Associação de Polimorfismos em Genes de Citocinas Com A Proteção e Susceptibilidade À Infecção e Progressão Da Dengue

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ANA CAROLINE MELO DOS SANTOS
ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS EM GENES DE CITOCINAS COM A

PROTEÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE À INFECÇÃO E PROGRESSÃO DA DENGUE
MACEIÓ/AL
2017
ANA CAROLINE MELO DOS SANTOS
ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS EM GENES DE CITOCINAS COM A

PROTEÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE À INFECÇÃO E PROGRESSÃO DA DENGUE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Alagoas, como
requisito parcial para obtenção do Título de
Mestra em Ciências da Saúde.
Orientador (a): Prof.ª. Drª. Elaine Virgínia

Martins de Souza Figueiredo
Co-orientador: Prof. Dr. Tiago Gomes de

Andrade
MACEIÓ/AL
2017
À Deus para quem nada é impossível, a minha amada filha Ane Beatriz, a minha família e aos
meus amigos companheiros de todas as horas.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, primeiramente e acima de tudo, a quem devo minha vida e cada conquista e
por me iluminar em todos os caminhos trilhados e por sempre me trazer graças. É em Ti que
busco forças para superar cada obstáculo. Obrigada Senhor por ter ouvido minhas preces e ter
tornado realidade mais esta conquista. És a minha Fortaleza e minha luz.
A minha família que sempre me apoiou nos meus estudos e nas decisões tomadas, obrigada
por tudo.
A minha querida e amada filha Ane Beatriz pela paciência, carinho e compreensão nos
diversos momentos que precisei me ausentar.
A minha querida orientadora Prof.ª Drª. Elaine Virgínia Martins de Souza Figueiredo meus
sinceros agradecimentos pelo ensinamento, conselhos, oportunidade, pela acolhida, atenção,
confiança, dedicação, amizade e constante incentivo durante todo o desenvolvimento desta
pesquisa.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Tiago Gomes de Andrade pela compreensão, ensinamentos,
desenvolvimento crítico reflexivo e pelo apoio no desenvolvimento desta pesquisa.
Aos Profs. Drs. Carol de Sales Marques e Alexandre Urban Borbely pelas considerações
enriquecedoras feitas na qualificação do meu mestrado e por aceitarem compor a banca de
defesa.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, PPGCS, pela oportunidade e

enriquecimento técnico científico proporcionado a uma enfermeira para a realizaçãodeste
trabalho.
Ao secretário da Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Jhonatan Guedes, pela

acessibilidade e paciências na resolutividade das demandas do PPGCS nos momentos que
precisei.
Aos pacientes com dengue e os voluntários saudáveis que generosamente contribuíram com
as amostras de sangue para o seguimento deste estudo. Meus sinceros agradecimentos.
Agradecimento especial, ao Laboratório de Análises Clínicas Dr. Edler Lins na pessoa de

Rosângela pelas sorologias ofertadas para teste do grupo controle deste estudo, meu muito
obrigada.
Ao Laboratório Municipal de Arapiraca, especialmente nas pessoas de Fernando e Kely e dos
profissionais que se dispuseram em realizar as coletas dos pacientes com dengue durante a
rotina.
A Profª Msc. Karol Fireman de Farias pela paciência, dedicação, o ensinar, o escutar, o estar
perto, que desde a graduação tem me mostrado que és exemplo de docente compromissada
com os alunos e exemplo a ser seguido pelos outros.
A Profª Drª Verônica de Medeiros Alves pela elucidação diante do meu aprendizado em uma
nova metodologia ainda obscura na época.
Agradeço a Barbara Rayssa, Edilson Leite, Jean Moisés, Ailson Darlan, Alexandre Wendel,
Adriely Ferreira, Denise Macedo, Rubens Pereira, Susana Paiva e William Miguel por todo o
apoio, pelas buscas incessantes dos pacientes e pelas noites de sono em laboratório para
finalização desta pesquisa.
Aos meus colegas de pós-graduação Mayara, Luiz, Maria, Abel, Aline, Diego e Daniel pelo
enriquecimento como profissional, pelas risadas e pela amizade adquirida no decorrer do
mestrado.
Aos meus queridos amigos irmãos que adquiri na universidade Alex Sampaio, Elis Mayara,
Gilmar Ferreira, Imaculada Pereira, Jackson Santana, Jane Carla, Leilane Camila, Roberta
Oliveira e Reudson Douglas. Meu muito obrigado por todos os momentos de
companheirismo!!!
Aos funcionários da UFAL que contribuíram indireta ou diretamente para a consolidação

deste trabalho.
A Fundação de Amparo à Pesquisa de Alagoas (FAPEAL) pelo financiamento do projeto que

permitiu a execução desta pesquisa e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) pela bolsa de estudo.
Meu Muito obrigado!!!

