TCC

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Ana Paula da Silva Bastiani
Expressão heteróloga de uma proteína quimérica pan-tripanosomatídeos em Leishmania

tarentolae e Trypanosoma rangeli
Florianópolis
2022

Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em Ciências

Biológicas do Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Santa Catarina como requisito
para a obtenção do título de Bacharel em Ciências
Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Edmundo Carlos Grisard
Florianópolis
2022

Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de “Bacharel
em Ciências Biológicas” e aprovado em sua forma final pelo Curso de Graduação em
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina.
Florianópolis, 05 de dezembro de 2022.
________________________
Profª. Drª. Daniella Cristina de Toni
Coordenador do Curso
Banca Examinadora:
________________________
Prof. Dr. Edmundo Carlos Grisard
Orientador
UFSC
________________________
Prof.ª Dr.ª Patricia Hermes Stoco
Avaliadora
UFSC
________________________
Prof. Dr. Rafael Diego da Rosa
Avaliador
UFSC
Este trabalho é dedicado ao meu avô que infelizmente não verá o
fim desse ciclo e a minha avó que me deixou cedo demais.
AGRADECIMENTOS
Agradeço inicialmente ao meu orientador Dr. Edmundo Carlos Grisard por ter me
aceitado no laboratório lá no final de 2019 enquanto eu estava perdida sem saber que área da
biologia seguir. Desde o início me incentivou a ser uma pessoa curiosa e buscar os porquês das
coisas, sempre acreditando no meu potencial e no meu trabalho.
A minha família que, em nenhum momento, me criticou por eu ter escolhido cursar
biologia, que sempre me ajudou a ter um ensino de qualidade e me incentivou a correr atrás dos
meus alvos, não importasse o que eu escolhesse. Aos meus pais por me ajudarem a me manter
durante esse período de graduação para que eu pudesse focar nos meus estudos. Ao meu irmão
que fez e faz de tudo por mim e me ajudou a montar um cantinho de estudos onde eu passei
horas e horas fazendo resumos e estudando para as provas. A minha prima Kauany que sempre
acreditou mais em mim do que eu mesma e sempre teve confiança de que tudo o que eu fizesse
iria dar certo (e deu mesmo!). A minha vó Nilva (em memória) que infelizmente me deixou
cedo demais, mas sempre me apoiou e ajudou nos meus estudos. A minha avó Lena que sempre
me mimou e me ajuda em tudo que precisar e meu vô Fabiano (em memória) que sempre se
interessou em saber como estava indo a faculdade e me apoiou em tudo, mas infelizmente me
deixou antes de me ver concluir essa etapa.
Aos meus professores do IFSC, em especial o Prof. Marcelo de Biologia que, sem
perceber, me ajudou a decidir a área em que eu queria seguir. Aos amigos que o IFSC que me
acompanham desde 2013. Em especial a Julia, Nara, Ricardo e Rodrigo que sempre foram bons
amigos e me proporcionaram muitas risadas e belos momentos que deixaram o dia-a-dia do
IFSC mais leve. Este pequeno parágrafo não faz jus ao quanto vocês foram e são especiais na
minha vida. Também quero agradecer a Ádila, Luana e Millena que conheci durante o ensino
médio e apesar de não nos falarmos muito ultimamente vocês me proporcionaram muito
momentos bons.
A minha amiga Tiffany que sempre esteve disposta a me ouvir falar sobre meus
problemas e ansiedades e que me ajuda a passar por momentos difíceis. Ao meu amigo Matheus
por sempre proporcionar conversas profundas e conversas interessantes sobre ciência. Esses
dois sempre me deram apoio por acreditar em mim e são responsáveis por muitos momentos
felizes que eu vivi. A minha amiga Luana que sempre me proporciona muitas risadas e que me
faz muitas perguntas biológicas. E a Carmem, que é uma segunda mãe para mim por sempre se
preocupar comigo e me dar bons conselhos.
Ao meu namorado Vini que passou a estar presente em um dos momentos mais
conturbados da minha vida e se manteve firme do meu lado nas minhas crises de ansiedade não
me deixando desistir em nenhum momento. Ele sempre me ajudou, até mesmo indo comigo no
laboratório no final de semana me fazer companhia enquanto eu terminava meus experimentos
e em todos os momentos me apoia, tanto nos meus estudo quanto nos meus projetos pessoais.
Ao meu quarteto fantástico que se formou durante esses anos de graduação. Só tenho
a agradecer a Denise, Iasmin e a Laura por todo companheirismo e amizade. Obrigada por
sempre depositarem confiança em mim e por acreditarem no meu potencial, por tornarem as
aulas (principalmente de Zoologia) divertidas, por me ajudarem a ser uma pessoa melhor, por
todas as horas de conversas e risadas que tivemos e por sempre vibrarem com as minhas
conquistas. Com certeza sentirei saudades de encontrar vocês nos corredores do MIP e esse
pequeno texto não é nada comparada a tudo que a gente já viveu na UFSC.
Ao João Victor que conheci no laboratório, mas que me acompanhou em algumas
disciplinas, tornando-as mais leves. Aos meus colegas de turma que sempre fizeram ótimos
questionamentos nas aulas me ajudando a aprender cada vez mais.
Aos meus antigos e atuais colegas de laboratório Caibe, Natália, Viviane, Thais,
Vanessa, Guilherme, Vilmar, Ana Claudia, Marilene, Giovanna, Luisa, Luiza, Maria e Lucy
que tornaram os dias no laboratório mais divertidos. Em especial a Beatriz que por um tempo
fez parte desse projeto comigo, a Carol que tornou a viagem a Caxambu mais divertida e sempre
almoça comigo, a Amábilli que sempre está disposta a me ajudar, almoça comigo e juntas
desabafamos sobre nossos problemas, a Carime que me ajudou e me ensinou muito no início
do meu projeto, a Adriana que forneceu o plasmídeo que utilizei neste projeto. Também a
Laryssa e a Bibiana que foram de extrema importância para a realização e construção deste
projeto, me ajudando em diversos experimentos e tirando muitas dúvidas, com certeza sem elas
eu não teria conseguido fazer metade do que fiz.
Ao Prof. Dr. Ricardo Toshio Fujiwara e a Dra. Luiza Almeida de Figueiredo que
forneceram a proteína quimérica, essencial para a realização deste trabalho.
Aos integrantes banca que aceitaram avaliar e fazer suas contribuições para este
trabalho.
Por fim, a CNPq, CAPES, FINEP, LAMEB e a UFSC pelo apoio financeiro e
estrutural para a realização deste trabalho.
A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez. (SHAW,
George Bernard, 1930)
RESUMO
A doença de Chagas causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e as leishmanioses causadas

por diferentes espécies do gênero Leishmania e acometem em conjunto cerca de 7-8 milhões
de pessoas no mundo. A prevenção e o controle dessas doenças ainda são baseados
primariamente no controle vetorial, sendo que os medicamentos disponíveis apresentam
elevada toxicidade e baixa eficácia. Buscamos desenvolver neste estudo uma estratégia vacinal
baseada no uso de tripanosomatídeos não patogênicos (L. tarentolae e T. rangeli) expressando
uma proteína quimérica formada por genes que codificam epítopos imunogênicos conservados
presentes em diferentes tripanosomatídeos patogênicos. Testes preliminares em camundongos
imunizados com a proteína purificada revelaram uma redução da parasitemia pelo T. cruzi e
uma redução das lesões e cargas parasitárias nos animais infectados com L. amazonensis, L.
mexicana e L. infantum. No presente estudo, transfectamos promastigotas de L. tarentolae e
epimastigotas de T. rangeli com o plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo contendo o gene da
quimera proteica. Ainda durante a seleção dos transfectantes com geneticin (G-418), a presença
do plasmídeo verificada através de PCR e a expressão da proteína quimérica foi avaliada
indiretamente pela detecção da expressão de mNeonGreen. Para L. tarentolae, após sete
semanas de seleção, os parasitos apresentaram motilidade e morfologia alteradas (formas
arredondadas) e um padrão de fluorescência puntiforme, não progredindo em cultura. A
população de T. rangeli transfectada ainda em processo inicial de seleção, apresenta expressão
puntiforme de mNeonGreen 48h após a transfecção. Com as primeiras passagens, observamos
parasitos com morfologia, motilidade e padrões de divisão compatíveis com os parasitos
selvagens, possuindo uma fluorescência em crescente intensidade. Os parasitos-controle
transfectados com o plasmídeo base (FlagGPI_pROCK Neo), além de apresentarem os
parâmetros biológicos semelhantes aos parasitos selvagens, apresentam uma fluorescência
dispersa no citoplasma. Ensaios de Western blot utilizando um antissoro anti-quimera serão
realizados com estas populações visando confirmar a expressão da quimera proteica.
Palavras-chave: Vacina. Tripanosomatídeos. Doenças negligenciadas.

ABSTRACT
Chagas disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and Leishmasiases (the set of
diseases called Leishmaniasis) are caused by different species from the genus Leishmania, both
affecting approximately 7-8 million people in the world. The prevention and control of these
disease are still primarily based in vector control, and available drugs present high toxicity and
low efficacy. In this study, we sought to develop a vaccine strategy based on the use of non-
pathogenic trypanosomatids (L. tarentolae e T. rangeli) expressing a chimeric protein,
produced with genes encoding conserved immunogenic epitopes that are present in different
pathogenic trypanosomatids. Preliminary infection tests in mice previously immunized with the
purified protein revealed a reduction in parasitaemia by T. cruzi and a reduction of lesions and
parasite load in animals infected by L. amazonensis, L. mexicana and L. infantum. In the present
study, we transfected L. tarantolae promastigotes and T. rangeli epimastigotes with the plasmid
FlagGPI_pROCK containing the chimeric protein gene. During the selection of the
transfectants with geneticin (G-418), the plasmid presence was verified through PCR and the
expression of the chimeric protein was evaluated indirectly by detection of mNeonGreen
expression. For L. tarentolae, after seven weeks of selection, the parasites showed altered
motility and morphology (rounded shapes) and a punctate fluorescence pattern, not progressing
in culture. T. rangeli transfectants are still under selection process, initially showing
mNeonGreen punctiform expression 48 hours after transfection. Regarding initial passages, we
observed parasites showing morphology, motility, and division patterns like those displayed by
wild parasites, with fluorescence in increasing intensity. the control parasites transfected with
the base plasmid (FlagGPI_pROCK Neo), in addition to revealing biological parameters similar
to those found in wild parasites, also presented a dispersed fluorescence pattern in the
cytoplasm. Western blot assays using an anti-chimera antiserum will be performed with these
populations in order to confirm the expression of the protein chimera.
Keywords: Vaccine. Trypanosomatids. Neglected diseases.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. ........................................................ 17

