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FACULDADE DE EDUCAÇÃO E MEIO AMBIENTE

GEORGIANE NASCIMENTO LIMA

INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV):


MÉTODOS DE DETECÇÃO COM ÊNFASE NA BIOLOGIA
MOLECULAR

ARIQUEMES – RO
2013
GEORGIANE NASCIMENTO LIMA

INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV):


MÉTODOS DE DETECÇÃO COM ÊNFASE NA BIOLOGIA
MOLECULAR

Monografia apresentada ao Curso de


Graduação em Farmácia da Faculdade de
Educação e Meio Ambiente – FAEMA,
como requisito parcial a obtenção do grau
de Bacharel em Farmácia.

Orientador (a): Profª. Ms. Fábia Maria


Pereira de Sá

ARIQUEMES – RO
2013
Georgiane Nascimento Lima

INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV):


MÉTODOS DE DETECÇÃO COM ÊNFASE NA BIOLOGIA
MOLECULAR

Monografia apresentada ao curso de


Graduação em Farmácia da Faculdade de
Educação e Meio Ambiente – FAEMA,
como requisito parcial a obtenção do grau
de Bacharel em Farmácia.

COMISSÃO EXAMINADORA:

__________________________________________
Orientador(a): Profª. Ms. Fábia Maria Pereira de Sá
Faculdade de Educação e Meio Ambiente – FAEMA

__________________________________________
Profª. Esp. Viviane Guimarães Silva
Faculdade de Educação e Meio Ambiente – FAEMA

__________________________________________
Prof. Esp. Jonas Canuto da Silva
Faculdade de Educação e Meio Ambiente – FAEMA

Ariquemes, 06 de junho de 2013.


Aos meus pais Osvaldo e Maria pelo apoio
em todos os momentos de minha vida.

Ao meu esposo Robson e meu filho Gabriel


que me apoiaram sempre.

A meus amigos que me deram força e


sempre estiveram comigo.
AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por te me dado forças em todos os momentos em que


pensei em desistir, por ter me guiado me ensinado o caminho certo a seguir.
Ao meu esposo Robson por ter me dado esta oportunidade de estudar, pelo
carinho e paciência durante estes quatro anos e meio.
Ao meu filho Gabriel peço perdão pelos momentos de ausência.
Aos meus pais, meu tudo, minha fortaleza, que me ensinaram desde cedo a
nunca desistir dos meus objetivos mesmo que encontrasse muitas pedras no
caminho, pelo amor e apoio que me deram ao longo desta minha caminhada.
Agradeço a minha irmã Gigliane, meu irmão Adriano e cunhada Miriam que
me ajudaram nos momentos de estagio cuidado do meu filhote Gabriel.
A todos(as) amigos(as) que de uma forma ou de outra contribuíram um
pouquinho para esta minha conquista.
As minhas queridas amigas Adriana Martins e Nelimar Spadotto pelos
momentos de força, por sempre estarem comigo nesta caminhada e agora nesta
conquista.
A Érica Mello, Aline Marques amigas pelos momentos de apoio.
A minha professora e orientadora, Ms. Fábia Maria Pereira de Sá, por sua
paciência e compreensão e pelas orientações precisas em todos os momentos
solicitados, e acima de tudo pela amizade que construímos.
A todos os professores que me deram aula durante estes quatro anos e
meio.
Ao professor e coordenador do curso de Farmácia Nelson Pereira da Silva
Júnior pelo companheirismo.
Aos professores da banca examinadora pelas correções e sugestões.
E por fim a todos que contribuíram direta ou indiretamente, para que esse
trabalho fosse realizado.
RESUMO

