Bibiane Lago de Castro

AVALIAÇÃO DO USO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS

SOBRE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS DA DERME
ASSOCIADAS À MATRIZ DE REGENERAÇÃO DÉRMICA

Dissertação submetida ao
Programa de Pós Graduação
em Biologia Celular e do
Desenvolvimento da
Universidade Federal de Santa
Catarina para a obtenção do
Grau de Mestre em Biologia
Celular e do Desenvolvimento.
Orientador: Profa. Dra. Andréa
Gonçalves Trentin.

Florianópolis
2013
 Dedico este trabalho aos meus pais Umberto e Maira,
meus grandes exemplos de vida, amor, carinho e dedicação,
por estarem sempre ao meu lado, incentivando
a busca dos meus objetivos.
 AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Prof. Dra. Andréa Gonçalves Trentin, por

ter confiado em mim e por todos os ensinamentos transmitidos ao longo
desse caminho. Cada dia no laboratório foi muito importante na minha
formação e eu agradeço a você por ter me incluído neste maravilhoso
grupo de pesquisa.

Aos demais professores do LACERT, Dr. Ricardo Castilho

Garcez, Dr. Giordano Wosgrau Calloni e Dr. Marcio Alvarez da Silva,
pelo incentivo, confiança e apoio à minha formação científica.

Aos queridos amigos integrantes e ex-integrantes do LACERT,

obrigada pelas inúmeras ajudas e dúvidas respondidas, pelas conversas
amigas, pelas jantas deliciosas (ainda mais quando era sushi!) e,
principalmente, por tornarem o meu dia-a-dia mais leve e divertido,
vocês foram essenciais para que eu conseguisse chegar até aqui!

Aos demais professores da pós-graduação que contribuíram para

a minha formação e crescimento acadêmico.

Ao Prof. Dr. Rodrigo Bainy Leal, por abrir as portas do seu

laboratório e me apresentar a sua querida aluna Ana Paula Costa,
agradeço pela colaboração nos experimentos de Western blot.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela bolsa concedida, e também às agências financiadoras
FAPESC, CNPq, Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT/INFRA),
INTT, e PRONEX/CNPq.

À minha orientadora de graduação e amiga, Magali Ferrari

Grando, por ser essa pessoa maravilhosa e apaixonada pela ciência.
Obrigada por me apresentar ao mundo da pesquisa e por toda a ajuda
que sempre me destes.

Às minhas irmãzinhas de Floripa, Aline Hardt, Mirela Artner e

Vanessa Borges. Não tenho palavras pra expressar o quanto vocês foram
importantes ao longo desses anos, agradeço a Deus por ter colocado
vocês na minha vida.
 Às minhas amigas de sempre e para sempre, Ariane Pandolfo,
Camila Alves, Daniana Schneider e Vanessa Raiter. Com vocês aprendi
o significado da palavra amizade e juntas dividimos nossos sonhos
desde a infância, obrigada pela força e incentivo que vocês sempre me
deram!

Ao Guilherme Mendonça, por todo carinho, apoio e incentivo.

Obrigada por estar ao meu lado, até mesmo nos momentos de dúvidas e
nervosismo, e por sempre acreditar no meu potencial.

Durante esse ano perdi uma pessoa muito especial e não posso
deixar de fazer uma homenagem a ela, minha amada Vó Maria. Muito
obrigada pelas orações, pelo desejo de felicidade e sucesso, pela união
da família e por ter me mostrado a face de uma verdadeira guerreira.
Saudades eternas!

À minha amada vó, Nilde, por todas as orações (sei que o Sto.
Antônio ouviu muito meu nome ultimamente), pelo amor e carinho que
a gente só recebe de uma avó dedicada e querida como a senhora.
Obrigada por me esperar sempre com um abraço carregado de amor e
saudades e com uma deliciosa ―nega maluca‖!

Ao meu irmão Humberto, que é o meu exemplo de dedicação e

profissionalismo, por todo amor, preocupação e incentivo. Obrigada por
seu meu mano e por me dar a certeza de que sempre poderemos contar
um com o outro.

Às pessoas mais importantes da minha vida, meus amados pais,

Umberto e Maira. Obrigada por estarem sempre buscando o melhor para
mim, muitas vezes abdicado dos próprios sonhos para que eu pudesse
realizar os meus e por sempre incentivarem o meu crescimento pessoal e
profissional, acompanhando com orgulho e entusiasmo todos os passos
dados ao longo da minha vida. Amo muito vocês!

Finalmente, agradeço a Deus pela vida que Ele me deu, pela

família maravilhosa que eu tenho, por todas as pessoas especiais que
sigo encontrando no meu caminho e por guiar a minha vida na direção
da felicidade.
 RESUMO

As células tronco mesenquimais (CTM) exibem ampla

plasticidade e rápida expansão in vitro, podendo ser isoladas e
manipuladas de modo reprodutível e com poucos problemas éticos.
Dentre os diversos tipos de CTM encontram-se as CTM da derme
(CTMd), as quais demonstram capacidade para agir na regeneração de
tecidos lesionados. Atualmente, estudos visando o desenvolvimento de
estratégias para o reparo de grandes lesões de pele vêm sendo
realizados. Nesse sentido a Engenharia de Tecidos apresenta matrizes de
regeneração dérmica (MRD), utilizadas na clínica cirúrgica, como a
MRD Integra®. Além disto, estudos envolvendo fatores de crescimento
(FC) vêm apresentando resultados satisfatórios na manutenção e
diferenciação celular, neste contexto, o plasma rico em plaquetas (PRP)
se mostra uma interessante fonte de FC a ser aplicada com biomateriais.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o uso do PRP sobre as
CTMd humana em ambientes de cultivo bidimensional e tridimensional,
associados à MRD Integra®. Para isto, as CTMd foram cultivadas sob
dois modelos: (1) bidimensional: CTMd associado ao PRP sobre o
plástico; (2) CTMd associado ao PRP sobre o Integra®. Em cultivo
bidimensional, os resultados mostraram que o PRP promove diminuição
da viabilidade e número de células. Este resultado é coerente com o
estímulo do PRP na diferenciação celular, aumentando a proporção de
células com o fenótipo muscular liso/miofibroblástico (positiva para α-
SMA). Concomitantemente a estes resultados, observou-se que as
culturas tratadas com PRP apresentaram células grandes com
morfologia alongada, diferentemente das culturas controle, que
apresentavam células menores com morfologia arredondada. Além
disso, as CTMd tratadas com PRP apresentaram maior depósito de
colágeno tipo I. Em modelo tridimensional, o PRP promoveu
diminuição da viabilidade celular, assim como estimulou a diferenciação
para células positivas para α-SMA. As análises de MEV demonstraram
que as células cultivadas com PRP apresentam maior adesão e
adquiriram características fenotípicas semelhantes ao muscular
liso/miofibroblástico. Em conclusão, estes resultados demonstram que a
associação da MRD Integra® com as CTMd e o PRP constituem um
microambiente efetivo para o crescimento, a viabilidade, a migração, a
adesão e a diferenciação das CTMd, apresentando grande potencial para
a Engenharia de Tecidos.
Palavras chave: células tronco mesenquimais, plasma rico em
plaquetas, Integra®, biomateriais, Medicina Regenerativa.
 ABSTRACT

Mesenchymal stem cells (MSC) exhibit broad differentiation

potential and high expansion capacity in vitro. They can be isolated and
manipulated in a reproducible fashion and their use raises no ethical
issues. The dermis is a remarkable source of MSCs (namely dermis
derived MSC or dMSC), which are able to act in the regeneration of
injured tissues. Currently, several efforts to develop strategies for the
repair of large skin lesions have been made. In this scenario, the Tissue
Engineering area aims to develop biomaterials that can be used in
surgical procedures as dermal regeneration templates (DRT), such as
Integra ®. Furthermore, studies involving growth factors (GF) have
shown satisfactory results in cell differentiation and maintenance. The
platelet-rich plasma (PRP) comprises an interesting source of GF to be
applied in association with biomaterials. This study aimed to evaluate
the use of PRP on human dMSC cultured on dimensional and three-
dimensional environments. Human dMSC were grown under two
models: (1) two-dimensional: cells grown on plastic in association with
PRP and (2) associated with PRP on the DRT Integra ®. Under the two-
dimensional culture system, there was PRP promoted a decrease in cell
viability and the total cell number. This result is consistent with the
stimulation of PRP on cell differentiation, increasing the proportion of
cells with the phenotype smooth muscle / myofibroblastic (α-SMA-
positive). Concurrently to these results, cells treated with PRP showed
elongated morphology with large size. Contrariwise, cells in the control
condition were smaller and with rounded morphology. Moreover, dMSC
treated with PRP showed greater deposition of collagen type I. In the
three-dimensional model, PRP caused a decrease in cell viability, and
also stimulated the differentiation of dMSC into α-SMA positive.
Scanning electronic microscopy analyzes demonstrated that cells
cultured with PRP acquired greater adhesion and phenotypic
characteristics similar to smooth muscle / myofibroblastic. In
conclusion, these results demonstrate that the association of DRT
Integra® with dMSC and PRP provides an effective microenvironment
that supports growth, viability, migration, adhesion and differentiation
of dMSC. This shows, therefore, show great potential for fure
application in Tissue Engineering.
Keywords: mesenchymal stem cells, platelet rich plasma, Integra ®,
biomaterials, regenerative medicine
 LISTA DE ABREVIATURAS

αSMA: alfa actina de músculo liso

BSA: albumina bovina
CD31: cluster de diferenciação molecular 31
CTs: células tronco
CTM: célula tronco mesenquimal
CTMd: célula tronco mesenquimal da derme humana
DAPI: 4’-6-diamino-2fenilindol
DMEM/F12: dulbecco`s Modified Eagle Medium: Nutrient
Mixture F-12
DNA: ácido desoxiribonucleico
EDTA: ácido etileno-dinitrilo-tetracético
EGF: fator de crescimento epidérmico/epidermal
FGF: fator de crescimento de fibroblasto
IGF: fator de crescimento semelhante à insulina
KCl: cloreto de potássio
MEC: matriz extracelular
MEV: microscopia eletrônica de varredura
MRD: Matriz de Regeneração Dérmica
MTT: brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-
tetrazoliumPBS: tampão fosfato salino
PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas
PRP: plasma rico em plaquetas
PPP: plasma pobre em plaquetas
PS: penicilina/streptomicina
SBF: soro bovino fetal
SDS: dodecil sulfato de sódio
TCLE: termo de consentimento livre e esclarecido
TGF- β1: fator de crescimento transformante β1
TGF- β2: fator de crescimento transformante β2
TxRd: vermelho do texas
UFC-F: unidade formadora de colônias fibroblastóide
UV: ultravioleta
VEGF: fator de crescimento de endotélio vascular
2D: bidimensional
3D: tridimensional
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Ilustração esquemática dos estágios de diferenciação de

queratinócitos.........................................................................................20

Figura 2 - Ilustração esquemática da estrutura da pele.........................21

Figura 3 - Tríade em que a Engenharia de Tecidos se baseia para a

reconstrução de tecidos ou órgãos.........................................................22

Figura 4 - Detalhe da microestrutura da Matriz de Regeneração Dérmica

Integra®.................................................................................................24

Figura 5 - Tríade baseada na Engenharia de Tecidos para a possível

aplicação no reparo de grandes lesões de pele.......................................31

Figura 6 - Análise morfologica das CTMd............................................46

Figura 7 - Efeito do PRP na sobrevida das CTMd pelo ensaio de

MTT.......................................................................................................47

Figura 8 - Efeito do tratamento com PRP no número de CTMd,

analisadas por
DAPI.......................................................................................................48

Figura 9 - Efeito do PRP na mortalidade por necrose de CTM..............50

Figura 10 - Efeito do tratamento com PRP na síntese de colágeno tipo I

pelas CTMd, analisadas por
Imunofluorescência................................................................................52

Figura 11 - Efeito do tratamento com PRP na expressão de CD31 nas

CTMd, analisadas por RT-PCR.............................................................54

Figura 12 - Efeito do tratamento com PRP na expressão α-SMA em

CTMd, analisadas por Imunofluorescência...........................................56

Figura 13- Efeito do tratamento com PRP na morfologia de CTMd

positivas para α-SMA, analisadas por Imunofluorescência...................57
Figura 14 - . Efeito do PRP na viabilidade das CTMd cultivadas na
MRD integra®, pelo ensaio de MTT....................................................59

Figura 15 - Morfologia de CTMd cultivadas em MRD Integra® e

analisadas por MEV...............................................................................61

Figura 16 - Morfologia de CTMd cultivadas em MRD no grupo

Controle, analisadas por MEV...............................................................62

Figura 17 - Morfologia de CTMd cultivadas em MRD no grupo de

tratamento 1:50, analisadas por MEV...................................................63

Figura 18 - Morfologia de CTMd cultivadas em MRD no grupo de

tratamento 1:100, analisadas por MEV.................................................64

Figura 19 - Efeito do PRP sobre CTMd associadas à MRD Integra

avaliado pela expressão de mRNA para CD31 por RT-PCR................65

Figura 20 - Análise da expressão proteica de α-SMA em CTMd tratadas

com PRP e cultivadas na MRD integra® por Western blot..................66
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Marcadores de superfície de CTMs......................................27