Figura 2 - Ciclo de vida da Leishmania sp. ................................................................ 19
Figura 3 - Mapa do plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo utilizado para expressão
proteica em tripanosomatídeos. ................................................................................................ 29
Figura 4 -Verificação da presença e correta orientação do gene da quimera proteica em
colônias de bactérias E. coli Top10 transformadas com plasmídeo Quimera_pGEM®️-T Easy.
.................................................................................................................................................. 35
Figura 5 - PCR de colônia da ligação do gene da quimera no plasmídeo
FlagGPI_pROCK Neo. ............................................................................................................. 36
Figura 6 - PCR com diferentes iniciadores para confirmar a presença do gene da
quimera no plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo. ........................................................................ 36
Figura 7 - Alinhamento da sequência teórica esperada para a construção do plasmídeo
Quimera_FlagGPI_pROCK Neo com o contig gerado através do sequenciamento do plasmídeo
(Contig 1).................................................................................................................................. 38
Quimera_FlagGPI_pROCK Neo com o contig gerado através do sequenciamento do plasmídeo
(Contig 2).................................................................................................................................. 39
Figura 9 – Concentração de inibição em 50% (CI50) de Leishmania tarentolae quando
exposta ao G-418 (Geneticin). .................................................................................................. 40
Figura 10 - Detecção do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em Leishmania
tarentolae transfectadas. ........................................................................................................... 41
Figura 11- Detecção do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em Trypanosoma
rangeli transfectados................................................................................................................. 42
Figura 12 - Comparação da morfologia dos parasitos dos dois ensaios de transfecção
de L. tarentolae com o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo. ...................................... 44
Figura 13 – Observação da expressão de mNeonGreen por formas epimastigotas de
Trypanosoma rangeli transfectados com plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e
FlagGPI_pROCK Neo. ............................................................................................................. 47
Figura 14 – Representação da fluorescência puntiforme em epimastigotas de T. rangeli
.................................................................................................................................................. 48
Figura 15 -Western blot de extrato total de proteínas de Leishmania tarentolae
transfectada com o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e FlagGPI_pROCK Neo,
revelado com anticorpo anti-Flag e com soro policlonal anti-quimera. ................................... 49
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% Porcentagem
µg Micrograma
µl Microlitro
anti-IgG Anti imunoglobulina G
BCG Bacilo de Calmette e Guérin
BHI Do inglês Brain Heart Infusion
BSA Albumina bovina sérica
CI50 Concentração de inibição em 50%
cm Centímetros
DAPI 4',6'-diamino-2-fenil-indol
DNA Ácido desoxiribonucleico
dNTP Desoxirribonucleotídeos tri fosfatados
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
g Grama/força de gravidade
G-418 Geneticin
GPI Glicosilfosfatidilinositol
HCl Ácido Clorídrico
KCl Cloreto de potássio
kDa Kilodalton
l Litro
LB Meio Luria Bertani
LC Leishmaniose cutânea
LIT Do inglês Liver Infusion Tryptose
LMC Leishmaniose mucocutânea
LV Leishmaniose visceral
mg Miligrama
Mg²+ Magnésio
ml Mililitro
mM Milimolar
mNG mNeonGreen
MPLA Monofosforil-lipído A
NaCl Cloreto de Sódio
ng Nanograma
nm Nanômetro
o
C Graus Celsius
p p-valor
pb Pares de base
PBS Tampão fosfato salino
PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial hidrogeniônico
pmol Picomole
SBF Soro bovino fetal
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-PAGE Do inglês Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SUS Sistema Único de Saúde
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
Tween 20 Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
U Unidade
UFSC Universidade Federal de Santa Catarina
V Volts
X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo
α Alfa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 15
1.1 Doença de Chagas.................................................................................................. 15
1.2 Leishmanioses........................................................................................................ 17
1.3 Prevenção, controle e tratamento da doença de chagas e leishmanioses ............... 19
1.4 Vacinas para doença de chagas e leishmanioses ................................................... 21
1.5 OBJETIVOS .......................................................................................................... 25
1.5.1 Objetivo Geral ...................................................................................................... 25
1.5.2 Objetivos Específicos ........................................................................................... 25
2 Metodologia .......................................................................................................... 26
2.1 Parasitos ................................................................................................................. 26
2.2 Construção do vetor de expressão da quimera proteica em tripanosomatideos .... 26
2.3 Sequenciamento do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo ......................... 29
2.3.1 Análises de bioinformática .................................................................................. 30
2.4 Avaliação da sensibilidade de formas promastigotas de Leishmania tarentolae ao

G-418. 30
2.5 Transfecção do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo EM Leishmania

tarentolae e em Trypanosoma rangeli ..................................................................................... 31
2.6 Avaliação da eficácia da transfecção ..................................................................... 31
2.6.1 Extração e PCR dos parasitos transfectados..................................................... 31
2.6.2 Citolocalização da quimera proteica em Trypanosoma rangeli ....................... 32
2.7 Avaliação da expressão da quiméra proteica ......................................................... 32
2.7.1 Ensaios de Western blot ...................................................................................... 32
3 Resultados e discussões ....................................................................................... 34

3.1 Subclonagem da quimera proteica em vetor de expressão para tripanosomatideos
34
3.2 Sequenciamento do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK ................................. 37

3.3 Avaliação da sensibilidade de formas promastigotas de Leishmania tarentolae ao
G-418. 40
3.4 Avaliação da presença do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em

transfectados de Leishmania tarentolae e Trypanosoma rangeli. ............................................ 41
3.5 Avaliação da transfecção do plasmídeos Quimera_FlagGPI_pROCK em

Leishmania tarentolae e em Trypanosoma rangeli .................................................................. 43
3.5.1 Leishmania tarentolae .......................................................................................... 43
3.5.2 Trypanosoma rangeli ............................................................................................ 46
3.6 Avaliação da expressão da quiméra proteica ......................................................... 48
4 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 51
5 Perspectivas .......................................................................................................... 51
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 52
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 DOENÇA DE CHAGAS
A doença de Chagas ou tripanosomíase americana é uma doença causada pelo
protozoário Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909), pertencente à família Trypanosomatidae e
a classe Kinetoplastea. Atualmente estima-se que esta doença acomete cerca 6-7 milhões de
pessoas no mundo, causando todo ano 30.000 novos casos e 12.000 mortes (DNDi, 2022).
Antigamente ela era restrita apenas em áreas rurais da região das Américas, mas a mobilidade
populacional fez com que muitas pessoas infectadas fossem morar em áreas urbanas,
proporcionando um novo ambiente de transmissão. Assim, nos dias de hoje a doença de Chagas
é encontrada em países da América do Norte, Europa e África, mas sua maior incidência é em
21 áreas endêmicas da América Latina, incluindo o Brasil. Acredita-se que aproximadamente
75 milhões de pessoas no mundo correm risco de infecção (WHO, 2022), sendo que, no Brasil,
2.740 casos de infecção foram registrados no período de 2010-2020 (BRASIL, 2022).
Essa doença é caracterizada por possuir uma fase aguda e uma crônica. A fase aguda
se manifesta durante as primeiras semanas ou até dois meses após a infecção, apresentando
elevada parasitemia. A maioria dos casos são assintomáticos e quando apresentam sinais
clínicos, as manifestações são comuns a outras doenças como febre, fadiga, dores no corpo e
entre outros (WHO, 2022). Entretanto, outros sinais podem ser detectados como sinais de
penetração do parasito (chagoma), glândulas/regiões inchadas ou inchaço das pálpebras (sinal
de Romaña) (CDC, 2022). Já a fase crônica pode durar por toda vida da pessoa e na maioria
dos infectados ela se apresenta assintomática. Esta fase é caracterizada pela redução dos
parasitos circulantes na corrente sanguínea, pois eles passam a invadir principalmente células
do cardíacas e do sistema digestivo. Assim, em dez a trinta anos os pacientes portadores da
doença de Chagas podem sofrer complicações cardíacas como, aumento do coração,
insuficiência cardíaca e até parada cardíaca. Além de complicações gastrointestinais, o que
inclui aumento anormal do esôfago (megaesôfago) ou do cólon (megacólon) (CDC, 2022;
DNDi, 2022).
A transmissão da doença de Chagas pode se dar por transmissão congênita, transfusão
de sangue, transplante de órgão, consumo de alimentos contaminados, exposição laboratorial
acidental e principalmente por transmissão vetorial através do inseto triatomíneo ou barbeiro
pertencente à família Reduviidae dos gêneros Triatoma, Rhodnius e Panstrongylus (CDC,
2022). Essa última forma de transmissão caracteriza o ciclo de vida do T. cruzi como
heteroxênico, ou seja, este parasito precisa passar por um hospedeiro invertebrado (barbeiro) e
16
por um hospedeiro vertebrados (mamíferos, incluindo o ser humano) para completar seu ciclo
de vida. Dessa forma, podem ocorrer três ciclos de transmissão sendo eles o ciclo silvestre,
peridoméstico e doméstico. O ciclo silvestre ocorre na natureza onde mamíferos como o tatu,
macaco e veado servem de alimento para os barbeiros. Já o ciclo peridoméstico acontece
quando o ambiente natural é alterado e animais selvagens, como marsupiais e roedores, passam
a visitar as regiões peridomésticas para procurar alimentos, e animais domésticos, com cães e
gatos, passam a visitar ambientes silvestres. Consequentemente, os vetores presentes nas áreas
peridoméstica, podem gradualmente invadir o ambiente domiciliar e assim gerar um ciclo de
transmissão doméstica, no qual o triatomíneo passa a se alimentar do sangue do ser humano
(COURA; DIAS, 2009).
Durante o repasto sanguíneo, em um hospedeiro mamífero infectado, o triatomíneo
ingere formas tripomastigostas que estão no sangue. Alguns desses parasitos podem ser
eliminados no estômago do vetor, os que sobrevivem migram para o intestino se transformam
nas formas epimastigotas (forma somente encontrada no inseto vetor). Essas formas se aderem
a membrana perimicrovilares, secretadas pelas células intestinais do intestino médio posterior,
e se dividem intensamente. Nas partes posteriores do intestino e no reto, os epimastigotas se
desprendem e se transformam em tripomastigotas metacíclicos (forma infectiva para
mamíferos) que são eliminados nas fezes e urina do inseto vetor. Em um novo repasto sanguíneo
em um mamífero, além de se alimentar o barbeiro elimina a forma tripomastigota do T. cruzi
juntamente com suas fezes e urina. No caso dos hospedeiros humanos, as principais vias de
entrada do parasito no corpo são através da lesão da picada ou pela mucosa ocular (SOUZA et
al., 2010).
Assim, uma vez dentro do hospedeiro mamífero, as formas tripomastigotas invadem
células próximas ao local de entrada, como fibroblastos, macrófagos e células epiteliais. A
entrada na célula envolve o recrutamento de lisossomos ou através da invaginação da membrana
plasmática a posterior fusão com o lisossomo (TARDIEUX et al., 1992; ANDRADE;
ANDREWS, 2004) formando o vacúolo parasitóforo. Após um tempo, o parasito lisa a
membrana o vacúolo parasitóforo escapando para o citoplasma celular, onde se diferencia na
forma amastigota possibilitando a replicação do parasito (NOGUEIRA; COHN, 1976;
CARVALHO; SOUZA, 1989). Após isso, a forma amastigota do T. cruzi se diferencia
novamente em tripomastigota que pode romper a célula e ficar livre para infectar novas células,
além disso, podem estar na corrente sanguínea e ao fazer o repasto sanguíneo, o barbeiro pode
se infectar continuando o ciclo (LIMA et al., 2010) (Figura 1).
17
Figura 1 - Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi.
Fonte: adaptado do CDC.
1.2 LEISHMANIOSES
As leishmanioses são causadas por diferentes protozoários do gênero Leishmania que
pertencem a família Trypanosomatidae e a classe Kinetoplastea, assim com o T. cruzi. Essas
doença pode se manifestar de três formas distintas, a leishmaniose visceral (LV), cutânea (LC)
e mucocutânea (LMC). A LV, causada pelas espécies Leishmania (L.) infantum e Leishmania
(L.) donovani, é a forma mais grave podendo levar a morte se não tratada e seus sintomas são
febre, perda de peso e aumento anormal do fígado (hepatomegalia) e do baço (esplenomegalia).
Ocorre de forma endêmica em 76 países, contudo a maior parte dos casos se concentra no Brasil,
África Oriental e na Índia e estima-se que anualmente ocorrem cerca de 50 a 90 mil novos casos
no mundo (WHO, 2022). Na América Latina o Brasil é responsável por 90% dos casos e cerca
de 3.500 pessoas são infectadas anualmente (BRASIL, 2022). A LC causada principalmente
por Leishmania (Viannia) brasiliensis, Leishmania (L.) major, Leishmania (L.) amazonensis e
Leishmania (L.) mexicana, é a manifestação mais comum e menos severa, é caracterizada por
causar lesões na pele iniciando como inchaços ou caroços, podendo resultar em úlceras e
18
geralmente são indolores (CDC, 2022). Ela é endêmica em 87 países, incluindo o Brasil e
acredita-se que todos os anos 600 mil a 1 milhão de pessoas são infectadas no mundo (DNDi,
2022). Segundo o Ministério da Saúde (2022), em 2020 aproximadamente 16 mil pessoas foram
diagnosticadas com LC no Brasil. Por fim, a LMC principalmente associada a L. brasiliensis,
pode se apresentar como uma complicação da LC ocorrendo meses ou anos após a cicatrização
das úlceras cutâneas (DNDi, 2022). Ela leva a destruição das mucosas da boca, garganta e nariz
e 90% dos casos se restringem a Bolívia, Brasil, Etiópia e Peru (WHO, 2022). Dessa forma, a
Organização Mundial da Saúde estima que mais de 1 bilhão de pessoas vivem em áreas
endêmicas e correm o risco de serem infectadas por diferentes espécies de Leishmania sp.
acarretando nas diferentes formas clínicas das leishmanioses.
A principal forma de transmissão das leishmanioses é através da picada de fêmeas de
flebotomíneo infectadas da subfamília Phlebotominae (BATES, 2007). Assim, como o T. cruzi
as espécies do gênero Leishmania possuem o ciclo de vida heteroxênico, no qual infecta um
hospedeiro vertebrado e um invertebrado para completar seu ciclo.
Ao se alimentarem de um mamífero infectado, as fêmeas de flebotomíneo ingerem
além de sangue, células do sistema fagocitário mononuclear (macrófagos) infectados com
formas amastigotas. Dentro do vetor, o parasito fica envolvido por uma matriz peritrófica
secretada pelo intestino e se transforma em promastigotas procíclicas (forma flagelada com
pouca motilidade), e se replica intensamente durante alguns dias. Depois, migram e se
estabelecem no intestino anterior e médio e retomam sua replicação até que por fim atingem a
válvula estomodeal do flebotomíneo. Neste local, as formas promastigotas procíclicas se
transformam em promastigotas metacíclicas (forma infectiva). Assim, em um novo repasto
sanguíneos as fêmeas de flebotomíneo regurgitam essas formas na lesão formada durante a sua
alimentação, infectando um novo mamífero (BATES, 2007).
Dentro do hospedeiro vertebrado, as formas promastigotas induzem o recrutamento de
neutrófilos nas primeiras horas (MÜLLER et al., 2001; PETERS et al., 2008) e de células do
sistema fagocitário mononuclear, principalmente macrófagos. Essas células fagocitam os
parasitos e esse processo é mediado por receptores presentes na membrana plasmática dos
macrófagos. Neste processo, a Leishmania sp. é internalizada, sendo mantida dentro do vacúolo
parasitóforo onde se transforma em amastigota e se replica (SOLBACH; LASKAY, 1999).
Após se multiplicarem intensamente na forma amastigota provocam apoptose, morte celular e
lise da célula (LÜDER et al., 2001), liberando amastigotas para o meio extracelular que irão
infectar novos macrófagos dando continuidade à infecção (Figura 2).
19
Figura 2 - Ciclo de vida da Leishmania sp.
Fonte: adaptado do CDC.
1.3 PREVENÇÃO, CONTROLE E TRATAMENTO DA DOENÇA DE CHAGAS E

