise estatistica
O tratamento estatístico foi efetuado com o software IBM SPSS (Statistical Package for Social
Sciences) v. 22.0.
A análise da normalidade foi realizada com o teste de Shapiro-Wilk. No caso de comparação

entre médias de dois grupos independentes foi usado o teste de U-Mann-Witney. Os gráficos
foram gerados pelo GraphPad Prism versão 6.01.
Para a comparação entre mais de dois grupos utilizou-se o teste de KrusKal-Wallis e nas
comparações múltiplas considerou-se a correção de Bonferroni.
Todos os cálculos tiveram em conta um nível de significância de 0,05.
As curvas de dose-resposta para o estudo da citotoxicidade foram obtidas com recurso ao

software OriginPro (modelo “DoseResp”). Relativamente ao ensaio clonogénico as curvas
foram obtidas de acordo com o modelo linear quadrático
2
(𝑆𝐹 = 𝑒 −𝛼𝐷−𝛽𝐷 ).
3-Resultados
As terapêuticas convencionais utilizadas no tratamento do cancro do colo do útero, estão

associadas a uma toxicidade e resistência notável (51,65,104). A realização desta dissertação
teve como principal objetivo avaliar a expressão da CD133, da Wnt, da β-catenina e outras
proteínas envolvidas na via Wnt/β-catenina (LRP6, pLRP6, Naked1 e Axin1), após a exposição
à radioterapia e ao tratamento com cisplatina, na tentativa de perceber se estas proteínas poderão
ser utilizadas como alvo direto no tratamento desta neoplasia, para minimizar a toxicidade e a
resistência. E ainda, como objetivo secundário pretendeu-se perceber se a alteração da
expressão da CD133 irá interferir com a expressão da β-catenina. Desta forma, após a obtenção
da IC50 e da DL50 utilizaram-se concentrações e doses de radiação superiores, iguais e inferiores
àqueles valores, isto é, concentrações correspondentes à IC80, à IC50 e à IC20 e doses de 10 Gy,
de DL50 (3 Gy) e de 2 Gy após um período de incubação de 48 horas. Estas concentrações e
doses foram utilizadas para avaliar a morte celular, a distribuição das células pelo ciclo celular,
a produção de espécies reativas de oxigénio assim como a situação das defesas antioxidantes
através da expressão de GSH. Os resultados da morte celular, avaliados pela citometria de fluxo,
foram corroborados com a coloração de May-Grünwald-Giemsa. Posteriormente, com o intuito
de avaliar a expressão das proteínas CD133, Wnt, β-catenina, LRP6, pLRP6, Axin1 e Naked1
42
útero.
após os diferentes tratamentos (radioterapia e quimioterapia) realizaram-se os ensaios de

western blot e de imunocitoquímica. Os resultados apresentados na secção dos efeitos da
cisplatina na linha celular HeLa (análise da proliferação, viabilidade e morte celulares, ciclo
celular, stresse oxidativo e espécies reativas de oxigénio) e efeitos da radiação na linha
celular HeLa (sobrevivência, viabilidade e morte celulares e stresse oxidativo e espécies
reativas de oxigénio), são resultados partilhados com os trabalhos conferentes ao grau de
mestre da Adriana Duarte, do André Salvada e do Paulo Teixeira realizados na Faculdade de
Medicina da Universidade de Coimbra.
3.1-Efeitos da cisplatina na linha celular HeLa

3.1.1-Proliferação celular
Após a exposição da linha celular HeLa à cisplatina com diferentes concentrações e
tempos de incubação (24, 48 e 72 horas) foi possível traçar as curvas de proliferação abaixo
indicadas (Figura 3.1). Os respetivos valores da IC50 e R2 para os diferentes tratamentos estão
representados na tabela 3.1.
Figura 3. 1: Cisplatina diminui a proliferação celular na linha HeLa com o aumento da

concentração e tempo de tratamento. Curvas de proliferação da linha celular HeLa após, 48 e 72 horas
de incubação com cisplatina. Os resultados foram obtidos através do ensaio sulforodamina b e estão
expressos em percentagem (%) de proliferação celular em função do logaritmo da concentração da
cisplatina e expressam a média e o erro padrão de pelo menos três experiências independentes. Não foi
possível traçar a curva para as 24 horas.
43
útero.
Tabela 3. 1: Determinação dos valores IC20, IC50 e IC80 para os diferentes tempos de exposição à
cisplatina e respetivos valores de R2.
R2 IC20 IC50 IC80

(µM) (µM) (µM)
48 0,98 6,17±0,93 12,27±1,04 24,43±1,21
horas
72 0,97 5,92±0,78 10,20±0,88 17,54±1,00
horas
*Não foi possível determinar os valores acima representados para as 24 horas após a exposição à cisplatina.
3.1.2- Viabilidade e morte celulares

A cisplatina é um agente quimioterapêutico que induz morte celular por apoptose e por
necrose. Desta forma para averiguar o efeito deste fármaco na linha celular HeLa recorreu-se à
citometria de fluxo utilizando a dupla marcação com anexina V, acoplada ao fluorocromo FITC,
e com iodeto de propídeo. Estes resultados também foram corroborados pela coloração de May-
Grünwald-Giemsa. Na Figura 3.2 observou-se uma diminuição na percentagem de células
viáveis com o aumento da concentração do fármaco. Verificaram-se diferenças estatisticamente
significativas na condição IC20 (70,25%±0,7%; p<0,001), IC50 (59,13%±2,32%; p<0,001) e
IC80 (37,38%±2,19%; p<0,001) relativamente ao controlo (91,63%±1,25%). Observaram-se
ainda diferenças, estatisticamente significativas, entre diferentes condições nomeadamente IC50
(59,13%±2,32%; p<0,01) e IC80 (37,38%±2,19%; p<0,001) relativamente à condição IC20
(70,25%±0,7%) e entre as condições IC50 (59,13%±2,32%; p<0,001) e IC80 (37,38%±2,19%;
p<0,001).
Verificaram-se também um aumento da fração celular que se encontra na fase inicial do
processo apoptótico aquando do aumento da concentração do fármaco. Observaram-se
diferenças estatisticamente significativas (p<0,001) nas condições IC20 (15,63%±0,56%), IC50
(19,50%±0,68%) e IC80 (22,25%±1,62%) quando comparadas com a condição controlo
(2,38%± 0,42%). Estes dados da citometria de fluxo foram corroborados com a coloração de
May-Grünwald-Giemsa. Na Figura 3.3 foi possível verificar características de morte por
apoptose como a formação de corpos apoptóticos (A) na condição IC20. Na condição IC50 assim
como na condição IC80 também se verificou a vacuolização do citoplasma (C). Adicionalmente,
também se observou o aumento da percentagem de células em apoptose tardia/necrose com o
aumento da concentração da cisplatina. Verificaram-se diferenças estatisticamente
significativas nas condições IC20 (4,75%±0,41%, p<0,05), IC50 (7,25%±0,62%; p<0,001) e IC80
(10,13%±1,11%; p<0,001) quando comparadas com a condição controlo (1,5%±0,22%). Entre
44
útero.
as condições observaram-se diferenças estatisticamente significativas (p<0,001; p<0,05) entre

o IC20 (4,75%±0,41%) e o IC80 (9,43%±0,10%) e entre o IC80 (9,43%±0,10%) e o IC50
(7,25%±0,62%) respetivamente.
100
*** C o n tro lo
80 ** IC 20
*** ***
C é lu la s ( % )
IC 50
60 ***
IC 80
***
40 *** *** ***
* *
***
*** ***
20 ***
***
*** ******
* ***
0
V AI A T /N N
Figura 3. 2: Aumento da concentração de cisplatina diminui a viabilidade celular na linha HeLa.

Morte celular da linha HeLa 48 horas após o tratamento com cisplatina. A análise da morte celular
realizada com recurso à citometria de fluxo através da dupla marcação com anexina V, acoplada ao
fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC), e com iodeto de propídeo. O gráfico representa a
percentagem de células viáveis (V), em apoptose inicial (AI), apoptose tardia/necrose (AT/N) e necrose
(N) obtida após o tratamento com as concentrações que inibem em 20, 50 e 80 por cento a proliferação
celular (IC20, IC50 e IC80) respetivamente. Os resultados foram expressos em média e erro padrão de
quatro ensaios independentes. As diferenças estatisticamente significativas foramrepresentadas com *
para p<0,05; com ** para p<0,01 e com *** para p<0,001 obtidos através do teste estatístico Mann-
Whitney calculado considerando a ausência de normalidade da amostra.
A população de células em necrose também aumentou com o aumento da concentração

do fármaco, com diferenças estatisticamente significativas (p<0,001) nas condições IC20
(10,25%±0,80%), IC50 (12,13%±0,40%) e IC80 (28,25%±1,77%) quando comparadas com a
condição controlo (3,25%±0,56%). Entre as condições IC20 (10,25%±0,80%) e IC80
(28,25%±1,77%) observaram-se diferenças estatisticamente significativas (p<0,001). Para
além disso foi possível observar diferenças com significado estatístico (p<0,001) entre as
condições IC50 (12,13%±0,40%) e IC80 (28,25%±1,77%). A análise morfológica realizada pela
coloração de May-Grünwald-Giemsa corroborou estes resultados. Na Figura 3.3 foi possível
verificar o extravasamento do conteúdo citoplasmático (B) para o meio extracelular patente na
condição IC20, na condição IC50 e na condição IC80. Verificou-se que na condição IC80 o
extravasamento do conteúdo citoplasmático para o meio extracelular foi maior quando
comparado com as outras condições, destacando-se a necrose como o tipo de morte celular
predominante nesta condição.
45
útero.
Figura 3. 3: A cisplatina induz o aparecimento de características morfológicas de necrose com o

aumento da concentração na linha HeLa. Imagens obtidas após a coloração por May-Grünwald-
Giemsa com a ampliação 400×. As imagens ilustram os resultados obtidos sem à exposição à cisplatina
(controlo) e com a exposição durante 48 horas às concentrações inibitórias de cisplatina (IC), que inibem
em 20, 50 e 80 por cento a proliferação celular IC20, IC50 e IC80 respetivamente. A- formação de corpos
apoptóticos, B- extravasamento do conteúdo citoplasmático e C- vacuolização do citoplasma.
3.1.3-Ciclo celular
A cisplatina devido ao seu mecanismo de ação, que se traduz pela formação de aductos,
tem a capacidade de induzir a paragem das células em diferentes fases do ciclo celular a fim de
promover a reparação do DNA. Devido a esta característica avaliou-se o ciclo celular com
recurso a citometria de fluxo utilizando o iodeto de propídeo.
Analisando o ciclo celular (Figura 3.4) verificou-se uma tendência para a diminuição
não significativa da percentagem de células na fase pré-G0/G1 com o aumento da concentração
do fármaco. Na fase G0/G1 verificou-se uma diminuição da percentagem de células na condição
IC50, havendo um posterior aumento na condição IC80. Observou-se ainda, que a maior
percentagem de células bloqueadas nesta fase do ciclo celular corresponde à condição controlo.
Verificaram-se diferenças estatisticamente significativas (p<0,001) na condição IC20
(7,13%±1,51%), IC50 (9%±1,31%) e IC80 (24,63%±3,57%) quando comparadas com o controlo
(66,88%±1,01%). Observou-se também diferença estatisticamente significativa (p<0,001) entre
a condição IC50 (9%±1,31%) e a condição IC80 (24,63%±3,57%). O aumento da concentração
do fármaco também induz aumento da percentagem de células em fase S, sendo este aumento
46
útero.
mais evidente na condição IC80. Verificaram-se ainda diferenças estatisticamente significativas