Tabela 2 - Marcadores utilizados nas reações imunocitoquímicas ...... 39

Tabela 3 - Sequência de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para os

experimentos de RT-PCR......................................................................43
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .....................................................................19
1.1 Pele...................................................................................19
1.2 Engenharia de Tecidos......................................................22
1.3 Células Tronco .................................................................25
1.4 Células Tronco Mesenquimais (CTMs)............................26
1.5 Plasma Rico em Plaquetas (PRP).....................................28
2. OBJETIVOS..........................................................................33
2.1 Objetivo Geral..................................................................33
2.2 Objetivo Específico..........................................................33
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................35
3.1. Isolamento e Cultivo de Células Tronco Mesenquimais
derivadas da derme (CTMd) humana.....................................................35
3.2. Preparo do PRP..................................................................36
3.2.1. Obtenção da trombina autóloga e ativação do PRP.....36
3.3 Associação das CTMd humana com PRP em cultivp
bidimensional.........................................................................................37
3.4. Cultura das CTMs com PRP em associação com a MRD
em cultivo tridimensional.......................................................................37
3.5. Avaliação da sobrevida celular..........................................37
3.6. Análise imunocitoquímica.................................................38
3.7. Ensaio de Quantificação Celular ......................................39
3.8. Análise de morte celular ...................................................39
3.9. Análise da MRD por Microscopia de Varredura
(MEV).....................................................................................................40
3.10. Análise de diferenciação celular por Western
blot..........................................................................................................40
3.10.1. Preparação das amostras..............................................40
3.10.2. Eletroforese e Eletrotransferência...............................41
 3.10.3. Imudetecção....................................................................41
3.11. Análise de diferenciação celular por RT-PCR.................41
3.12. Análise estatística............................................................43
4. RESULTADOS.................................................................................45
4.1. Análise dos efeitos do PRP sobre as CTMd em cultivo
celular bidimensional..............................................................................45
4.1.1. Efeito do PRP na Morfologia, Adesão e Crescimen45
Celular por Microscopia de Contraste de Fase.................................45
4.1.2. Efeitos do PRP na Viabilidade, Morte e Proliferação
Celular...................................................................................................47
4.1.3. Efeito de PRP na Produção de colágeno I..................51
4.1.4. Efeito de PRP na diferenciação das CTMd................53
4.2. Avaliação dos efeitos do PRP sobre as CTMd em cultivo
tridimensional com a matriz de regeneração dérmica Integra®............58
4.2.1. Efeito do PRP na viabilidade das CTMd cultivadas na
MRD Integra®......................................................................................58
4.2.2. Efeito do PRP na Morfologia e Adesão das CTMd
associadas à MRD integra®................................................................59
4.2.3. Efeito do PRP na Diferenciação das CTMd cultivadas
na MRD Integra®................................................................................59
5. DISCUSSÃO..........................................................................67
6. CONCLUSÕES......................................................................73
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................75
ANEXOS.....................................................................................85
 19

1.INTRODUÇÃO

1.1 Pele

A pele é um órgão complexo, que regula interações celulares e

moleculares, efetuando respostas cruciais ao meio ambiente,
representando 16% do peso corporal e podendo chegar a uma superfície
de até 2m² no adulto (DRÉNO, 2008). Anatomicamente e
funcionalmente, a pele apresenta duas camadas distintas: a epiderme,
mais externa, e a derme, mais profunda, sendo constituída por células
derivadas de duas camadas germinativas, ectoderma (epiderme) e
mesoderma (derme), além de conter células derivadas da crista neural
(melanócitos) (PASSERON et al., 2005; POWELL, 2006).
A epiderme é a camada superficial, composta por epitélio
estratificado pavimentoso queratinizado, possuindo quatro tipos
diferentes de células: queratinócitos (80% a 90%), melanócitos, células
de Langerhans e células de Merkel. A epiderme não apresenta
vascularização própria e, desta maneira, sua nutrição ocorre através da
derme (DRÉNO, 2008).
Esse órgão possui função de barreira a infecções e à perda de
líquidos e, devido a uma resposta fisiológica às inúmeras agressões que
sofre no dia-a-dia, se encontra em estado de constante renovação
(BARTHEL e ABERDAM, 2005). Na epiderme toda atividade
proliferativa está restrita à camada basal, onde residem as células tronco
ou progenitoras dos queratinócitos. Os queratinócitos estão distribuídos
linearmente em quatro camadas morfologicamente distintas, cujas
alterações são decorrentes de sua transformação de célula jovem, não
queratinizada, em célula adulta queratinizada, em um ciclo que leva
aproximadamente 30 dias (BARTHEL e ABERDAM, 2005; STRONG
et al., 2006) (Figura 1).
A segunda camada da pele, a derme, situa-se logo abaixo da
epiderme e é responsável pela elasticidade e pela integridade mecânica
da pele. Nesse tecido encontram-se vasos sanguíneos e nutrientes, os
quais são responsáveis pela nutrição e manutenção da epiderme. A
derme é uma camada espessa, sendo constituída de tecido conjuntivo
contendo fibroblastos, que sintetizam colágeno, fibras elásticas e
proteoglicanos (DRÉNO, 2008; KUMAR et al, 2005). Entre suas
funções encontra-se a retenção de água e de minerais, fornecendo turgor
aos tecidos moles e rigidez aos tecidos esqueléticos, respectivamente. A
derme atua também como reservatório de fatores do crescimento,
controlando a proliferação celular (KUMAR et al, 2005).
20

Dupla camada Camada Córnea

Macrofibrilas de Lipídica
Queratina
Camada Granulosa
Junções
Tight

Camada Espinhosa

Camada Basal

Derme

Figura 1: Estágios da diferenciação de queratinócitos. A partir da

camada basal, mitoticamente ativa, os queratinócitos entram em um programa
linear de diferenciação celular. Os mesmos irão passar pela camada espinhosa,
camada granulosa até a camada córnea, anucleada. Esta é formada por
queratina, associada a envelopes revestidos por dupla camada lipídica (esquema
circular). As junções tipo Tight, que estão na camada granular, exercem papel
essencial na retenção de água (Adaptado de SEGRE, 2006)

Na derme estão presentes diversas estruturas epidermais, como os

anexos cutâneos, compostos pelo folículo piloso, glândula sebácea e
epiderme interfolicular (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012). Em muitos
casos, esses são responsáveis pela reepitelização da pele lesada, que
ocorrerá a partir dos bordos da lesão, quando não ultrapassar poucos
centímetros. Nessa condição, a reepitelização irá ocorrer pelas células
tronco de queratinócitos, presentes no folículo piloso, formando, desta
maneira, a epiderme e o próprio pêlo em sua estrutura completa
(ABBAS e MAHALINGAM, 2009) (Figura 2).
 21

Figura 2: Estrutura da pele humana (Adaptado de MITCHELL e

LYNCH, 1996).

Devido à interação dinâmica existente entre as duas camadas da

pele, que modulam respostas de vários tipos celulares presentes nesses
tecidos e que mantém suas devidas atividades e funções, qualquer
desequilíbrio nessa relação pode determinar inúmeros processos
patológicos (DRÉNO, 2008). Desta forma, é importante que a
reconstrução da pele após ferimentos, sejam eles leves ou graves, ocorra
rapidamente para evitar sequelas à pele atingida. Para tanto, a
regeneração da pele é automaticamente iniciada pelo organismo pelo
processo de cicatrização (WICKETT ; VISSCHER, 2006).
A cicatrização envolve uma série de etapas, tipos celulares
específicos, mediadores e fatores de crescimento (CHOUCAIR ;
PHILLIPS, 1997; HANNA ; GIACOPELLI, 1997). Esse processo tem
como objetivo o restabelecimento morfológico e fisiológico da derme e
da epiderme, em toda a sua magnitude e integridade (WICKETT ;
VISSCHER, 2006). Porém, em lesões onde há perda total de tecido
dérmico e epidérmico, o processo natural de cicatrização fica
comprometido devido à grande perda de tecido e a sua equivalente área
que deve ser regenerada. Para esses casos, existe a possibilidade de
tratamentos, como a engenharia de tecidos, que oferece um análogo ao
tecido perdido e que estimula a regeneração e a cicatrização do mesmo.
22

1.2. Engenharia de Tecidos

A engenharia de tecidos é um campo multidisciplinar que

envolve princípios de Engenharia e Ciências da Vida. Possui como
objetivo principal o crescimento, a restauração e a manutenção de
sistemas biológicos existentes (KNIGTH ; EVANS, 2004).
Os elementos necessários para a aplicação dos princípios da
Engenharia de Tecidos estão baseados na tríade: (1) cultivo de células
apropriadas (fibroblastos, osteoblastos, células tronco, entre outras); (2)
matrizes (confeccionadas em colágeno, osso ou polímeros sintéticos) e;
(3) adição de mediadores solúveis, como fatores de crescimento (UEDA
et al., 2000) (Figura 3).

Matrizes

Células Sinalizadores

Figura3: Tríade em que a Engenharia de Tecidos se baseia para a

reconstrução de tecidos ou órgãos.

Nas duas últimas décadas pesquisadores têm se dedicado a

estudos visando desenvolver substitutos cutâneos para cobrir grandes
lesões da pele, sendo que, uma vez exauridas as fontes doadoras
autóloga e homóloga da pele, é de extrema importância a existência de
substitutos cutâneos para a cobertura imediata de lesões
(BALASUBRAMANI et al., 2001). Desta maneira, evita-se que a região
afetada fique exposta a perdas hídricas e a agentes externos, como
bactérias, aumentando a comorbidade e agravando o prognóstico do
paciente (MENDES JR. et al., 2007; SCHURR et al., 2009).
 23

Estes estudos possibilitaram que substitutos cutâneos de

compósitos biodegradáveis e bioabsorvíveis fossem desenvolvidos. Tais
materiais tem o objetivo de atuar como suportes estruturais temporários
para as células (TUZLAKOGLU, 2009; WEIR, 2009). Para serem
considerados efetivos, além de mimetizar, total ou parcialmente, a
anatomia e a função da pele, estes substitutos devem possuir
estabilidade mecânica, não serem tóxicos ou carcinogênico, serem
esterilizáveis, absorvíveis, e permeáveis a nutrientes e seus produtos do
catabolismo. Adicionalmente, se forem absorvíveis, sua taxa de
degradação necessita ser equivalente ao crescimento do novo tecido no
local do implante (SAFFLE, 2009; SCHURR et al., 2009).
Entre os substitutos de pele mais utilizados em todo o mundo e
em uso na prática clínica diária, encontra-se a matriz de regeneração
dérmica (MRD) Integra®, (Integra Life- Sciences Inc. USA) (JONES et
al, 2002). Essa matriz possui uma estrutura bilaminar constituída de
colágeno bovino e condroitina-6-sulfato (componente dérmico) em sua
região interna, possuindo a função de auxiliar na reestruturação da
neoderme. Sua superfície externa é coberta por uma lâmina sintética de
silicone (polímero de polisiloxane), com a espessura de 100 μm
(componente epidérmico), cuja função é impedir a perda de líquidos
(0,5 ml/cm²/h), agindo como uma pseudo-epiderme temporária (Figura
4) (ANTHONY et al., 2006; WOOD et al., 2007).
24

Figura 4: Estrutura da MRD Integra®. A área denominada como

Componente Dérmico, representa a estrutura tridimensional da MRD, sendo
constituída de colágeno bovino e de condroitina-6-sulfato. Sua superfície
externa, denominada como Componente Epidérmico, é constituída por uma
lâmina sintética de silicone (polímero de polisiloxane).

A MRD Integra® é utilizada após o desbridamento inicial da

lesão, sendo colocada sobre a ferida limpa e aberta. Devido à sua
característica porosa, essa matriz confere uma estrutura para a infiltração
de fibroblastos. Inicialmente, não há possibilidade de enxertia devido à
falta ou precariedade da vascularização local. A neoformação vascular
ocorre num período de três a seis semanas após a lesão, quando então,
um enxerto autólogo pode ser realizado, necessitando assim de um
segundo procedimento cirúrgico. Contudo, pode ocorrer uma
vascularização insuficiente no local, inviabilizando tal procedimento.
Este evento atrasa o processo de cicatrização, levando a sequelas graves
como retrações, cicatrizes hipertróficas e perda de função (SHERIDAN
et al., 2001). É, portanto, necessário um aprimoramento no processo de
utilização dessa matriz dérmica, objetivando aumentar a taxa de
integração celular e, principalmente, a melhora da vascularização do
tecido lesado. Para isso, buscam-se associações com outros fatores
importantes para a cicatrização, como por exemplo, o uso de células
tronco e de fatores de crescimento.
 25

1.3. Células Tronco

Simultaneamente à progressiva experiência clínica com os

produtos da engenharia de tecido, houve maior compreensão biológica
do uso das células tronco (CT). Estudos realizados com estas células
vêm demonstrando seu grande potencial terapêutico e são considerados
promissores no desenvolvimento de estratégias efetivas para a
regeneração de diversos tipos de tecidos, incluindo tecidos da pele
(BLANPAIN; FUCHS, 2006; VISHNUBALAJI et al., 2012).
As CT são definidas como células indiferenciadas, clonogênicas,
possuindo capacidade de autorrenovação e de originar linhagens
celulares diferenciadas (THOMSON et al, 1998). A autorrenovação
dessas células pode se dar por divisão simétrica ou assimétrica. Pela
divisão simétrica, as CT geram células com as mesmas características,
sem alterar seu estado indiferenciado. Já pela divisão assimétrica, são
geradas tanto CT indiferenciadas quanto células progenitoras,
consideradas comprometidas fenotipicamente e seguindo uma via de
diferenciação celular (SANDERS et al., 2006). As células progenitoras
apresentam divisões celulares limitadas e, uma vez exaurido este
potencial, se diferenciam em um tipo celular específico (SO ; EPSTEIN,
2004).
As CT podem ser isoladas a partir de tecidos embrionários, fetais
e adultos (THOMSON et al, 1998). As CT embrionárias, derivadas da
massa celular interna do blastocisto, são pluripotentes, podendo originar
todos os tipos celulares do embrião. Diferentemente, as CT adultas e
fetais possuem potencial de diferenciação mais restrito, sendo
denominadas de multipotentes, e contribuem para a produção de apenas
algumas linhagens celulares (WAGERS; WEISSMAN, 2004). Apesar
da menor potencialidade, as CT adultas mantêm as características de
autorrenovação, vida longa e alto potencial proliferativo (WISLET ;
GENDEBIEN et al, 2005), podendo ser estimuladas in vitro e in vivo,
em resposta a fatores de crescimento e a lesões (COTSARELIS et al,
1999).
Devido às controvérsias éticas e políticas, além de problemas de
rejeição imunológica e do alto potencial para o desenvolvimento de
tumores (ESPINOZA; PETERSON, 2012), estudos e aplicações clínicas
com as CT embrionárias têm se mostrado inviáveis. Consequentemente,
muitos estudos são realizados para a identificação de CT em tecidos
adultos, como modo de desenvolver estratégias para a regeneração e
reparo tecidual (RABIE et al, 2007). Essas células podem ser isoladas
de tecidos autólogos, descartando a possível rejeição pelo imune, bem
26

como os questionamentos éticos, além disto, não têm sido relacionadas

com a formação de teratomas (CHAGASTELLES; NARDI, 2011).
Diversos tipos de CT de tecidos adultos foram isoladas e
caracterizadas. Inicialmente, foram identificadas no sistema
hematopoiético, sendo até hoje as mais estudadas. Na clínica, as CT do
sistema hematopoiético podem ser rotineiramente isoladas do sangue
periférico, do cordão umbilical e da medula óssea, as quais já são
utilizadas no tratamento de algumas doenças, como a leucemia
(ULLOA-MONTOYA et al., 2005). Outras populações de CT adultas
conhecidas incluem: as CT epidermais, as CT neurais e as CT
mesenquimais (ALISON; ISLAM, 2009; BIANCO et al., 2008).