LEISHMANIOSES
A prevenção e o controle da doença de Chagas são baseados principalmente no
controle vetorial através da pulverização de inseticidas de forma regular e contínua em
residências infestadas com barbeiros. Na América Latina esse método foi o mais empregado,
mostrando que essa forma de prevenção ajuda a reduzir o ciclo de transmissão doméstico e
peridoméstico da doença (MONCAYO, 2003; WHO, 2022). O uso de mosquiteiros e a melhoria
das habitações também são boas maneiras de reduzir a presença do vetor dentro das residências.
A triagem através de diagnóstico sorológico de bancos de sangue e de órgãos destinados a
transplantes ajudam a reduzir infecções por transfusão sanguínea e transplante de órgãos
(PAHO, 2022). Outra forma de controle da doença é o tratamento antiparasitário com fármacos
que visa eliminar a infecção por T. cruzi. Os medicamentos que possuem eficácia comprovada
e são utilizados atualmente é o benznidazol, tratamento de primeira linha e o Nifurtimox, o qual
não é utilizado no Brasil. Ambos os medicamentos podem causas efeitos adversos variando de
20
dermatite grave, dermatite associada a febre e linfadenopatia para o benznidazol e efeitos

gastrointestinais e efeitos tóxicos neurológicos para o Nifurtimox (JACKSON et al., 2010;
PINAZO et al., 2010; TORNHEIM et al., 2013), por isso não é indicado para mulheres
grávidas.
Em relação a cura parasitológica, esses medicamentos podem chegar a 100% de
eficácia ao serem administrados logo após a infecção ou transmissão congênita. Essa eficiência
aumenta em crianças e reduz com o tempo de infecção e a idade (ANDRADE et al., 1996;
PAHO, 2022). Em relação ao tratamento na fase crônica há estudos que relatam a prevenção ou
o retardo do desenvolvimento de alterações clínico-patológicas, porém o tratamento não pode
passar de dois meses devido à alta chance de efeitos adversos (ESTANI et al., 1998; VIOTTI et
al., 2006; FABBRO et al., 2007; WHO, 2022).
Entretanto, apesar do controle vetorial ser eficiente, ele necessita ser repetido
constantemente o que requer financiamento, equipamentos e pessoas para realizar esse serviço
o que não é possível para muitas regiões pobres. Além do mais a existência de um grande
número de espécies que são vetores da doença impossibilita a completa interrupção do ciclo de
transmissão (TARLETON et al., 2007). Juntamente com a existência de reservatórios animais,
falta de medicamentos adequados, pessoas assintomáticas e falta de tratamento eficaz para
pessoas na fase crônica a completa eliminação do T. cruzi se torna impossível (TARLETON;
CURRAN, 2012; ESCH; PETERSEN, 2013).
Para realizar a prevenção e o controle de transmissão das leishmanioses se realiza um
controle de vetores como também de reservatórios animais (principalmente para leishmaniose
visceral). Assim como para doença de Chagas, a pulverização de inseticidas e o uso de
mosquiteiros tratados com inseticidas ajudam a reduzir ou até mesmo eliminar a transmissão
da doença no ambiente domiciliar (WHO, 2022). Evitar ficar ao ar livre no período de
alimentação do vetor (anoitecer e amanhecer), como também utilizar repelentes e minimizar a
quantidade de pele exposta através do uso de blusas de manga comprida e calça ajudam evitar
o contato com o flebotomíneo (CDC, 2022). Para o controle dos reservatórios animais cada país
ou região adota uma medida distinta. No Brasil, o principal reservatório animal da doença é o
cão doméstico, assim o país adotou políticas públicas voltadas para a eutanásia de cães
soropositivos. Entretanto, por mais que o abate de cães inicialmente pareça reduzir a
prevalência de cães infectados por Leishmania sp., não há nenhum estudo que mostre a
eficiência desta medida de prevenção no Brasil (DIETZE et al., 1997; COURTENAY et al.,
2002). Além disso, a incidência de cães assintomáticos, a demora para realizar os testes e
21
remoção de cães infectados e a rápida reposição de animais pelos tutores proporcionam a

continuidade do ciclo de transmissão. Além disso, o apego emocional dos tutores com seus cães
também contribui para a baixa adesão à esta forma de controle, assim uso coleiras repelentes e
vacinação de cães torna-se uma alternativa mais viável (ESCH et al., 2012 ESCH; PETERSEN,
2013).
O tratamento das leishmanioses depende da espécie do parasito e da condição do
paciente (gravidez, imunossupressão), mas de forma geral ela se dá pelo uso de antimoniato de
N-metil glucamina como fármaco de primeira linha, e anfotericina B nas formulações
lipossomal ou desoxicolato de anfotericina B como medicamentos de segunda linha,
especialmente quando há resistência ao de primeira linha e em pacientes imunodeprimidos. Em
2020 foi incorporado ao Sistema Único de Saúde (SUS) a miltefosina para tratamento de
leishmaniose tegumentar, contudo devido a falta de dados científicos esse medicamento não é
amplamente utilizado (BRASIL, 2021; WHO, 2022). Esses fármacos possuem um perfil de
toxicidade, causando muitos efeitos adversos como náuseas, dores abdominais além de
causarem problemas renais, cardíacos e hepáticos (MONZOTE, 2009; BRASIL, 2021). Além
disso, nenhum desses medicamentos podem proporcionar a cura estéril, pois Leishmania spp.
parece permanecer viável no hospedeiro e podem reacender os sintomas quando ocorre
imunossupressão (WHO, 2022). Outro aspecto, é o aumento de cepas resistentes aos
medicamentos, podendo ser ocasionado pela falha terapêutica, abandono do tratamento devido
aos efeitos adversos ou não adesão ao tratamento, pois a maioria dos fármacos são
administrados por via intravenosa necessitando de um profissional da saúde experiente
(SUNDAR et al., 1994; SUNDAR et al., 2000; WHO, 2022).
Considerando que a doença de Chagas e as leishmanioses são doenças tropicais
negligenciadas com um elevado impacto socioeconômico e que suas formas de prevenção,
controle e tratamento não são eficientes para interromper o ciclo de transmissão, o
desenvolvimento de vacinas se torna uma alternativa de interesse. O uso de medidas preventivas
como a vacinação podem reduzir custos com tratamentos por prevenir enfermidades, além de
reduzir a severidade e morbidade associadas as estas doenças (LEE et al., 2010; LEE et al.,
2012).
1.4 VACINAS PARA DOENÇA DE CHAGAS E LEISHMANIOSES

O surgimento das vacinas foi um ponto chave para a história da ciência e da saúde
humana e animal. Desde que a primeira vacina foi criada, proporcionou uma redução drástica
22
na mortalidade e morbidade, aumento do tempo de vida e diminuiu custos com tratamentos

(PLOTKIN et al., 2012). Isso pode ser constatado quando observamos os impactos positivos
causados pelo surgimento de vacinas contra vírus e bactérias como a BCG, febre amarela,
hepatite B, poliomielite e entre outras. A proteção mediada pelas vacinas envolve o sistema
imune adaptativo, principalmente a imunidade do tipo humoral de longa duração, que estimula
a produção de anticorpos, sendo este um aspecto importante. Isso porque, quando o corpo entra
em contato com o patógeno os anticorpo protetores, produzidos devido a vacina, servirão como
primeira linha de defesa (THAKUR et al., 2012).
Contudo, ainda carecemos de vacinas para muitas doenças importantes,
principalmente para parasitas. Existem poucas vacinas antiparasitárias e em sua maioria são
direcionadas a animais (DALTON; MULCAHY, 2001). Entretanto, há muitas doenças
negligenciadas que até os dias de hoje afetam pessoas e animais no mundo inteiro e que não
possuem uma forma eficaz e segura de prevenção e tratamento, como a doença de Chagas e as
leishmanioses. Nesse contexto, o desenvolvimento de uma vacina, mesmo com eficácia
protetora moderada, é fundamental para controlar a transmissão dessas doenças (LEE et al.,
2010; LEE et al., 2012).
Atualmente não há uma vacina disponível para doença de Chagas, mas muitas
pesquisas vêm sendo feitas para desenvolver uma estratégia vacinal eficiente para esta doença.
Diversas metodologias vêm sendo empregadas como imunização com parasitos vivos, mortos,
atenuados ou frações celulares (MILLER et al., 1996; BASSO et al., 2008; BRANDAN et al.,
2011). Outras formulações com proteínas purificadas, recombinantes e até mesmo de DNA vem
sendo exploradas (SNARY, 1983; PEREIRA et al., 2003; DUMONTEIL et al., 2022). Além
disso, há estudos que visam desenvolver uma vacina terapêutica, afim de utilizá-la em pacientes
na fase crônica da doença sendo ou não combinada com fármacos disponíveis (SANCHEZ-
BURGOS et al., 2007; ZAPATAESTRELLA et al., 2006).
Em relação as leishmanioses, o primeiro relato de vacinação foi o método conhecido
como leishmanização que consistia na inoculação de formas virulentas de Leishmania sp. em
pessoas saudáveis buscando conferir proteção contra a leishmaniose cutânea, reduzindo as
chances de desenvolvimento de lesões na face, tendo sido muito utilizado em locais endêmicos
da doença (NOAZIN et al., 2008; SINGH; SUNDAR, 2012). Entretanto, esse método foi
descontinuado devido à falta de padronização, controle das doses, identidade das cepas e perda
de virulência das cepas. Além disso, alguns indivíduos apresentavam lesões persistentes,
incorrendo em grande risco de disseminar leishmaniose em imunocomprometidos
23
(GILLESPIE et al., 2016). Posteriormente, se desenvolveu formulações utilizando parasitos