O câncer de colo uterino é o segundo câncer que mais acomete mulheres no Brasil
e no mundo, com maior incidência em países subdesenvolvidos do que em países
desenvolvidos e em desenvolvimento. A detecção e o diagnóstico precoce é uma
importante ferramenta na prevenção do câncer de colo uterino. O objetivo deste
trabalho foi discorrer sobre as características da infecção pelo Papilomavírus
Humano (HPV), com ênfase nos métodos de biologia molecular para detecção do
vírus. Para tanto, realizou-se revisão de literatura com pesquisa de artigos científicos
em plataformas online, como Biblioteca Virtual em Saúde (BVS), Scientific Electronic
Library Online (SCIELO) e Google Acadêmico. A infecção pelo vírus do HPV está
entre os fatores principais para o desenvolvimento de câncer de colo uterino, no
entanto, não é o suficiente para que ocorra a lesão neoplásica. Papilomavírus
Humano (HPV) são vírus pertencentes à família Papillomaviridae, não envelopados
que apresentam simetria icosaédrica e DNA de fita dupla. São vírus que infectam
seres humanos, causando infecções na pele e mucosa, replicando-se no núcleo das
células epiteliais. O diagnóstico de infecção por HPV é feito através de métodos
como o exame de papanicolau, colposcopia, biopsia e através de técnicas de
biologia molecular como: Southern blot, Dot blot, Hibridização in situ e PCR. Existem
diversos tipos de tratamento para o câncer de colo uterino, desde medicações
tópicas como: Ácido Tricloroacético e 5 - Fluorouracil, até métodos de criocirurgia e
excisão cirúrgica. E pode ser prevenido com o uso de vacinas profiláticas, do tipo
bivalente e tetravalente, produzidas a partir da proteína L1 do capsídeo viral através
de tecnologia do DNA recombinante.

Palavras-chave: Papilomavírus Humano, Câncer de colo de útero, Biologia


molecular, Exame Papanicolau, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
ABSTRACT

Cancer of the cervix is the second most cancer that affects women in Brazil and the
world, with the highest incidence in developing countries than in developed countries
and developing countries. The detection and early diagnosis is an important tool in
the prevention of cervical cancer. The aim of this studywas to address the
characteristics of the Human Papillomavirus (HPV), with emphasis on molecular
biology methods for detection of viruses. Therefore, we carried out a literature review
with research papers online platforms such as Biblioteca Virtual em Saúde (BVS),
Scientific Electronic Library Online (SciELO) and Google Acadêmico. Infection with
HPV is among the main factors for the development of cervical cancer, however, is
not enough to prevent the neoplastic lesion. Human Papillomavirus (HPV) belonging
to the family Papillomaviridae, presenting non-enveloped icosahedral symmetry and
double stranded DNA. Are viruses that infect humans, causing infections of the skin
and mucosa replicate in the nucleus of epithelial cells. The diagnosis of HPV
infection is done through methods such as the Pap smear, colposcopy, biopsy and
through molecular biology techniques such as Southern blot, dot blot, in situ
hybridization and PCR. There are several types of treatment for cervical cancer,
since topical medications such as Trichloroacetic Acid and 5 - Fluorouracil until
methods cryosurgery and surgical excision. It can be prevented with the use of
prophylactic vaccines, the kind bivalent and tetravalent produced from the viral
capsid protein L1 via recombinant DNA technology.

Keywords: Human Papillomavirus, Cervical cancer, Molecular biology, Pap Test,


Polymerase Chain Reaction (PCR).
LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática do genoma do HPV............................ 15

Figura 2 - Replicação do HPV nas células epiteliais......................................... 17

Figura 3 - Reação da técnica de Hibridização In Situ........................................ 20

Figura 4 - Demonstração do método de Southern Blot..................................... 21

Figura 5 - Demonstração do método de Dot Blot............................................... 21

Figura 6 - Processo da reação em cadeia da polimerase - PCR...................... 23

Figura 7 - Resultado final da reação em cadeia da polimerase - PCR............. 24


LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

HPV Papilomavírus Humano

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

DNA Ácido Desoxirribonucléico

RNA Ácido Ribonucleico

BVS Biblioteca Virtual em Saúde

SCIELO Scientific Eletronic Library Online

LCR Região Longa de Controle

ASC-US Células Atípicas de Significado Indeterminado

NIC Neoplasia Intraepitelial Cervical

HIS Hibridização In Situ

pRb Proteína de Retinoblastoma


SUMÁRIO

INTRODUÇÃO....................................................................................................... 11
2 OBETIVOS......................................................................................................... 12
2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................ 12
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................... 12
3.0 METODOLOGIA............................................................................................ 13
4.0 REVISÃO DE LITERATURA......................................................................... 14
4.1 BIOLOGIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO ............................................... 14
4.2 ASSOCIAÇÃO ENTRE O HPV E O CÂNCER CERVIAL.............................. 15
4.3 TRANSMISSÃO DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO....................................... 16
4.4 DIAGNÓSTICO.............................................................................................. 18
4.4.1 Exame de papanicolau.............................................................................. 18
4.4.2 Biologia molecular.................................................................................... 19
4.4.2.1 Hibridização in situ................................................................................... 19
4.4.2.2 Método de southern blot........................................................................... 21
4.4.2.3 Método de dot blot.................................................................................... 21
4.4.2.4 Captura hídrica......................................................................................... 22
4.4.2.5 Reação em cadeia da polimerase - PCR................................................. 23
4.5 TRATAMENTO DA INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANO............. 24
CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................. 26
REFERÊNCIAS..................................................................................................... 27
INTRODUÇÃO