1.4. Células Tronco Mesenquimais (CTM)

As CTM, que foram assim denominadas por Caplan em 1991,

têm seus estudos remontando aos anos 1960 e 1970, quando
Friedenstein e colaboradores iniciaram as pesquisas com células
fibroblastóides da medula óssea de roedores e coelhos.
Inicialmente, estas células eram consideradas precursores de
fibroblastos, derivados da medula óssea e denominadas unidades
formadoras de colônias de fibroblastos (UFC-F). Mais tarde, descobriu-
se que as colônias de células fibroblastóides derivadas da medula óssea
eram capazes de se diferenciar em células com características de
osteócitos, condrócitos ou adipócitos. A partir da constatação de que as
UFC-F derivavam de uma porção estromal da medula óssea, as células
aderentes ao plástico passaram a ser denominadas células estromais da
medula óssea (BIANCO et al., 2008).
Atualmente, o termo células estromais da medula óssea
compreende todas as células que compõem o estroma medular, como
fibroblastos, adipócitos e também macrófagos. Já o termo CTM, refere-
se apenas à população celular com morfologia fibroblastóide, aderente
ao plástico em condições de cultivo padrão, capaz de proliferar in vitro e
com potencial de diferenciação celular para osteoblastos, adipócitos e
condrócitos, em condições indutivas (SILVA MEIRELLES; NARDI,
2009; DOMINICI et al., 2006; CAPLAN, 2005).
Estas células apresentam uma distribuição quase onipresente em
indivíduos adultos, sendo encontradas não só na medula óssea, mas
também em diferentes tecidos, incluindo a pele, o músculo esquelético,
o tecido adiposo, a polpa dental, os ossos e o fígado (ZUK et al., 2002;
MIURA et al., 2003; DA SILVA MEIRELLES et al., 2008;.
NINCHERI et al., 2009).
 27

A diversidade de fontes de obtenção das CTM, juntamente com a

variedade de métodos de isolamento e expansão descritos na literatura,
dificultou a comparação e progresso dos estudos neste campo. Para
tanto, foram propostos pelo Comitê de Células Tronco e Tecidos da
Sociedade Internacional de Terapia Celular critérios de caracterização
das CTM humanas. Além das características acima descritas de
morfologia, proliferação, adesão e diferenciação, as CTM devem ainda
expressar os marcadores de superfície celular CD105, CD90 e CD73, e,
para assegurar uma população homogênea, não expressar os marcadores
hematopoiéticos e endoteliais CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a
ou CD19 e HLA-DR (DOMINICI et al., 2006). Este painel foi sugerido
em consenso, porém existem outras moléculas de superfície expressas
por estas células que podem ser úteis na pesquisa (Tabela 1) (SILVA
MEIRELLES; NARDI, 2009).

Tabela 1 Marcadores de superfície de CTM

Fonte: SILVA MEIRELLES; NARDI, 2009.

As CTM são consideradas uma das principais candidatas na

Medicina Regenerativa com base em suas características únicas, que
podem ser extremamente úteis para aplicações clínicas (BIANCO;
ROBEY, 2001). Com o estímulo apropriado, as CTM são capazes de se
diferenciar em diversos tipos celulares, incluindo células endoteliais,
adipócitos, condrócitos, células neurais, fibroblastos e osteoblastos.
Além disso, as CTM têm grande capacidade de expansão, representam
baixo risco imunogênico e tumorogênico (WEIR, 2009) e possuem alta
capacidade de migrar para locais de lesão (SATIJA et al., 2007).
A aplicabilidade das CTM em protocolos de terapias celular tem
sido expandida com o uso de matrizes sintéticas ou naturais, que
mimetizam seu microambiente, e assim melhoram de maneira
significativa a sobrevivência e funções teciduais (HAMDI et al., 2009).
28

Portanto, as CTM são fortes candidatas para uso em processos de

cicatrização de feridas dérmicas em associação com MRDs.
O trabalho em andamento no Laboratório de Células Tronco e
Regeneração Tecidual - UFSC (Tese de Doutorado Talita Jeremias PG-
BCD/UFSC), estabeleceu as condições de obtenção e cultivo das CTM
de derme humana (CTMd). A caracterização foi realizada por
imunofenotipagem (marcação positiva para CD90, CD105 e CD73 e
negativa para CD14, CD34 e CD45), morfologia fibroblastóide,
aderência ao plástico e a diferenciação para os fenótipos adipogênico e
osteogênico. A caracterização das CTM derivadas da derme viabilizou o
seu uso em experimentos in vitro associando-as à MRD Integra®,
ressaltando a importância da associação com um ambiente
tridimensional. O próximo passo deste trabalho é o ensaio pré-clínico
em camundongos utilizando as CTM em associação com a MRD
Integra® (JEREMIAS, et al., em redação).

1.5. Plasma Rico em Plaquetas (PRP)

Embora a possibilidade de regeneração de tecidos lesados gere

grandes expectativas e aplicações em Engenharia de Tecidos, existe um
atual desafio na identificação de um substrato adequado que atenda às
necessidades das CTM, bem como os fatores de crescimento
apropriados que promovam desempenho celular, vascularização e
cicatrização do tecido. Portanto, ao se criar um sistema de engenharia de
tecido, ou aprimorá-lo com tecnologias atuais, deve-se considerar o tipo
celular, a matriz escolhida e ainda os sinais biológicos que devem ser
fornecidos (ELISSEEFF, 2005).
Nesta linha, o plasma rico em plaquetas (PRP), surge como um
veículo de armazenamento de fatores de crescimento, podendo
representar uma nova fonte para aplicações clínicas. O PRP possui
várias vantagens sobre o uso do soro de animais ou fatores de
crescimento recombinantes, essencialmente devido à sua disponibilidade
autóloga imediata, potencialmente segura e eficaz em aplicações clínicas
(PRINS et al., 2009).
O PRP é definido como a porção do plasma sanguíneo, obtida
através de protocolos de centrifugação, que apresenta concentração
plaquetária superior aos níveis de referência (DUAN et al., 2011;
MARX, 2004). O PRP é um produto orgânico, atóxico e não
imunorreativo, que tem sido utilizado para acelerar o reparo das feridas
cirúrgicas pela ação dos fatores de crescimento que contém (ANITUA,
1999; MARX, 2004). Os fatores de crescimento presentes no PRP estão
 29

estocados nos grânulos α das plaquetas. A secreção destes fatores se

inicia com o processo de formação do coágulo e, consequente à ativação
plaquetária. Os grânulos se fundem com a membrana das plaquetas e os
fatores são secretados. Cerca de 95% dos fatores de crescimento são
secretados na primeira hora de sua ativação. Após a liberação inicial, as
plaquetas sintetizam e secretam fatores adicionais pelos sete dias
restantes do seu ciclo de vida. Estudos demonstrando que as CTM, os
osteoblastos, os fibroblastos, as células endoteliais e as células
epidermais, expressam receptores de membrana para os fatores de
crescimento presentes no PRP. A ativação destes receptores resulta na
expressão de sequências gênicas que controlam a proliferação celular, a
síntese de colágeno e a formação de matriz extracelular, estimulando o
processo natural de cicatrização (GASSLING et al., 2009; MARX,
2004).
Entre os fatores presentes no PRP, encontram-se o fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento
transformante β1 e β2 (TGF-β1, TGF-β2), fator de crescimento de
endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento endotelial (EGF), fator
de crescimento semelhante à insulina (IGF) e prostaglandina E2 (PGE2)
(CENNI et al., 2010; KASTEN et al., 2008). Os fatores de crescimento
derivados do PRP não entram na célula ou em seu núcleo, não são
mutagênicos e agem estimulando o processo de cicatrização normal da
célula, de maneira a apenas, torna-lo mais rápido, não sendo capaz de
induzir tumores (MARX, 2004).
O PRP tem sido utilizado, isoladamente ou em combinação com
CT, em diversos modelos experimentais e testes clínicos, para promover
cicatrização em tecidos de diferentes densidades (CROVETTI et al,
2004;. ANITUA et al., 2008, KASTEN et al., 2008, CHEN et al., 2009).
Estes estudos demonstraram que o PRP é efetivo na proliferação celular,
quimiotaxia, diferenciação celular e síntese de matriz extracelular.
Consequentemente, o PRP facilita o reparo tecidual, já que estimula a
angiogênese, melhora a integração de enxertos, sejam eles ósseos,
cutâneos, cartilaginosos ou adiposos, bem como estimula a cicatrização
de feridas (OKUDA et al., 2003; VENDRAMIN et al., 2009).
Estudos in vitro comprovaram a eficácia do PRP em culturas de
CTM provenientes da medula óssea humana, podendo corresponder a
um subsídio ideal ao soro bovino fetal, bem como a uma fonte de
múltiplos fatores de crescimento capaz de suportar satisfatoriamente a
viabilidade e a proliferação celular e sua expressão gênica. Além disso,
ao ser testado em associação com a MRD Integra®, as células cultivadas
em presença de PRP exibiram uma maior aptidão para colonizar a
30

MRD, demonstrando uma melhora na adesão e uniformidade celular em

comparação com as células cultivadas apenas com a MRD Integra®
(FORMIGLI et al., 2011).
Todavia, embora resultados demonstrem melhora na otimização
da cultura de CTM de medula óssea, em associação com biomateriais e
o PRP (FORMIGLI et al., 2011), ainda não existem relatos de estudos
envolvendo a sua associação com CTMd humana, tampouco se sabe da
capacidade de diferenciação destas células, quando expostas aos fatores
de crescimento presentes no PRP.
Nos últimos anos, as CTMd vêm ganhando destaque no campo
científico por apresentarem células capazes de atuar no desenvolvimento
do folículo através das CTs presentes na papila dérmica e no bulge
(BLANPAIN; FUCHS, 2006). Além disso, elas também são capazes de
se auto-renovar e agir na cura, regeneração e reparo no tecido lesionado
(CRIGLER et al., 2007). Como a pele é um dos tecidos mais abundantes
do corpo humano, ela representa uma fonte ideal para obtenção de
grandes quantidades de CTs. Além disso, muitos fragmentos de pele são
descartados após cirurgias de estética corporal, o que torna a obtenção
de CTs da pele um método não invasivo, de fácil acesso e menos
suscetível a restrições de ordem ética (YAN; OWENS, 2008).
Portanto, considerando a plasticidade das CTMd e a importância
da interação celular em um ambiente tridimensional, como a MRD,
pode-se considerar que estes dois componentes combinados se
aproximam do modelo ideal do substituto cutâneo. Adicionalmente, os
fatores de crescimento presentes no PRP associados às CTMd podem
auxiliar de maneira eficiente na formação da ―neoderme‖ vascularizada
em um menor espaço de tempo. Desta forma, baseando-se nos recentes
avanços da Engenharia de Tecidos, o presente trabalho propõe o uso da
tríade: células (CTMd), matrizes (MRD Integra®) e sinalizadores
celulares (PRP) (Figura 5), visando a utilização destes componentes
biológicos para otimizar o tratamento de grandes lesões de pele.
 31

Figura 5: Tríade baseada na Engenharia de Tecidos para a possível

aplicação no reparo de grandes lesões de pele.
32
 33

2.OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral:

Avaliar o uso associado das Células Tronco Mesenquimais
derivadas da derme humana com Plasma Rico em Plaquetas, em
diferentes condições de cultivo celular, bidimensional e tridimensional,
associado à Matriz de Regeneração Dérmica Integra®, visando o uso em
terapias de regeneração de pele.

2.2. Objetivos específicos:

1 - Avaliar o efeito do Plasma Rico em Plaquetas sobre as Células

Tronco Mesenquimais de derme, quando cultivadas em modelo
bidimensional, analisando:
- a morfologia das CTMd, por microscopia de contraste de fase.
- a toxicidade das diluições do PRP, por SYTOX Green®.
- a viabilidade celular, por MTT.
- a diferenciação celular, por Imunofluorescência e RT-PCR.