(p<0,001) na condição IC50 (55,88%±4,90%) e na condição IC80 (63,50%±4,66%) quando
comparadas com a condição controlo. Para além disso, também se verificou diferenças com
significado estatístico entre as condições IC20 (33%±2,51%) e IC50 (55,88%±4,90%) (p<0,01)
e entre as condições IC20 (33%±2,51%) e IC80 (63,50%±4,66%) (p<0,001). Na fase G2/M
verificou-se um aumento da percentagem de células até a condição IC20, diminuindo na
condição IC80. Observaram-se diferenças estatisticamente significativas (p<0,001) na condição
IC20 (59,88%±3,96%) e na condição IC50 (35,38%±5,14%) quando comparadas com a condição
controlo (11,63%±0,84%). Também se observou diferenças estatisticamente significativas
(p<0,001) quando comparada a condição IC20 (59,88%±3,96%) com a condição IC50
(35,38%±5,14%) e com a condição IC80 (11,88%±1,26%). Entre as condições IC50
(35,38%±5,14%) e IC80 (11,88%±1,26%) também se observaram diferenças estatisticamente
significativas (p<0,001).
100
C o n tro lo
***
*** IC 20
80 ** ***
***
C é lu la s ( % )
IC 50
*** ***
60
*** IC 80
40 *** ***
***
20
***
***
0
P r e - G 0 /G 1 G 0 /G 1 S G 2 /M
Figura 3. 4: Cisplatina induz a progressão no ciclo celular da linha HeLa. Distribuição em

percentagem de células (HeLa) pelas diferentes fases do ciclo celular (G0/G1, S e G2/M) e pico
apoptótico 48 horas após o tratamento com cisplatina. Avaliação realizada com recurso a citometria de
fluxo utilizando o iodeto de propídeo com RNAse. Os resultados foram expressos em média e erro
padrão de quatro ensaios independentes. As concentrações inibitórias (IC), que inibem em 20, 50 e 80
por cento a proliferação celular estão representadas como IC20, IC50 e IC80 respetivamente. As diferenças
estatisticamente significativas estão representadas com * para p<0,05; com ** para p<0,01 e com ***
para p<0,001 obtidos através do teste estatístico Mann-Whitney calculado considerando a ausência de
normalidade da amostra.
3.1.4- Stresse oxidativo e espécies reativas de oxigénio

O stresse oxidativo é descrito como um dos principais mecanismos de toxicidade celular
provocada pelos fármacos. Desta forma, com o propósito de avaliar o impacto da produção
intracelular do radical superóxido, de peróxidos e da defesa antioxidante GSH recorreu-se à
47
útero.
citometria de fluxo e para a avaliação do efeito radical hidroxilo utilizou-se o ensaio SRB com
e sem o seu inibidor, o manitol.
Na figura 3.5 foi possível observar o aumento da produção intracelular do radical
superóxido com o aumento da concentração do fármaco, verificando-se diferenças
significativas (p<0,001) entre a condição controlo e as condições IC20 (2,52MIF±0,068MIF),
IC50 (2,67MIF±0,15) e IC80 (2,82MIF±0,14MIF). Os valores foram normalizados em relação à
condição controlo.
d e r a d ic a is s u p e r ó x id o s (M IF )
3 ***
***
P r o d u ç ã o in t r a c e lu la r
***
( c o n d iç ã o /c o n tr o lo )
0
C o n t r o lo IC 2 0 IC 5 0 IC 8 0
Figura 3. 5: Cisplatina induz o aumento da produção intracelular de superóxidos com o aumento

da concentração. Produção intracelular de radicais superóxidos na linha celular HeLa, 48 horas após o
tratamento com a cisplatina. Análise realizada com recurso à citometria de fluxo através da DHE
(dihidroetidina). O gráfico representa a produção intracelular do radical superóxido na condição controlo
e 48 horas após o tratamento com as concentrações inibitórias (IC20, IC50 e IC80), que inibem em 20, 50
e 80 por cento a proliferação celular respetivamente. Os resultados foram normalizados em relação ao
controlo e os valores referem-se à média ± erro padrão de quatro ensaios independentes expressos em
média de intensidade de fluorescência (MIF). As diferenças estatisticamente significativas foram
representadas com * para p<0,05; com ** para p<0,01 e com *** para p<0,001 obtidos através do teste
estatístico Mann-Whitney calculado considerando a ausência de normalidade da amostra.
Na figura 3.6 verificou-se um aumento da produção intracelular dos peróxidos na

condição IC20, diminuindo a concentração de espécies reativas de oxigénio com o aumento da
concentração do fármaco. Observaram-se diferenças estatisticamente significativas (p<0,01)
entre a condição IC20 (1,68MIF±0,03MIF) e a condição controlo e entre a condição IC20 (1,68
MIF±0,03MIF) quando comparada com a condição IC80 (1,07MIF±0,20MIF).
48
útero.
d e p e r ó x id o s ( M IF )
**
2
**
0
Figura 3. 6: Cisplatina induz a alteração da produção intracelular de peróxidos. Produção

intracelular de peróxidos na linha celular HeLa, 48 horas após o tratamento com a cisplatina. A análise
foi realizada com recurso à citometria de fluxo através da sonda DCFH2-DA (2’,7’-
diclorodihidrofluoresceínadiacetato). O gráfico representa a produção intracelular de peróxidos após 48
horas sem tratamento (controlo) e após o tratamento com as concentrações inibitórias (IC), que inibem
em 20, 50 e 80 por cento a proliferação celular IC20, IC50 e IC80 respetivamente. Os resultados foram
normalizados pelo controlo, e os valores referem-se a média±erro padrão de quatro ensaios
independentes expressos em média de intensidade de fluorescência (MIF). As diferenças
estatisticamente significativas foram representadas com * para p<0,05; com ** para p<0,01 e com ***
para p<0,001 obtidos através do teste estatístico Mann-Whitney calculado considerando a ausência de
Analisando a produção intracelular de glutationa reduzida (Figura 3.7) observou-se

aumento da produção intracelular de GSH com o aumento da concentração do fármaco.
Verificaram-se diferenças significativas (p<0,05) entre a condição IC20 (1,59MIF±0,13MIF) e
a condição IC50 (1,64MIF±0,16MIF) quando comparadas com a condição controlo. Os valores
foram normalizados em relação à condição controlo.
49
útero.
d e g lu t a t io n a r e d u z id a ( M IF )
3
2
* *
0
Figura 3. 7: Cisplatina induz o aumento da produção intracelular do glutationa reduzida com

aumento da concentração. A análise foi realizada com recurso à citometria de fluxo através do
alaranjado de mercúrio. O gráfico representa a produção intracelular de glutationa reduzida após 48
horas sem tratamento (controlo) e após o tratamento com as concentrações inibitórias (IC), que inibem
em 20, 50 e 80 por cento a proliferação celular IC20, IC50 e IC80 respetivamente. Os resultados foram
normalizados pelo controlo, representam a média e erro padrão de quatro ensaios independentes
expressos em média de intensidade de fluorescência. As diferenças estatisticamente significativas foram
representadas com * para p<0,05; com ** para p<0,01 e com *** para p<0,001 obtidos através do teste
estatístico Mann-Whitney calculado considerando a ausência de normalidade da amostra.
Na impossibilidade de detetar os níveis do radical hidroxilo de forma direta utilizou-se

o seu inibidor, manitol. O tratamento com o manitol induziu um aumento na proliferação celular
quando comparado com o tratamento com a cisplatina isolada. Na Figura 3.8 encontram-se os
resultados da proliferação celular da linha celular HeLa, 48 horas após o tratamento com
cisplatina e com cisplatina associada com manitol (40 mM). Os respetivos valores do R2 e de
IC50 para os diferentes tratamentos estão representados na tabela 3.2.
50
útero.
Figura 3. 8: Aumento da proliferação celular na linha HeLa após o tratamento com cisplatina e
manitol (40mM). Curvas de proliferação da linha celular HeLa 48 horas após a exposição a cisplatina
e a cisplatina com manitol (40mM) obtidos pelo ensaio de sulforodamina B. Os resultados foram
expressos em percentagem (%) de proliferação celular em função do logaritmo da concentração da
cisplatina e cisplatina com manitol, e expressam a média e o erro padrão de pelo menos quatro
experiências independentes em triplicado.
Tabela 3. 2: Determinação do IC50 na linha HeLa 48 horas após o tratamento com cisplatina e
com cisplatina associada a manitol (40 mM) e respetivos valores de R2.
R2 IC50
(µM)
Cisplatina 0,98 12,27±1,04
Cisplatina 0,99 22,57±0,71

e manitol

Naked1 e Axin1) após a exposição à cisplatina.
O CD133 tem sido descrito como marcador de células estaminais cancerígenas.
Diversos estudos sugerem que a sobrexpressão deste marcador está envolvido na
sobrevivência, na invasão, na metastização e na resistência ao tratamento(122,131–133).
Para além disso, considera-se que este marcador poderá ser um potencial ativador da via
Wnt/β-catenina. Tendo em conta esta informação, decidiu-se avaliar a expressão deste
51
útero.
marcador assim como as demais proteínas da via Wnt/ β-catenina após as diferentes
terapêuticas.
Na Figura 3.9 observou-se que a expressão da CD133 na condição IC20 é igual ao
controlo, diminui na condição IC50 e aumenta na condição IC80. Os resultados demonstraram a
existência de significância estatística (p=0,04). Também na Figura 3.9-C, foi possível verificar
o mesmo padrão com marcação com o anticorpo anti-CD133 dirigido contra a sequência de
aminoácidos 170-430 da proteína Prominin-1 através da técnica imunocitotoquímica.
Verificou-se uma imunomarcação semelhante na condição controlo e IC20 com posterior
diminuição da intensidade de marcação na condição IC50. Na condição IC80, observou-se um
aumento da expressão deste marcador quando comparado com a condição IC50.
Figura 3. 9: Cisplatina induz a alteração da expressão da CD133 (117 kDa) na linha celular HeLa,
48 horas após o tratamento. A análise foi realizada com recurso ao western blot e imunocitoquímica.
(A) Immunoblot ilustrativo da expressão da CD133 e da calnexina (90 kDa). (B) O gráfico representa
os resultados do western blot, normalizados em relação ao controlo (CD133/calnexina), expressos em
média e erro padrão de pelo menos quatro experiências independentes. (C) Análise da expressão da
CD133 por imunocitoquímica com a ampliação a 400×. CTL-controlo; IC- concentrações inibitórias
(IC), que inibem em 20, 50 e 80 por cento a proliferação celular IC20, IC50 e IC80 respetivamente. Os
resultados possuem uma significância estatística de p=0,04, obtidos através do teste estatístico Mann-
Whitney calculado considerando a ausência de normalidade da amostra.
52
útero.
Na Figura 3.10 observou-se um aumento da imunomarcação Wnt nas condições IC20

(imagem A) e IC50 (imagem B) relativamente à condição controlo. Enquanto que na condição
IC80 (imagem C) verificou-se uma diminuição da imunomarcação.
Figura 3. 10: Cisplatina altera a expressão da Wnt na linha celular HeLa. Análise da expressão da
Wnt por imunocitoquimica 48 horas após o tratamento com a cisplatina com a ampliação a 400×. As
imagens ilustram a imunomarcação com o anticorpo Wnt após 48 horas sem tratamento (controlo) e
após o tratamento com as concentrações inibitórias (IC), que inibem em 20, 50 e 80 por cento a
proliferação celular IC20, IC50 e IC80 respetivamente. A- condição IC20, aumento da imunomarcação
relativamente ao controlo; B-condição IC50; aumento da imunomarcação relativamente ao controlo, C-
condição IC80, diminuição da imunomarcação relativamente ao controlo. As setas indicam a
imunomarcação.
Na Figura 3.11 observou-se uma tendência para o aumento da expressão da β-catenina

na condição IC50 e diminuição da expressão na condição IC 80. Também na Figura 3.11
(imagem C) se observou o mesmo padrão. Observou-se o aumento da intensidade da
marcação da β-catenina na condição IC50 e diminuição da intensidade de marcação na maior
concentração do fármaco (IC 80).
53
útero.
Figura 3. 11: Cisplatina induz a alteração da expressão da β-catenina (92 kDa) na linha celular
HeLa, 48 horas após o tratamento. A análise foi realizada com recurso ao western blot e
imunocitoquímica. (A) Immunoblot ilustrativo da expressão da CD133 e calnexina (90 kDa). (B) O
gráfico representa os resultados (β-catenina/calnexina), obtidos por western blot normalizados pelo
controlo expressos em média e erro padrão de três experiências independentes. (C) Análise da expressão
da CD133 por imunocitoquímica com a ampliação a 400×. CTL-controlo; IC- concentrações inibitórias
(IC), que inibem em 20, 50 e 80 por cento a proliferação celular IC20, IC50 e IC80 respetivamente.
Aplicou-se o teste estatístico Mann-Whitney considerando a ausência de normalidade da amostra.
O Wnt ao ligar-se ao recetor FZD e ao co-recetor LRP6 promovendo a fosforilação da