Papilomavírus Humanos (HPV) são vírus pertencentes à família


Papillomaviridae e são considerados como um dos principais causadores de lesões
intraepiteliais escamosas e do câncer cervical. (WOLSCHICK et al., 2007).
O câncer invasor do colo do útero continua sendo o segundo câncer mais
frequente entre mulheres no mundo. No Brasil, é a neoplasia maligna que mais
acomete o trato genital feminino. (GUARASI et al., 2004).
Estudos epidemiológicos constataram que a infecção pelo vírus HPV não é o
suficiente para ocorrência do câncer de colo do útero. (AYRES et al., 2010), fatores
como: o nível econômico, idade precoce na atividade sexual, vários parceiros,
tabagismo, também são considerados fatores predisponentes para o
desenvolvimento do câncer de colo de útero. (GUARASI et al., 2004).
O combate ao câncer de colo de útero obteve grandes avanços após a
confirmação do papel etiológico do vírus HPV sobre a doença. O controle do câncer
cervical pode ainda ser feito por meio de detecções de lesões precursoras e seu
tratamento. A associação do vírus HPV com o câncer de colo de útero teve início
em 1949 quando o patologista George Papanicolau introduziu o exame que levou
seu nome. Este exame permitiu a detecção de alterações celulares pré-malignas
que posteriormente pudessem desenvolver o câncer de colo de útero.
(NAKAGAWA et al., 2010).
O HPV é transmitido por relação sexual, mas também pode ser transmitido
por via oral. A maioria das infecções por HPV são assintomáticas e apenas 10% dos
pacientes desenvolvem lesões ou displasias. (PINCIANATO et al., 2009). O método
mais simples de prevenção do câncer cervical é através do exame Papanicolau. No
entanto, vêm sendo apontados índices não-ideais de sensibilidade no preparo
convencional, com variações entre 50%-60%. (TULIO et al., 2007).
A prevalência de HPV nas mulheres varia de 2 a 44%, estima-se que 50% a
80% das mulheres com vida sexual ativa estão infectadas por este tipo de vírus.
(ROCHA et al., 2010).
A identificação e avaliação do risco de desenvolvimento do câncer de colo de
útero pela infecção do vírus HPV vem sendo feita através de testes de biologia
molecular. Entre estes testes destacam-se: Hibridização in situ, Southern blot, Dot
11

blot, captura hídrica e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). (WOLSCHICK et


al., 2007). A PCR é considerada de alta sensibilidade, sendo capaz de identificar
níveis baixos de carga viral das células e tecidos. (LIMA et al., 2011).
O tratamento da infecção pelo HPV pode ser realizado tanto por meios
químicos como através do uso de ácido tricloroacético e podofilina, por métodos
físicos, através de excisão cirúrgica e criocirurgia, e ainda pelo o uso de drogas
citotóxicas, como 5- Fluorouracil, por exemplo. (MARANA et al., 1999). Em relação
aos métodos profilácticos, atualmente estão disponíveis dois tipos de vacinas, a
quadrivalente e a bivalente. (BORSSATO et al., 2011).
Através do exposto, ressalta-se, portanto, a importância do conhecimento dos
métodos de detecção deste agente infeccioso, já que está relacionado a problemas
graves de saúde pública.
12

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Discorrer sobre as características da infecção pelo Papilomavírus Humano


(HPV), com ênfase nos métodos de biologia molecular para detecção do vírus.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Comentar sobre aspectos biológicos do HPV;


• Relatar a associação entre a infecção pelo HPV e o câncer de colo uterino;
• Descrever os métodos de biologia molecular empregados para a detecção do
HPV.
• Comentar sobre o tratamento das infecções sobre HPV.
13

3 METODOLOGIA

Este trabalho é do tipo revisão de literatura e para isto realizou-se pesquisa


de artigos científicos em plataformas online, como Biblioteca Virtual em Saúde
(BVS), Scientific Electronic Library Online (SCIELO) e Google Acadêmico. Além
disso, foram consultadas dissertações publicadas com os principais conceitos e
termos relacionados à pesquisa, bem como livros da área. Na pesquisa do material
literário empregou-se os seguintes descritores: Papilomavírus Humano, Câncer de
colo de útero, Biologia molecular, Exame Papanicolau, Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR).
14