2 - Avaliar o efeito do Plasma Rico em Plaquetas na cultura

tridimensional de Células Tronco Mesenquimais de derme, com Matriz
de Regeneração Dérmica Integra®, analisando:
- a viabilidade celular, por MTT.
- a morfologia e a integração celular com a MRD, por
Microscopia Eletrônica de Varredura.
- a diferenciação celular, por Western bloting.
34
 35

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Isolamento e Cultivo de Células Tronco Mesenquimais

derivadas da derme (CTMd) humana
As amostras de pele foram obtidas em colaboração com o Ilha
Hospital Maternidade. As amostras foram coletadas de pacientes
submetidos à cirurgia plástica de ―lifting” facial, com assinatura do
termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE, Anexo 1). Os
procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com
Seres Humanos da Universidade Federal de Santa Catarina sob o
parecer de número 1982/11. As amostras foram encaminhadas para o
Laboratório de Células Tronco e Terapia Celular (LACERT-UFSC) em
um tubo contendo meio de cultivo dulbecco’s Modified Eagle Medium:
Nutrient Mixture F12 (DMEM-F12), suplementado com 15% de soro
bovino fetal (SBF), a temperatura ambiente, onde foram processadas em
ambiente estéril.
Para o isolamento das CTMd, os fragmentos de pele foram
cortados em pequenos pedaços e incubados com 12,5 U/mL de dispase
(BD) durante 15 horas, a 4°C. Após este período, a epiderme e a
hipoderme foram removidas do tecido, com o auxílio de pinça e tesoura,
e a derme foi incubada com solução de tripsina a 0,25% e ácido etileno-
dinitrilo-tetracélico (EDTA) a 0,02% (Invitrogem) durante 45 minutos a
37°C. Após o bloqueio da reação enzimática com meio DMEM-F12
suplementado com 15% de SBF, a suspensão de células foi filtrada em
malha de 70μm (Cell Strainer, BD) e centrifugada durante 7 minutos a
1.200 RPM. As células foram então ressuspendidas em DMEM-F12
(Vitrocell) suplementado com penicilina/estreptomicina (PS, 1U/μg,
Gibco) e 15% de soro bovino fetal (SBF) (Cultilab), plaqueadas em
garrafas de cultura de 25cm2 e mantidas a 37ºC, 5% CO2 e 95% de
umidade.
As CTMd foram selecionadas pela adesão ao plástico. O meio de
cultivo era renovado a cada 4 dias e as células não aderentes ao plástico
eram descartadas. Assim que as células atingiam uma confluência de
aproximadamente 80%, eram descoladas da placa de cultivo com
solução de tripsina/EDTA e replaqueadas para expansão numa
proporção de 1:3 (passagem 1). Este processo era repetido até a
passagem 10, sendo que as passagens utilizadas para os experimentos
foram de passagem 5 até a passagem 10.
36

3.2. Preparo do PRP

O PRP foi preparado de acordo com Vendramin et al., (2009)
com algumas modificações. Brevemente, o sangue periférico de
doadores foi coletado mediante apresentação e assinatura do termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE2 – Anexo 2). De cada doador
foram coletados 10mL de sangue e distribuídos em três tubos de coleta
contendo EDTA. Para compensar as diferenças individuais nos níveis de
fatores de crescimento, o PRP foi preparado com sangue de quatro
doadores.
O sangue coletado foi centrifugado a 400 X g por 5 minutos,
formando três fases: uma inferior, vermelha, contendo as hemácias,
outra superior, amarelada, contendo o plasma e as plaquetas, e entre elas
uma terceira fase estreita e esbranquiçada, chamada de zona de névoa
(buffy coat), contendo plaquetas maiores e células brancas (neutrófilos e
basófilos). A fase superior foi coletada até a borda da zona da névoa,
sendo reservado 200 μL para preparo da trombina autóloga. O restante
foi colocado em tubo estéril e centrifugado a 800 X g por 10 minutos,
com a formação do precipitado (pellet) de plaquetas. Foram separados
2/3 do sobrenadante, denominado de plasma pobre em plaquetas (PPP).
O precipitado foi ressuspendido no restante do PPP. As plaquetas foram
contadas em câmara de Neubauer e ajustadas com PPP para uma
densidade de 109 plaquetas/mL.

3.2.1. Obtenção da trombina autóloga e ativação do PRP

Para obter a trombina autóloga foi adicionado 250μL de
Gluconato de Cálcio (Sigma) a 10% para cada 1mL de plasma (retirado
após a primeira centrifugação do PRP) e mantido a 37°C por 15
minutos, ocorrendo a gelificação do plasma. O gel formado foi
centrifugado a 800 X g por 10 minutos, resultando na separação de um
líquido claro, contendo a trombina. A ativação do PRP foi realizada pela
adição da trombina autóloga ao PRP em uma proporção de 1:5. O gel
resultante da adição da trombina no PRP foi submetido à centrifugação a
800 X g por 10 minutos, resultando em um precipitado de coágulo e de
um líquido contendo os fatores de crescimento, denominado PRP
ativado. Após a obtenção do PRP ativado, o mesmo foi estocado a -
80°C até a utilização.
 37

3.3 Associação das CTMd humana com PRP em cultivo

bidimensional
Para avaliar os efeitos do PRP sobre a viabilidade, morte,
proliferação e diferenciação celular em cultivo bidimensional, as CTMd
foram cultivadas com diferentes concentrações de PRP.
Para tanto, as CTMd foram cultivadas em placas de 96 poços com
1x104 células/poço em meio DMEM-F12 suplementado com 15% de
SBF durante 24 horas, para permitir a adesão das células. Após este
período o meio de cultivo foi removido e as células foram submetidas a
duas lavagens com PBS. Os tratamentos foram realizados com o PRP
diluído em DMEM-F12 nas proporções de 1:50 e 1:100 (FORMIGLI et
al., 2011). O meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF foi
utilizado como controle do experimento. As placas de cultura foram
mantidas em estufa de CO2 a 37ºC, 5% CO2 e 95% de umidade durante
4 dias e utilizadas nos ensaios de viabilidade, proliferação, morte e
diferenciação celular, como descrito nos itens 3.5, 3.6, 3.7, 3.10 e 3.11.
3.4. Cultura das CTMd com PRP em associação com a MRD
em cultivo tridimensional
Para o cultivo das CTMd em associação com a MRD Integra®
foram utilizadas placas de cultivo de 96 poços. A MRD foi cortada em
fragmentos de aproximadamente 6mm, os quais foram lavados por três
vezes em PBS e imersos por 30 minutos nos meios usados para os
tratamentos: meio controle (DMEM F12 suplementado com 15% de
SBF), e meios controle contendo PRP nas proporções de 1:50 e 1:100.
Após este período, a MRD foi acomodada nos poços, com a cobertura
de silicone voltada para a base da placa e a porção porosa voltada para a
superfície. A seguir, uma suspensão de 10µL contendo 1x104/mL
células foi colocada sobre a MRD, com o auxílio de uma micropipeta e
mantidas por 2 horas, para adesão das células à MRD, em estufa a 37ºC,
5% CO2 e 95% de umidade. Após este período, foi adicionado 150 µL
do meio utilizado no tratamento. As placas de cultura foram mantidas
em estufa de CO2 a 37ºC, 5% CO2 e 95% de umidade durante 5 dias e
utilizadas nos ensaios de viabilidade, proliferação, morte e diferenciação
celular como descrito nos itens 3.5, 3.6, 3.7, 3.10 e 3.11

3.5. Avaliação da sobrevida celular

A sobrevida foi avaliada por incorporação de brometo de 3-[4,5-
dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolium (MTT). O MTT é um sal de
tetrazólio solúvel em água, convertido em formazana púrpura após a
clivagem do anel de tetrazólio, pelas enzimas desidrogenases
mitocontriais, ativas nas células vivas. Desta maneira, pode-se
38

considerar que o precipitado púrpura reflete a atividade celular,

obtendo-se, assim, uma estimativa de células viáveis da amostra. Em
nossos experimentos, o MTT (2,5mg/ml) foi acrescentado ao meio de
cultura e incubado durante 4 horas em estufa a 37°C e 5% CO2. A
seguir, o composto foi solubilizado com 100 μl de dimetilsulfóxido
(DMSO) e a intensidade da coloração quantificada por absorbância a
570nm em leitora de microplacas (Tecan Infinite M200). Nos
experimentos realizados com associação da MRD as matrizes foram
transferidas para novos poços antes da incubação com MTT, para evitar
interferências de células que possivelmente tenham aderido ao plástico
da placa de cultura. Esse ensaio foi realizado em triplicatas em 4
experimentos independentes.

3.6. Análise imunocitoquímica

As células foram fixadas com paraformaldeído 4% por 30
minutos, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com PBS-
Triton X-100 (0,25%) durante 30 minutos. Os sítios inespecíficos foram
bloqueados com 5% de SBF em PBS durante uma hora e, após nova
lavagem com PBS, as amostras foram incubadas com os anticorpos
primários específicos segundo a tabela 2, por 14 horas a 4°C. Após este
período, procederam-se três lavagens com PBS-Tween 20 (0,05%) e em
seguida, as células foram incubadas com os anticorpos secundários
conjugados a fluorocromos durante 1 hora. Após nova lavagem com
PBS-Tween, as células foram incubadas com 4’-6-diamino-2fenilindol
(DAPI) (50ng/mL) durante 15 segundos, à temperatura ambiente, para
marcação dos núcleos. As marcações foram analisadas em microscópio
epifluorescente (Olympus IX71) e fotografadas em câmara Olympus
DP71. Foram realizados três experimentos independentes em triplicatas.
 39

Tabela 2 Marcadores utilizados nas reações imunocitoquímicas

Fenótipo Anticorpo Primário Diluição Anticorpo Secundário Diluição
Célula de Anti-αSMA 1:800 Cabra contra IgG2a de 1:400
Músculo (anti α actina de camundongo
Liso músculo liso) conjugado a Alexa
– IgG2a de 594
camundongo
Colágeno Anti-Colágeno I 1:100 Cabra contra IgG de 1:400
tipo I – IgG de coelho coelho conjugado a
Alexa 488
Célula Anti - CD31 – IgG1 1:100 Cabra contra IgG1 de 1:500
Endotelial de camundongo camundongo
conjugado a Alexa 59
Queratinócito Anti-citoqueratina 1:200 Cabra contra IgG de 1:500
19 – IgG de coelho coelho conjugado a
Alexa 488

A proporção de células positivas para α-SMA foi calculada em

relação ao número total de células pela contagem dos núcleos corados
com DAPI. O programa ImageJ® foi utilizado para quantificar a
marcação de colágeno tipo I presente, bem como para quantificar os
núcleos corados com DAPI. Após, foi calculada a relação percentual
entre valores de pixels da marcação de colágeno tipo I e de DAPI.

3.7. Ensaio de Quantificação Celular

A quantidade de células foi avaliada nas culturas bidimensionais
pela quantificação do numero total de células durante o período de
cultivo, avaliando-se os núcleos corados com DAPI. Para tanto, placas
de cultura de 96 poços foram plaqueadas com 1.104 células/poço. Após
quatro dias, as células foram lavadas com PBS e fixadas como descrito
acima para a imunofluorescencia (no item 3.6). Após nova lavagem com
PBS, as culturas foram analisadas em microscópio epifluorescente.
Foram contados os núcleos de 15 campos (visualizados em objetiva de
10X) em cada condição experimental, em nove experimentos
independentes.

3.8. Análise de morte celular

A morte celular por necrose foi avaliada pela marcação com
SYTOX® Green. Esse é um corante de alta afinidade por ácidos
nucléicos sendo incorporado apenas por células com a membrana
plasmática comprometida, sem marcar células viáveis. Para tanto, as
células foram incubadas com SYTOX® Green na concentração de
10mM, adicionado ao meio de cultura, por 10 minutos, de acordo com
40

as instruções do fabricante. A seguir, as células foram lavadas com PBS,

fixadas e os núcleos corados com DAPI como descrito acima, no item
4.6. Após nova lavagem com PBS, as culturas foram examinadas em
microscópio epifluorescente.
Para esta análise, foram realizados três experimentos
independentes, em triplicatas. A proporção de células positivas para
SYTOX® Green foi calculada em relação ao número total de células.

3.9. Análise da MRD por Microscopia de Varredura (MEV)

A técnica de MEV foi empregada para verificar a adesão e a
morfologia das CTMd cultivadas em ambiente tridimensional com a
MRD Integra®. Após o cultivo descrito no item 4.4, as amostras foram
fixadas em solução de Cacodilato de sódio 0,1M, por 14 horas a 4°C e,
após, submetidas a 3 lavagens de 15 minutos na mesma solução.
Posteriormente, foi realizado o processo de desidratação por incubações
de 20 minutos em soluções de álcool de concentrações crescente (30%,
50%, 70%, 90% e 100%). A última etapa (álcool 100%) foi repetida
três vezes. Após a desidratação, as amostras foram submetidas à
secagem no equipamento de ponto crítico de CO2 (Leica EM CPD 030).
Neste processo as partículas de álcool são substituídas por CO2. Ao
final, as amostras foram metalizadas com uma cobertura de ouro de
30nm (metalizador Sputter Leica EM SCD 500) e então analisadas no
microscópio eletrônico de varredura por captura de elétrons secundários
em 15kV (Jeol JSM-6390LV).