inteiros e mortos, sendo ou não combinadas com a vacina BCG (MAYRINK et al., 1985;
ANTUNES et al., 1986; ARMIJOS et al., 1998; SHARIFI et al., 1998). Contudo, nenhuma das
abordagens utilizando parasitos mortos mostrou reprodutibilidade da eficácia protetora além de
não produzirem uma resposta imune relevante e duradoura (NOAZIN et al., 2008).
Com o avanço da tecnologia, novas formulações começaram a ser exploradas e
estratégias utilizando proteínas recombinantes, DNA, formulações lisossômicas e entre outras,
foram criadas (MAZUMDAR et al., 2004; AGUILAR-BE et al., 2005; FERNANDES et al.,
2008). Outra estratégia que vem sendo utilizada é formulações com proteínas quiméricas, pela
junção de diferentes proteínas e epítopos imunogênicos (LAGE et al., 2020; OSTOLIN et al.,
2021). Para isso, diversos modelos animais são utilizados a fim de testar a eficácia vacinal,
sendo o cão um modelo útil, uma vez que a vacinação bem-sucedida em cães pode controlar a
transmissão da doença para humanos em áreas endêmicas (TESH, 1995). Com isso em mente,
muitas formulações foram testadas e sua eficácia foi avaliada para serem utilizadas como
vacinas caninas. Atualmente no Brasil, apenas a vacina recombinante Leish-Tec® foi
regulamentada para uso em cães sob a licença Nº 9.270/2007 e apresenta uma eficácia vacinal
de 71,4% (REGINA-SILVA et al., 2016).
Considerando que os gêneros Trypanosoma e Leishmania compartilham em média 80-
93% dos seus genes, uma nova abordagem vacinal passa a ser explorada levando em
consideração o alto nível de conservação genética entre esses tripanosomatídeos (KISSINGER,
2006; DUMONTEIL, 2009). Uma estratégia que teve a participação de nosso grupo, buscou a
construção de uma vacina multicompetente para proteção contra infecção por Trypanosoma
cruzi e diferentes espécies de Leishmania. Essa construção se baseou em genômica comparativa
e levou ao desenvolvimento de uma proteína quimérica formada pela fusão de epítopos
antigênicos conservados entre L. braziliensis, L. donovani, L. infantum, L. major, L. mexicana
e T. cruzi (Cepas CL Brener e Sylvio) (FIGUEIREDO, 2019).
A proteína quimérica purificada a partir de expressão heteróloga em Escherichia coli
foi utilizada em ensaios de imunização de camundongos Balb/C, associada ou não à
monofosforil-lipído A (MPLA) como adjuvante. Nos ensaios de desafio dos animais
imunizados frente à infecção experimental por T. cruzi; por L. mexicana (como modelo de
leishmaniose cutânea) e por L. infantum (como modelo de leishmaniose visceral), os animais
desafiados com formas sanguíneas de T. cruzi revelaram uma redução de 68% da parasitemia.
Além disso, detectaram uma cicatrização mais rápida e a redução e 60% das lesões cutâneas
24
determinadas por L. mexicana e uma proteção significativa com redução na carga parasitária
(73%) das lesões hepáticas nos animais desafiados com L. infantum em relação aos grupos
controle (FIGUEIREDO et al., 2019).
Considerando esses resultados preliminares do seu uso como imunizante, buscamos
adaptar a expressão dessa proteína quimérica em tripanosomatídeos não patogênicos
(Leishmania tarentolae e Trypanosoma rangeli) utilizando vetores plasmidiais que permitam a
apresentação da mesma na membrana celular dos parasitos.
A L. tarentolae pertence ao subgênero Sauroleishmania e é um protozoário parasita
de lagarto que não é infectivo para mamíferos, mas que possui uma maquinaria eucariótica de
expressão proteica similar aos organismos patogênicos para os quais se deseja elicitar uma
resposta imune protetora, possuindo ainda a vantagem de crescer rapidamente in vitro e
produzir grandes quantidades de proteínas recombinantes (KLATT et al., 2019), fato pelo qual
já sendo utilizada em estudos biotecnológicos como organismo vacinal com bons resultados
(ABDOSSAMADI et al., 2017; BRETON et al., 2005). O T. rangeli é um parasito
filogeneticamente próximo do T. cruzi, sendo transmitido pelos mesmos vetores e igualmente
infectivo para o ser humano, porém, não sendo patogênico para seus hospedeiros mamíferos.
Apesar disso, a infecção pelo T. rangeli induz uma resposta imune humoral com elevados níveis
de anticorpos que incorrem em uma reatividade cruzada com o T. cruzi em exames sorológicos
convencionais face ao compartilhamento de cerca de 60% de suas constituições antigênicas
solúveis (GRISARD et al., 1999; STOCO et al., 2014). Ainda que alguns pesquisadores relatem
a indução de proteção contra a infecção pelo T. cruzi em animais previamente infectados pelo
T. rangeli, este parece ser um fenômeno cepa-dependente, apontando somente uma redução não
significativa da parasitemia pelo T. cruzi nos animais desafiados, carecendo de detalhamento
acerca da caracterização dos parasitos utilizados e dos mecanismos pelos quais esta redução da
carga parasitária ocorre (INTROINI et al., 1998; BASSO et al., 2008).
Dessa forma, considerando a relevância médico-social da doença de Chagas e das
leishmanioses e de sua natureza como doenças tropicais negligenciadas, o que limita o
desenvolvimento de novas formas de controle, buscamos expressar a proteína quimérica em
organismos não patogênicos como uma nova estratégia para elicitação de resposta imune contra
os agentes etiológicos destas doenças.
Considerando que a proteína quimérica expressa de forma heteróloga em E. coli gerou
resultados promissores quanto ao curso destas doenças em modelos animais, nossa hipótese é
que realizando a expressão da mesma em organismos filogeneticamente próximos aos agentes
25
etiológicos das leishmanioses e doença de Chagas, permita a apresentação dos epítopos da

quimera por tripanosomatídeos, levando a indução de uma resposta imune humoral mais efetiva
e duradoura. Neste estudo, portanto, tratamos de realizar o desenvolvimento de uma ferramenta
que permita esta apresentação de antígenos por tripanosomatídeos não patogênicos.
1.5 OBJETIVOS
1.5.1 Objetivo Geral
Expressar uma proteína quimérica pan-tripanosomatídeos em Leishmania tarentolae e
em Trypanosoma rangeli como estratégia vacinal para Doença de Chagas e Leishmanioses.
1.5.2 Objetivos Específicos

• Subclonar o gene da quimera proteica em um vetor plasmidial adaptado para expressão
heteróloga em tripanosomatídeo;
• Expressar, de forma heteróloga, o gene da quimera proteica em Leishmania tarentolae;
• Expressar, de forma heteróloga, o gene da quimera proteica em Trypanosoma rangeli;
• Avaliar a expressão da quimera proteica nos organismos transfectados.
26
2 METODOLOGIA
2.1 PARASITOS
O cultivo da forma promastigota de Leishmania tarentolae da cepa P10 foi realizada
em meio BHI (Brain Heart Infusion) suplementado com hemina a 25 mg/ml, 50 U/ml de
penicilina e 50 μg/ml de estreptomicina (Cultilab) a 26,5 °C. O cultivo de formas epimastigotas
de Trypanosoma rangeli foi realizado em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) suplementado
com 50 U/ml de penicilina e 50 μg/ml de estreptomicina (Cultilab) e 10% de soro bovino fetal
(Sigma-Aldrich) a 26,5 °C. Estas cepas foram mantidas através de passagens semanais em seus
respectivos meios e encontram-se criopreservadas no Laboratório de Protozoologia
(MIP/CCB/UFSC).
2.2 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DA QUIMERA PROTEICA EM

TRIPANOSOMATÍDEOS
O desenvolvimento da proteína quimérica foi realizado pelo Laboratório de
Imunologia e Genômica de Parasitos da UFMG (FIGUEIREDO et al., 2019). O gene da
proteína quimérica é formado pela fusão de sequências de DNA conservadas que codificam
para epítopos com elevado potencial imunogênico, definidas por análises de bioinformática de
alta estringência utilizando como base os genomas de L. braziliensis, L. donovani, L. infantum,
L. major, L. mexicana e T. cruzi (Cepas CL Brener e Sylvio), considerando também os padrões
de expressão proteica. A estrutura quimérica final possui 1.707 pares de base (pb) representando
66 epítopos distintos e foi sintetizada pela empresa GenScript, tendo inicialmente sido clonada
em vetor pUC57. Salienta-se que o processo de desenvolvimento e uso desta quimera para fins
diagnósticos foi registrado no INPI (Processo BR 10 2018 002228 8), sendo a UFSC
participante deste registro através do nosso grupo de pesquisa.
O vetor pUC57 contendo a sequência codificante para a quimera proteica foi utilizado
na transformação de bactérias E. coli DH5α por choque térmico, seguindo o protocolo padrão
do laboratório. Após a transformação as bactérias foram crescidas em meio SOC (2 g/L triptona,
0,5 g/L extrato de levedura, 1 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 2 mM Mg²+, 2 mM Glicose) e mantidas
a 37 oC por 1 hora, sob agitação a 120 rpm (Shaker MaxQ 4000, Thermo Scientific). Depois da
incubação, a suspensão celular foi plaqueada em meio LB (10 g/L triptona, 5 g/L extrato de
levedura, 0,17 mM NaCl) com ampicilina (100 µg/ml) e mantida por 12 horas a 37 oC. Algumas
colônias foram selecionadas, repicadas e crescidas em meio LB suplementado ampicilina (100
µg/ml) por 16 horas, a 37 oC sob agitação. Em seguida, foi realizado a extração do DNA
27
plasmidial por protocolo padrão de lise alcalina (SAMBROOK; RUSSEL, 2001), sendo o
material obtido dosado por espectrometria a 260 a 280 nm em equipamento Picodrop P100 e
estocado a -20 oC.
Para a subclonagem do gene codificante para a quimera em vetor de expressão
adaptado a tripanosomatídeos, foram desenhados iniciadores específicos quimera senso (5’
GGT ACC TTA CAG AAT CTG CAC GGT GCT 3’) e quimera antissenso (5’ AAG CTT
ATG GCC CTG CTG GAA CTG C 3’), os quais foram acrescidos de sítios de restrição para as
enzimas KpnⅠ e HindⅠⅠⅠ nas suas extremidades 5' (sublinhado/negrito), respectivamente. A
amplificação do gene codificante para a quimera foi realizada via PCR utilizando 1 U da enzima
Taq DNA polimerase no tampão do fabricante (Invitrogen), 2 mM de dNTP (Invitrogen), 10
pmol de cada iniciador e 50 ng de DNA molde. O perfil térmico de amplificação consistiu em
uma etapa de desnaturação a 95 ºC por 2 minutos, seguida por 35 ciclos contendo uma etapa de
desnaturação (95 ºC por 1 minuto), uma etapa de ligação dos iniciadores (62 °C por 30
segundos) e uma etapa de elongação do DNA pela polimerase (72 ºC por 2 minutos). Por fim,
uma etapa da reação à 72 °C por 10 minutos foi adicionada para elongação das cadeias. Os
produtos de amplificação foram visualizados através de resolução por eletroforese em gel de
agarose 1% corado pelo brometo de etídio (10 mg/ml), sendo os resultados registrados
digitalmente. Na sequência, realizou-se a purificação do fragmento de 1789 pb da amplificação
excisando-o do gel e utilizando o kit GFX PCR DNA and gel band purification (GE Healthcare),
segundo as especificações do fabricante.
O fragmento da quimera foi inicialmente subclonado no vetor pGEM®️-T Easy
(Promega), seguindo-se as recomendações do fabricante. Após a transformação em bactérias E.
coli Top 10, conforme descrito anteriormente, a suspensão celular foi plaqueada em meio LB
(10 g/L triptona, 5 g/L extrato de levedura, 0,17 mM NaCl contendo X-gal (20 µg/ml), IPTG
(40 µg/ml) e ampicilina (100 µg/ml)) e mantida por 12 h a 37 oC. A ligação do inserto no vetor
foi verificada primariamente pela coloração branca das colônias, as quais foram selecionadas
para confirmação através de PCR utilizando-se iniciadores dirigidos as sequências do vetor que
flanqueiam o sítio de clonagem e também iniciadores dirigidos para o gene da quimera,
descritos acima. Os iniciadores dirigidos ao plasmídeo pGEM®️-T Easy foram o M13 senso (5’
CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’) e o M13 antissenso (5’ TAC CAC AGG AAA
CAG CTA TGA C 3’). Em seguida, os fragmentos amplificados foram resolvidos através de
eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, conforme descrito acima.
28
Após a confirmação, as colônias contendo o inserto desejado foram repicadas e