LRP6 e posterior recrutamento da Axin, ocorrendo assim a disrupção do complexo de
destruição da β-catenina. Além da Axin, a Naked1 também é descrito como um potencial
inibidor desta via (138–140,142–147). Desta forma, após o tratamento com a cisplatina
avaliou-se a expressão destas proteínas (LRP6, pLRP6, Axin1 e Naked1) na tentativa de
perceber de melhor forma a possível influência destas proteínas nesta linha celular.
Na Figura 3.12 verificou-se uma tendência para a diminuição da expressão da LRP6

com o aumento da concentração do fármaco.
54
útero.
Figura 3. 12: A Cisplatina induz a diminuição da expressão da LRP6 (180,210 kDa) na linha
celular HeLa, 48 horas após o tratamento. A análise foi realizada com recurso ao western blot. (A)
Immunoblot ilustrativo da expressão da LRP6 e calnexina (90 kDa). (B) O gráfico representa os
resultados (LRP6/calnexina), obtidos por western blot normalizados pelo controlo expressos em média
e erro padrão de três experiências independentes com exceção da condição IC50. CTL-controlo; IC-
concentrações inibitórias (IC), que inibem em 20, 50 e 80 por cento a proliferação celular IC20, IC50 e
IC80 respetivamente. Aplicou-se o teste estatístico Mann-Whitney considerando a ausência de
55
útero.
Na Figura 3.13 observou-se uma tendência para o aumento da expressão do marcador

pLRP6 (Ser1490) após o tratamento com a cisplatina.
Figura 3. 13: Cisplatina induz o aumento da expressão da pLRP6 (180,210 kDa) na linha celular
HeLa, 48 horas após o tratamento. A análise foi realizada com recurso ao western blot. (A)
Immunoblot ilustrativo da expressão da pLRP6 e de calnexina (90 kDa). (B) O gráfico representa os
resultados (pLRP6/calnexina), obtidos por western blot normalizados pelo controlo expressos em média
e erro padrão de quatro experiências independentes. CTL-controlo; IC- concentrações inibitórias (IC),
que inibem em 20, 50 e 80 por cento a proliferação celular IC20, IC50 e IC80 respetivamente. Aplicou-se
o teste estatístico Mann-Whitney considerando a ausência de normalidade da amostra.
56
útero.
Analisando a expressão da proteína Naked1, verificou-se uma tendência para a sua

diminuição com o aumento da concentração do fármaco (Figura 3.14).
200
( C o n d iç ã o /c o n tr o lo )
150
N aked1
100
50
0
Figura 3. 14: Cisplatina induz a diminuição da expressão da Naked1 (59,61kDa) na linha celular
HeLa, 48 horas após o tratamento. A análise foi realizada com recurso ao western blot. Os resultados
(Naked1/calnexina), normalizados pelo controlo estão expressos em média e erro padrão de duas
experiências independentes. CTL-controlo; IC- concentrações inibitórias (IC), que inibem em 20, 50 e
80 por cento a proliferação celular IC20, IC50 e IC80 respetivamente. Resultados preliminares.
57
útero.
Na Figura 3.15 observou-se uma tendência para a diminuição da expressão da Axin1

com o aumento da concentração do fármaco.
Figura 3. 15: Cisplatina induz a diminuição da expressão da Axin1 (110 kDa) na linha celular
HeLa, 48 horas após o tratamento. A análise foi realizada com recurso ao western blot. (A)
Immunoblot ilustrativo da expressão da Axin1 e calnexina (90 kDa). (B) O gráfico representa os
resultados (Axin1/calnexina), normalizados pelo controlo expressos em média e erro padrão de pelo
menos três experiências independentes com exceção da condição IC50. CTL-controlo; IC- concentrações
inibitórias (IC), que inibem em 20, 50 e 80 por cento a proliferação celular IC20, IC50 e IC80
respetivamente. Aplicou-se o teste estatístico Mann-Whitney considerando a ausência de normalidade
da amostra.
58
útero.
3.2-Efeitos da radiação ionizante na linha celular HeLa

3.2.1-Sobrevivência celular
A radiação ionizante é capaz de induzir uma diminuição da capacidade de sobrevivência
celular e proliferação da linha HeLa. Após realizar o ensaio clonogénico foi possível traçar a
curva dose resposta (Figura 3.16) e determinar a DL50 (Tabela 3.3).
aumento da dose. Curva de sobrevivência da linha celular HeLa, obtida pelo ensaio clonogénico com
pelo menos quatro experiências independentes. Dez dias após a exposição à radioterapia efetuou-se a
contagem das colónias, considerando como colónia um grupo com pelo menos 50 células.
Tabela
Figura 3. 3. 17:
3: Resultados
Exposição obtidos com recurso
à radiação-X diminuiao amodelo linear quadrático
sobrevivência para, α, HeLa
da linha celular β, α/β,com
DL50o
2
eaumento
o fator de
da sobrevivência
dose. Curva de com a dose dedaa linha
sobrevivência 2Gy celular
(Fs(2))HeLa,
e respetivo
obtida R
peloassociado.
ensaio clonogénico com
contagem das colónias, considerando como colónia
α um-grupo com pelo menos 50 células.
0,1499
aumento da dose. Curva de sobrevivência daβlinha 0,1174
celular HeLa, obtida pelo ensaio clonogénico com
α/ β um
contagem das colónias, considerando como colónia -1,28
grupo com pelo menos 50 células.
DL50 3,15
Fs(2)
aumento da dose. Curva de sobrevivência da 1,02 HeLa, obtida pelo ensaio clonogénico com
linha celular
2
contagem das colónias, considerando como colónia 0,8996
um grupo com pelo menos 50 células.
R
59
útero.
3.2.2- Viabilidade e morte celular

A radioterapia tem como principal objetivo inibir o potencial proliferativo da células e
provocar a morte celular (68,95). Estes processos poderão ocorrer por apoptose, necrose,
catástrofe mitótica, indução da senescência e autofagia (68,96).
Desta forma, recorreu-se a citometria de fluxo utilizando a dupla marcação com anexina
V, acoplada ao fluorocromo FITC, e com iodeto de propídeo.
Analisando a morte celular, 48 horas após o tratamento com a radioterapia (Figura 3.17),
verificou-se que com o aumento da dose houve uma diminuição da percentagem de células
viáveis. Observou-se uma redução estatisticamente significativa da viabilidade celular na
condição 3 Gy (82,60%±1,96%; p<0,05) e na condição de 10 Gy (74,60%±1,88%; p<0,001),
quando comparadas com a condição controlo (90,25%±0,83%). Quanto a diferença entre
condições, verificou-se uma diminuição na percentagem de células viáveis, com diferenças
estatisticamente significativas (p<0,05) entre a condição de 2 Gy (88,88%±0,72%) e a condição
de 3 Gy (82,60%±1,96%). Entre condição de 2 Gy (88,88%±0,72%) e a condição de 10 Gy
(74,60%1,88%) verificou-se uma diminuição da viabilidade celular, com diferenças
estatisticamente significativas (p<0,001).
Relativamente à apoptose inicial, verificou-se um aumento da percentagem de células
com o aumento da dose. Observaram-se alterações estatisticamente significativas entre a
condição de 3 Gy (5,7%±0,86%; p<0,05) e a condição de 10 Gy (8,88%±1,99%; p<0,01)
quando comparadas com o controlo (2,31%±0,37%). Entre a condição de 2 Gy (3,50%±0,38%)
e a condição de 10 Gy (8,88%±1,99%) observou-se um aumento estatisticamente significativo
(p<0,05) na percentagem de células em apoptose inicial. Na Figura 3.18 foi possível verificar,
pela coloração de May-Grünwald-Giemsa, a formação de corpos apoptóticos (A) na condição
de 2 Gy.
A análise da percentagem de células em apoptose tardia/necrose revelou que não se
verificaram alterações significativas quando comparadas com a condição controlo e entre
condições. Verificou-se uma tendência para o aumento na percentagem de células na condição
de 3 Gy (3,50%±0,65%), diminuindo ligeiramente a percentagem de células em apoptose
tardia/necrose na condição de 10 Gy (3,30%±0,65%).
Analisando a percentagem de células em necrose observou-se um aumento com o
aumento da dose de radiação, verificando-se um aumento com significado estatístico (p<0,01)
na condição de 10 Gy (13,10%±1,35%) quando comparada com o controlo (5,69%±0,85%).
Entre a condição de 2 Gy (5,63%±0,53%) e a condição de 10 Gy (13,10%±1,35%) verificou-
se um aumento estatisticamente significativo (p<0,01). Estes resultados foram corroborados
60
útero.
pela coloração de May-Grünwald-Giemsa, mostrada na Figura 3.18, onde se observou o

extravasamento do conteúdo citoplasmático (B) para o meio extracelular nas condições de 2 Gy,
de 3 Gy e de 10 Gy, sendo que na condição 10 Gy verificaram-se características necróticas mais
acentuadas.
***
100 *
C o n tro lo
*
80 2G y
***
3G y
C é lu la s ( % )
60 10G y
40
* **
20
**
* **
0
V AI A T /N N
Figura 3.17: Radioterapia diminui a viabilidade celular da linha HeLa, 48 horas após a exposição.
A análise da morte celular foi realizada com recurso à citometria de fluxo através da dupla marcação
com anexina V, acoplada ao fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC), e com iodeto de
propídeo. O gráfico representa a percentagem de células viáveis (V), em apoptose inicial (AI), apoptose
tardia/necrose (AT/N) e necrose (N). Os resultados foram expressos em média e erro padrão de pelo
menos cinco ensaios independentes. As diferenças estatisticamente significativas foram representadas
com * para p<0,05; com ** para p<0,01 e com *** para p<0,001 obtidos através do teste estatístico
Mann-Whitney calculado considerando ausência de normalidade da amostra.
61
útero.
Figura 3.18: Radioterapia induz o predomínio de características morfológicas de necrose com o

aumento da dose. As imagens foram obtidas após a coloração por May-Grünwald-Giemsa com a
ampliação 400×. Os resultados indicam a resposta celular 48h após a exposição à radioterapia (2 Gy, 3
Gy e 10 Gy) e sem exposição (controlo). As letras indicam a formação de corpos apoptóticos (A),
extravasamento do conteúdo citoplasmático (B).
3.2.3- Stresse oxidativo e espécies reativas de oxigénio