3.10. Análise de diferenciação celular por Western blot

3.10.1. Preparação das amostras
As culturas de células foram lisadas em dodecil sulfato de sódio
(SDS) stopping solution (4% SDS, 2 mM EDTA, 8% -mercaptoetanol,
e 50 mM Tris, pH 6,8). Resumidamente, as culturas de células foram
homogeneizadas mecanicamente em 100 µL de SDS stopping solution,
os lisados foram aquecidos a 100º C por 5 min, e centrifugados (10.000
x g por 10 min, a 4º C) para eliminar os restos celulares. Os
sobrenadantes foram utilizados para preparar as amostras e dosagem de
proteínas. A dosagem de proteínas foi determinada com o método
descrito em Peterson (1977). A seguir foram adicionados nas amostras
―tampão de diluição‖ (40% glicerol, 100 mM Tris, azul de bromofenol,
pH 6,8) 25:100 (v/v) e β-mercaptoetanol (concentração final 8%).
 41

3.10.2. Eletroforese e Eletrotransferência

As proteínas (30 µg) foram isoladas através de SDS-PAGE
(eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS) utilizando gel de
separação de acrilamida com concentração de 10% e gel de entrada 4%.
A eletroforese foi realizada com corrente fixa de 40 mA e voltagem
máxima de 150 mV durante aproximadamente 2 h. Após a corrida, os
géis foram submetidos ao processo de eletrotransferência e transferidos
para membrana de nitrocelulose usando um sistema semi-dry (1,2
mA/cm2; 1,5 h) como descrito por Bjerrum e Heegaard (1988). Para
verificar a eficiência do processo de transferência, as membranas foram
coradas com Ponceau S.

3.10.3. Imunodetecção
As membranas foram bloqueadas com 5% de albumina bovina
(BSA) em Tris 10 mM, NaCl 150 mM (TBS) pH 7,5 por 1 hora e após
sucessivas lavagens com TBS-T (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20
0,1%, pH 7,5) incubadas ―overnight‖ (4º C) com os anticorpos
específicos para das seguintes proteínas: α-SMA e β-actina. Os
anticorpos foram diluídos em TBS-T contendo BSA 2% nas diluições:
1:1000 (α-SMA) e 1:2000 (β-actina). Para a detecção dos complexos
imunes, as membranas foram incubadas por 1 hora com anticorpo
secundário anti-rabbit ou mouse (ligado à peroxidase) e reveladas em
filme autoradiogrfico após a emissão de quimioluminescência induzida
por reagentes adicionados a membrana de nitrocelulose, de acordo com
as recomendações do fabricante. As membranas foram incubadas com o
anticorpo anti-β-actina (1:2000) para verificar se a mesma quantidade de
proteínas teriam sido aplicadas no gel. O imunoconteúdo da proteína foi
determinado pela razão entre a D.O da banda e a D.O. da β-actina
(Posser et al., 2007). As bandas foram quantificadas utilizando o
software Scion Image ®.

3.11. Análise de diferenciação celular por RT-PCR

A síntese do cDNA foi realizada a partir de 1 μg do RNA total
tratado com DNase, a fita de cDNA foi sintetizada através do Kit para
transcrição reversa ImProm-II™ Reverse Transcription System
(Promega). Conforme especificações do fabricante, primeiramente foi
realizada uma reação com o RNA, 0,5 μL de oligo(dT) e água para
completar um volume final de 5 μL. As amostras foram então incubadas
por 5 minutos a 70ºC. Esta primeira reação serve para que o os
oligo(dT), que são utilizados como oligonucleotídeos iniciadores pela
transcriptase reversa, reconheçam e se liguem nas caudas poli-A dos
42

mRNAs. Em seguida, as amostras foram transferidas para o gelo e

incubadas por 5 minutos. Logo após, foram preparadas as reações com 4
μL de tampão (ImProm-II™ 5X Reaction Buffer), 5 mM de MgCl2,
dNTP Mix a 0,5 mM de cada dNTP, 20 unidades da enzima inibidora de
ribonuclease (Rnasin), 1 unidade da enzima transcriptase e água para
completar o volume de 15 μL. Os reagentes foram misturados com a
primeira reação e incubados por 5 minutos a 25ºC, 1 hora a 42ºC e 15
minutos a 70ºC. Todos os reagentes fazem parte do kit para transcrição
reversa da Promega.
Foram utilizados 2 controles para cada amostra na reação de RT,
onde 1 continha todos os reagentes, exceto o RNA, para verificar se
havia alguma contaminação na reação; o outro controle continha todos
os reagentes, exceto a transcriptase reversa, para verificar se havia
contaminação por DNA genômico nas amostras. Após a síntese de
cDNA, as amostras foram submetidas à PCR.
Na técnica de PCR para amplificação do gene CD31, a partir do
cDNA sintetizado, foram utilizados 0,4 μM de oligonucleotídeos
iniciadores específicos (tabela 2), sendo um senso e outro anti-senso,
12,5 μl do reagente GoTaq Master Mix (Promega) e 1 μL de cDNA, em
um volume final de 25 μL. As amostras foram desnaturadas inicialmente
a 94°C por 4 minutos, em seguida, foram submetidas a 35 ciclos de
94°C por 45 segundos para dissociação, 56,2ºC por 45 segundos, 72°C
por 1 minuto para extensão, com uma extensão final a 72ºC por 10
minutos.
As reações foram realizadas no termociclador Mastercycler
gradient (Eppendorf) e em triplicata para cada amostra. Nestes
experimentos, a expressão do gene gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase (GAPDH) foi utilizada como controle positivo das
reações. Em todos os experimentos foram utilizados controles negativos
que consistiram em adicionar todos os reagentes, exceto o cDNA, para
averiguar se havia alguma contaminação nas reações. Após a
amplificação, os produtos foram analisados por eletroforese em gel de
agarose.
 43

Tabela 3 Sequência de oligonucleotídeos iniciadores utilizados

para os experimentos de RT-PCR.
Gene Sequência de oligonucleotídeos Temperatura Tamanho do
iniciadores de fragmento
anelamento amplificado
(ºC)
CD31 Senso: 56.2ºC 107 pb
GAGTCCTGCTGACCCTTCTG
Anti-Senso:
ATTTTGCACCGTCCAGTCC
GAPDH Senso: 56.2ºC 226 pb
GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
Anti-Senso:
GAAGATGGTGATGGGATTTC

3.12. Análise estatística

A análise estatística foi realizada com a utilização do software
GraphPad Prism 5®. Foi empregada a análise de variância de uma via
(ANOVA), comparando-se as médias de cada grupo tratado em relação
às médias de um grupo controle, seguida pelo teste de Tukey a 5%. Os
resultados foram considerados significantes quando p < 0,05.
44
 45

4. RESULTADOS

4.1. Análise dos efeitos do PRP sobre as CTMd em cultivo

celular bidimensional

Inicialmente, foram analisados os efeitos do PRP sobre as CTMd

em cultivo bidimensional, avaliando a morfologia, crescimento celular,
viabilidade, morte e diferenciação celular. Foi avaliada também
produção de MEC (colágeno tipo I). Para estas análises, as CTMd foram
cultivadas diretamente sobre o plástico de placas de cultivo celular,
conforme descrito no item 3.3 da metodologia.

4.1.1. Efeito do PRP na Morfologia, Adesão e Crescimento

Celular por Microscopia de Contraste de Fase

As culturas foram analisadas por microscopia de contraste de fase

quanto às suas características morfológicas, adesão ao plástico e
confluência celular. A análise das células foi realizada rotineiramente
em todas as amostras durante o período experimental de 4 dias. Em
todas as condições experimentais, as células apresentaram as
características de adesão ao plástico formando monocamadas
confluentes, com morfologia fibroblastóide, que são características das
CTM (figura 4). É importante ressaltar que as células utilizadas neste
estudo foram caracterizadas previamente como CTM em estudos
realizados durante a Tese de Doutorado de Talita Jeremias (em
andamento, no Laboratório de Células Tronco e Regeneração Tecidual -
UFSC, pelo PG-BCD) (JEREMIAS, et al., em preparo).
46

Figura 6 Análise morfologica das CTMd: Fotografia representativa

das monocamadas de CTMd visualizadas em microscópio de contraste de fase.
As células foram cultivadas em placas de 96 poços (1x10 4 células/poço) em
meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF, controle (A), e em meio
DMEM-F12 contendo PRP nas diluições de 1:50 (B) e 1:100 (C).
 47

4.1.2. Efeitos do PRP na Viabilidade, Morte e Proliferação

Celular

O efeito do PRP na viabilidade celular foi realizado pelo ensaio

colorimétrico de MTT, conforme o item 3.5. O tratamento com PRP,
após 4 dias de cultivo, reduziu significativamente os valores do MTT
(absorbância em 540nm) em ambas as diluições avaliadas (1:50 e
1:100), representando uma diminuição de 52,7% e 46,9% em relação às
células cultivadas em meio controle (figura 5).

0.4

0.3
ABS 540 nm

*** ***
0.2

0.1

0.0
50
e

0
ol

10
1:
tr

1:
on
C

Figura 7. Efeito do PRP na sobrevida das CTMd pelo ensaio de

MTT: As células foram cultivadas por 4 dias em meio DMEM-F12
suplementado com 15% de SBF (controle), ou com PRP (1:50) (1:100) em
placas de 96 poços (1x104 células/poço). Os resultados são expressos em
absorbância a 540nm e representam as médias ± desvio padrão de três
experimentos independentes realizados em quadruplicatas. ***p <0.05 vs.
controle por ANOVA de uma via seguido por Tukey.

A seguir, foi avaliado o possível efeito do PRP no crescimento

celular, pela quantificação do número total de células. Para isso os
núcleos totais foram corados por DAPI e quantificados após 4 dias de
cultivo, segundo o item 3.7. Assim como no ensaio do MTT, o controle
do experimento apresentou número maior de células do que os grupos
tratados, porém, apenas na concentração 1:100 de PRP foi observada
diferença estatisticamente significante com uma redução de 16,6% em
relação ao controle (Figura6).
48

Figura 8. Efeito do tratamento com PRP no número de CTMd,

analisadas por DAPI: (A) Representação Gráfica do número de células por
poço, expressas pelas médias ± desvio padrão de seis experimentos
independentes realizados em triplicatas, por ANOVA de uma via seguido por
Tukey. ***p <0.05 vs. controle. (B) Imagem representativa observada por
microscopia de fluorescência em objetiva de 10X, em azul marcação de DAPI.
As células foram cultivadas em placas de 96 poços (1x104 células/poço), com
meio DMDM-F12 suplementado com 15% de SBF, controle (a) e nas diluições
de PRP de 1:50 (b) e 1:100 (c).
 49

Para avaliar se os resultados da análise da viabilidade e do

crescimento celular estavam relacionados a um possível efeito tóxico do
PRP sobre as CTMd, foi analisada a seguir a morte celular por necrose.
Para este ensaio, as culturas foram incubadas com SYTOX®
Green, conforme item 3.8. O SYTOX® Green é um corante fluorescente
com afinidade por DNA que penetra apenas em células com membranas
plasmáticas comprometidas, quando incubado em culturas de células
vivas.
O tratamento com PRP, em ambas as diluições, reduziu de modo
significante a morte celular por necrose, em relação ao controle. O PRP,
na diluição de 1:50, promoveu uma redução de 38,9%, enquanto que a
diluição de 1:100 de PRP, reduziu 63,4% da morte celular em relação ao
controle (figura 7). Esse resultado, em conjunto com os anteriores,
sugere que as reduções dos valores do ensaio do MTT não significam
redução na viabilidade celular e sim na taxa de crescimento celular.
50

Figura 9. Efeito do PRP na mortalidade por necrose de CTMd: (A)

Representação gráfica da morte celular das CTMd cultivadas com PRP. As
células positivas para SYTOX® Green foram contadas em nove campos
microscópicos aleatórios por condição de cultura, em três experimentos
independentes, realizados em triplicatas. A morte celular foi avaliada por
incorporação de SYTOX® Green em relação ao número total de células coradas
com DAPI. ***p < 0,05 vs controle por ANOVA de uma via seguido do teste
de Tukey. (B) Fotografia representativa de microscopia de fluorescência em
objetiva de 10X, mostrando, em azul, marcação de DAPI, e em verde, marcação
de SYTOX® Green. As células foram cultivadas em placas de 96 poços (1x104
células/poço), com meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF, controle
(a) e nas diluições de PRP de 1:50 (b) e 1:100 (c).
 51

4.1.3. Efeito de PRP na Produção de colágeno I

No PRP encontram-se diversos fatores de crescimentos, incluindo

o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de
crescimento transformante β1 e β2 (TGF-β1, TGF-β2), fator de
crescimento de endotélio vascular (VEGF) e o fator de crescimento
endotelial (EGF), capazes de estimular as células a sintetizarem matriz
extracelular, em especial o colágeno, e de se diferenciarem para
determinados tipos celulares, como células precursoras de vasos, como
citado no item 1.5. Devido a esta capacidade de estímulo celular do
PRP, foi analisada a seguir a produção de colágeno tipo I.
A produção de colágeno tipo I foi avaliada por imunocitoquímica,
como descrito no item 3.6. Os resultados demonstraram aumento de
34,3% e de 14,65% na quantidade de colágeno tipo I nas monocamada
de CTMd tratadas com diluições de PRP 1:50 e 1:100, respectivamente,
em relação às células cultivadas sob condição controle (Figura 8). Estes
dados sugerem que os fatores presentes do PRP estimulam a síntese de
colágeno tipo I nas CTMd.
52