crescidas a 37 oC em meio LB com ampicilina (100 µg/ml) por 16 horas sob agitação, sendo os
plasmídeos extraídos pelo protocolo padrão de lise alcalina (SAMBROOK; RUSSEL, 2001),
dosados por espectrofotometria a 260 e 280 nm em equipamento Picodrop P100 e estocados a
-20 oC.
Por fim, subclonamos o gene da quimera em um plasmídeo de expressão adaptado para
tripanosomatídeos, desenvolvido por nosso grupo. O plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo
(SILVA, 2021) foi desenvolvido com base na subclonagem da sequência sintética de
3xFlagTag® (DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK) (Sigma-Aldrich), mNeonGreen e
âncora GPI de T. rangeli em um vetor pROCK-Neo em substituição ao gene da eGPF do vetor
de expressão e sua estrutura está demonstrada na figura 3.
Para tanto, o plasmídeo pGEM®️-T Easy contendo o gene da quimera e o plasmídeo
FlagGPI_pROCK Neo foram digeridos com as enzimas KpnI (Invitrogen) a 37 ºC por 3 horas
e HindIII (Promega) a 37 ºC por 5 horas. O fragmento correspondente ao gene da proteína
quimérica foi purificado do gel utilizando-se o kit GFX PCR DNA and gel band purification
(GE Healthcare), segundo as especificações do fabricante. A ligação do fragmento purificado
no vetor foi realizada na presença da enzima T4 DNA ligase (Promega) em tampão fornecido
pelo fabricante e os produtos da ligação foram utilizados para transformação de bactérias E.
coli Top 10, que foram inicialmente crescidas em meio SOC (2 g/L triptona, 0,5 g/L extrato de
levedura, 1 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 2 mM Mg²+, 2 mM Glicose) e mantidas a 37 oC por 1
hora, sob agitação a 120 X g (Shaker MaxQ 4000, Thermo Scientific). Depois, a suspensão
celular foi plaqueada em meio LB (10 g/L triptona, 5 g/L extrato de levedura, 0,17 mM NaCl)
com ampicilina (100 µg/ml) e mantida por 12 horas a 37 oC.
Algumas colônias foram selecionadas para verificar a correta inserção do gene
codificante para a quimera no plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo, através de PCR utilizando-se
uma combinação iniciadores dirigidos ao vetor e a sequência da quimera. Os iniciadores
direcionados ao vetor foram o HX1 senso (5’ GGC GGT TAA CGA GTT TCT TC 3’) e mNG
antissenso (5’ TAT CCT CCT CGC CCT TGC TC 3’) e os mesmo iniciadores quimera senso
e antissenso dirigidos a quimera descritos acima. Em seguida, os fragmentos amplificados
foram resolvidos através de eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio,
indicando a presença dos insertos. Os clones selecionados contendo o plasmídeo
Quimera_FlagGPIpROCK Neo foram crescidos em meio LB (Luria-Bertani) suplementado
com 100 µg/ml de ampicilina, por 16 horas a 37 oC, sendo as bactérias submetidas a lise alcalina
29
para extração dos plasmídeos. Por fim, foram dosados por espectrofotometria a 260 e 280 nm
em equipamento Picodrop P100 e estocados a -20 oC.
Figura 3 - Mapa do plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo utilizado para expressão proteica em
tripanosomatídeos.
Fonte: Silva, 2021

* Mapa do vetor Flag GPI pROCK. Em lilás são regiões de ligação dos iniciadores desenhados para o plasmídeo,
em negrito os sítios únicos de clivagem e entre parênteses as distâncias em pares de base em relação ao início da
sequência β-tubulina. Em vermelho está a sequência 3xFlagTag, em verde o gene mNeonGreen seguido pelo gene
da âncora GPI em azul.
2.3 SEQUENCIAMENTO DO PLASMÍDEO Quimera_FlagGPI_pROCK Neo

Os plasmídeos Quimera_FlagGPIpROCK Neo gerados conforme descrito no item 2.2
foram sequenciadas pela empresa ACTGene Análises Moleculares (Alvorada, RS) para
confirmação da correta inserção do fragmento e a manutenção da correta fase de leitura. Para
isso, utilizaram-se no sequenciamento pelo método de Sanguer os iniciadores específicos
direcionados ao inserto (quimera) e a sequência do vetor (FlagGPI_pROCK Neo) (item 2.2) e
150 ng de DNA plasmidial conforme o protocolo da empresa.
30
2.3.1 Análises de bioinformática

Os cromatogramas gerados a partir do sequenciamento foram inicialmente submetidos
ao programa Pred-Phrap-Consed (EWING; GREEN, 1998; EWING et al., 1998) para estimar
qualidade das bases sequenciadas, tendo sido utilizado um cut-off de phred ≥30 para, realizar a
limpeza dos cromatogramas, removendo bases de baixa qualidade, determinar as bases
sequenciadas (basecalling), obter sequências contíguas (contigs) quando houvesse
complementariedade dentre os fragmentos gerados e gerar uma sequência consenso.
As sequências consenso obtidas foram alinhadas através do software Clustal Omega
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) com a sequência montada da
Quimera_FlagGPI_pROCK.
2.4 AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania

tarentolae AO G-418.
Promastigotas de Leishmania tarentolae da cepa P10 obtidos no terceiro dia de cultivo
foram distribuídos em uma placa de 96 poços na concentração de 0,72x106 parasitos por poço
em 180 µl de meio BHI suplementado com hemina a 25 mg/ml. Em seguida, os parasitos foram
tratados com 300 µg/ml, 100 µg/ml, 33,3 µg/ml, 11,1 µg/ml, 3,70 µg/ml, 1,24 µg/ml, 0,41
µg/ml de Geneticin – G418 (Santa Cruz). Utilizamos 7,4 µg/ml de anfotericina B (Sigma-
Aldrich) como controle positivo como controle negativo os parasitos somente em meio de
cultura. A placa foi incubada por 67 horas em estufa a 26 ºC e então, adicionado Resazurina
(Sigma-Aldrich) a 250 µg/ml em todos os poços e mantida por mais 5 horas em estufa a 37 ºC.
A fluorescência foi lida em um comprimento de onda de 530 nm de excitação e 590 nm de
emissão de filtro em espectrofotômetro Tecan® Modelo Infinite M200 (TADELE et al., 2021).
Os ensaios foram realizados em triplicatas técnicas e repetidos três vezes.
Os valores da concentração de inibição, do crescimento parasitário in vitro, em 50%
(CI50) foram estimados a partir dos valores médios obtidos na triplicata do percentual de
inibição utilizando-se a seguinte equação:
Percentual de inibição: 100 – (DOamostra/DOcontrole negativo) * 100
Os valores brutos obtidos foram armazenados em planilha no EXCEL®, onde passaram

por um tratamento para realizar análises no software GraphPad Prism (v. 8.0).
31
Esses valores foram determinados pela regressão não linear da curva a dose resposta
com transformação de x para log (x) e log (inhibitor) vs normalized response – variable slope.
As médias das CI50 foram submetidas a análises estatísticas. Para a avaliar a normalidade dos
dados utilizou o teste de Shapiro-Wilk e para a identificação de outliers os dados foram
submetidos ao teste de outliers de ROUT. Para análise paramétrica foi usado análise de
variância simples (one-way ANOVA) com teste múltiplo de Tukey’s com valores de p<0,05
considerados significativos.
2.5 TRANSFECÇÃO DO PLASMÍDEO Quimera_FlagGPI_pROCK Neo EM Leishmania

tarentolae E EM Trypanosoma rangeli
Para a transfecção utilizamos 5x107 parasitos, os quais foram primeiramente lavados
duas vezes em tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4 por centrifugação 2.000 X g por 10 minutos
a 22 ºC, sendo então adicionados de 200 µl de tampão de eletroporação e 10 µg de DNA
plasmidial. A cada transfecção foi realizada em cubetas de 0,2 cm de abertura (Bio-Rad), em
pulso único, sendo utilizado o programa U-033 no equipamento Nucleofector (Lonza). Em
seguida, os parasitos foram transferidos para tubos contendo meio de cultura específico a cada
espécie conforme descrito no item 2.1, cultivados por 24 horas e então acrescentados 37 µg/ml
e 20 µg/ml G-418 para a seleção de população transfectante de L. tarentolae e T. rangeli
conforme protocolos do laboratório, respectivamente. Os parasitos foram mantidos em fase
exponencial de crescimento a 27 °C através de repiques semanais em meio específico
suplementado com G-418. Os fenótipos dos parasitos transfectados foram comparados as cepas
selvagens, observando-se o crescimento, a ocorrência de divisão celular, a motilidade, a
morfologia e a expressão de mNeonGreen dos mesmos.
2.6 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA TRANSFECÇÃO

2.6.1 Extração e PCR dos parasitos transfectados
Após um período de pelo menos 21 dias de cultivo in vitro na presença de droga
seletiva (G-418), a comprovação da presença do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo
nas cepas de transfectados foi realizado através de PCR.
Para tanto, as formas promastigotas se L. tarentolae e epimastigotas de T. rangeli
foram coletadas e lavadas duas vezes em PBS pH 7,4 por centrifugação 2.000 X g por 10
minutos a 22 ºC. Após a adição de 500 µl de tampão de lise (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 10 mM
32
NaCl; 25 mM EDTA pH 8,0; 1% Dodecil Sulfato de Sódio - SDS) suplementados com 2,5 µl
de proteinase K a 20 mg/ml (Sigma-Aldrich), os lisados foram incubados a 42 ºC por 12 horas.
A extração dos ácidos nucleicos foi realizada utilizando-se o método padrão de
fenol/clorofórmio (GREEN; SAMBROOK, 2012) sendo o material extraído tratado com 200
μg/ml RNAse A (Sigma-Aldrich) por 1 h à 37 ºC. Após a avaliação da concentração, pureza e
integridade do DNA por espectrofotometria a 260 e 280 nm em equipamento Picodrop P100 e
eletroforese em gel de agarose 1% corado por brometo de etídio conforme descrito no item 2.2
o DNA extraído foi estocado a -20 oC.
Após a extração, o de DNA, foi utilizado em reações de PCR com o intuito de detectar
a presença do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo nos parasitos transfectados. Estas
reações foram realizadas conforme descrito no item 2.2, utilizando os iniciadores quimera senso
e quimera antissenso direcionados ao gene da quimera proteica e os iniciadores HX1 senso e
mNG antissenso direcionados ao plasmídeo.
2.6.2 Citolocalização da quimera proteica em Trypanosoma rangeli

Para visualizar a localização da quimera proteica e o marcador mNeonGreen, formas
epimastigotas de T. rangeli transfectados com plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e
FlagGPI_pROCK Neo foram lavadas duas vezes com PBS pH 7,4 por centrifugação a 2.000 X
g por 10 minutos a 22 ºC, e incubadas sob lamínulas de vidro por 20 minutos a temperatura
ambiente, para permitir sua adesão ao vidro. Em seguida, os parasitos foram fixados com
paraformaldeído 4% em PBS pH 7,4 por 5 minutos e lavados três vezes com PBS pH 7,4 por 5
minutos cada lavagem. Para visualização do núcleo e do cinetoplasto, os parasitos foram
incubados com DAPI (1mg/ml) por 5 minutos a temperatura ambiente. Após uma lavagem com
PBS pH 7,4, as lamínulas foram lavas com água milliQ e montadas em lâminas de vidro com
Hydromount (National Diagnostics, EUA). Os resultados foram obtidos em microscópio
Olympus BX41 e as imagens foram posteriormente editadas com o programa Adobe Photoshop
(V. 7.0).
2.7 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DA QUIMÉRA PROTEICA