Um dos principais mecanismos de ação da radioterapia é através da formação de radicais
livres originados principalmente da radiólise da água, o que poderá provocar danos no DNA,
RNA, proteínas e/ou lípidos. Sendo assim, avaliou-se o impacto desta terapêutica na formação
do radical superóxido, dos peróxidos e da produção de defesas antioxidantes nomeadamente a
concentração de GSH.
Analisando a produção intracelular de radicais superóxidos, 48 horas após o tratamento
com a radioterapia (Figura 3.19), verificou-se um aumento crescente com o aumento da dose.
Na condição de 10 Gy (1,57MIF±0,057MIF) verificou-se uma alteração estatisticamente
significativa (p<0,001) quando comparada com o controlo. Também se verificaram alterações
significativas entre a condição de 2 Gy (1,17MIF±0,117MIF) e a condição de 10 Gy
(1,57MIF±0,057MIF) (p<0,01) e entre a condição de 3 Gy (1,31MIF±0,19MIF) e a condição
de 10 Gy (1,57MIF±0,057MIF) (p<0,05).
62
útero.
r a d ic a is s u p e r ó x id o s (M IF )
P r o d u ç ã o in t r a c e lu la r d e
C o n tro lo
*
2G y
2
** 3G y
10G y
***
0
C o n t r o lo 2G y 3G y 10G Y
Figura 3.19: Radioterapia aumenta a produção intracelular de radicais superóxidos na linha

celular HeLa, 48 horas após a exposição. A análise foi realizada com recurso à citometria de fluxo
através da DHE (dihidroetidina). O gráfico representa a produção intracelular de superóxido após 48
horas sem tratamento (controlo) e após a exposição à radioterapia (2 Gy, 3 Gy e 10 Gy). Os resultados
foram normalizados pelo controlo e os valores referem-se a média e erro padrão de pelo menos quatro
ensaios independentes expressos em média de intensidade de fluorescência (MIF). As diferenças
para p<0,001 obtidos através do teste estatístico Mann-Whitney calculado considerando ausência de
Relativamente à produção intracelular de peróxidos (Figura 3.20) observou-se um

aumento tendencial com o aumento da dose, 2 Gy (1,03MIF±0,60MIF); 3 Gy
(1,94MIF±0,62MIF); 10 Gy (2,38MIF±0,55MIF), não se verificando alterações
estatisticamente significativas. Os valores foram normalizados em relação à condição controlo.
3
C o n tro lo
d e p e r ó x id o s ( M IF )
2G y
3G y
2
10G y
0
Figura 3.20: Radioterapia aumenta a produção intracelular de peróxidos na linha celular HeLa,
48 horas após a exposição. A análise foi realizada com recurso à citometria de fluxo através da sonda
DCFH2-DA (2’,7’-diclorodihidrofluoresceínadiacetato). O gráfico representa a produção intracelular de
superóxido após 48 horas sem tratamento (controlo) e após a exposição à radioterapia (2 Gy, 3 Gy e 10
Gy). Os resultados foram normalizados pelo controlo os valores referem-se a média e erro padrão de
pelo menos quatro ensaios independentes expressos em média de intensidadede fluorescência (MIF). As
diferenças estatisticamente significativas foram representadas com * para p<0,05; com ** para p<0,01
e com *** para p<0,001 obtidos através do teste estatístico Mann-Whitney calculado considerando
ausência de normalidade da amostra.
63
útero.
Verificou-se uma diminuição nos níveis da glutationa redutase (Figura 3.21) com o
aumento da dose na condição de 3 Gy. No entanto, com a dose de 10 Gy verificou-se um
aumento da concentração de glutationa reduzida ao contrário do que se tinha verificado quando
se depositaram doses inferiores. Verificaram-se alterações estatisticamente significativas entre
a condição de 2 Gy (0,87MIF±0,03MIF; p<0,05) e a condição de 3 Gy (0,52MIF±0,042MIF,
p<0,01) quando comparadas com o controlo. Observaram-se diferenças significativas entre a
condição de 2 Gy e a condição de 3 Gy (p<0,001) e entre a condição de 3 Gy e a condição de
10 Gy (1,35MIF±0,15MIF) (p<0,05). Os resultados foram normalizados relativamente ao
controlo.
3
g lu t a t io n a r e d u z id a ( M IF )
P r o d u ç ã o in t r a c e lu la r d e
C o n tro lo
2G y
3G y
2
* 10G y
***
1
*
**
0
Figura 3. 21: Radioterapia altera a produção intracelular de glutationa reduzida na linha celular
HeLa, 48 horas após a exposição. A análise foi realizada com recurso à citometria de fluxo através do
alaranjado de mercúrio. O gráfico representa a produção intracelular de glutationa reduzida após 48
horas sem tratamento (controlo) e após a exposição à radioterapia (2 Gy, 3 Gy e 10 Gy). Os resultados
foram normalizados pelo controlo e os valores representam a média e erro padrão de quatro ensaios
independentes expressos em média de intensidade de fluorescência (MIF). As diferenças
para p<0,001 obtidos através do teste estatístico Mann-Whitney calculado considerando ausência de

Naked1 e Axin1) após a exposição à cisplatina.
Além de se ter avaliado a expressão da CD133, da Wnt, da β-catenina, da LRP6, da
pLRP6, da Naked1 e da Axin1 após o tratamento com a cisplatina, avaliou-se também o
efeito da radioterapia na expressão destes marcadores uma vez que o CD133 é considerado
um marcador de células estaminais cancerígenas e um possível ativador da via Wnt/β-
64
útero.
catenina que está relacionada com a sobrevivência celular e sobrexpressa em diversos

cancros.
Na Figura 3.22 observou-se uma diminuição tendencial na condição de 2 Gy, com
aumento na condição de 3 Gy e diminuição na condição de 10 Gy. Foi possível verificar o
mesmo padrão com a imunohistoquímica (imagem C). Na condição de 2 Gy verificou-se uma
diminuição da intensidade de marcação, havendo um reforço na intensidade de marcação na
condição de 3 Gy e uma diminuição na condição de 10 Gy.
Figura 3.22: Radioterapia altera a expressão da CD133 (117 kDa) na linha celular HeLa, 48 horas
após a exposição. A análise foi realizada com recurso ao western blot e imunocitotoquimica. (A)
Immunoblot ilustrativo da expressão da CD133 e calnexina (90 kDa). (B) O gráfico representa os
resultados (CD133/calnexina), normalizados pelo controlo e expressam a média e erro padrão de pelo
menos quatro experiências independentes. (C) Análise da expressão da CD133 por imunohistoquimica
com a ampliação a 400×. CTL-controlo. Aplicou-se o teste estatístico Mann-Whitney considerando a
ausência de normalidade da amostra.
Relativamente à expressão da Wnt após a exposição à radioterapia, observou-se um

aumento da imunomarcação nas condições expostas à radioterapia (2 Gy, 3 Gy e 10 Gy) quando
comparadas com a condição controlo. A imunomarcação mantém-se relativamente constante
nas condições expostas à radioterapia (Figura 3.23).
65
útero.
Figura 3.23: Radioterapia induz o aumento da expressão da Wnt nas células HeLa com o aumento
da dose. Análise da expressão da Wnt por imunocitoquímica 48 horas após a exposição á radioterapia
com a ampliação a 400×. A-condição 2 Gy, aumento da expressão de Wnt relativamente ao controlo; B-
condição 3 Gy, aumento da expressão de Wnt relativamente ao controlo; C- aumento da expressão de
Wnt relativamente ao controlo.
Na Figura 3.24 observou-se uma tendência para a diminuição na expressão da proteína

β-catenina com dose de 3 Gy com aumento na condição de 10 Gy. Verificou-se o mesmo padrão
com a imunocitoquímica (imagem C), isto é um aumento na intensidade de marcação na
condição de 2 Gy, diminuição na intensidade de marcação na condição de 3 Gy e aumento na
intensidade de marcação na condição de 10 Gy mas sem diferenças relativamente à condição
controlo.
66
útero.
Figura 3.24: Radioterapia altera a expressão da β-catenina na linha celular HeLa, 48 horas após
a exposição. A análise foi realizada com recurso ao western blot e imunocitoquímica. (A) Immunoblot
ilustrativo da expressão da CD133 e calnexina (90 kDa). (B) O gráfico representa os resultados (β-
catenina/calnexina), normalizados ao controlo e expressos em média e erro padrão de pelo menos quatro
experiências independentes. (C) Análise da expressão da CD133 por imunohistoquímica com a
ampliação a 400×. Aplicou-se o teste estatístico Mann-Whitney considerando a ausência de normalidade
da amostra.
67
útero.
Na Figura 3.25 verificou-se uma tendência para a diminuição da expressão da LRP6

com o aumento da dose na radioterapia.
Figura 3.25: Radioterapia diminui a expressão da LRP6 na linha celular HeLa, 48 horas após a
exposição. A análise foi realizada com recurso ao western blot. (A) Immunoblot ilustrativo da expressão
da LRP6 e calnexina (90 kDa). (B) O gráfico representa os resultados (LRP6/calnexina), normalizados
pelo controlo expressos em média e erro padrão de pelo menos três experiências independentes. CTL-
controlo. Aplicou-se o teste estatístico Mann-Whitney considerando a ausência de normalidade da
amostra.
Na Figura 3.26 verificou-se uma tendência para o aumento da expressão da pLRP6

(Ser1490) na condição de 2 Gy e para a diminuição da expressão para as doses mais elevadas
de radioterapia.
68
útero.
Figura 3.26: Radioterapia altera a expressão da pLRP6 (180,210 kDa) na linha celular HeLa, 48
horas após a exposição. A análise foi realizada com recurso ao western blot. (A) Immunoblot ilustrativo
da expressão da pLRP6 e calnexina (90 kDa). (B) O gráfico representa os resultados (pLRP6/calnexina),
normalizados pelo controlo expressos em média e erro padrão de pelo menos três experiências
independentes. Aplicou-se o teste estatístico Mann-Whitney considerando a ausência de normalidade da
amostra.
Observou-se uma tendência para a diminuição da expressão de Naked1 nas condições

de 2 Gy e de 3 Gy e de aumento com a dose de 10 Gy (Figura 3.27).
200
( C o n d iç ã o /c o n tr o lo )
150
N aked1
100
50
0
C o n t r o lo 2G y 3G y 10G y
Figura 3.27: Radioterapia diminui a expressão da Naked1 na linha celular HeLa, 48 horas após
a exposição à radioterapia. A análise foi realizada com recurso ao western blot. Os resultados
(Naked1/calnexina), normalizados pelo controlo estão expressos em média e erro padrão de duas
experiências independentes. Resultados preliminares.
69
útero.
Relativamente à expressão da Axin1 após o tratamento com a radioterapia, observou-se

uma tendência para a diminuição na condição de 2 Gy quando comparada com a condição
controlo e posterior aumento da expressão na condição de 3 Gy, e de diminuição da expressão
na condição de 10 Gy (Figura 3.28).
200
150
A x in 1
100
50
0
C o n t r o lo 2G y 3G y 10G y
Figura 3.28: Radioterapia altera a expressão da Axin1 na linha celular HeLa, 48 horas após a
exposição à radioterapia. A análise foi realizada com recurso ao western blot. Os resultados
(Axin1/calnexina), foram normalizados pelo controlo estão expressos em média e erro padrão de duas
experiências independentes. Resultados preliminares.
70
útero.
4-Discussão
O cancro do colo do útero é o quarto cancro mais comum a nível mundial (3). Em países
em desenvolvimento é o segundo cancro mais comum em mulheres e a terceira causa de morte.
Na Europa mais de 58000 casos são diagnosticados, e morrem por ano aproximadamente 24000
pessoas (3). Os programas de rastreio do cancro do colo do útero permitem a deteção em
estádios precoces e a vacinação contra o HPV permite prevenir o desenvolvimento desta
neoplasia. Porém, estes recursos não estão disponíveis em todos os países, principalmente, nos
países em desenvolvimento (177). O tratamento desta neoplasia varia com o estádio, sendo que
nos estádios avançados os tratamentos aplicados são a quimioterapia e a radioterapia (19). Além
da toxicidade provocada por estes tratamentos, outro dos problemas associados a nível clínico
é o desenvolvimento de resistência por parte dos doentes (37,49,106).
A presença de células estaminais do cancro está associada muitas vezes à resistência às
terapêuticas. Essas células têm a capacidade de auto-renovação e de proliferação (115). As
células estaminais do cancro são muito importantes na progressão tumoral porque sustentam a
proliferação celular, o crescimento e a metastização (118). Estão descritos na literatura alguns
marcadores de células estaminais do cancro como a EpCAM (molécula de adesão de células
epiteliais), a ALDH (aldeído desidrogenase), o CD44, o CD133 que nos permitem identifica-
las e isola-las das restantes células presentes no ambiente tumoral (115,178–180). O CD133 é
um marcador de células estaminais cuja expressão está associada a regeneração, diferenciação,
metabolismo e tumorigénese (131). Vários estudos têm demonstrado que a expressão deste
marcador está relacionada com a resistência à quimioterapia e à radioterapia, à capacidade
invasora das células tumorais e que a sua expressão é um possível indicador de baixa sobrevida
(122,134,181). Verificou-se ainda que a CD133 é capaz de interagir com a HDAC6 (histona
desacetilase 6) e promover a estabilização da β-catenina (136). Por outro lado, também existem
trabalhos que associam a diminuição da expressão de CD133 com a diminuição da capacidade
de metastização e a localização nuclear da β-catenina (128,137). A via Wnt/β-catenina está
envolvida em diversos processos de desenvolvimento embrionário e homeostasia das células
adultas. Relativamente às CSCs a via Wnt/β-catenina está relacionada com a sua auto-
renovação, proliferação e manutenção no nicho tumoral (141,182).
Devido à heterogeneidade tumoral, algumas células conseguem “escapar” ao tratamento (183).
A heterogeneidade tumoral pode ser devida a diversos fatores como as alterações genéticas, as
alterações epigenéticas e as alterações proteicas (182). Estas alterações poderão ter como
consequência o aumento da proliferação celular, a evasão aos supressores tumorais, a
71
útero.
angiogénese e a ativação da invasão e da metastização. Contudo, as terapêuticas convencionais