4 REVISÃO DE LITERATURA

4.1 BIOLOGIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)

Os HPV são vírus que pertencem à família Papillomaviridae, não envelopados


e que apresentam simetria icosaédrica, tendo um capsídeo composto por 72
capsômeros e um genoma de ácido desoxirribonucleico (DNA) de dupla fita circular,
com aproximadamente 8.000 pares de bases. (FERRAZ et al., 2012). São vírus que
infectam seres humanos, causando infecções na pele e mucosa e sua replicação
ocorre no núcleo de células escamosas epiteliais. (LETO et al., 2011).
Os diferentes tipos de HPV são classificados conforme o risco oncogênico em
de baixo risco, como os tipos 6 e 11, e ainda os de alto risco, destacando-se os tipos
16 e 18. (PASSOS et al., 2008). Os diferentes tipos de vírus variam no seu tropismo
tecidual e estão relacionados a diferentes tipos de lesões e potencial oncogênico.
(WOLSCHICK et al., 2007).
Os HPV são reconhecidos como o principal causador de neoplasias do colo
uterino. Já foram descritas mais de 200 espécies de HPV, os quais são distintos pela
sequência de DNA. Dentre os tipos que acometem seres humanos, existem mais de
100 espécies, das quais 50 acometem a mucosa do aparelho genital. (NAKAGAWA
et al., 2010).
Os tipos 5,11,42,44,70 e 73 são classificados como de baixo risco, e os tipos
16,18,31,33,34,35,39,45,51,52,56,58,59,66 e 68 são classificados como de alto risco
oncogênico, estando associados a lesões intraepiteliais. (SILVA et al., 2006).
O HPV possui um genoma com 8 regiões (Figura 1), classificadas como fases
de leitura aberta (Open Reading Frames) e uma região não-codificadora. As
chamadas fases de leitura aberta são classificadas em três regiões. (FERRAZ et al.,
2012).
A região (E) denominada precoce e codifica várias proteínas (E1, E2, E4,
E5, E6 e E7) que regulam a transcrição e a replicação viral bem como o controle
do ciclo celular, assim, o vírus tem a capacidade de transformar e imortalizar as
células do hospedeiro. Na região (L), denominada tardia, localiza-se os genes L1 e
L2 e a sequência destes genes é altamente conservada nos vírus HPV. (CAMARA
et al., 2000?).
15

A região LCR está localizada entre L1 e E6 e possui de 500 e 1.000 pares de


bases. São bem conservadas entre os HPV, estando envolvidas na expressão
gênica e na replicação viral. (LETO et al., 2011).

Figura 1 – Representação esquemática do genoma do HPV


Fonte: Adaptado de Bringhenti et al. (2010)

As proteínas E6 e E7 estão relacionadas com a carcinogênese mediada pelo


HPV. Acredita-se que ocorra uma interação da proteína E6 com as proteínas p53, e
E7 com a pRb, ocasionado a desregulação do ciclo celular, pois estas proteínas
atuam na prevenção da transformação celular, e interrompe sua divisão e
proliferação. (RIVOIRE et al., 2006).

4.2 ASSOCIAÇÃO ENTRE HPV E CÂNCER DE COLO DE ÚTERO

O câncer de colo de útero é o segundo câncer que mais acomete mulheres no


Brasil e no mundo, com maior incidência nos países subdesenvolvidos em relação a
países desenvolvidos e em desenvolvimento, devido, principalmente, a programas
de rastreamento, através do exame Papanicolau. (ROCHA et al., 2010).
Programas de diagnóstico precoce do câncer do colo do útero, são
importantes medidas de saúde publica, considerando que esta neoplasia é
16