2.7.1 Ensaios de Western blot
Para avaliar a expressão da proteína quimérica pelos parasitos transfectados foi
realizado ensaios de Western blot utilizando-se extratos totais de L. tarentolae transfectados
com o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo. Para tanto, aproximadamente 4ml de cultivo
33
foram lavados duas vezes em PBS pH 7,4 a 2000 X g por 10 minutos a temperatura ambiente.
Após as lavagens os parasitos foram acrescidos de tampão de lise (50 mM NaCl, 200 mM Tris-
HCl pH 8,0, 1% de Triton X-100) previamente aquecido à 95 ºC, acrescido de 1 μl de coquetel
de inibidores de proteases (Merck), homogeneizados vigorosamente e mantidos em banho de
gelo.
A concentração de proteínas nos extratos totais foi mensurada pelo método de Bradford
(BRADFORD, 1976), utilizando uma curva padrão de 0 a 4 µg/µl albumina bovina sérica
(BSA) como controle para a mensuração por absorbância a 595 nm em espectrofotômetro
Tecan® Modelo Infinite M200. Na sequência os extratos foram adicionados ao tampão de
amostra na proporção 1:5 (20% glicerol, 0,5% azul de bromofenol, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8,
4,4% SDS e 2% β-mercaptoetanol), aquecidos a 95 ºC por 5 minutos e submetidos à separação
eletroforética em gel SDS-PAGE 5 % de concentração e 10 % separação, a 100 volts (V) por
aproximadamente 3 horas. Após a separação, as proteínas foram então transferidas para
membranas de nitrocelulose Hybond-ECL® (GE Healthcare) conforme descrito por Towbin et
al. (1979). Após a transferência, as membranas foram coradas com Ponceau (Serva) para
verificar a eficiência da transferência. Depois, as membranas foram bloqueadas com leite
desnatado 5% diluído em tampão de blotting (25 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl e 0,1%
Tween 20) durante 1 hora, lavadas e incubadas com anticorpo anti-flag ou com soro policlonal
anti-quimera (gentilmente cedido pelo Dr. R.T. Fujiwara da UFMG) por 1 hora à temperatura
ambiente sob agitação. Após as lavagens, a membrana foi incubada com anticorpo secundário
anti-IgG de camundongo conjugado à peroxidase (Sigma-Aldrich) nas mesmas condições. A
detecção foi realizada utilizando-se o reagente Pierce® ECL Plus Substrate (Thermo Scientific)
sendo o resultado revelado utilizando o fotodocumentador Chemidoc MP® BIORAD®.
34
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 SUBCLONAGEM DA QUIMERA PROTEICA EM VETOR DE EXPRESSÃO PARA
TRIPANOSOMATÍDEOS
A abordagem inicial para subclonagem do gene da quimera no vetor de expressão em
tripanosomatídeos constituiu na excisão do gene de interesse do plasmídeo pUC57 através de
digestão com as enzimas de restrição HindIII e KpnI, uma vez que possibilitavam uma
clonagem direcional e em correta fase de leitura no plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo.
Após a digestão inicial do plasmídeo pUC57 e verificação da excisão do inserto por
eletroforese em gel de agarose 1%, o mesmo foi purificado e ligado no plasmídeo
FlagGPI_pROCK Neo utilizando-se a enzima DNA ligase, o qual havia previamente sido
digerido com as mesmas enzimas.
Após diversas tentativas de subclonagem utilizando-se a estratégia acima, não obtemos
nenhum resultado positivo. As tentativas infrutíferas utilizaram diferentes marcas de enzimas
de restrição e de ligação, diferentes tampões, tempos de reação de restrição e ligação,
proporções de inserto:vetor e linhagens bacterianas. Cabe salientar ainda que foram testados
ensaios de co-digestão assim como de digestão sequencial, sendo igualmente infrutíferas as
tentativas de ligação, ainda que controles realizados passo-a-passo utilizando-se outros
plasmídeos como o próprio pUC57 apontassem o funcionamento das enzimas.
Devido a isso, utilizamos uma nova abordagem que envolveu uma etapa intermediária
de subclonagem em vetor pGEM®️-T Easy dos produtos de amplificação por PCR do gene da
quimera proteica a partir do plasmídeo pUC57 utilizando-se os iniciadores quimera senso e
quimera antissenso. Esse é um vetor comercial pré-linearizado com uma timina extra na região
3’- terminal de ambas as fitas, permitindo a ligação de forma direta de produtos de PCR
(PROMEGA, 2021).
Com base nesta estratégia, obtivermos diversas colônias positivas na seleção
azul/branco em meio de cultura, sendo selecionadas aleatoriamente quatro delas para realizar
uma PCR confirmatória. Conforme descrito no item 2.2, utilizamos iniciadores direcionados ao
plasmídeo e a sequência da quimera, confirmando a presença e a correta orientação do inserto
em duas colônias (Colônias 1 e 2) e gerando o plasmídeo Quimera_ pGEM®️-T Easy (figura 4).
35
Figura 4 -Verificação da presença e correta orientação do gene da quimera proteica em

colônias de bactérias E. coli Top10 transformadas com plasmídeo Quimera_pGEM®️-T Easy.
Fonte: Autora.
* Gel agarose 1% corado com brometo de etídio. PCR da ligação do gene da quimera no vetor pGEM®️-T Easy.
1= Marcador molecular (Fago Lambda digerido com a enzima PstI), 2= Controle negativo (Sem DNA), 3= Colônia
1 (iniciadores quimera senso e antissenso), 4= Colônia 2 (iniciadores quimera senso e antissenso), 5= Colônia 3
(iniciadores quimera senso e antissenso), 6= Colônia 4 (iniciadores quimera senso e antissenso), 7= Marcador
molecular, 8= Controle negativo (Sem DNA), 9= Colônia 1 (iniciadores plasmídeo M13 senso e antissenso), 10=
Colônia 2 (iniciadores plasmídeo M13 senso e antissenso), 11= Colônia 3 (iniciadores plasmídeo M13 senso e
antissenso) e 12= Colônia 4 iniciadores plasmídeo M13 senso e antissenso). Tamanho esperados para a PCR com
iniciadores da quimera proteica 1.789 pb. Tamanho esperado para a PCR com os iniciadores do vetor: 2.023 pb.
A etapa seguinte de subclonagem ocorreu conforme descrito no item 2.2, onde

obtivemos o crescimento de várias colônias. De forma aleatória, foram selecionadas 13 colônias
que foram submetidas a uma PCR confirmatória utilizando-se bactérias coletadas diretamente
das colônias da placa de cultivo (PCR de colônia) e os iniciadores desenhados para o gene da
quimera proteica (figura 5). Das 13 colônias positivas para a presença da quimera, escolhemos
as colônias 2, 5 e 6 para realizar uma nova PCR usando diferentes combinações de iniciadores
direcionados ao plasmídeo e a quimera, buscando verificar a correta inserção do inserto. Os
tamanhos teóricos dos fragmentos de amplificação esperados para as combinações de
iniciadores HX1 senso com quimera antissenso e quimera senso e mNG antissenso foram
observados exclusivamente para a colônia 5 sendo 2.018 pb e 1.899 pb, respectivamente (figura
6).
36
Figura 5 - PCR de colônia da ligação do gene da quimera no plasmídeo FlagGPI_pROCK

Neo.
Fonte: Autora.
* Gel de agarose 1% corado em brometo de etídio. PCR de colônia para confirmar a ligação do gene da quimera
no vetor FlagGPI_pROCK Neo. 1= Marcador molecular (Fago Lambda digerido com a enzima PstI), 2= Controle
negativo, 3-15= Colônias de 1 a 13. Tamanho esperado: 1.789 pb.
Figura 6 - PCR com diferentes iniciadores para confirmar a presença do gene da quimera no
plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo.
Fonte: Autora.
* Gel de agarose 1% corado em brometo de etídio. PCR de colônia para confirmar a ligação do gene da quimera
no vetor FlagGPI_pROCK Neo. 1= Marcador molecular (Fago Lambda digerido com a enzima PstI), 2= Controle
negativo, 3= Colônia 2 com iniciadores HX1 senso e quimera antissenso, 4= Colônia 5 com iniciadores HX1 senso
e quimera antissenso, 5= Colônia 6 com iniciadores HX1 senso e quimera antissenso, 6= Colônia 2 com iniciadores
quimera senso e mNG antissenso, 7= Colônia 5 com iniciadores quimera senso e mNG antissenso e 8= Colônia 6
com iniciadores quimera senso e mNG antissenso. Tamanho dos fragmentos esperado para os iniciadores HX1
senso e quimera antissenso e para os iniciadores quimera senso e mNG antissenso de 2.018 pb e 1.899 pb,
respectivamente.
Com base nos resultados obtidos nas PCR com as diferentes combinações de
iniciadores, a colônia 5 apresentou os perfis desejados, indicando a correta inserção do gene da
37
quimera no plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo gerando o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK

Neo. Dessa forma, a colônia 5 foi crescida em meio LB e teve seu DNA plasmidial extraído por
lise alcalina, conforme anteriormente descrito, visando i) confirmar a manutenção da correta
fase de leitura do gene da quimera no vetor plasmídial através de sequenciamento e ii)
transfectar o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em L. tarentolae e T. rangeli.
3.2 SEQUENCIAMENTO DO PLASMÍDEO Quimera_FlagGPI_pROCK

O sequenciamento do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo foi realizado
utilizando-se quatro iniciadores diferentes, sendo: quimera senso, quimera antissenso, HX1
senso e mNG antissenso. O sequenciamento pelo método de Sanger resultou, portanto, em
quatro fragmentos distintos, os quais, quando analisados com o programa Phred-Phrap-
Consed, geraram dois contigs em função da sobreposição dos fragmentos gerados. Essas
sequências foram comparativamente analisadas com a sequência teórica esperada para o
plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo utilizando-se o software Clustal Omega, resultando
em um alinhamento com 100% de identidade, conforme ilustrado nas figuras 7 e 8.
38

Quimera_FlagGPI_pROCK Neo com o contig gerado através do sequenciamento do
plasmídeo (Contig 1).
Fonte: Autora.
* Alinhamento das sequências realizado no sortware Clustal Omega. Os asteriscos indicam que os nucleotídeos
são iguais entre as duas sequências e os traços indicam que não há nenhuma correspondência. Toda a região com
asterisco corresponde a sequência consenso 1. Os retângulos laranja cobrem toda a sequência correspondente ao
gene da quimera, que foi ocultada em função de estar protegida por registro junto ao INPI (Processo BR 10 2018
002228 8).
39

Quimera_FlagGPI_pROCK Neo com o contig gerado através do sequenciamento do
plasmídeo (Contig 2).
Fonte: Autora.
* Alinhamento das sequências realizado no software Clustal Omega. Os asteriscos indicam que os nucleotídeos
são iguais entre as duas sequências e os traços indicam que não há nenhuma correspondência. Toda a região com
asterisco corresponde a sequência consenso 2. Os retângulos laranja cobrem toda a sequência correspondente ao
gene da quimera, que foi ocultada em função de estar protegida por registro junto ao INPI (Processo BR 10 2018
002228 8). Em vermelho indica a região do plasmídeo contendo parte da sequência 3xFlagTag.
40
3.3 AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania

tarentolae AO G-418.
O vetor Quimera_FlagGPI_pROCK Neo possui em sua sequência o gene de
resistência a neomicina, como demostrado na figura 3. Neste estudo, utilizamos o G418
(Geneticin) para selecionar os parasitos transfectados com este vetor. O G418 é um
aminoglicosídeo usado como agente seletivo em culturas de células e análogo ao fármaco
neomicina, possuindo mecanismos de ações similares (INVITROGEN, 2022).
Não sendo conhecida a concentração de inibição 50% do G418 para cepa P10 de L.
tarentolae, realizamos ensaios preliminares para determinar a concentração de inibição em 50%
(CI50%) dos parasitos pelo G418, conforme descrito no item 2.4. Com isso, o valor médio de
CI50% para cada um dos três experimentos independentes realizados foram submetidos ao teste
de Shapiro-Wilk, sendo os valores das médias não considerados normais e com o teste de ROUT
não identificamos nenhum outlier. Por fim, utilizando o teste de one-way ANOVA e teste de
múltipla comparação de Tukey´s verificamos que não havia diferença significativa entre as três
médias obtidas, resultando em uma CI50% de L. tarentolae cepa P10 por G418 de 37,67 µg/ml
(figura 9). O valor obtido em nossas condições experimentais é menor que as concentrações
frequentemente utilizadas em alguns estudos de seleção de L. tarentolae transfectantes com
G418, que fica em torno de 40-50 µg/ml (LIMA; SIMPSON, 1996; PAPADOPOULOU et al.,
1996; GRONDIN et al., 1997; CARDOZO, 2020).
Figura 9 – Concentração de inibição em 50% (CI50) de Leishmania tarentolae quando

exposta ao G-418 (Geneticin).
Fonte: Autora.
* Os dados não se apresentaram normais pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk e não foram detectados
outliers pelo teste de ROUT. Os valores de CI50 foram analisados pelo teste one-way ANOVA e teste de
41
múltipla comparação de Tukey´s, os valores foram considerados p>0,05, logo a média foi efetuada utilizando
os três valores de CI50 obtidos. A linha indica horizontal no percentual de mortalidade em 50%.
A avaliação de sensibilidade de formas epimastigotas de T. rangeli ao G-418 não foi

realizada neste estudo uma vez que as concentrações para a seleção de parasitos transfectados
foi anteriormente estabelecida no Laboratório de Protozoologia (UFSC/MIP/CCB), iniciando
em 20 µg/ml.
3.4 AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DO PLASMÍDEO Quimera_FlagGPI_pROCK Neo EM