Figura 10. Efeito do tratamento com PRP na síntese de colágeno

tipo I pelas CTMd, analisadas por Imunofluorescência: (A) Representação
Gráfica do percentual de pixels captados pelo programa ImageJ® de colágeno
tipo I vs. DAPI. Foram realizadas análises de dois experimentos independentes
em triplicatas, por ANOVA de uma via seguido por Tukey. ***p <0.05 vs.
controle. (B) Imagem representativa observada por microscopia de
fluorescência em objetiva de 4X, em verde marcação de colágeno tipo I e em
azul marcação de DAPI. As células foram cultivadas em placas de 96 poços
(1x104 células/poço), com meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF
controle (a) e nas concentrações de 1:50 (b) e 1:100 (c).
 53

4.1.4. Efeito do PRP na diferenciação das CTMd

Para verificar possíveis efeitos do tratamento com PRP na

diferenciação das CTMd foram realizadas análises de imunocitoquímica
avaliando os fenótipos queratinocítico (marcação de citoqueratina 19);
endotelial (marcação de CD 31) e miofibroblasto (marcação de α-SMA),
além do ensaio de RT-PCR, para o mRNA de CD 31, conforme os itens
3.6 e 3.11, respectivamente.
Não foram observadas células marcadas para citoqueratina 19 em
nenhum dos tratamentos e controle, sugerindo que PRP não promove a
diferenciação das CTMd para queratinócitos nas condições avaliadas
(dados não mostrados).
Com o objetivo de verificar se o PRP induz CTMd a se
diferenciarem para células endoteliais, foram realizadas análises de
imunocitoquímica e de RT-PCR para a expressão da proteína CD31.
Nas análises de imunocitoquímica, foi observada uma leve marcação
após ambos tratamentos com PRP, ausente na condição controle (Figura
9). Para confirmar esse resultado, foram realizadas análises de RT-PCR.
Porém, não foi detectada a presença do mRNA de CD31 nas CTMd em
nenhum dos tratamentos realizados. Este resultado demonstra que o
PRP, nas condições experimentais do presente trabalho, não promove a
diferenciação das CTMd em células endoteliais (Figura 9).
54

Figura 11. Efeito do tratamento com PRP na expressão de CD31 nas

CTMd, analisadas por RT-PCR: (A) Fotografias representativas de produtos
de mRNA em gel de agarose, demonstrando que as células tratadas com PRP a
1:50 e a 1:100, bem como as células cultivadas em meio controle. Em todas as
condições experimentais há a marcação para GAPDH, que foi usado como
controle positivo da RT-PCR Como positivo (C+) para a expressão de CD31
forma utilizados leucócitos humanos de sangue periférico. C: controle, 1:50 e
1:100, concentrações de PRP, C+: leucócitos. (B) Imagem representativa
registrada por microscopia de fluorescência em objetiva de 10X, em vermelho,
suposta marcação de CD31, em azul, marcação de DAPI. As células foram
cultivadas com meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF, controle (a)
e nas diluições de PRP de 1:50 (b) e 1:100 (c).
 55

Resultados em andamento da tese de doutorado de Talita

Jeremias demonstram que as CTMd, quando cultivadas in vitro,
expressam a proteína α-SMA em proporções baixas (JEREMIAS, et al.,
em andamento). Visando analisar o efeito do PRP na diferenciação das
CTMd em células de músculo liso/ miofibroblasto, foi realizada a
análise de imunocitoquímica para a proteína α-SMA, segundo o item
3.6.
Os resultados obtidos demonstraram que as diluições 1:50 e
1:100 de PRP promoveram um aumento de 22,69% e de 23,34% na
proporção das células positivas para α-SMA, quando comparadas com
as células cultivadas em condições controle (Figura 10).
Adicionalmente, constatou-se que as CTMd positivas para aSMA
apresentavam diversas morfologias, conforme descrito na literatura:
morfologia triangular (Figura 12-A/a), rombus (Figura 12-A/b),
filopodia-filopodia (Figura 12-A/c) e lamelipodia-filopodia (Figura 12-
A/d) (MONTESINOS, et al., 2009).
Na situação controle, 22,5% das células apresentaram morfologia
triagular, sendo que, no grupo de tratamento com PRP nas diluições
1:50 e 1:100, apenas 5% das células apresentaram esta morfologia
(Figura 12-B/a). A morfologia rombus foi observada em 18% das
células na situação controle, porém, apenas 3% e 9% das células tratadas
com PRP, diluições 1:50 e 1:100, respectivamente, apresentavam essa
morfologia (Figura 12-B/b). Concomitantemente, houve aumento na
proporção de células com morfologia filopodia-filopodia e lamelipodia-
filopodia. A morfologia filopodia-filopodia foi observada em 11,5% das
células controle, passando para 57% e 46% da células após tratamento
com PRP nas diluições de 1:50 e 1:100, respectivamente. Já a
morfologia lamelipodia-filopodia, presente em 49,5% das células
controle, passou para 36% e 40 % das células após os respectivos
tratamentos.
56

Figura 12. Efeito do tratamento com PRP na expressão α-SMA em

CTMd, analisadas por Imunofluorescência: (A) Representação Gráfica do
percentual do número de células positivas para α-SMA, as células foram
contadas em nove campos randômicos por condição de cultura em três
experimentos independentes realizados em triplicatas, **p < 0,05 versus
controle por ANOVA de uma via seguido do teste de Tukey. (B) Imagem
representativa observada por microscopia de fluorescência em objetiva de 10X,
em vermelho, marcação por α-SMA, em azul marcação de DAPI. As células
foram cultivadas em placas de 96 poços (1x104 células/poço), com meio
DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF, controle (a) e nas concentrações
de 1:50 (b) e 1:100 (c).
 57

Figura 13. Efeito do tratamento com PRP na morfologia de CTMd

positivas para α-SMA, analisadas por Imunofluorescência: (A) Imagens
representativas das CTMd, observadas por microscopia de fluorescência em
objetiva de 10X. Em vermelho, marcação por α-SMA, apresentando as
morfologias: triangular (a), romus (b), lamilipodia-filopodia (c) e filopodia-
filopodia (d). (B) Representação Gráfica do número de células positivas para α-
SMA observadas em suas diferentes morfologias: triangular(a) , rhombus (b),
lamilipodia-filopodia (c) e filopodia-filopodia (d). As células foram analisadas,
em nove campos microscópicos de 10X randômicos por condição de cultura de
três experimentos independentes realizados em triplicatas,. **p < 0,05 versus
controle por ANOVA de uma via seguido do teste de Tukey. As células foram
cultivadas com meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF, controle e
nas concentrações de 1:50 e 1:100.
58

4.2. Avaliação dos efeitos do PRP sobre as CTMd em cultivo

tridimensional com a matriz de regeneração dérmica Integra®

A interação célula-matriz extracelular é capaz de intermediar

respostas fisiológicas responsáveis pelo controle do crescimento,
migração, diferenciação, sobrevivência celular além da organização do
tecido e remodelamento da matriz (BIRGERS-DOTTER et al., 2005).
Tendo em vista a importância do ambiente tridimensional para o
comportamento celular, e, buscando novas alternativas para tratamentos
de lesões de pele, foram realizados ensaios in vitro associando as CTMd
e o PRP à MRD integra®
Para tanto, as CTMd foram cultivadas na MRD integra®,
conforme descrito no item 3.4. As células foram cultivadas no meio
controle (DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF) ou na presença
de PRP (diluições 1:50 e 1:100). Após cinco dias de cultivo, as células
foram avaliadas quanto à morfologia, viabilidade e diferenciação
celular. Para tal, foram realizadas análises de MEV, MTT, RT-PCR e
Western blot.

4.2.1. Efeito do PRP na viabilidade das CTMd cultivadas na

MRD Integra®

Para analisar o efeito do PRP na viabilidade das CTMd cultivadas

em MRD, foi realizado o ensaio colorimétrico de MTT, após 24h e 5
dias de cultivo celular.
Os testes realizados após 24h de tratamento foram utilizados para
avaliar a viabilidade celular no momento inicial do cultivo. Nestas
condições, não houveram diferenças significativas entre os grupos
controle e tratados com PRP. No entanto, no quinto dia de cultivo,
notou-se que o tratamento com PRP reduziu significativamente a
viabilidade das CTMd, em relação às células cultivadas em meio
controle (Figura 12), de modo semelhante ao observado no cultivo
bidimensional. Estes resultados sugerem que, no momento inicial da
cultura, as CTMd mantém a sua viabilidade quando cultivadas sobre a
MRD integra®. Contudo, após um período maior de tratamento, há um
declínio na quantidade de células quando tratadas com PRP.
 59

Figura 14. Efeito do PRP na viabilidade das CTMd cultivadas

na MRD integra®, pelo ensaio de MTT: As células foram cultivadas
em meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF (controle), e em
PRP (1:50) (1:100). Os resultados são expressos pelos valores obtidos
da absorbância das amostras/poço de 96 poços e representam as médias
± desvio padrão de três experimentos independentes realizados em
quadruplicatas. ***p <0.05 vs. controle por ANOVA de uma via
seguido por Tukey.

4.2.1. Efeito do PRP na Morfologia e Adesão das CTMd

associadas à MRD integra®

A interação entre as células cultivadas sobre a MRD integra® foi

analisada através da técnica de MEV. As micrografias de MEV
revelaram que as CTMd mantém a capacidade de aderir à MRD quando
tratadas com PRP em ambas as diluições de 1:50 e 1:100, bem como
quando mantidas em meio controle (DMEM-F12 suplementado com
15% de SBF) (Figuras 13).
No entanto, foram constatadas alterações na morfologia e na
interação com a matriz quando as células eram mantidas na presença do
PRP, comparativamente com a situação controle (figura 13). Nas células
mantidas em meio controle, foram observadas morfologias semelhantes
aos resultados de marcação para α-SMA no cultivo bidimensional
(Figura 11). A maioria das células nestas condições apresentavam
tamanho reduzido, com morfologia triangular (setas na figura 14/A) ou
romboide (setas na figura 14/B). Porém, uma proporção de células
apresentavam a morfologia lamelipodia-filopodia (setas na figura 14/D)
ou com prolongamentos celulares (setas na figura 14/C)
60

Após o tratamento com PRP, pôde-se observar que as CTMd

eram mais alongadas (Figura 13/C/E), assumindo, em sua maioria,
morfologias filopodia-filopodia (Figuras 15/A;B;E;F e 16/A;B;C;E;F) e
lamelipodia-filopodia (Figuras 15/C;D;E;F e 16/A;B;D;E), concordando
com os resultados de cultivo bidimensional. Adicionalmente, foi
possível visualizar interações entre as células, emissão de pseudópodes e
presença de múltiplos pontos de adesão à matriz (Figuras 15 e 16,
indicado por setas), sugerindo que as células, após o tratamento com
PRP, assumiram característica migratória (EVEN-RAM ; YAMADA,
2005).
 61

Figura 15. Morfologia de CTMd cultivadas em MRD Integra® e

analisadas por MEV: (A;B) controle, células pequenas (C;D) CTMd tratada
com 1:50 de PRP, células maiores, com prolongamentos. (E;F) CTMd tratadas
com 1:100 de PRP, células maiores, com prolongamentos. As células foram
cultivadas em meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF, controle, e
em meio DMEM-F12 com as diluições de PRP 1:150 e 1:100, sobre a MRD
integra®.
62

Figura 16. Morfologia de CTMd cultivadas em MRD no grupo

Controle, analisadas por MEV: A: morfologia triangular. (B) célula se
aderindo à MRD integra®. (C) morfologia romboide, com poucos
prolongamentos e interações com a MRD. (D) célula com morfologia
lamilipodia-filopodia, com prolongamentos e pontos de adesão à matriz. (E)
morfologia romboide e triangular, contato célula-célula por prolongamentos
citoplasmáticos (F) célula aderindo a matriz, com poucos pontos de adesão. As
células foram cultivadas em meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SBF,
sobre a MRD Integra®.
 63

Figura 17. Morfologia de CTMd cultivadas em MRD no grupo de

tratamento 1:50, analisadas por MEV: (A) morfologia filopodia-filopodia
com emissões de prolongamentos e interação célula-célula. (B) morfologia
filopodia-filopodia com interação célula-célula. (C) morfologia rhombus e
lamelipodia-filopodia, com interação entre as células e emissões de filopódios.
(D) detalhe da emissão de filopódios em célula com morfologia lamelipodia-
filopodia, (E) célula com morfologia romboide, possuindo muitos pontos de
adesão à matriz e prolongamentos. (F) Multiplos pontos de interação entre
célula-célula e à matriz, além de emissões de pseudópodos. As células foram
cultivadas com 1:50 de PRP sobre a MRD Integra®.
64

Figura 18. Morfologia de CTMd cultivadas em MRD no grupo de

tratamento 1:100, analisadas por MEV: (A) células com morfologias
lamelipodia-filopodia e triangular com interação célula-célula, (B) células
apresentando morfologia lamelipodia-filopodia. filopodia-filopodia e rombus,
com pontos de interação com a matriz e interação celular, (C) morfologia
filopodia-filopodia, com pontos de adesão à matriz e emissões de
prolongamentos, (D) células lamelipodia-filopodia, interagindo entre si e com a
MRD (E) células apresentando morfologia filipodia-filopodia, rombus,
filopodio-lamelipodio e triangular, interagindo entre si e com a matriz (F) célula
com morfologia filopodia-filopodia, com emissão de prolongamentos. As
células foram cultivadas com 1:100 de PRP sobre a MRD Integra®.
 65

4.1.3. Efeito do PRP na Diferenciação das CTMd cultivadas

na MRD Integra®

Tendo em vista os resultados obtidos pelo cultivo bidimensional,

foram realizadas análises quanto à diferenciação celular para os
fenótipos endotelial e miofibroblastico.
A expressão do fenótipo endotelial foi realiza por RT-PCR, para
CD31. Não foi detectada expressão do mRNA de CD31 em nenhuma
das condições experimentais (Figura 17). Este resultado coincide com os
resultados observados em ambiente bidimensional (Figura 9) e sugerem
que PRP, associado ao ambiente tridimensional oferecido pela MRD,
não influencia a diferenciação das CTMd em células endoteliais.