precedida de lesões precursoras, que podem ser detectadas e tratadas reduzindo o


risco de desenvolvimento do câncer de colo uterino. (BRINGHENTI et al., 2010).
A infecção pelo vírus HPV está entre os fatores principais para o
desenvolvimento de câncer de colo uterino, no entanto a infecção pelo vírus é um
fator necessário, mas não suficiente para que ocorra a lesão neoplásica. Embora o
câncer uterino seja menos provável se não houver a presença do vírus. (SILVA et
al., 2006).
Atualmente, esta comprovada a relação entre o HPV e o câncer de colo de
utero, em cerca de 99% dos casos de câncer de colo de útero o DNA do HPV de alto
risco é encontrado, porem fatores como: tabagismo, uso de contraceptivos orais,
múltiplos parceiros e inicio precoce das atividades sexuais favorecem a persistência
da infecção pelo HPV. (SILVA et al., 2006).
As infecções pelos vírus HPV, na maioria das vezes, são assintomáticas,
sendo que uma pequena porcentagem desenvolvem verrugas ou displasias. Em
pacientes infectados pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), as
manifestações clínicas são mais agressivas e com maior chance de ocorrer
recidivas. (PINCINATO et al., 2009).
O número de mulheres portadoras do DNA do vírus HPV chega a 291 milhões
em todo o mundo, e cerca de 105 milhões de mulheres serão infectadas pelo vírus
HPV 16 e 18. A infecção pelo HPV de alto risco no Brasil é semelhante aos países
subdesenvolvidos, com prevalência maior em mulheres na faixa de 35 anos. O
grupo de risco são jovens sexualmente ativos, principalmente os que estão no início
da atividade sexual, a infecção neste grupo é de 3 a 4 vezes mais do que em
mulheres de 35 a 55 anos. (NAKAGAWA et al., 2010).

4.3 TRANSMISSÃO DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO

O HPV é transmitido preferencialmente através do contato sexual, cerca de


99,7% das neoplasias de colo de útero apresentam o DNA de HPV, mas apenas 1%
das mulheres infectadas pelo vírus HPV apresentam risco de desenvolvimento de
câncer. (DINIZ 2009.). O HPV pode ser transmitido através de contato direto ou
indireto com o indivíduo que tem uma lesão. As barreiras epiteliais podem está com
suas funções danificadas devido a traumas e agressões, que provocam a perda de
solução de continuidade da pele, facilitando a infecção viral. (LETO et al., 2011).
17

Frequentemente o vírus do HPV causa infecção em jovens no início da


atividade sexual. Dos diversos tipos de vírus, cerca de 40 tipos, causam infecção no
trato genital feminino. (RAMA et al., 2007). Podendo também ser transmitido de mãe
para filho durante a gestação. (XAVIER et al., 2007).
Todos os tipos de vírus HPV têm tropismo pelas células do epitélio escamoso,
a mucosa. É o local mais afetado, não apenas pelo tropismo do vírus a este tecido,
mas pelo fato de este local ter maior probabilidade de sofrer microtraumas e ser uma
região de contato permanente. (PASSOS et al ., 2008).
O grau de oncogenicidade do vírus está totalmente ligado à atuação de seu
genoma no núcleo da célula hospedeira, os HPV de baixo risco oncogênico tendem
a conservar seu DNA íntegro, circular e epissomal, já os HPV de alto risco
oncogênico geralmente se aderem ao DNA da célula hospedeira (Figura 2).
(FERRAZ et al., 2012).

Figura 2 – Replicação do Papilomavírus Humano nas células epiteliais


Fonte: Vidal et al. (2012)

As infecções por HPV, na maioria das vezes, são assintomáticas, sendo que
em apenas 10% dos pacientes apresentam sintomas como lesões verrucosas ou
displasias. (PINCINATO et al., 2009). A incubação do vírus varia de três semanas a
oito meses após a inoculação e, na maioria dos casos, ocorre regressão
espontânea. (LETO et al., 2011).
18

Nos dias de hoje, tem se dado grande importância ao estudo do HPV, devido
à associação em lesões de cérvice uterina. É importante ressaltar que mulheres com
maior risco de desenvolver uma infecção maligna em cérvice uterina são as
portadoras dos HPV 16 e 18. (NORONHA et al., 1999). Foi a partir da década de 70
que o vírus HPV foi reconhecido como o principal fator etiológico de neoplasias de
colo uterino sendo o genoma deste vírus encontrado no núcleo das células
infectadas. (NAKAGAWA et al., 2010).
O mecanismo de infecção do HPV, quando está dentro da célula germinativa,
pode ocorrer de duas formas: infecção produtiva, onde alguns genes presentes no
vírus estimulam a mitose, resultando em lesões benignas, como por exemplo, os
condilomas. E uma infecção não produtiva, onde não há produção de vírus, mas, ao
entrar em contato com a camada germinativa e infectá-la, ocorre integração do
genoma do vírus com o genoma do hospedeiro. (PASSOS et al., 2008).