TRANSFECTADOS DE Leishmania tarentolae E Trypanosoma rangeli.
Após a extração de DNA de transfectados de L. tarentolae e T. rangeli pelo método
de fenol-clorofórmio como descrito no item 2.6, utilizamos 10 ng de DNA de cada cepa em
reações de PCR. Para L. tarentolae utilizamos um conjunto de iniciador, os dirigidos ao gene
da quimera (quimera senso e quimera antissenso). Para T. rangeli usamos dois conjuntos de
iniciadores, os dirigidos ao gene da quimera (quimera senso e quimera antissenso) e os dirigidos
a sequências do vetor (HX1 e mNG). Considerando que o tamanho do fragmento de
amplificação esperado para a reação com os iniciadores da quimera é de 1.789 pb e para a
reação com os iniciadores do plasmídeo 2.118 pb, o resultado das reações de PCR apresentados
nas figuras 10 e 11 indica a presença do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo nos
transfectados de L. tarentolae e T. rangeli, respectivamente.
Figura 10 - Detecção do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em Leishmania

tarentolae transfectadas.
Fonte: Autora.
* Gel agarose 1% corado pelo brometo de etídio. PCR da extração de DNA de Leishmania tarentolae transfectada
com plasmídeo Quimera_Flag_GPI_pROCK Neo, utilizando os iniciadores direcionados ao gene da quimera. 1=
42
Marcador molecular (Fago Lambda digerido com a enzima PstI), 2= parasitos não transfectados (WT), 3=
Transfecção 1 com plasmídeo Quimera_Flag_GPI_pROCK Neo, 4= Transfecção 2 com o
Quimera_Flag_GPI_pROCK Neo, 5= Transfecção 1 com o plasmídeo Flag_GPI_pROCK Neo 6= Controle
positivo (Quimera_pUC57) e 7= Controle negativo (Sem DNA). Tamanho de fragmento esperado para a
amplificação dos transfectados com o plasmídeo Quimera_Flag_GPI_pROCK Neo e o controle positivo: 1.789
pb.
Na figura 10, observamos na coluna 5 um fragmento de amplificação de 1.789 pb

correspondendo ao tamanho do gene da quimera proteica. Entretanto não esperávamos a
amplificação de nenhum fragmento nesta posição, uma vez que a amostra utilizada nessa reação
foi da extração de DNA de parasitos transfectados com o plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo, no
qual não possui nenhuma sequência complementar aos iniciadores direcionados a quimera
proteica. Considerando que o controle negativo da reação não apresenta quaisquer sinais de
contaminação, uma das hipóteses é que L. tarentolae pode ter, em seu genoma, uma sequência
complementar aos iniciadores direcionados a quimera proteica, pois podemos observar no
parasito selvagem (coluna 2) uma banda fraca com o mesmo tamanho fragmento de
amplificação da quimera proteica. Assim, considerando que quimera proteica contém
sequências conservadas de DNA de diferentes espécies de Leishmania e que esse gênero é um
clado irmão do gênero Sauroleishmania (FIGUEIREDO, 2019; KLATT, 2019), os iniciadores
direcionados ao gene da quimera proteica podem ter correspondência a alguma região do DNA
de L. tarentolae, gerando um fragmento de amplificação de tamanho compatível. Outra hipótese
é de que a cultura de parasitos transfectados com FlagGPI_pROCK Neo possam ter sido
contaminados com a cultura dos parasitos transfectados com Quimera_FlagGPI_pROCK Neo,
fato que será dirimido com a nova transfecção realizada.
Figura 11- Detecção do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em Trypanosoma rangeli

transfectados.
43
Fonte: Autora.
* Gel agarose 1% corado pelo brometo de etídio. PCR da extração de DNA de Leishmania tarentolae transfectada
com plasmídeo Quimera_Flag_GPI_pROCK Neo, utilizando os iniciadores direcionados ao gene da quimera. 1=
Marcador molecular (Fago Lambda digerido com a enzima PstI), 2= parasitos não transfectados (WT), 3=
Quimera_Flag_GPI_pROCK Neo, 5= Transfecção 1 com o plasmídeo Flag_GPI_pROCK Neo 6= Controle
positivo (Quimera_pUC57) e 7= Controle negativo (Sem DNA). 8= parasitos não transfectados (WT), 9=
Quimera_Flag_GPI_pROCK Neo, 11= Transfecção 1 com o plasmídeo Flag_GPI_pROCK Neo. Tamanho do
fragmento de amplificação esperado para a reação com os iniciadores da quimera é de 1.789pb e para a reação
com os iniciadores do plasmídeo 2.118 pb.
Assim como na L. tarentolae observamos na figura 11 a amplificação de fragmento no

DNA extraído da cultura de T. rangeli transfectado com plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo
(coluna 4) ao utilizar iniciadores direcionados ao gene da quimera. Entretanto, o fragmento
amplificado é menor que 1.700 pb e não corresponde ao gene da quimera. Observamos o mesmo
tamanho de fragmento de amplificação no parasito selvagem (coluna 2) quando usado os
iniciadores direcionados ao gene da quimera. Considerando que, para a construção da quimera
proteica se utilizou diferentes cepas de T. cruzi e que ele é filogeneticamente próximo ao T.
rangeli (STOCO et al., 2014; FIGUEIREDO, 2019), os iniciadores direcionados ao gene da
quimera podem ter complementariedade com alguma região do genoma de T. rangeli. A
natureza destas amplificações não esperadas será objeto de avaliações futuras.
3.5 AVALIAÇÃO DA TRANSFECÇÃO DO PLASMÍDEOS Quimera_FlagGPI_pROCK EM

Leishmania tarentolae E EM Trypanosoma rangeli
3.5.1 Leishmania tarentolae
Foram realizados dois ensaios distintos de transfecção do plasmídeo
Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e FlagGPI_pROCK Neo em L. tarentolae, conforme descrito
no item 2.5. Após 24 horas se iniciou a seleção dos parasitos com 37,67 µg/ml de G418. Durante
as primeiras semanas os parasitos foram cultivados em meio ágar sangue suplementado com
meio BHI contendo hemina, 10% de SBF e 37,67 µg/ml de G418 a 26,5 ºC. Depois de uma
semana, observamos que a morfologia dos parasitos transfectados com ambos os plasmídeos
era de, em sua maioria, formas arredondadas distintas da morfologia característica dos
promastigotas de L. tarentolae e com motilidade reduzida quando comparadas à morfologia dos
parasitos selvagens não transfectados. Além disso, o número de parasitos observados em
divisão foi muito inferior ao observado nos parasitos selvagens.
Considerando que a condição ideal de crescimento in vitro de L. tarentolae é sob leve
agitação, realizamos repique de parte da cultura dos parasitos transfectados para garrafa de
44
poliestireno de 25cm2 com tampa contendo filtro, a qual foi mantida sob agitação leve no
agitador Titer Plate Shaker (Lab-Line) a 26,5 ºC. Após duas semanas, comparando os parasitos
crescidos em garrafa e em tubo, não foram observadas diferenças na morfologia entre os dois
tratamentos, tendo sido descontinuado o cultivo em garrafas de cultura.
Em todas as semanas de cultivo dos parasitos transfectados em presença de G418,
observamos as culturas em microscópio de fluorescência, pois como ilustrado na figura 3, o
plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo possui em sua estrutura o gene mNeonGreen que permite a
detecção de expressão de produtos plasmidiais. De forma global, somente os parasitos de
morfologia alterada (formas arredondadas) apresentavam um padrão de fluorescência
puntiforme, não sendo o mesmo observado nas raras formas promastigotas livre-natantes. Além
disso, os parasitos de morfologia alterada formavam grandes agrupamentos em cultura,
relembrando divisão de formas amastigotas (figura 12).
Figura 12 - Comparação da morfologia dos parasitos dos dois ensaios de transfecção de L.

tarentolae com o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo.
Fonte: Autora.
* Cada linha representa uma transfecção diferente de L. tarentolae com o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK
Neo e as duas primeiras colunas mostram o campo em que a foi tirado a foto, a última coluna é a sobreposição das
duas primeiras.
45
Após quatro semanas de seleção com G418, a morfologia dos parasitos em cultura não
apresentou qualquer alteração, sendo observada uma baixa divisão celular, uma motilidade
reduzida nas formas arredondadas e a presença de raros promastigotas apresentando baixa taxa
de divisão celular e motilidade normal.
Considerando que tal fenômeno possa estar relacionado à pressão de droga seletiva e
ou à expressão da quimera, dentre outros fatores, realizamos duas passagens dos parasitos em
meio sem a adição de G418. O acompanhamento destas culturas ao longo de três semanas, de
forma comparativa aos parasitos selvagens e aos transfectados mantidos na presença de G418,
não revelou nenhuma alteração na morfologia dos parasitos, havendo uma baixa quantidade de
formas promastigotas não fluorescentes e grande quantidade de formas arredondadas com
motilidade reduzida, as quais mantinham uma fluorescência como a apresentada na figura 10.
Uma vez que ao fim de sete semanas de cultivo as culturas não apresentavam diferenças visíveis
(figura 10) realizamos a extração de DNA das mesmas a fim de verificar da presença do
plasmídeo nos parasitos por PCR, sendo que todas as passagens foram criopreservadas no
criobanco do Laboratório de Protozoologia para análises futuras da expressão da quimera por
Western blot.
Devido aos parâmetros morfológicos e de crescimento in vitro de L. tarentolae
transfectadas com os plasmídeos Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e FlagGPI_pROCK Neo
permanecerem alterados durante sete semanas, resolvemos descontinuar momentaneamente os
cultivos e iniciar o processo de transfecção desses plasmídeos em T. rangeli, sendo este um
segundo objetivo originalmente traçado para este trabalho.
Em relação à mudança morfológica de L. tarentolae da forma promastigotas para uma
forma arredondada similar à forma amastigota, acreditamos que a proteína quimérica possa
apresentar toxicidade ou alterar algum outro parâmetro biológico de L. tarentolae não
compreendido por nós. Considerando que a proteína quimérica é formada pela junção de 66
epítopos distintos dando origem a uma proteína sintética não natural e inexistente em
organismos vivos, sua expressão pode favorecer a formação de agregados proteicos e de corpos
de inclusão (MARKOSSIAN; KURGANOV, 2004). Esse efeito foi observado quando
Figueiredo (2019) expressou a proteína quimérica em bactéria E. coli, na qual apresentou baixo
rendimento e uma característica insolúvel. Em L. tarentolae pudemos observar em microscopia
de fluorescência uma fluorescência verde puntiforme, podendo indicar a formação de corpos
de inclusão contendo a proteína quimérica. Esta observação pode ser corroborada pois
observamos a expressão de fluorescência, ainda que tênue, relacionada com a alteração
46
morfológica para formas arredondadas, sendo a fluorescência não observada em formas

promastigotas.
Outra hipótese é que não houve uma boa recepção do plasmídeo FlagGPI_pROCK
Neo por essa espécie, uma vez que a transfecção somente com o plasmídeo FlagGPI_pROCK
Neo também apresentou uma morfologia alterada. Este plasmídeo foi desenvolvido com base
em sequências genômicas de T. rangeli que, apesar de apresentarem alta similaridade com as
de L. tarentolae, não são idênticas. Há diversos trabalhos que utilizam a L. tarentolae como
estratégia vacinal para diferentes doenças por ela possuir uma maquinaria de expressão proteica
eucariótica similar a organismos não patogênicos (KLATT et al., 2019). Alguns deles utilizam
diferentes tipos de plasmídeos de expressão para tripanosomatídeos tendo, de forma geral, boa
eficiência de transfecção (PINEDA et al., 2016; KUSHNIR et al., 2011). Entretanto o
plasmídeo mais utilizado e recomendado para a expressão em L. tarentolae é o plasmídeo
comercial pLEXSY (Jena Bioscience, Alemanha), o qual foi desenvolvido especificamente
para expressão em L. tarentolae, proporcionando uma transfecção estável e objetivando a
secreção de proteínas (ABDOSSAMADI et al., 2017; BRETON et al., 2005).
3.5.2 Trypanosoma rangeli

Dois ensaios distintos de transfecção do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e
FlagGPI_pROCK Neo foram realizados em T. rangeli, conforme descrito no item 2.5. Ao fim
de 24 horas se iniciou a seleção dos parasitos com 20 µg/ml de G418. Os parasitos transfectados
se encontram em processo de seleção e estão sendo cultivados em meio ágar sangue
suplementado com meio LIT, 10% de SBF e 20µg/ml de G418 a 26,5 ºC. Após uma semana da
transfecção, observamos que a morfologia dos parasitos com ambos os plasmídeos era, em sua
maioria, similar à morfologia característica de epimastigotas de T. rangeli. Entretanto, os
parasitos com o plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo demoraram uma semana a mais para se
recuperar do processo de transfecção. Além disso, a motilidade e divisão celular, comparadas
aos parasitos selvagens, se encontram preservados.
Durante as semanas de cultivo dos parasitos transfectados na presença de G-418,
observamos ambas as culturas em microscópio de fluorescência, a fim de verificar se o gene
mNeonGreen estava sendo expresso. De forma geral, a cultura com o plasmídeo
Quimera_FlagGPI_pROCK Neo apresenta alguns epimastigotas livre-natantes com motilidade
e morfologia preservadas e fluorescência puntiforme verde. Enquanto a cultura com o
plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo possui epimastigotas livre-natantes que mantém motilidade
47
e morfologia preservadas e com dois tipos de fluorescência, alguns apresentam uma

fluorescência puntiforme verde (figura 14) igual a cultura com plasmídeo
Quimera_FlagGPI_pROCK e outros com fluorescência em todo o corpo celular.
Para uma melhor visualização dos parasitos transfectados, realizamos um ensaio de
microscopia corando o DNA com DAPI e, conforme mostra a figura 13, as culturas da primeira
transfecção apresentam formas epimastigotas expressando fluorescência verde difusa,
indicando um sucesso da transfecção. Os parasitos da segunda transfecção ainda estão sendo
submetidos ao processo de seleção e, por isso, ainda não apresentam muitos parasitos com
morfologia característica de epimastigotas de T. rangeli ou fluorescência.
Diferente da transfecção do plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo em L. tarentolae, era
esperado a compatibilidade deste plasmídeo com o T. rangeli, uma vez que Silva (2022)
desenvolveu o plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo para realizar expressão de proteínas em T.
rangeli, tendo bons resultados em suas transfecções.
Figura 13 – Observação da expressão de mNeonGreen por formas epimastigotas de