Figura 19. Efeito do PRP sobre CTMd associadas à MRD Integra

avaliado pela expressão de mRNA para CD31 por RT-PCR: Fotografias
representativas de produtos de mRNA em gel de agarose, demonstrando que as
células tratadas com PRP (1:50 e 1:100), bem como as células cultivadas em
meio controle (DMEM/F12 acrescido de 15% de SBF), expressam GAPDH, o
qual foi utilizado como controle positivo da RT-PCR, e não expressam o
mRNA de CD 31. C: controle, 1:50 e 1:100, concentrações de PRP, C+:
leucócitos como controle positivo para a expressão do mRNA de CD31.

Para analisar se o PRP possui influência sobre as CTMd

cultivadas em ambiente tridimensional na expressão de α-SMA, foram
realizadas análises de Western blot. Os resultados obtidos demonstraram
que as diluições 1:50 e 1:100 de PRP promoveram um aumento de
9,00% ± 6,91 e 5,55% ± 2,84, respectivamente, na síntese α-SMA,
quando comparadas com as células cultivadas em condições controle.
No entanto, estes resultados não apresentaram diferença estatística
significante (Figura 18).
66

Figura 20: Análise da expressão proteica de α-SMA em CTMd

tratadas com PRP e cultivadas na MRD integra® por Western blot. (A)
Fotografia representativa de Western blot para α-SMA e β-actina em CTMd na
situação controle e após tratamento com PRP. (B) Representação gráfica dos
valores obtidos pela razão da densitometria de bandas imunorreativas de α-
SMA pela β-actina. Os valores obtidos na situação controle foram considerados
100 %, enquanto os valores obtidos nas diluições de PRP foram calculados
como porcentagem do controle. Os resultados são expressos como médias +
erro padrão de cinco experimentos independentes, em triplicata. p = 0,56 versus
controle.
 67

5. DISCUSSÃO

As CTM, por suas características de obtenção reprodutível por

métodos padronizados e alta plasticidade in vitro, vêm atraindo a
atenção de pesquisadores que visam a sua utilização como agente
terapêutico para o tratamento de várias doenças (SILVA MEIRELLES;
NARDI, 2009). As CTM estão sendo visadas ainda como componente
biológico para reposição tecidual em lesões, como abordado em trabalho
recente que associa CTM de medula óssea humana, a MRD Integra® e o
PRP (FORMIGLI et al., 2011). Neste sentido, estudos que abordam a
tríade da Engenharia Tecidual (célula, fatores de crescimento e
substrato) são fundamentais para o desenvolvimento de aplicações
terapêuticas.
Outro aspecto a ser considerado no desenvolvimento de
estratégias da Engenharia de Tecidos é a identificação de fontes de CTM
capazes de se diferenciar em diversos tipos celulares (BERTANI et al.,
2005). A pele pode ser considerada uma boa fonte de obtenção e, dentre
os diversos tipos de CTs na pele, destacam-se as CTMd, que vêm
ganhando destaque na regeneração e reparo de tecidos lesionados
(BLANPAIN; FUCHS, 2006).
No presente trabalho buscou-se avaliar o uso do PRP, como
fonte de fatores de crescimento, sobre diferentes aspectos
morfofuncionais das CTMd humana em ambientes de cultivo
bidimensional e tridimensional, associados à MRD integra®.
As CTM são caracterizadas pela morfologia fibroblastóide e
alta adesão ao plástico em cultura (DOMINICI, et al., 2006). Os
resultados obtidos com o cultivo bidimensional das CTMd foram
consistentes com o padrão de caracterização descritos na literatura,
demonstrando que o tratamento com PRP nesse ambiente as células
mantem a morfologia fibroblastóide e alta adesão ao plástico (Figura 6).
Para avaliar os efeito do PRP na viabilidade celular, inicialmente
foi realizado o ensaio de MTT. É importante salientar que o ensaio de
MTT reflete alterações da viabilidade celular, taxa de crescimento
celular ou atividade mitocondrial, uma vez que se baseia na redução de
um sal de tetrazólio realizada pelas enzimas desidrogenases
mitocontriais, presentes em células vivas (GERLIER; THOMASSET,
1984). Os resultados demonstraram redução nos valores do MTT em
CTMd tratadas com PRP, o que sugere diminuição do número de células
promovida por menor taxa de proliferação ou elevada morte celular.
Para avaliar a possível redução no número de células nas culturas
tratadas com PRP, foi realizada a contagem de núcleos totais. O
68

resultado revelou diminuição no numero total de CTMd após tratamento

com PRP (Figura 8), coerente com os resultados do MTT. Esse efeito
foi acompanhado na redução de células necróticas, demonstrando que o
PRP diminui as taxas de mortalidade celular por necrose (Figura 9),
sugerindo, dessa forma, que o PRP, nessas diluições (1:50 e 1:100), não
é toxico para as CTMd, corroborando com os resultados de Formigli e
colaboradores (2011).
A diminuição no número de CTMd, promovida por PRP, pode ser
explicada pela diminuição na taxa de proliferação celular, o que é
coerente com um estímulo à diferenciação celular. Essa possibilidade foi
avaliada pela expressão de marcadores proteicos e moleculares,
relacionados à diferenciação de queratinócitos (citoqueratina 19),
células endoteliais (CD31) e células de musculo liso/miofibroblastos (α-
SMA). Não foram observadas marcações para citoqueratina 19, nem
para CD31 (Figura 11), no controle e após tratamento com PRP,
sugerindo que as CTMd não diferenciam para queratinócitos e nem
células endoteliais nas condições experimentais analisadas. Estes
resultados estão de acordo com obtidos por Formigli e colaboradores
(2011).
No entanto, os resultados demonstram aumento significativo no
número de células positivas para α-SMA, sugerindo que PRP possa estar
estimulando a diferenciação das CTMd para o fenótipo muscular liso ou
de miofibroblastos (Figura12), uma vez que estes são caracterizados
pela expressão da isoforma alfa da actina (α-SMA) (TOMASEK, et al.,
2002). Estes resultados corroboram com trabalhos recentes, que
demonstraram que, na presença de PRP, CTs de tendão e fibroblastos
provenientes de gengiva se diferenciaram de maneira significativa para
células positivas para α-SMA, semelhantes à miofibroblastos (ZHANG,
et al., 2010 ; CÁCERES, et al.,2008). O efeito do PRP em estimular a
diferenciação das CTMd para células semelhantes à musculo liso ou
miofibroblastos, pode estar relacionada à presença de altas
concentrações de TGF-β1 e PDGF. Estes fatores de crescimento foram
descritos como importantes indutores da diferenciação celular de
fibroblastos e de CTM para o fenótipo de miofibroblasto (HINZ, et al.,
2001 ; CHRISTGAU, et al., 2006 ; LIU, et al, 2009). Estudos in vivo
demonstram que os miofibroblastos se originam de células negativas
para α-SMA, e estão associados à maior capacidade de contração do
citoesqueleto (ARORA; MCCULLOCH, 1994).
Os efeitos do PRP na diferenciação das CTMd para o fenótipo de
musculo liso ou de miofibroblasto, pode ser evidenciado também pelos
resultados de alterações morfológicas. Foram observados 4 tipos de
 69

morfologias celulares, sendo elas: romboide, triangular, lamelipodia-

filopodia e filopodia-filipodia (MONTESINOS, et al., 2009) (Figura
13). Alguns autores sugerem que estas diferentes morfologias estão
relacionadas à auto-renovação e/ou estado de maturação celular
(COLTER, et al., 2001). Na condição controle, havia predomínio de
células de pequeno tamanho com morfologia romboide e triangular, o
que pode estar relacionado a uma maior proliferação celular e estado
mais indiferenciado (MONTESINOS, et al., 2009), estando de acordo
com os resultados de viabilidade e de quantificação celular. Nesta
condição, foi observada grande quantidade de células lamelipodia-
filopodia com morfologia fibroblastóide, a qual é considerada a
principal morfologia existente em populações de CTM (DOMINICI, et
al., 2006). Após o tratamento com PRP, no entanto, foi constatada
presença predominante de células de tamanho maior, em sua maioria
com morfologia lamelipodia-filopodia ou filopodia-filopodia, com
muitos prolongamentos citoplasmáticos. Esses resultados de alteração
morfológica, em conjunto com os de diferenciação, viabilidade e
quantificação celular, podem sugerir efeito do PRP na diferenciação
celular, em que as células deixam de expressar características
morfológicas de células indiferenciadas e com grande potencial de
divisão celular, e passam a assumir características mais diferenciadas e
com menor taxa de crescimento celular (JUNQUEIRA ; CARNEIRO,
2012).
Além disso, é possível que as células positivas para α-SMA
estejam assumindo um caráter migratório. As CTM, ao entrarem em
processo de migração celular, adotam morfologia fusiforme, com
prolongamentos celulares, semelhante à fibroblastos, mioblastos e de
células endoteliais individuais ou células de sarcoma (FRIELD, 2004).
As morfologias observadas nas monocamadas de CTMd tratadas com
PRP com prolongamentos citoplasmáticos foram consistentes com o
padrão descrito por Frield (2004).
Durante a cicatrização de feridas, a síntese de colágeno,
modulada por fatores de crescimento, é considerada essencial para a
reconstituição do tecido perdido (SCHAFFER, et al., 1996). Logo após
o ferimento, uma matriz provisória de fibronectina, fibrinogenio, fibrina,
e vitronectina é formada na área da ferida. Após este processo, os
fibroblastos devem sintetizar uma nova matriz de colágeno para que a
reconstituição do tecido seja efetivada (SCHAFFER, et al., 1996). Neste
trabalho, foi observado maior marcação de colágeno tipo I após o
tratamento com PRP em relação às células mantidas em meio controle
(Figura 10). Este resultado pode estar relacionado à presença de TGF-β
70

no PRP, importante para a síntese de colágeno tipo I (SHU-JEN, et al.,

1999). Estudos realizados por Kakudo e colaboradores (2011),
demonstraram reepitelização mais rápida com PRP em lesões de pele
humana, apresentando melhor organização e maior número de fibras de
colágeno em relação às feridas não tratadas. Desse modo, em conjunto
com resultados apresentados neste trabalho, pode-se sugerir que uso de
PRP em lesões de pele possa estimular os fibroblastos das bordas da
lesão à sintetizar colágeno tipo I, contribuindo para reconstituição da
matriz em menor período de tempo.
Em conjunto, os resultados dos experimentos de tratamento com
PRP das CTMd em cultivo bidimensional sugerem um grande potencial
para aplicação em terapias celulares e na reconstituição tecidual. No
entanto, para elucidar o completo potencial na Medicina Regenerativa, é
necessário avaliar, in vitro, ambientes experimentais que mimetizem ao
máximo a arquitetura e a fisiologia do ambiente encontrado por essas
células in vivo (GODIER et al., 2008). Além das CT e dos fatores de
crescimento, a Engenharia de Tecidos também dispõe de um terceiro
elemento, que é o substrato. Tendo em vista a íntima relação entre as CT
e o seu microambiente extracelular, estruturas tridimensionais que
mimetizem ao máximo a arquitetura e fisiologia do ambiente encontrado
pelas CT in vivo, vêm sendo desenvolvidas. No contexto de
bioengenharia de tecidos dérmicos, MRDs feitas de polímeros naturais,
biocompatíveis e biodegradáveis estão sendo produzidas e
caracterizadas para utilização em estudos de comportamento e
mecanismos celulares bem como para aplicações clínicas (MANN,
2003; DONG et al., 2009). Nesse sentido, uma das principais MRD
testadas e utilizadas na clínica atual é o Integra®.
No presente trabalho, as CTMd foram cultivadas sobre a MRD
Integra® e tratadas com PRP. Inicialmente, foi avaliada a viabilidade
celular pelo ensaio do MTT. Com 24 horas de cultivo os valores foram
similares entre as condições analisadas, sugerindo que, inicialmente, a
associação do PRP com a MRD não produz toxicidade e nem altera a
adesão celular (Figura 14/A). No 5o dia de cultivo, no entanto,
constatou-se diminuição nos valores do MTT com o tratamento com
PRP de modo similar ao observado nos experimentos bidimensionais
(Figura 14/B).
Em ambiente tridimensional, a adesão célula-matriz é capaz de
intermediar respostas fisiológicas responsáveis pelo controle do
crescimento celular, migração, diferenciação, sobrevivência,
organização do tecido e remodelamento da matriz extracelular
(BIRGERS-DOTTER, et al., 2005; MARTIN, 1997). Neste estudo, os
 71