não valorizam estas diferenças e os tratamentos desenvolvidos consideram o cancro como uma
doença homogénea. Tendo em conta estes fatores, é extremamente importante o
desenvolvimento de terapias dirigidas a alvos específico de cada tipo de cancro (183,184).
Posto isto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão da CD133, Wnt, β-catenina
e outras proteínas envolvidas na via Wnt/β-catenina (LRP6, pLRP6, Naked1 e Axin1) após a
exposição à radioterapia e ao tratamento com a cisplatina na tentativa de perceber se estas
proteínas poderão ser utilizadas como alvo direto no tratamento, de forma a minimizar a
toxicidade. Como objetivo secundário pretendeu-se perceber se a alteração da expressão da
CD133 irá interferir com a expressão da β-catenina. Para a realização deste estudo utilizou-se
a linha celular HeLa exposta ao tratamento com o fármaco cisplatina e a radiação-X.
De modo a analisar os efeitos da quimioterapia nestas proteínas procedeu-se à análise
da proliferação celular, análise do ciclo celular, da viabilidade e morte celulares, das espécies
reativas de oxigénio e da defesa antioxidante GSH (glutationa reduzida).
Os efeitos da quimioterapia na proliferação celular foram avaliados utilizando o ensaio
SRB. As células da linha celular HeLa foram tratadas com concentrações crescentes de
cisplatina (0,5-33 µM) durante 24, 48 e 72 horas. Após a realização deste ensaio foi possível
obter curvas de dose-resposta e calcular os valores de IC20, IC50 e IC80 às 48 e 72 horas. Para as
24 horas não foi possível determinar os valores de IC20, IC50 e IC80 uma vez que, mesmo com
a concentração mais alta do fármaco (33 µM), o valor de proliferação celular mínima
encontrada foi de 48,29%. Para as 48 horas o valor de IC20 de 6,17 µM, o valor de IC50 foi de
12,27 µM e o valor de IC80 foi de 24,43 µM, enquanto para as 72 horas o valor de IC20 foi de
5,92 µM, o valor de IC50 foi de 10,20 µM e o valor de IC80 foi de 17,54 µM (Tabela 3.1). O
efeito da cisplatina na linha HeLa demonstrou ser dependente da concentração do fármaco e do
tempo de exposição ao tratamento. Posteriormente, utilizaram-se os valores de IC20, de IC50 e
de IC80 obtidos às 48 horas para avaliar a expressão das diferentes proteínas (CD133, Wnt, β-
catenina, LRP6, pLRP6, Naked1 e Axin1) que pretendemos estudar.
O ensaio da sulforodamina B (SRB) permite inferir sobre o nível de proliferação
celular, na medida em que o corante SRB se liga aos aminoácidos previamente fixados. Desta
forma, a quantidade de corante ligado é proporcional à massa celular, ou seja, quanto maior for
o número de células maior será a quantidade de corante e maior será a absorvância medida
(152–156). A linha celular HeLa é caracterizada por ser uma linha aderente, porém, quando as
células morrem ficam em suspensão. Desta forma, neste ensaio antes da utilização do corante
72
útero.
efetuou-se a lavagem dos poços com PBS de modo a eliminar as células mortas, impedindo
qualquer interferência destas nos resultados. É no entanto, de notar que as células que estejam
em apoptose inicial podem não se ter destacado completamente o que poderá influenciar no
resultado proliferativo obtido. Neste contexto seria também interessante realizar o ensaio MTT,
(do inglês, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) para corroborar os
resultados obtidos no ensaio SRB. O ensaio MTT baseia-se na formação de cristais de
formazano pela redução do sal de tetrazólio presente no MTT pelas células metabolicamente
ativas (185). Desta forma, o número de células metabolicamente ativas será proporcional à
quantidade de cristais de formazano formados (185).
A nível celular a cisplatina atua a diversos níveis, pois é capaz de promover a paragem
no ciclo celular induzindo a formação de espécies reativas de oxigénio e de induzir a morte
celular (46,66). Desta forma, com recurso à citometria de fluxo, avaliámos o impacto deste
fármaco na distribuição das células pelo ciclo celular, tipos de morte, formação de espécies
reativas de oxigénio e da defesa antioxidante GSH. Os dados obtidos para os tipos de morte
celular foram seguidamente corroborados pela coloração de May-Grünwald-Giemsa.
Nos estudos de viabilidade e de morte celulares (Figura 3.2) verificou-se que a
percentagem de células viáveis diminuiu com o aumento da concentração do fármaco
acompanhado por um crescente aumento de células em apoptose e em necrose. Observou-se
também que, a morte celular provocada por este fármaco na linha HeLa ocorreu por necrose e
por apoptose. Analisando a população de células não viáveis, verificou-se uma maior
percentagem de células em apoptose nas condições da IC20 e da IC50 enquanto na condição da
IC80 há uma maior percentagem de células em necrose (28,25%±1,77%). Os resultados obtidos
neste estudo, por citometria de fluxo, foram também corroborados pela coloração de May-
Grünwald-Giemsa (Figura 3.3): de facto, as imagens mostraram características apoptóticas
(vacuolização do citoplasma e formação de corpos apoptóticos) e necróticas (extravasamento
do conteúdo citoplasmático para o meio extracelular) em todas as condições, apesar de na
condição de IC80 haver um predomínio das características necróticas. Estes resultados vão de
encontro aos resultados esperados, ou seja, predomínio da apoptose nas concentrações
correspondentes ao IC20 (6,17 µM) e ao IC50 (12,27 µM) e predomínio da necrose na
concentração correspondente ao IC80 (24,43 µM). Os valores obtidos evidenciaram o que já se
encontra descrito na literatura. Ou seja, que o tipo morte celular induzido por este fármaco
depende da concentração do mesmo. Deste modo, as células expostas a menores concentrações
de cisplatina apresentaram características apoptóticas enquanto que concentrações mais elevas
73
útero.
induziram características necróticas (66). Além de avaliar a apoptose e a necrose também seria
interessante avaliar a P53, proteínas anti-apoptóticas e pró-apoptóticas como a BCL-2 e a BAX,
caspase-8 e caspase-9 por western blot. Esta avaliação permitiria caracterizar de melhor forma
a resposta apoptótica face ao tratamento com a cisplatina.
No estudo realizado por Yano et al. em que avaliaram a morte celular induzida pela
cisplatina em células de uma linha celular de epitélio renal (LLC-PK1) também recorreram à
dupla marcação com anexina V e iodeto de propídeo e verificaram que a morte celular ocorria
tanto por necrose como por apoptose (186). Shino et al. verificaram que a exposição contínua
(30 µM, durante 24 horas) das mesmas células à cisplatina aumentava o número de células em
apoptose (marcadas por anexina V e deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end
labeling-TUNEL) porém, a exposição transiente a este fármaco (500 µM, durante 1 hora ) não
provocava alterações quando comparada com as células não expostas (187). Já no estudo
realizado por Lieberthal et al. Onde utilizaram o corante Hoechst e o homodímero etídeo
verificaram que o tipo de morte provocada em células do epitélio renal dependia da
concentração do fármaco, isto é, em baixas concentrações de cisplatina a morte celular ocorria
por apoptose enquanto que em concentrações aumentadas a morte celular ocorria por necrose
(188). Os resultados obtidos por Yano et al. e por Lieberthal et al. vão ao encontro com os
resultados por nós obtidos. No estudo realizado por Shino et al. apenas verificaram o aumento
de células em apoptose não referindo a necrose. O que poderá ser explicado pelo próprio método
utilizado pelos autores (TUNEL e anexina V) que detetam células em apoptose e não em
necrose.
Avaliando a distribuição de células pelas diferentes fases do ciclo celular (Figura 3.4)
foi possível verificar que a percentagem de células correspondente à fase pré-G0/G1 na
condição controlo foi de 0,63%±0,18% enquanto que nas condições de IC20, de IC50 e de IC80
exibiram uma maior percentagem de células em fase pré-G0/G1. A presença de células na fase
pré-G0/G1 nas condições tratadas (IC20, IC50 e IC80) corrobora os resultados referentes ao tipo
de morte celular (apoptose) presentes nas condições anteriormente referidas. O iodeto de
propídeo com RNAse (utilizado como reagente no ciclo celular) tem a capacidade de se ligar
de forma estequiométrica ao DNA, pelo que a quantidade de luz emitida é proporcional a
quantidade de DNA ligado. A fase pré-G0/G1, devido a fragmentação do DNA e libertação dos
corpos apoptóticos, possui menor quantidade de DNA, enquanto as células nas restantes fases
(células pré-replicativas (fase G0/G1), replicativas (fase S) e pós-replicativas e mitóticas
74
útero.
(G2/M)) possuem maior quantidade de DNA. Desta forma, a fase pré-G0/G1 correlaciona-se
com as células em apoptose (162).
A maior percentagem de células (66,88%±1,01%) paradas na fase G0/G1 corresponde
à condição controlo. Nas concentrações referentes ao IC50, IC80, verificou-se uma maior
percentagem de células paradas na fase S (55,88%±4,90% e 63,50%±4,67% respetivamente).
Por outro lado, observou-se que a condição de IC20 induziu maior bloqueio (59,88%±3,96%)
na fase G2/M do ciclo celular. Estes resultados poderão ser explicados pelo próprio mecanismo
de ação da cisplatina. Este fármaco tem a capacidade de se ligar ao DNA por meio de ligações
covalentes sendo mais tóxico em células em replicação do que em células quiescentes, pelo que
poderá ter induzido a progressão no ciclo celular de forma a provocar maiores erros a nível do
DNA e, consequentemente, a morte celular.
Os bloqueios observados pelas diferentes fases do ciclo celular, de acordo com a
concentração do fármaco, poderão ser explicados pelos respetivos danos a nível do DNA e a
ação dos check-points existentes nas diferentes etapas do ciclo celular.
O bloqueio observado com as concentrações correspondentes ao IC50 e ao IC80 na fase
S, poderá ser explicado pelo facto dessas concentrações serem elevadas e produzirem danos a
nível do DNA, de tal ordem que não as permitiu avançar no ciclo celular. Apesar desses erros,
as células conseguiram ultrapassar o check-point na fase G1 do ciclo celular, porém, nota-se
um bloqueio na fase S. Ao ultrapassar a fase G1, posteriormente poderá ter ocorrido um atraso
ou bloqueio na fase S devido a presença de erros que não foram reparados. As células expostas
à concentração correspondente à condição IC20 (menor concentração de fármaco) terão
ultrapassado os check-points anteriores (G1-S), provavelmente, por terem menos erros no
DNA. No entanto, não tiveram a capacidade de escapar ao check-point na fase G2/M,
possivelmente devido à acumulação de erros (189,190). Estes resultados permitem apontar que
a cisplatina tem a capacidade de permitir a progressão no ciclo celular. Além disso, indicam
que a paragem das células HeLa nas diferentes fases do ciclo celular varia de acordo com a
concentração de cisplatina. Para uma melhor perceção destes resultados seria interessante
realizar o ensaio cometa que permite avaliar os danos causados no DNA pelas diferentes
concentrações do fármaco. O ensaio cometa baseia-se na ligação de um corante com afinidade
para o DNA. O DNA que está danificado, durante a migração, forma uma cauda devido à perda
da sua estrutura enquanto que o DNA não danificado não migra. Desta forma, o tamanho da
cauda será proporcional aos danos no DNA (191,192). Este ensaio permitirá avaliar a proporção
de danos causados pela cisplatina.
75
útero.
A análise da expressão de genes envolvidos na regulação dos check-points do ciclo