4.4 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANO

4.4.1 Exame Papanicolau

Em 1934, foi desenvolvido, por George Papanicolau, um teste chamado


Papanicolau, que permitiu o diagnóstico do câncer de colo de útero através de
análises de esfregaço cervical, sendo possível detectar a presença de células
anormais na mucosa cervical. (ROCHA et al., 2010). Além disso, através do exame
Papanicolau, é possível fazer uma inspeção visual, observando alterações no colo
uterino. (FRANCO et al., 2008).
As alterações morfológicas encontradas no exame Papanicolau são
diagnosticadas como: células escamosas atípicas de significado indeterminado
(ASCUS) e NIC (graus I, II, e III). (TULIO et al., 2007). A prevenção do câncer
ginecológico através de exames é uma técnica usada para diminuir os altos números
de morte por câncer de útero, vagina e vulva ocasionados pelo vírus HPV.
(QUEIROZ et al., 2005).
Não é possível fazer a detecção do vírus HPV por meio de cultura
convencional, pois o vírus não cresce nesse meio e a detecção por métodos de
sorologia apresentam limitações. (LETO et al., 2011).
19

A colposcopia também é uma ferramenta poderosa no diagnóstico de câncer


de colo de útero, através deste exame é possível identificar possíveis alterações no
epitélio, que são impossíveis de se ver a olho nu. (MUNHOZ et al., 2009).
A biopsia também é uma forma de diagnóstico, esse exame é feito com a
retirada de um pedaço da lesão para análise, a indicação vai depender do aspecto e
do local da lesão. (BRASIL, 2002).

4.4.2 Biologia Molecular

Os testes de biologia molecular vêm sendo usados como métodos de triagem


na identificação do HPV em mulheres com risco de desenvolvimento do câncer
uterino. (WOLSCHICK et al., 2007). Nos últimos 50 anos, o câncer de colo uterino
vem sendo prevenido e diagnosticado através de técnicas tanto de baixa tecnologia,
como o exame de visualização com ácido acético, como através de técnicas mais
modernas, como as técnicas de biologia molecular. (BRAGAGNOLO et al., 2010)
As técnicas de biologia molecular são de grande importância na identificação
do DNA do HPV, podendo se confirmar a existência da infecção, mesmo que não
haja alterações morfológicas. Assim, pode-se avaliar, com muita antecedência, o
risco de desenvolvimento do câncer de colo uterino. (WOLSCHICK et al., 2007).
Dentre estes métodos, os quais são classificados de acordo com sua
sensibilidade, destacam-se: a Hibridização in situ, considerado de baixa
sensibilidade; Southern blot e dot blot, de sensibilidade intermediária; e a Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) e captura híbrida, de alta sensibilidade. (PIVA et
al., 2008).

4.4.2.1 Hibridização in Situ

Hibridização in situ (HIS) é uma técnica utilizada na detecção e localização do


HPV na célula infectada. Ocorre a hibridização (ligação) de uma sonda específica
(sequência curta de DNA) para um tipo de HPV, como por exemplo, tipo 16, e faz-se
uma lâmina com a amostra previamente preparada com tampões específicos. E,
através de uma reação de peroxidase, é possível a visualização de pontos
amarronzados no núcleo celular, indicando a presença do HPV (Figura 3). (VIDAL et
al., 2012).
20

Figura 3 – (A) Controle positivo da reação de HIS com sonda biotinilada para HPV,
(B) Controle negativo da reação de HIS, (C) Controle de mucosa normal negativa
(núcleos azuis) com sonda biotinilada para HPV 16 e 18, (D) Reação de HIS positiva
com sonda biotinilada para HPV 16 e 18 (núcleos castanhos).
Fonte: Soares et al. (2002)

4.4.2.2 Método de southern blot

O método Soutbern blot é bem específico na detecção do DNA viral. Pode ser
feito através de fragmentos de biopsia ou esfoliação celular. No entanto, é uma
técnica de alto custo e leva muito tempo. (MENDONÇA et al., 2005). Esta técnica
consiste na extração do DNA e, após a extração, este é submetido a separação por
eletroforese em gel de agarose, conforme velocidade de migração. (WOLSCHICK et
al., 2007). Em seguida, sofre desnaturação e é transferido para uma membrana de
nailon. Esta membrana é incubada com uma sonda específica, que, em seguida, é
revelada conforme sua marcação. Os fragmentos de DNA que se hibridizarem com a
sonda, por apresentarem sequência complementar a ela, são então detectados,
confirmando, assim, a presença de HPV (Figura 4). (RODRIGUES 2006).
21