Trypanosoma rangeli transfectados com plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e
FlagGPI_pROCK Neo.
Fonte: Autora.
* As duas primeiras linhas representam a primeira transfecção em T. rangeli com o plasmídeo
Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e FlagGPI_pROCK Neo, respectivamente. As duas últimas representam a
48
segunda transfecção em T. rangeli com o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e FlagGPI_pROCK Neo,

respectivamente. A última coluna é a sobreposição da coluna do DAPI e do mNeonGreen.
Figura 14 – Representação da fluorescência puntiforme em epimastigotas de T. rangeli
*A) campo escuro, pontos representa a fluorescência puntiforme proveniente da expressão de mNeonGreen. B)
campo claro, representando os parasitos .
3.6 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DA QUIMERA PROTEICA

Ainda que os parâmetros morfológicos e de crescimento in vitro de L. tarentolae
transfectada com o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo não tenham sido esperados, a
detecção do plasmídeo nesses parasitos através de PCR nos levou a realizar a avaliação
preliminar da expressão da quimera através de ensaios de Western blot utilizando um anticorpo
monoclonal anti-Flag e um soro policlonal anti-quimera conforme descrito no item 2.7.1. Com
base nas análises in silico e nos resultados de Figueiredo (2019), o tamanho esperado da
quimera é 99,43 kDa, uma vez que se projetou a expressão da quimera de forma fusionada à
Flag. Neste ensaio preliminar de Western blot (figura 14), obtivemos unicamente a detecção de
uma proteína de aproximadamente 33,13 kDa com anticorpo anti-Flag, o que corresponderia
apenas a expressão da proteína Flag+mNeonGreen, não sendo observado nenhum
reconhecimento da quimera.
49
Figura 15 -Western blot de extrato total de proteínas de Leishmania tarentolae transfectada

com o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e FlagGPI_pROCK Neo, revelado com
anticorpo anti-Flag e com soro policlonal anti-quimera.
Fonte: Autora.
* Western blot com extratos totais de proteína de L. tarentolae transfectada com o plasmídeo
Quimera_FlagGPI_pROCK Neo para verificar a expressão da proteína quimérica. Membrana de nitrocelulose a
esquerda com amostras de 1-4 reveladas com anticorpo anti-Flag. 1= Padrão massa molecular para proteínas (BIO-
RAD), 2= Extrato total de proteínas de L. tarentolae selvagem, 3= Extrato total de proteínas de L. tarentolae
transfectada com FlagGPI_pROCK Neo, 4= Extrato total de proteínas de L. tarentolae transfectada com
Quimera_FlagGPI_pROCK Neo. Membrana de nitrocelulose a direita com amostras de 5-8 reveladas com
anticorpo policlonal anti-quimera. 5= Padrão massa molecular para proteínas, 6= Extrato total de proteínas de L.
tarentolae selvagem, 7= Extrato total de proteínas de L. tarentolae transfectada com FlagGPI_pROCK Neo, 8=
Extrato total de proteínas de L. tarentolae transfectada com Quimera_FlagGPI_pROCK Neo. Tamanhos esperados
para Flag+Quimera 99,43 kDa e para Flag 33,13 kDa.
A não detecção da expressão da proteína Flag nos parasitos transfectados com

FlagGPI_pROCK Neo pelo anticorpo monoclonal anti-Flag pode estar a associado ao baixo
número de proteínas extraídas da cultura desses parasitos. Contudo, não esperávamos a
detecção apenas da proteína Flag em transfectados com Quimera_FlagGPI_pROCK Neo
quando utilizado o anticorpo anti-Flag, uma vez que o plasmídeo foi projetado para que a
sequência Flag estivesse fusionada com a proteína quimérica. A ausência de proteínas
detectadas com a utilização do soro policlonal anti-quimera pode ter resultado da baixa
quantidade de soro utilizado no experimento. Como recebemos uma pequena quantidade de
soro policlonal anti-quimera gerado por Figueiredo (2019), não pudemos testar diferentes
concentração do soro para estimar a quantidade necessária para ser utilizada no ensaio de
Western blot.
50
O grupo colaborador da UFMG está em fase final de produção de novo antissoro anti-
quimera, o que será utilizado na repetição destes ensaios com as populações de T. rangeli
selvagem, transfectadas com Quimera_FlagGPI_pROCK Neo e com FlagGPI_pROCK Neo.
51
4 CONCLUSÃO
De forma geral, a estratégia de subclonagem com os plasmídeos FlagGPI_pROCK
Neo e Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em promastigotas Leishmania tarentolae não
apresentou um bom desempenho tendo os parasitos apresentado alterações de crescimento,
motilidade e morfologia em relação à cepa selvagem. Entretanto, a transfecção com os
plasmídeos FlagGPI_pROCK Neo e Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em epimastigotas de
Trypanosoma rangeli apresentou um bom desempenho no qual as características biológicas de
crescimento e divisão celular iguais à população selvagem do parasito.
5 PERSPECTIVAS
Apesar de não obtermis evidência direta da expressão da proteína quimérica
em Leishmania tarentolae e Trypanosoma rangeli, novos ensaios serão realizados com extratos
52
totais, com extratos solúveis e insolúveis de parasitos selvagens e transfectados com os

plasmídeos FlagGPI_pROCK Neo e Quimera_ FlagGPI_pROCK Neo visando determinar a
expressão da quimera. Para tanto, novo antissoro anti-quimera está sendo produzido pelos
nossos colaboradores na UFMG. Para confirmar, se houve uma incompatibilidade do plasmídeo
FlagGPI_pROCK Neo por L. tarentolae ou se a quimera proteína é realmente tóxica, uma nova
subclonagem do gene da quimera proteica será realizada em um vetor pLEXSY, uma vez que
esse vetor foi desenvolvido para ter uma melhor eficiência na transfecção e expressão de
proteínas em L. tarentolae. Além disso, para identificar corretamente os sítios de expressão da
quimera proteica em T. rangeli, ensaios de imunofluorescência indireta deverão ser realizados
e visualizados em microscopia confocal. Em sendo verificada a expressão da quimera proteica
por Trypanosoma rangeli, propõe-se a realização de ensaios-desafio de eficácia vacinal de
animais previamente infectados com o T. rangeli expressando a quimera proteica com cepas
de T. cruzi ou Leishmania spp.
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TCC

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Ana Paula da Silva Bastiani

Expressão heteróloga de uma proteína quimérica pan-tripanosomatídeos em Leishmania

Expressão heteróloga de uma proteína quimérica pan-tripanosomatídeos em Leishmania

Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em Ciências

Expressão heteróloga de uma proteína quimérica pan-tripanosomatídeos em Leishmania

Florianópolis, 05 de dezembro de 2022.

A doença de Chagas causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e as leishmanioses causadas

Palavras-chave: Vacina. Tripanosomatídeos. Doenças negligenciadas.

Keywords: Vaccine. Trypanosomatids. Neglected diseases.

Figura 1 - Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. ........................................................ 17

1.3 Prevenção, controle e tratamento da doença de chagas e leishmanioses ............... 19

1.4 Vacinas para doença de chagas e leishmanioses ................................................... 21

1.5 OBJETIVOS .......................................................................................................... 25

1.5.1 Objetivo Geral ...................................................................................................... 25

1.5.2 Objetivos Específicos ........................................................................................... 25

2.2 Construção do vetor de expressão da quimera proteica em tripanosomatideos .... 26

2.3 Sequenciamento do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo ......................... 29

2.3.1 Análises de bioinformática .................................................................................. 30

2.4 Avaliação da sensibilidade de formas promastigotas de Leishmania tarentolae ao

2.5 Transfecção do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo EM Leishmania

2.6 Avaliação da eficácia da transfecção ..................................................................... 31

2.6.1 Extração e PCR dos parasitos transfectados..................................................... 31

2.6.2 Citolocalização da quimera proteica em Trypanosoma rangeli ....................... 32

2.7 Avaliação da expressão da quiméra proteica ......................................................... 32

2.7.1 Ensaios de Western blot ...................................................................................... 32

3 Resultados e discussões ....................................................................................... 34

3.2 Sequenciamento do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK ................................. 37

3.4 Avaliação da presença do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em

3.5 Avaliação da transfecção do plasmídeos Quimera_FlagGPI_pROCK em

3.5.1 Leishmania tarentolae .......................................................................................... 43

3.5.2 Trypanosoma rangeli ............................................................................................ 46

3.6 Avaliação da expressão da quiméra proteica ......................................................... 48

Figura 1 - Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi.

Fonte: adaptado do CDC.

Figura 2 - Ciclo de vida da Leishmania sp.

Fonte: adaptado do CDC.

1.3 PREVENÇÃO, CONTROLE E TRATAMENTO DA DOENÇA DE CHAGAS E

dermatite grave, dermatite associada a febre e linfadenopatia para o benznidazol e efeitos

remoção de cães infectados e a rápida reposição de animais pelos tutores proporcionam a

1.4 VACINAS PARA DOENÇA DE CHAGAS E LEISHMANIOSES

na mortalidade e morbidade, aumento do tempo de vida e diminuiu custos com tratamentos

(GILLESPIE et al., 2016). Posteriormente, se desenvolveu formulações utilizando parasitos

etiológicos das leishmanioses e doença de Chagas, permita a apresentação dos epítopos da

1.5.2 Objetivos Específicos

2.2 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DA QUIMERA PROTEICA EM

Após a confirmação, as colônias contendo o inserto desejado foram repicadas e

Fonte: Silva, 2021

2.3 SEQUENCIAMENTO DO PLASMÍDEO Quimera_FlagGPI_pROCK Neo

2.3.1 Análises de bioinformática

2.4 AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania

Percentual de inibição: 100 – (DOamostra/DOcontrole negativo) * 100

Os valores brutos obtidos foram armazenados em planilha no EXCEL®, onde passaram

2.5 TRANSFECÇÃO DO PLASMÍDEO Quimera_FlagGPI_pROCK Neo EM Leishmania

2.6 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA TRANSFECÇÃO

2.6.2 Citolocalização da quimera proteica em Trypanosoma rangeli

2.7 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DA QUIMÉRA PROTEICA

Figura 4 -Verificação da presença e correta orientação do gene da quimera proteica em

A etapa seguinte de subclonagem ocorreu conforme descrito no item 2.2, onde

Figura 5 - PCR de colônia da ligação do gene da quimera no plasmídeo FlagGPI_pROCK

quimera no plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo gerando o plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK

3.2 SEQUENCIAMENTO DO PLASMÍDEO Quimera_FlagGPI_pROCK

Figura 7 - Alinhamento da sequência teórica esperada para a construção do plasmídeo

Figura 8 - Alinhamento da sequência teórica esperada para a construção do plasmídeo

3.3 AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania

Figura 9 – Concentração de inibição em 50% (CI50) de Leishmania tarentolae quando

A avaliação de sensibilidade de formas epimastigotas de T. rangeli ao G-418 não foi

3.4 AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DO PLASMÍDEO Quimera_FlagGPI_pROCK Neo EM

Figura 10 - Detecção do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em Leishmania

Na figura 10, observamos na coluna 5 um fragmento de amplificação de 1.789 pb

Figura 11- Detecção do plasmídeo Quimera_FlagGPI_pROCK Neo em Trypanosoma rangeli

Assim como na L. tarentolae observamos na figura 11 a amplificação de fragmento no

3.5 AVALIAÇÃO DA TRANSFECÇÃO DO PLASMÍDEOS Quimera_FlagGPI_pROCK EM

Figura 12 - Comparação da morfologia dos parasitos dos dois ensaios de transfecção de L.

morfológica para formas arredondadas, sendo a fluorescência não observada em formas