celular, por microarray, também seria interessante de se realizar, na medida em que permitiria
perceber como a cisplatina modela a expressão destes genes e, consequentemente, a distribuição
das células HeLa pelas diferentes fases do ciclo celular.
No estudo realizado por Schloffer et al., os autores verificaram que o fármaco induzia
uma paragem na fase S do ciclo celular após incubar células HeLa S3 com 40 µM de cisplatina
durante 6 horas (193). Velma et al. observaram que havia uma acumulação de células na fase
pré-G0/G1, S e G2 do ciclo celular após incubar células HL-60 com 1 µM de cisplatina duante
24 horas (194). O aumento do período de incubação com a mesma concentração de fármaco (1
µM) induziu uma acumulação de células na fase S e pré-G0/G1. Células tratadas com 2 µM e
3 µM de cisplatina mostraram acumulação de células na fase pré-G0/G1. Neste estudo, os
autores concluíram que a distribuição das células pelo ciclo celular, após o tratamento com a
cisplatina, não depende somente da concentração do fármaco, mas também do tempo de
exposição (194). Os resultados obtidos por Schloffer et al. E por Velma et al. vão de encontro
aos resultados por nós obtidos, ou seja, as distribuições das células pelas fases do ciclo
dependem da concentração do fármaco, embora não se tenha avaliado a exposição ao longo do
tempo.
As espécies reativas de oxigénio como o radical superóxido, o radical hidroxilo ou o
peróxido de hidrogénio têm papel importante em funções biológicas como a fagocitose, a
produção de energia, o crescimento celular, porém, em excesso são prejudicais. Para evitar este
excesso, os agentes antioxidantes como a SOD (superóxido dimutase), a catálase e o glutationa
reduzida desempenham um papel importante (97,98). O radical superóxido é dismutado pela
SOD originando o peróxido de hidrogénio que, posteriormente, é decomposto em água e
oxigénio pela catálase. O peróxido de hidrogénio também pode ser convertido em água pela
ação da GSH, sendo necessário o consumo de duas moléculas de GSH para reduzir uma
molécula de peróxido de hidrogénio (98,170). O peróxido de hidrogénio também origina o
radical hidroxilo, um dos radicais biologicamente mais reativos (170–173).
Nesta dissertação avaliámos a produção intracelular do radical superóxido, do peróxido
de hidrogénio, do radical hidroxilo e da glutationa reduzida. Assim, como esperado, observou-
se que o radical superóxido aumentou com o aumento da concentração do fármaco (Figura 3.5).
Uma vez que a cisplatina induz a formação de espécies reativas de oxigénio, que provoca danos
a nível do DNA, podendo resultar em morte celular, espera-se que a produção de espécies
reativas seja tanto maior quanto maior for a concentração do fármaco. Relativamente à
76
útero.
produção intracelular dos peróxidos (Figura 3.6) observou-se que a condição do IC20 exibe uma
maior produção intracelular de peróxidos (1,68MIF±0,03MIF). Quanto à GSH, a produção
intracelular também aumenta com o aumento da concentração do fármaco (Figura 3.7).
Relativamente à GSH o resultado obtido vai de encontro ao esperado uma vez que um
dos mecanismos de ação da cisplatina é através da formação de espécies reativas. O aumento
da produção intracelular da GSH poderá ter ocorrido na tentativa de converter o peróxido de
hidrogénio em água. Porém, os resultados obtidos para os peróxidos não vão de encontro aos
resultados esperados, ou seja, o aumento da produção dos peróxidos com o aumento da
concentração da cisplatina. Estes resultados podem ser explicados, uma vez que a 2’,7’
diclorodihidrofluoresceina (DCFH) pode ser oxidada em 2’,7’-diclorofluoresceina (DCF) em
menor proporção por outras ERO sem ser o peróxido de hidrogénio, o que interferirá na
quantidade de peróxidos medidos. Consegue reagir também com os peroxinitritos e as
hidroperoxidases lipidicas (195). Adicionalmente, as espécies reativas de oxigénio possuem
uma semi-vida muito curta, podendo-se converter em outras espécies reativas de oxigénio,
alterando assim a quantidade final das mesmas (196). Posto isto, a análise da GSH peroxidase
(GPx) também seria interessante uma vez que a GSH é oxidada em GSSG (dissulfeto de
glutationa) pela ação da GPx utilizando como substrato o peróxido de hidrogénio. Nesta reação,
o peróxido de hidrogénio é convertido em água por intermédio da GPx (197). A análise da GPx,
uma das principais enzimas responsáveis pela eliminação dos peróxidos permitiria uma melhor
compreensão deste processo oxidativo.
Verifica-se ainda que há stresse oxidativo uma vez que é necessário o consumo de duas
moléculas de GSH para reduzir uma molécula de peróxido. Por outro lado, o aumento da
expressão da GSH pode também indicar um mecanismo de defesa/resistência da célula a este
fármaco, uma vez que a cisplatina quando conjugada com a GSH é exportada para fora da célula
(72). Sabendo que cerca de 60% da cisplatina se liga à GSH, seria também interessante avaliar
o transporte da GSH para fora da célula (198). A GSH é exportada através dos transportadores
ABC (do inglês, ATP‐binding cassette), em especial pelas MRP 1 e 2 (do inglês, multidrug
resistance proteins) (199). Poder-se-ia inibir estes transportadores e, posteriormente, medir a
GSH, comparando os níveis extracelulares pré e pós-inibição dos transportadores.
Relativamente ao anião superóxido não se pode concluir se há ou não stresse oxidativo,
uma vez que este resulta do desequilíbrio entre a formação das espécies reativas de oxigénio e
a sua remoção. Desta forma, não analisando a SOD, enzima importante no combate desta ERO,
nada se pode concluir.
77
útero.
Num estudo realizado por Whang et al. onde utilizaram a sonda DHE (dihidroetidina)
para avaliar a produção de espécies reativas de oxigénio observaram que, 24 horas após o
tratamento de células de uma linha celular do cancro do colon, a expressão das ERO era
dependente da concentração da cisplatina, isto é, quanto maior a concentração do fármaco maior
os níveis intracelulares de ERO (200). Este estudo está em concordância com os resultados que
obtivemos, uma vez que a produção intracelular dos superóxidos aumentou com o aumento da
concentração do fármaco. Que et al. Observaram, com recurso a marcação com DCFH,
aumento das espécies reativas de oxigénio, após tratar com cisplatina células de duas linhas de
cancro hepatocelular (201). Este estudo não vai de encontro com os resultados por nós obtidos,
uma vez que a produção intracelular dos peróxidos não aumentou com o aumento da
concentração do fármaco. O que poderá ser justificado pelo facto das linhas celulares serem
diferentes.
Por fim utilizou-se o manitol como neutralizador do radical hidroxilo com o intuito de
perceber o efeito do radical hidroxilo na proliferação das células HeLa. Como referido em Ding
X et al. utilizou-se a concentração de 40 mM de manitol (171) e após 48 horas de incubação,
assim como esperado observou-se um aumento de 12,27µM ±1,04 µM para 22,57µM ±0,71µM
no IC50 sugerindo que o radical hidroxilo está envolvido na citotoxicidade provocada nas
células HeLa (Figura 3.7).
Relativamente à expressão da CD133 observou-se, por western blot, que este diminuiu
na condição IC50 com posterior aumento na condição IC80 (p=0,04) (Figura 3.9 A). Os
resultados foram corroborados pela imunomarcação da CD133 (Figura 3.9 C). Estes resultados
não vão de encontro aos resultados esperados. Como a CD133 está associada à resistência à
quimioterapia era espectável que a expressão se mantivesse relativamente constante com o
aumento da concentração do fármaco ou que a expressão deste marcador aumentasse na
tentativa de combater a ação da cisplatina. Porém, estes resultados indicam que a expressão da
CD133 se altera com a concentração do fármaco. Este resultado poderá ter sido provocado pela
alteração da expressão génica das células HeLa após a exposição à cisplatina, resultando em
diferentes expressões proteicas. Neste contexto, a avaliação da expressão por PCR (do inglês,
polymerase chain reaction) após o tratamento seria também importante permitindo elucidar o
comportamento do gene (PROM-1) que codifica para expressão da proteína CD133.
No estudo realizado por Liu Y et al. em que células de duas linhas de cancro do pulmão,
a H460 e a H661, foram tratadas com diferentes concentrações de cisplatina (1 µM/L, 10 µM/L
e 2 µM/L, 20 µM/L respetivamente) durante 24 horas, os autores observaram um aumento da
78
útero.
expressão génica por PCR e proteica por citometria de fluxo da CD133 (196). Os resultados
obtidos neste estudo não possuem o mesmo padrão de expressão proteica quando comparados
com os resultados por nós obtidos; como referido anteriormente, a análise da expressão génica
nesta dissertação seria muito importante facilitando a compreensão dos diferentes padrões
proteicos observados.
Na Figura 3.10 observa-se o aumento da imunomarcação da Wnt (nas condições de IC20
e de IC50) e posterior diminuição relativamente ao controlo na condição IC80. Observa-se que a
expressão da β-catenina foi mais elevada na condição de IC50 diminuindo, tendencialmente, na
condição de IC80 (Figura 3.11 A). O aumento da expressão da β-catenina na condição de IC50,
poderá indicar uma tentativa da célula combater a ação do fármaco, porém em concentrações
mais elevadas o fármaco consegue reverter este aumento. A análise da expressão da LRP6
revelou que há uma tendência para a diminuição da expressão desta proteína com o tratamento,
sendo que a concentração mais elevada (IC80) do fármaco corresponde a menor expressão desta
proteína (Figura 3.12). Na Figura 3.13 é possível observar o aumento tendencial da pLRP6 com
o aumento da concentração do fármaco. O diferente padrão de expressão observado entre a
proteína total (LRP6) e a proteína fosforilada (pLRP6), poderá ser explicado pelo facto de não
se ter realizado análise por western blot no mesmo gel, o que poderá expor os diferentes géis a
variáveis diferentes que poderão afetar a quantificação. Sendo assim, seria necessário a
realização deste ensaio no mesmo gel. Porém, devido ao aumento tendencial da pLRP6, e à
diminuição tendencial da Naked1 (figura 3.14, resultados preliminares) e da Axin1 (Figura
3.15), poderá ser expectável haver a localização nuclear da β-catenina. Estudos para confirmar
a localização nuclear da β-catenina seriam importantes de se realizar. A β-catenina ao entrar no
núcleo consegue-se ligar ao domínio fator de célula T/fator potenciador linfoide (TCF/LEF,
do inglês T-cell factor/lymphoid enhancer factor) e promover a transcrição de genes alvos. A
realização de uma imunoprecipitação permitiria avaliar essa interação.
No tratamento do cancro, a radioterapia constitui uma das principais opções
terapêuticas. A escolha desta terapêutica poderá variar com o estádio, tipo de tumor e perfil da
população (76). Apesar dos avanços feitos nesta área, a radioterapia não é uma terapia seletiva,
afeta também as restantes células adjacentes. Existem relatos de efeitos adversos como a
dermatite, a toxicidade hematológica e as alterações do trato gastrointestinal (78,80,81).
Um dos principais objetivos da radioterapia é inibir o potencial proliferativo ou a
capacidade clonogénica das células (68). A inibição da capacidade clonogénica pode ser
avaliada pelo ensaio clonogénico, o que permite obter informações sobre a radiossensibilidade
79
útero.
celular (67,77). Desta forma, neste estudo, para avaliar o efeito da radioterapia nas células da
linha HeLa, avaliou-se a capacidade clonogénica (ensaio clonogénico) 10 dias após a exposição
à radioterapia utilizando doses compreendidas entre 0 Gy e 10 Gy. Após a realização desse
ensaio foi possível traçar a curva dose-resposta e determinar a DL50 (dose letal média)
utilizando-se o modelo linear quadrático. Os valores obtidos foram de 3,15 Gy para o DL50, de
-0,1499 Gy para o α, de 0,1174 Gy para o β e de 1,02 para o Fator de Sobrevivência (2). A
razão α/β foi de -1,28. Este valor não permite inferir sobre a radiossensibilidade da linha, uma
vez que valores α/β compreendidos entre 1 e 5 indicam que a linha celular é radio-resistente ou
que responde de forma tardia à radioterapia enquanto que valores compreendidos entre 6 e 12
indicam que a linha é radiossensível ou que responde de forma precoce à radioterapia (77). Por
se ter obtido um valor de α negativo a razão α/β também foi negativa. O valor de alfa negativo
pode ser explicado pelo início da curva em que se verifica o aumento da sobrevivência celular,
pois até aos 2 Gy as células HeLa não respondem à radioterapia, o que traduz radiorresistência.
Nos estudos posteriores utilizaram-se as doses de 2 Gy, de 3 Gy e de 10 Gy após 48 horas de
exposição.
A inibição da capacidade clonogénica poderá ocorrer por apoptose, necrose, catástrofe
mitótica, indução da senescência e/ou autofagia (68,96). A nível biológico a radioterapia
consegue atuar de forma direta e indireta. Os efeitos diretos resultam da interação direta da
radiação com os componentes celulares. O efeito indireto é através da formação de espécies
radicalares como as espécies reativas de oxigénio e de nitrogénio (88,89). Desta forma,
analisou-se a morte celular, a produção de espécies reativas de oxigénio (superóxido e
peróxidos) e a defesa antioxidante GSH.
Assim como esperado a análise da morte celular, por citometria de fluxo (dupla
marcação com anexina V e iodeto de propídeo), revelou uma diminuição da percentagem de
células viáveis com o aumento da dose, acompanhado por um aumento de morte celular.
Observou-se ainda que há um predomínio da necrose em todas as condições quando
comparadas com a apoptose, e estes valores são estatisticamente significativos em células
tratadas com a maior dose de radioterapia, ou seja, dose de 10 Gy (Figura 3.17). Estes resultados
foram corroborados parcialmente pela coloração de May-Grünwald-Giemsa. É possível
observar a existência de características apoptóticas e necróticas na condição de 2 Gy,
características necróticas na condição de 3 Gy e de 10 Gy (Figura 3.18). A condição de 10 Gy
exibe características necróticas ainda mais acentuadas quando comparada com as restantes
condições. Esta diferença pode dever-se à utilização de duas técnicas distintas pois a coloração
80
útero.
por May-Grünwald-Giemsa permite observar a morfologia das células enquanto a citometria,