Figura 4 – Demonstração da técnica Soutbern blot


Fonte: Rodrigues (2006)

4.4.2.3 Método de dot blot

Já o método Dot blot é considerado uma técnica trabalhosa, mas que


apresenta boa sensibilidade e um bom diagnóstico. (LETO et al., 2011). Após
extração do DNA aplica-se este em gotas sobre o filtro de netrocelulose onde são
observados sinais típicos de hibridização após auto-radiografia (Figura 5). Este teste
possibilita o exame de um grande número de amostras. (WOLSCHICK et al., 2007).
22

Figura 5 – Demonstração da técnica Dot blot


Fonte: Arap et al. (2004)

4.4.2.4 Captura hídrica

A captura hídrica é uma técnica molecular bastante específica que fornece a


tipagem viral por grupos, permitindo avaliar a carga viral. Utiliza-se o genoma viral
juntamente com sondas complementares e, em presença de partículas virais, ocorre
formação de híbridos constituídos pelo DNA viral e sondas específicas (ROCHA et
al., 2010).
Atualmente, o teste de captura hídrica II é muito utilizado. Este utiliza sondas
de ácido ribonucleico (RNA) específicas para treze tipos de HPV de alto risco e cinco
tipos de baixo risco. O resultado do teste não especifica o tipo de HPV presente na
amostra, ele só indica se a amostra é positiva ou negativa, e se o vírus é de alto ou
baixo risco. (VIDAL et al., 2012). O teste de captura hídrica I (primeira geração)
23

detecta HPV oncogênicos (16,18,31,33,35,45,51,52 e 56) e captura hídrica II


(segunda geração) detecta quatro tipos de vírus adicionais (39,58,59 e 68). (ROCHA
et al., 2010).

4.4.2.5 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) é uma técnica criada em 1983 por


Kary Mullins e que gerou grande impacto por ser de alta sensibilidade. (MENDONÇA
et al., 2005). É uma das técnicas mais utilizadas atualmente na detecção do HPV
devido a sua alta sensibilidade permitindo o uso de uma pequena quantidade de
material. A PCR ocorre em três etapas, repetidas, em média de 25 a 30 ciclos. Cada
etapa ocorre em temperatura adequada. As etapas são: desnaturação do DNA, que
consiste na separação das fitas do DNA-molde em temperatura de
aproximadamente 95°C; em seguida, com o DNA já desnaturado, os primers, com
suas sequências de base complementar a região delimitada, liga-se à região de
DNA que irá ser amplificada, ou seja, anela-se ao DNA-molde, esta etapa ocorre em
baixa temperatura; a terceira etapa é a de extensão, a qual é feita pela ação de uma
DNA-polimerase (Taq DNA-polimerase) que adiciona os desoxirribonucleotídeos as
extremidades dos primers que estão pareados à fita do DNA-molde (Figuras 6 e 7).
(RODRIGUES, 2006).
Os primers mais utilizados nas técnicas de PCR são os pares MY09/11,
GP+5/+6 e o par de primers PGMY09/11. Estes primers podem ser utilizados na
detecção da maioria dos tipos de HPV, pois são derivados do gene da proteína L1
viral, proteína encontrada no capsídeo dos vírus. Os primers MY09/11 e PGMY09/11
possuem 450 pares de base e os primers GP+5/+6 190 pares de base. (VIDAL et al.,
2012).
A PCR convencional utiliza apena um dos pares de primers, citados acima
para a detecção do HPV. (LIMA et al., 2011). É uma técnica rápida, barata e segura,
que não necessita de muito espaço e utiliza um aparelho chamado termociclador.
(OLIVEIRA, 2010). A PCR em tempo real consiste na quantificação do DNA de
modo preciso, determinando os valores durante as fases de reação, através da
emissão de compostos fluorescentes, que aumentam à medida que entram em
contato com o produto da PCR. (NOVAIS, 2004).
24

No entanto, o método habitualmente utilizado para detecção de HPV genital é


o Nested PCR utilizando o MY09/11 e GP5+/6+ primers conjuntos (MY/ GP+).
(HAWS et al., 2004). Nested-PCR consiste em duas etapas: uma que é semelhante
à PCR convencional, onde se utiliza um par de primers que amplifica uma região
específica do DNA, resultando em fragmentos amplificados do gene escolhido; e a
outra consiste na utilização de primers internos a esta região anteriormente
amplificada. As amostras para análises são coletadas por raspagem da região
cervical, utilizando escovas do tipo cytobrusb e a extração do DNA se dá a partir de
500µL de secreção vaginal. (LIMA et al., 2011).