efeitos do PRP sobre a adesão e morfologia das CTMd no Integra® foi

avaliado por MEV. Os resultados sugerem aumento na capacidade de
adesão à MRD após tratamento com PRP, demonstrada pela maior
quantidade de pontos de adesão celular ao Integra® em relação ao
controle (Figuras 15, 16, 17 e 18). Nesta condição, poucas células
apresentavam a morfologia rombus ou triangular, e, em maior parte,
apresentavam células alongadas e fibroblastoides, apresentando muitas
emissões citoplasmáticas e prolongamentos semelhantes à pseudópodos,
corroborando com os resultados obtidos nos experimentos em condições
bidimensional e sugerindo possível característica migratória (FRIELD,
2004) (Figuras 15, 16, 17 e 18).
A morfologia alongada e a adesão celular são mediadas pela
presença de forças de tração altas em ambos os polos celulares,
promovidas, em grande parte, pelas integrinas (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2012). O fator de crescimento TGF-β1 modula a regulação
das integrinas β1 e β3, responsáveis pela adesão e morfologia celular
alongada (HEINO; MASSAGUE, 1989 ; HEINO, et al., 1989). Segundo
Xu e Clark (1996), o fator de crescimento EGF também demonstrou
estimular a expressão da integrina β1 em células de fibroblasto
embrionário de camundongo 3T3. Adicionalmente, Bellas e
colaboradores (1991) demonstraram que o fator PDGF-BB induziu a
expressão de integrinas-α5 em fibroblastos de pele. Esses três fatores de
crescimento (TGF-β1, EGF e PDGF-BB) estão presentes no PRP
(CENNI et al., 2010; KASTEN et al., 2008), desta forma, podem estar
relacionados com os resultados de adesão e morfologia observados no
presente trabalho.
Neste trabalho, foi analisado ainda, o efeito do PRP em estimular
a diferenciação das CTMd quando cultivadas em associação à MRD
Integra®. Assim como nos resultados obtidos no cultivo bidimensional,
não foi detectado o marcador endotelial CD31 (Figura 19). Porém, se
encontrou aumento na expressão do marcador de musculo
liso/miofibroblasto,α-SMA (Figura 20), após tratamento com PRP,
corroborando com os resultados bidimensionais, e de acordo com os
resultados de Cáceres e colaboradores (2008).
Os resultados de alterações morfológicas, juntamente com a
expressão elevada de α-SMA, apresentados neste trabalho, sugerem que,
no ambiente tridimensional apresentado pela MRD Integra®, o PRP
estimula a diferenciação das CTMd para fenótipo similar ao muscular
liso ou miofibroblástico. Este resultado é relevante para a regeneração
de tecidos, já que a migração celular e a diferenciação miofibroblástica
são essenciais para a cicatrização de feridas. Estudos relatam que as
72

células miofibroblasticas são responsáveis por mediações celulares

envolvendo a contração da matriz extracelular. Através da contração do
citoesqueleto de actina, os miofibroblastos são capazes de reduzir o
tamanho inicial da ferida e, assim, contribuir para a reparação dos
tecidos. (TOMASEK, et al., 2002). Além disto, os miofibroblastos
também desempenham um papel significativo durante a contração do
tecido na fase granulação da cicatrização (DARBY ; GABBIANI, 1990 ;
ARORA; MCCULLOCH, 1994).
Contudo, na regeneração de grandes lesões de pele, é importante
que o tecido lesado seja reconstituído em curto período de tempo
(SCHURR et al., 2009). Nesse sentido, a MRD Integra® oferece um
fechamento imediato à lesão, evitando que a área afetada fique exposta a
perdas hídricas e a agentes externos, como bactérias, e um análogo à
matriz extracelular, fornecendo um molde para o crescimento
organizado de células no local lesado e orientando fatores do
crescimento na sua apresentação às células (ROBEY; BIANCO, 2004).
Na clínica, após a aplicação do Integra®, a neoformação vascular
necessita de um longo período (de três a seis semanas) após a lesão para
a realização da enxertia autóloga. Entretanto, em alguns casos, pela falta
ou precariedade de vascularização no local da lesão, há necessidade de
uma espera maior para este procedimento, o que atrasa o processo de
cicatrização e pode levar a sequelas graves, como retrações, cicatrizes
hipertróficas e perda de função do tecido (SHERIDAN et al., 2001).
Visando diminuir o tempo de espera do paciente para uma nova
enxertia e evitar possíveis sequelas, a interação apresentada pelos bio-
componetes utilizados no presente trabalho pode representar um avanço
neste tratamento. Uma vez que os componentes moleculares do PRP
podem estimular a diferenciação das CTMd para miofibroblastos, assim
como a sua adesão e migração sobre o Integra®, pode-se sugerir uma
melhor taxa de vascularização e de integração da matriz no local
lesionado. Dessa forma o intervalo de espera da neoderme vascularizada
e o tempo de internação do paciente poderão ser reduzidos.
Fundamentalmente, a tríade: PRP, CTMd e Integra®, constituem
um microambiente efetivo para o crescimento, a viabilidade, a
migração, a adesão e a diferenciação das CTMd, possibilitando que esse
sistema tridimensional seja utilizado em ensaios pré-clínicos com
animais e, se for bem sucedido, poderá representar um potencial
tratamento para aplicações terapêuticas na Engenharia de Tecidos.
 73

6. CONCLUSÕES:

 Em cultivo bidimensional, as CTMd tratadas

com PRP não apresentaram morte por necrose e
demonstraram maior sobrevida em cultura, porém,
houve redução na atividade celular, o que foi coerente
com a diminuição da quantidade de células observadas
nas culturas submetidas à este tratamento.

 Em cultivo bidimensional, o PRP promoveu

maior expressão de α-SMA pelas CTMd, além disso, as
células que expressaram este marcador apresentaram,
em sua maioria, morfologias alongadas e
fibroblastóides, coerentes com caráter migratório e com
a diferenciação celular para fenótipo similar ao
muscular liso ou miofibroblástico. No entanto, não
estimulou a diferenciação destas células para os
fenótipos endotelial e queratinocítico.

 O tratamento com o PRP, em cultivo

bidimensional, promove uma maior deposição de
colágeno tipo I pelas CTMd.

 Em cultivo tridimensional associado à MRD

Integra®, o PRP demonstrou não ser tóxico e nem
alterar a adesão celular das CTMd, mantendo a
viabilidade das mesmas nas primeiras 24h de cultivo.

 Em cultivo tridimensional associado à MRD

Integra®, o PRP promoveu mudanças morfológicas nas
CTMd, que apresentaram células fibroblastóides
alongadas. Além disso, o tratamento promoveu maior
expressão de α-SMA, demonstrando diferenciação em
fenótipo similar ao muscular liso ou miofibroblástico.
Porém, não promoveu a diferenciação endotelial.

 As CTMd tratadas com ambas as diluições de

PRP apresentaram maior aptidão para se aderir e
colonizar a MRD Integra®, demonstrando morfologias
74

similares às de CTMs migratórias, com muitos pontos

de adesão à MRD Integra® e estruturas citoplasmáticas
semelhantes à pseudópodos.

 A associação das CTMd com o PRP e a MRD

Integra® formam in vitro um microambiente efetivo
para o crescimento, a viabilidade, a migração, a adesão
e a diferenciação das CTMd, representando um
potencial tratamento para aplicações terapêuticas na
Engenharia de Tecidos.
 75

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

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84
 85

ANEXOS

ANEXO1 – TCLE1: Coleta de fragmentos de pele, para

isolamento das CTMd

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR,
EMBRIOLOGIA E GENÉTICA

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E

ESCLARECIDO

Título do Projeto: ―Avaliação do efeito do plasma rico em

plaquetas sobre células tronco mesenquimais da derme humana
associadas a matriz de regeneração dérmica‖
Pesquisador Responsável: Profa. Dra. Andréa Gonçalves
Trentin
Pesquisador(es) participante(s): Bibiane Lago de Castro
Telefones para contato: (48) 37216905

Prezado Senhor (a),

Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário
(a), do trabalho de: ―Avaliação do efeito do plasma rico em plaquetas
sobre células tronco mesenquimais da derme humana associadas a
matriz de regeneração dérmica‖, de responsabilidade da pesquisadora
Profa. Dra. Andréa Gonçalves Trentin. A seguir lhe serão apresentados
informações e esclarecimentos a respeito da proposta do trabalho.
Qualquer duvida o (a) Sr (a) poderá esclarecer entrando em contato com
o Laboratório de Célula-tronco e Regeneração Tecidual, da
Universidade Federal de Santa Catarina, pelo telefone (48) 37216905.

INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA

Este estudo tem por objetivo avaliar o uso do PRP sobre as
CTMd humana em ambientes de cultivo bidimensional e tridimensional,
associados à MRD Integra®, visando o uso destes bio-materiais na
Medicina Regenerativa.
86

Para a realização desta pesquisa serão utilizados fragmentos de

pele retirados durante as cirurgias plásticas, que normalmente são
descartados em lixos hospitalares após o procedimento cirúrgico. A
partir destes fragmentos, realizaremos culturas de células tronco da pele
para compreendermos melhor o comportamento destas células. Estudos
como estes são necessários, uma vez que nos proporcionarão
conhecimentos que futuramente poderão ser empregados no
desenvolvimento de terapias, como por exemplo, no tratamento de
pacientes com lesões de pele. Reforçamos que os fragmentos de pele
que venham a ser doados serão utilizados somente em procedimentos
laboratoriais.
Se você estiver de acordo em participar desta pesquisa,
permitindo a utilização do fragmento de pele retirado durante a cirurgia
plástica e que seria descartado, asseguramos o sigilo sobre sua
participação, garantindo sua privacidade. Também garantimos que não
haverá qualquer custo ou riscos para o(a) Sr(a) por participar desta
pesquisa. Caso não queira mais fazer parte da mesma, entre em contato
através dos telefones citados acima.

Como forma de manifestar seu consentimento solicitamos que

o(a) Sr(a) assine esse documento.

Assinatura do pesquisador :
__________________________________

CONSENTIMENTO DE PARTICIPAÇÃO

Eu,___________________________________________,
RG___________________, fui esclarecido (a) sobre a pesquisa
―Avaliação do efeito do plasma rico em plaquetas sobre células tronco
mesenquimais da derme humana associadas a matriz de regeneração
dérmica‖ e concordo em participar do estudo.
Assinatura do paciente ou responsável:
________________________________

Florianópolis, ____ de ______________________ de 2013.

 87

ANEXO2 – TCLE2: Coleta da placenta para isolamento das

CTMPs

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR,
EMBRIOLOGIA E GENÉTICA

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E

ESCLARECIDO

Título do Projeto: ―Avaliação do efeito do plasma rico em

plaquetas sobre células tronco mesenquimais da derme humana
associadas a matriz de regeneração dérmica‖
Pesquisador Responsável: Profa. Dra. Andréa Gonçalves
Trentin
Pesquisador(es) participante(s): Bibiane Lago de Castro
Telefones para contato: (48) 37216905

Prezado Senhor (a),

Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário
(a), do trabalho de: ―Avaliação do efeito do plasma rico em plaquetas
sobre células tronco mesenquimais da derme humana associadas a
matriz de regeneração dérmica‖, de responsabilidade da pesquisadora
Profa. Dra. Andréa Gonçalves Trentin. A seguir lhe serão apresentados
informações e esclarecimentos a respeito da proposta do trabalho.
Qualquer duvida o (a) Sr (a) poderá esclarecer entrando em contato com
o Laboratório de Célula-tronco e Regeneração Tecidual, da
Universidade Federal de Santa Catarina, pelo telefone (48) 37216905.

INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA

Este estudo tem por objetivo avaliar o uso do PRP sobre as CTMd humana em
ambientes de cultivo bidimensional e tridimensional, associados à MRD Integra®, visando o
uso destes bio-materiais na Medicina Regenerativa.
Para a obtenção do PRP, utilizaremos sangue periférico. A coleta de sangue será
realizada no Laboratório de Células Tronco e Regeneração Tecidual-UFSC, por um
profissional treinado e um assistente. O doador estará na posição sentado, com apoio para o
braço. Será utilizada a técnica de assepsia adequada com álcool 70% e para a estase venosa
será utilizado torniquete do tipo cinta com velcro, para melhor conforto. Será coletado 10 ml de
88

sangue por punção venosa na região da fossa anti-cubital, utilizando-se agulha e seringa
descartáveis, as quais serão descartadas de forma segura em caixas próprias para descartes de
perfuro-cortantes infectantes.
As amostras serão levadas para o laboratório para serem processadas. O PRP será
adicionado à uma matriz de regeneração dérmica comercial e a cultura de CTMs, esses
materiais serão utilizados em lesões de pele realizadas em camundongos e o seu efeito será
avaliado com auxilio de técnicas histológicas.
A coleta de sangue não envolve riscos consideráveis se executado de forma correta. A
formação de hematoma é a complicação mais comum da punção venosa, quando ocorre um
extravasamento do sangue para o tecido, durante ou após a punção, sendo visualizado na forma
de uma protuberância de cor arroxeada. A dor é o sintoma de maior desconforto ao paciente, e
eventualmente, pode ocorrer a compressão de algum ramo nervoso. Entretanto, serão tomadas
todas as medidas de segurança para que os riscos e as complicações decorrentes desta atividade
sejam mínimos para os doadores voluntários.
Se você estiver de acordo em participar desta pesquisa, permitindo a coleta de seu
sangue e aceitando responder as perguntas do Questionário de Seleção de Doadores,
asseguramos o sigilo sobre sua participação, garantindo sua privacidade. Também garantimos
que não haverá qualquer custo ou riscos para o (a) Sr (a) por participar desta pesquisa, bem
como não haverá benefícios ou ressarcimentos. Caso não queira mais fazer parte da mesma,
pode entrar em contato através dos telefones citados acima.
Como forma de manifestar seu consentimento solicitamos que o
(a) Sr (a) assine esse documento.
Assinatura do pesquisador:
__________________________________
CONSENTIMENTO DE PARTICIPAÇÃO

Eu,___________________________________________,
RG___________________, fui esclarecido (a) sobre a pesquisa―Ensaio
pré-clínico do uso de células tronco mesenquimais derivadas da derme e
plasma rico em plaquetas associados a uma matriz de regeneração
dérmica‖, e concordo em participar do estudo, como voluntário.

Assinatura do paciente ou responsável:

__________________RG:_______________Florianópolis, ____ de
______________________ de 2013.