com recurso a anexina V e iodeto de propídeo, permite distinguir células viáveis, células em
apoptose inicial, células em apoptose tardia/necrose e células em necrose tendo como princípio
a ligação da anexina V à fosfotidilserina membranar e o iodeto de propídeo ao DNA (8,9). Pela
técnica de May-Grünwald-Giemsa pode não ter sido possível detetar características referentes
à apoptose inicial por ser uma técnica que se baseia apenas na observação microscópica. Jin X
e colaboradores recorreram à citometria de fluxo para analisar a morte celular com recurso a
anexina V e iodeto de propídeo após tratar as células HeLa com 0,5 Gy e com 3 Gy. Observaram
que com o aumento da dose, ocorria o aumento apoptose (202). Na tentativa de perceber o efeito
da radiação-X (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy, 10 Gy, 12.5 Gy, 15 Gy e 20 Gy) nas células
HeLa, Zhao et al., observaram, com recurso à citometria de fluxo (anexina V-FITC e iodeto de
propídeo), aumento de células em apoptose com o aumento da dose em diferentes tempos (48
e 72 horas) (203). Os nossos estudos revelaram a mesma tendência, isto é, aumento da
percentagem de células em apoptose com o aumento da dose depositada. Porém, os estudos
realizados por Jin X et al. E por Zhao et al. não discriminam a percentagem de células em
necrose, assim como também não foi possível encontrar bibliografia que fizesse esta separação.
Os nossos resultados permitem concluir que quanto maior for a dose depositada menos
viável se torna a célula e maior é a tendência para ocorrer a morte por necrose. Também seria
interessante avaliar a P53, proteínas anti-apoptóticas e pró-apoptóticas como a BCL-2 e a BAX,
caspase-8 e caspase-9 por western blot antes e após a exposição à radioterapia de modo a
perceber de melhor forma a apoptose.
Relativamente à produção de espécies reativas de oxigénio observou-se um aumento
crescente da produção intracelular de radicais superóxidos (Figura 3.19) e um aumento
tendencial de peróxidos (Figura 3.20) com o aumento da dose, como expectável. Zhao et al.
também observaram, com recurso a DHE, aumento de espécies reativas de oxigénio com o
aumento da dose (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy, 10 Gy, 12.5 Gy, 15 Gy e 20 Gy) (204). Este
resultado também vai de encontro ao encontrado no nosso estudo, isto é, aumento da produção
intracelular de superóxidos com o aumento dose, uma vez que uma das principais formas de
atuação da radioterapia é através da formação de espécies reativas que poderão induzir morte
celular.
Também era expectável verificar o aumento da expressão da GSH, na tentativa de
combater os peróxidos. Porém, o que verificámos no nosso estudo, foi a diminuição
significativa da expressão de GSH com a dose de 3 Gy e aumento na condição de 10 Gy (Figura
81
útero.
3.21). A GSH desempenha um papel protetor na radioterapia, uma vez que o aumento da sua
expressão está relacionado com a radioresistência, o que poderá ser justificado pela ligação da
GSH à P53, impedindo assim, a sua correta função (197). No entanto, existe pelo menos um
estudo que descreve a diminuição da expressão da GSH após a radioterapia (205). Krishna e
colaboradores observaram em doentes com cancro do colo do útero nos estádios IIB e IIIB
expostas à radioterapia, com dose de 35 Gy distribuída em 16 frações durante 4 semanas, houve
diminuição da GSH ,após uma única fração de 2Gy de radiação-X, tanto nas amostras
sanguíneas como nas amostras tumorais (205). Surpreendentemente, os nossos dados revelam
que ocorre a diminuição da expressão com a dose de 3 Gy e o aumento da GSH com a dose de
10 Gy. Este aumento poderá ser justificado como uma tentativa das células HeLa contornarem
o efeito da radioterapia. É possível observar ainda em todas as condições a existência de stresse
oxidativo, uma vez que é necessário o consumo de duas moléculas de GSH para reduzir uma
molécula de peróxido (98). Desta forma, a análise da GPx também seria interessante já que a
GSH é oxidada em GSSG pela ação da GSH peroxidase utilizando como substrato o peróxido
de hidrogénio. O peróxido de hidrogénio nesta reação é convertido em água por intermédio da
GPx (197). A análise da GPx, permitiria compreender de melhor forma este processo oxidativo.
Uma vez que o stresse oxidativo resulta do desequilíbrio entre a formação das espécies
reativas de oxigénio e a sua remoção, analisando apenas os superóxidos não se pode concluir
se houve ou não stresse oxidativo porque não se avaliou a SOD, enzima importante na
transformação do peróxido de hidrogénio em água. Desta forma, seria também importante a
análise da SOD neste estudo.
Já existem publicações que relacionam a expressão da CD133 com a resistência à
radioterapia e a capacidade de formação de colónias (134). No nosso estudo além de avaliar a
expressão da CD133, também analisamos outras proteínas como a β-catenina, a Wnt, a LRP6,
a pLRP6, a Naked1 e a Axin1, 48 horas após a exposição à radioterapia (2 Gy, 3 Gy e 10 Gy),
na tentativa de perceber como varia a sua expressão após a radioterapia. A expressão da CD133
e de β-catenina foi avaliada simultaneamente por western blot e por imunocitoquímica. A
expressão da LRP6, da pLRP6, da Naked1 e da Axin1 foi analisada por western blot e a
expressão da proteína Wnt foi avaliada por imunocitoquímica.
Na Figura 3.22 (A e B) observa-se diminuição da expressão da CD133 na condição de
2 Gy, aumento da expressão na condição de 3 Gy e diminuição na condição de 10 Gy. Estes
resultados são também corroborados pela imunocitoquímica (Figura 3.22 C). Era expectável
que a expressão da CD133 se mantivesse constante por conferir resistência ao tratamento ou
82
útero.
que aumentasse com o aumento da dose, na tentativa de combater a ação da radioterapia. No

estudo realizado por Kurth et al. após terem submetido células de duas linhas celulares de
cancro de cabeça e pescoço (FaDu e Cal33) a várias frações de 4 Gy verificaram que após 24
horas, a expressão de CD133 aumentou a partir da terceira fração. Em sete dias após a exposição
à radioterapia observaram o aumento crescente da expressão de CD133 com a acumulação da
dose em todas as linhas. A análise da expressão da CD133 foi feita com recurso à citometria de
fluxo (206). No estudo realizado por Cojoc et al. submeteram células de linhas do cancro da
próstata à radioterapia fracionada (até 7 frações de 2 Gy) e observaram que nas linhas que
expressavam ALDH havia um aumento da expressão da CD133 (análise feita com recurso a
citometria de fluxo) com o aumento da dose (até à 5 fração). Este estudo foi realizado sete dias
após a exposição à radioterapia (207). Estes resultados não vão de encontro dos resultados
obtidos com o nosso trabalho uma vez que não se verificou o aumento da expressão da CD133
com o aumento da dose. Porém, é de realçar que os estudos anteriormente mencionados
avaliaram a expressão desta proteína com o fracionamento da radioterapia e sete dias após a
radioterapia fracionada, o que poderá explicar esta diferença de resultados. Seria então
interessante, no nosso estudo, avaliar a expressão da CD133 com a acumulação da dose e mais
dias após a exposição (sete dias) assim como avaliar a expressão génica por PCR de forma a
perceber o efeito da radiação na expressão deste gene. É de realçar que a expressão mais baixa
desta proteína se verifica na condição de10 Gy. Nota-se ainda que a maior percentagem de
morte celular por apoptose também foi na condição de 10 Gy (Figura 3.17). Esta diminuição de
expressão da CD133 poderá estar relacionada com a morte celular nesta condição, uma vez que
a diminuição da sua expressão pode induzir a apoptose (204).
Relativamente à Wnt observou-se um aumento da sua expressão com o aumento da dose
de radiação, quando comparada com a condição controlo, apesar de não se ter verificado
diferenças entre as condições (Figura 3.23). Quanto à expressão da β-catenina observou-se uma
tendência para o aumento na condição de 2 Gy, diminuição na condição de 3 Gy e aumento na
condição de 10 Gy (Figura 3.24 A e B). O aumento da expressão da β-catenina na condição de
2 Gy poderá ser justificado como uma tentativa da célula contrariar os efeitos da radioterapia,
uma vez que só se observou a diminuição da sobrevivência na linha celular HeLa após
exposição a 2 Gy. A diminuição da expressão da β-catenina na condição de 3 Gy (DL50) poderá
indicar que esta dose consegue diminuir a expressão desta proteína. O aumento na condição de
10 Gy poderá indicar uma tentativa das células sobreviventes de reverterem o efeito da
radioterapia. Estes resultados são corroborados pela imunomarcação onde se observa o mesmo
83
útero.
padrão de expressão da β-catenina (Figura 3.24C). Salienta-se que na condição de 2 Gy se

observou uma menor morte celular (Figura 3.17), o que poderá ser justificado pelo aumento da
expressão da β-catenina, podendo conferir resistência à terapêutica. Não foi encontrada
bibliografia que permitisse discutir os nossos resultados, porém estes resultados sugerem que a
exposição a radiação X aumenta a expressão da Wnt e que maiores níveis de β-catenina estão
associados a uma menor morte celular associada a apoptose.
Na Figura 3.25 observa-se que há uma tendência para a diminuição da expressão da