Figura 6 Processo da reação de PCR. Desnaturação da fita molde e pareamento


dos primers. Em verde a enzima que adicionas os nucleotídeos complementares a
fita mãe.
Fonte: Brasil (2011)
25

Figura 7 – Resultado final da reação de PCR. As duas fitas mães, pareadas com as
fitas-filhas complementares, resultado da adição dos nucleotídeos pela DNA
polimerase.
Fonte: Brasil (2011)

4.5 TRATAMENTO DA INFECÇÃO PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO

Existem vários tipos de tratamento para o câncer de colo uterino, desde


medicações tópicas até criocirurgia e excisão cirúrgica. Entre os medicamentos
tópicos usados o ácido tricloroacético é bastante eficaz em lesões na mucosa. O 5-
fluorouracil e a podofilina também são bastante usadas. (NADAL et al., 2004).
O uso de agentes tópicos, como Ácido tricloroacético de 50% a 90%, é
indicado em lesões na mucosa vaginal e cervical, já a 5-fluoracida em creme é o
tratamento de escolha nos casos de lesões com condilomas de grande extensão
vaginal. O objetivo do tratamento é diminuir ou eliminar lesões causadas pela
infecção e a forma de tratamento depende de vários fatores como: idade do paciente
tipo, tamanho e localização da lesão. (BRASIL, 2002). O tratamento atual para o
HPV é relacionado às condições clínicas, não podendo ser considerado um
tratamento específico, pois não atua diretamente no vírus, mas sobre as lesões.
(MARANA et al., 1999).
26

Geralmente, o tratamento de lesões intra-epiteliais pode ser feito através de


técnicas ablativas, como crioterapia e vaporização a lazer de CO2, sendo que a
crioterapia possui um custo baixo e boa ação para lesões vulvares e cervicais.
Através da vaporização a lazer de CO2 pode-se ter controle da profundidade da
destruição tecidual e possui rápida cicatrização. (WOLSCHICK et al., 2007).
A radioterapia é uma técnica usada na fase evolutiva da doença, sendo capaz
de destruir células tumorais através de feixes de radiações ionizantes, onde uma
quantidade específica de radiação é aplicada a um determinado tempo e volume de
tecido que engloba o tumor, buscando não atingir as células vizinhas normais.
(ALMEIDA et al., 2008).
Vacinas funcionam como métodos profilácticos, atualmente estão disponíveis
dois tipos de vacinas: a quadrivalente (Gardasil®) para os tipos (6,11,16 e 18) e a
bivalente (Cervarix®) para os tipos (16 e 18). (SANTOS, 2011).
As vacinas, tanto a bivalente quanto a quadrivalente, são produzidas a partir
da proteína L1 do capsídeo viral através de tecnologia de DNA recombinante e são
constituídas de partículas semelhantes ao vírus que não possuem DNA, não sendo
infectantes. (BORSATTO et al., 2011).
A vacina quadrivalente é indicada para mulheres com idade entre 9 e 26
anos, com o objetivo de prevenção de doenças causadas pelos vírus dos tipos: 6,
11, 16 e 18 de HPV, câncer cervical e verrugas genitais e para a prevenção de
lesões pré-cancerígenas ou displásicas. (VESPA, 2006).
27

CONSIDERAÇÕES FINAIS

O câncer de colo uterino é uma neoplasia que acomete o trato genital


feminino, tendo como principal agente causador o Papilomavírus Humano (HPV),
vírus que se replica no interior das células epiteliais, sendo transmitido
principalmente através de relações sexuais.
Para diagnóstico de infecções por HPV, emprega-se exames convencionais,
como: Papanicolau, colposcopia e biopsia, bem como técnicas de biologia molecular
como: Southern blot, Dot blot, Hibridização In Situ, Captura Hídrica e PCR.
Destaca-se a importância da criação de programas de incentivo ao
rastreamento e diagnóstico precoce das lesões precursoras, para diminuir o risco de
desenvolvimento do câncer de colo uterino.
28

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