LRP6 com o aumento da dose de radiação. Na figura 3.26 observa-se também a tendência para
a diminuição da expressão da pLRP6 com o aumento da dose de radiação. A diminuição da
pLRP6 poderá ser justificada pela diminuição da proteína total. Com a diminuição da pLRP6,
era esperado que houvesse diminuição da acumulação nuclear da β-catenina uma vez que a
fosforilação da LRP6 (Ser1490) indica a ligação da Wnt ao seu receptor LRP6, o que
posteriormente irá induzir a acumulação nuclear da β-catenina (208). Porém, esta avaliação não
foi efetuada. Como referido anteriormente, a β-catenina ao entrar no núcleo consegue-se ligar
ao domínio do fator da célula T/fator potenciador linfoide (TCF/LEF, do inglês T-cell
factor/lymphoid enhancer factor) e promover a transcrição de genes alvos. A realização de
uma imunoprecipitação permitiria avaliar a interação entre o domínio TCF/LEF e a β-catenina
e inferir melhor sobre a localização nuclear da β-catenina.
Os resultados preliminares da Naked1 (Figura 3.27) mostraram uma tendência para
diminuição da expressão desta proteína na condição de 3 Gy e aumento na condição de 10 Gy.
Na Figura 3.28 observa-se uma tendência para a diminuição da expressão da Axin1 na condição
de 2 Gy, aumento na condição de 3 Gy e diminuição na condição de 10 Gy (resultados
preliminares). Esta diminuição na expressão dos inibidores da via Wnt/β-catenina (Naked1 e
Axin1) na condição de 2 Gy poderá justificar o aumento da expressão da β-catenina nesta
condição. Além disso, a Axin1 induz a fosforilação da P53 promovendo a apoptose o que
poderá justificar o menor nível de apoptose observada nesta condição. Na condição de 3 Gy a
diminuição da expressão da β-catenina poderá ser justificada com o aumento da expressão da
Axin1. Já na condição de 10 Gy observou-se o aumento da expressão da Naked1 mantendo a
β-catenina níveis semelhantes à condição controlo. Estes resultados poderão indicar que a
expressão da Naked1 e da Axin1 depende da dose de radiação depositada a nível celular,
contudo seria necessário um maior número de amostras independentes para melhor avaliar estas
proteínas.
84
útero.
No estudo realizado por Han Y et al. numa linha de cancro do pulmão (A549),
observaram o aumento da expressão da Axin1 e apoptose após a exposição à radiação-X (1 Gy)
(209). No entanto, os nossos dados não indicam a existência de um maior nível de apoptose
quando se observa maior expressão da Axin1 (3 Gy). Isto poderá ser justificado como referido
anteriormente pelo aumento da Naked1 nesta condição. Porém, não foi possível encontrar
artigos que avaliassem a expressão da Naked1 após a exposição à radioterapia e que avaliassem
também a expressão da Axin1 na mesma linha celular após diferentes doses.
Além da CD133, a avaliação da expressão génica da Wnt, da β-catenina, da LRP6, da
pLRP6, da Naked1 e da Axin1 por PCR seria também importante uma vez que permitiria uma
melhor compreensão da expressão proteica observada, facilitando perceber o comportamento
destas proteínas em resposta à radioterapia e em que medida poderiam ser usadas como alvo no
tratamento.
5-Conclusão
O cancro do colo do útero é o quarto cancro mais comum a nível mundial (3). Em 2012
estimaram-se cerca de 528 000 novos casos e cerca de 266 000 mortes em todo o mundo,
sendo que cerca de 87% destes valores ocorreriam nas regiões menos desenvolvidas (10). Os
tratamentos existentes para esta neoplasia em estádios avançados são a quimioterapia e a
radioterapia. Porém, estes tratamentos estão associados a toxicidade e a resistência
(19,37,49,106).
A presença de células estaminais do cancro está associada muitas vezes à resistência às
terapêuticas (115). O CD133 é um marcador de células estaminais que está associado a
resistência à quimioterapia e à radioterapia, à invasão e à baixa sobrevivência (122,134,181). A
via Wnt/β-catenina está envolvida em diversos processos de desenvolvimento embrionário e de
homeostasia das células adultas. Em contexto tumorigénico, está relacionada com a manutenção
e com a evolução das células estaminais (141).
Devido ao envolvimento da CD133 e da via Wnt/na resistência às terapêuticas e no
desenvolvimento tumoral pretendeu-se avaliar a expressão destas proteínas e da LRP6, da
pLRP6, da Axin1 e da Naked1 em células do cancro do colo do útero.
Os resultados obtidos nas células da linha HeLa após o tratamento com cisplatina
sugerem que o efeito da cisplatina nesta linha dependeu do tempo e da concentração exposta, a
morte celular variou de acordo com a concentração da cisplatina e que este fármaco foi capaz
de induzir stresse oxidativo. A distribuição das células pelo ciclo celular dependeu da
85
útero.
concentração do fármaco, assim como a indução da expressão da CD133. Não se observou

correlação entre a expressão da CD133 e a localização nuclear da β-catenina.
Os resultados obtidos na linha celular HeLa após a exposição à radioterapia, revelaram
que quanto maior for a dose depositada maior a morte celular. A radioterapia induziu stresse
oxidativo nesta linha celular, no entanto, quando se aplicaram doses mais elevadas (10 Gy)
ocorreu o aumento da expressão intracelular da GSH na tentativa de compensar a produção
intracelular das espécies reativas de oxigénio. Não se observou correlação entre a expressão da
CD133 e localização nuclear da β-catenina. Observou-se que o aumento da expressão da β-
catenina e a diminuição da expressão da Axin1 poderão levar à apoptose e que os níveis de
expressão de inibidores da via Wnt/β-catenina como a Naked1 e a Axin1 poderão depender da
dose aplicada.
Tendo em conta os objetivos propostos neste estudo foi possível verificar que tanto a
radioterapia como a quimioterapia induziram alteração da expressão da CD133, da Wnt, da β-
catenina, da LRP6, da pLRP6, da Naked1 e da Axin1. Após o tratamento com a cisplatina
observou-se aumento da expressão da pLRP6 e diminuição da expressão da Naked1 e da Axin1
com o aumento da concentração do fármaco, o que poderá levar a localização nuclear da β-
catenina e induzir a transcrição de genes responsáveis pela sobrevivência e pela proliferação
das células tumorais. Estes resultados poderão estar associados à resistência ao tratamento com
a cisplatina nos doentes com cancro do colo do útero. Na radioterapia foi possível observar que
o aumento da expressão da β-catenina está associada a uma menor morte celular e que a menor
expressão da CD133 está associada a maior morte celular.
Desta forma, foi possível alcançar os objetivos propostos, porém não se conseguiu
estabelecer uma completa correlação entre as proteínas analisadas. Continua assim a ser
necessário o desenvolvimento de mais estudos que permitam perceber esta interação de forma
a minimizar o crescimento tumoral, a toxicidade e a resistência.
86
útero.
6- Perspetivas futuras
Com a realização deste trabalho surgiram novas propostas para estudos futuros que poderão
permitir esclarecer alguns dos resultados obtidos:
1) Isolamento de células que expressam o marcador CD133 nas células da linha HeLa e
comparar com células cuja a expressão foi inibida na tentativa de perceber o papel deste
marcador face à resposta à quimioterapia e à radioterapia.
2) Analisar a expressão nuclear da β-catenina
3) Inibir a expressão da Axin1 e da Naked1 na tentativa de perceber como estes marcadores
influenciam na proliferação e a sobrevivência das células da linha HeLa.
87
útero.
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100
útero.
8- Anexos
Anexo I
Estadiamento do cancro do colo do útero de acordo com as normas da FIGO.
IA1-Invasão do estroma ≤3mm em

profundidade e ≤7mm em extensão
IA2-Invasão do estroma >3mm e ≤5mm em

profundidade e ≤7mm em extensão
Estádio I - Carcinoma limitado ao colo
IB-Carcinoma clinicamente visível com

≤4cm
IB2-Carcinoma clinicamente visível com

>4cm
IIA-Tumor envolve até os 2/3 superiores da

vagina, sem infiltração óbvia do paramétrio
Estádio II - Carcinoma estende-se para além

do colo, mas não atinge a parede pélvica,
nem o 1/3 inferior da vagina
IIA1-Carcinoma clinicamente visível com

≤4cm, sem envolvimento do paramétrio
101
útero.
IIA2-Carcinoma clinicamente visível com

>4cm, sem envolvimento do paramétrio
IIB-Carcinoma infiltra o paramétrio, sem

atingir a parede pélvica
IIIA-Invasão do 1/3 inferior da vagina, sem

atingir a parede pélvica
Estádio III - Carcinoma estende-se à parede
pélvica e/ou invade o 1/3 inferior da vagina,
e/ou hidronefrose ou rim não funcionante (a
não ser que se conheça outra causa)
IIIB-Extensão à parede pélvica, e/ou
hidronefrose, e/ou rim não funcionante
IVA - O tumor invade a mucosa da bexiga

e/ou do reto
Estádio IV - Carcinoma estende-se para

além da pelve, e/ ou invade a mucosa da
bexiga e/ou do reto
IVB - Metástases à distância
102

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Simone Stephanie Fortes da Graça

Efeito de diferentes terapêuticas citotóxicas na

Efeito de diferentes terapêuticas citotóxicas na

Mecanismos Moleculares do Cancro

Trabalho efetuado sob a supervisão de:

Professora Doutora Maria Filomena Botelho

Professora Doutora Bibiana Ferreira

Declaração de autoria de trabalho

A Universidade do Algarve reserva para si o direito, em conformidade com o disposto no

O cancro do colo do útero é o quarto cancro mais comum a nível mundial. A

Palavras chaves: Cancro do colo do útero, células estaminais do cancro, cisplatina,

Figura 1. 1: Estimativa de novos casos e morte por sexo em países em desenvolvimento........ 2

A.M.Lisboa: Área Metropolitana de Lisboa EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético

I OH•: radical hidroxilo

1.1-Epidemiologia do cancro do colo do útero

A infeção genital pelo vírus do HPV é classificada epidemiologicamente, consoante

Figura 1. 1: Estimativa de novos casos e morte por sexo em países em desenvolvimento. A

Contudo, o cancro do colo do útero constitui um problema de saúde pública mesmo

Figura 1. 2: Incidência e mortalidade mundial do cancro do colo do útero. Paralelismo

Cancro do colo do útero

Taxa por 100 000 habitantes.

Figura 1. 3: Evolução da adesão aos programas de rastreio. Aumento da adesão ao programa de

1.2-Cancro do colo do útero

1.2.1- Papiloma vírus humano

bivalente (2vHPV), a quadrivalente (4vHPV) e a nonavalente (9vHPV). Todas conferem

Figura 1. 7: Biotransformação da cisplatina. O meio intracelular e o meio extracelular possuem

A difusão passiva e a difusão facilitada mediada por transportadores, são mecanismos

1.3.2-Resposta celular à cisplatina

Apesar da cisplatina ser o agente quimioterapêutico standard utilizado na clínica do

aplicada isolada ou combinada com outro tratamento de forma neoadjuvante, concomitante e

O fracionamento da dose permite, em grande parte, a redução dos efeitos colaterais em

1.4.1-Radioterapia e morte celular

1.4.2-Radioterapia e cancro do colo do útero

estádios avançados, após a terapêutica com a radioterapia, relata-se recorrência locorregional

1.5-Células estaminais do cancro

(EpCAM/ESA) e a subfamília G membro 2 da ATP-binding cassette ABCG2 indicados na

EpCAM CD133 CD44 ALDH

Figura 1. 8: Marcadores e vias de sinalização envolvidos na resistência à terapêutica das

O CD133 (prominin-1) pertence a família da glicoproteína transmembranar (128).

ocorre a perda da E-caderina é frequente ocorrer a translocação nuclear da β-catenina e

(GDP) e liga-se à guanosina trifosfato (GTP) o que resultará na ativação da fosfodiestarase.

2) Se as CSCs estão associadas à resistência à quimioterapia e à radioterapia e a via Wnt/

1) Numa primeira abordagem pretendeu-se avaliar o efeito da cisplatina na linha celular

2.2-Ensaios de sobrevivência, proliferação e viabilidade celular

2.2.1- Determinação das concentrações inibitórias de cisplatina

2.2-Avaliação dos efeitos da terapêutica com raios-X

Tabela 2. 1: Doses administradas em unidades de monitor (UM, do inglês monitor units, 1

Dose 0,5 Gy 1 Gy 1,5 Gy 2 Gy 3 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy 10 Gy

Figura 2. 1: Caixa da irradiação construída em acrílico. Marcas para o posicionamento gravadas

Figura 2. 2: Distribuição da dose na caixa de irradiação. Representação dos planos transversal

2.2.1- Determinação da dose letal

Tabela 2. 2: Número de células por cada condição.

Eficiência da placa (PE, do inglês plate efficiency) (%)

Fator de sobrevivência (%)

Relacionando as doses de radiação com o fator de sobrevivência (Fs) foi possível

2.3-Avaliação dos efeitos da quimioterapia e da radioterapia na linha celular HeLa

2.3.1-Avaliação da viabilidade celular e do tipo de morte

C4901). Posteriormente adicionaram-se 2,5 µL de anexina V (Immunostep s.l) e 1 µL de

2.3.2-Avaliação do ciclo celular