SALMO 91
Você que habita ao amparo do Altíssimo, e vive à sombra do Onipotente,

Diga a Javé: "Meu refúgio, minha fortaleza, meu Deus, eu confio em ti!"
Ele livrará você do laço do caçador, e da peste destruidora.
Ele o cobrirá com suas penas, e debaixo de suas asas você se refugiará. O braço dele é escudo e
armadura. Você não temerá o terror da noite, nem a flecha que voa de dia,
Nem a epidemia que caminha nas trevas, nem a peste que devasta ao meio-dia.
Caiam mil ao seu lado e dez mil à sua direita, a você nada atingirá.
Basta que você olhe com seus próprios olhos, para ver o salário dos injustos,
Porque você fez de Javé o seu refúgio e tomou o Altíssimo como defensor.
A desgraça jamais o atingirá, e praga nenhuma vai chegar à sua tenda,
Pois ele ordenou aos seus anjos que guardem você em seus caminhos.
Eles o levarão nas mãos, para que seu pé não tropece numa pedra.
Você caminhará sobre cobras e víboras, e pisará leões e dragões.
Eu o livrarei, porque a mim se apegou.
Eu o protegerei pois conhece o meu nome. Ele me invocará, e eu responderei.
Na angústia estarei com ele. Eu o livrarei e glorificarei.
Vou saciá-lo de longos dias e lhe farei ver a minha salvação
RESUMO
Dengue é a arbovirose de maior prevalência no mundo. Diversos fatores foram associados

com a susceptibilidade à dengue destacando-se a genética do sistema imune do hospedeiro
que pode predispor ao agravamento do quadro clínico. Polimorfismos em genes da resposta
imune têm sido associados tanto à proteção quanto a susceptibilidade para o desenvolvimento
de casos de dengue em diferentes populações. Diante deste contexto, o objetivo desta pesquisa
foi investigar o papel de fatores genéticos do sistema imune inato na infecção e evolução da
patogenia da dengue. Realizou-se um estudo do tipo caso-controle que incluiu 127 pacientes
diagnosticados laboratorialmente com dengue (78 com febre da dengue e 49 com febre da
dengue hemorrágica) e 135 controles saudáveis. Os SNPs nos genes TNFA (-308), IL-10 (-
819) e IFNG (+874) foram genotipados por reação em cadeia da polimerase em tempo real
(qPCR) e por PCR-ARMS. Para análise estatística foi utilizado o software on-line gratuito
SNPStats e o programa BioEstat versão 5.0. As frequências genotípicas foram testadas quanto
ao equilíbrio de Hardy-Weinberg sendo esta enquadrada dentro dos padrões de equilíbrio
como determinado pelo mesmo. Não houve diferença estatisticamente significante nas
frequências alélicas dos SNPs nos genes TNFA (-308) e IFNG (+874). Entretanto o alelo C da
IL-10 (-819) foi associado com proteção contra o desenvolvimento de febre hemorrágica da
dengue quando comparado ao grupo controle (OR com IC 95% = 0.56 [0.34 - 0.9]; p =
0.028). Diferença estatisticamente significante foi encontrada entre as distribuições
genotípicas do gene TNFA (-308) no modelo dominante (GA+AA vs GG) para proteção a
febre da dengue, quando comparado o grupo febre da dengue (OR com IC 95% = 0.45 [0.20 –
1.00]; p=0.043) com o grupo controle. Em relação ao SNP no gene IL-10 (-819), o genótipo
T/T foi associado significativamente com a febre da dengue no modelo codominante (OR com
IC 95% = 4.21 [1.45-12.25]; p=0.027) e recessivo (OR com IC 95% = 3.82 [1.38-10.59];
p=0.0089). Interessantemente, o genótipo C/T no modelo sobredominante (OR com IC 95% =
2.10 [1.01-4.38]; p=0.047) foi associado com a progressão para a dengue hemorrágica.
Quanto ao gene IFNG (+874), foi identificada uma associação significativa entre o genótipo
T/A com proteção à dengue quando comparado o grupo controle e DEN no modelo
codominante (AA; TA; TT) (OR com IC 95% = 0.45 [0.24-0.83]; p=0.026), dominante (AA
vs TA+TT) (OR com IC 95% = 0.54 [0.30-0.96]; p = 0.033) e sobredominante (TA vs
AA+TT) (OR com IC 95% = 0.46 [0.26-0.82]; p=0.0071). Quando estratificado pela
classificação clínica em febre da dengue e febre da dengue hemorrágica, no modelo
sobredominante houve associação significativa para proteção contra o desenvolvimento da
dengue (OR com IC 95% = 0.46 [0.24-0.89]; p=0.02) e do quadro hemorrágico (OR com IC
95% = 0.43 [0.19-0.95]; p=0.034). Quando os SNPs aqui estudados foram analisados em
combinação, foi identificado que a combinação G/T/A (OR com IC 95% =2.95 [1.18-7.41];
p=0.022) foi associado estatisticamente com a susceptibilidade à febre da dengue e a
combinação G/C/T (OR com IC 95%=0.28 [0.08 - 0.90]; p=0.035) com proteção contra o
desenvolvimento da febre da dengue hemorrágica. Nossos resultados sugerem que
polimorfismos genéticos envolvidos com moléculas do sistema imunológico podem afetar a
susceptibilidade ou promover proteção para fenótipos clínicos da dengue e podem ser
considerados como bons marcadores prognósticos.
Palavras-chave: Dengue. Polimorfismo genético. Interleucina-10. TNF-alfa. Interferon-gama.
ABSTRACT
Dengue is the most prevalent arboviruses in the world. Several factors have been associated
with susceptibility to dengue, highlighting the genetics of the host immune system that may
predispose to clinical severity. Polymorphisms in immune response genes have been
associated with both protection and susceptibility to the development of dengue cases in
different populations. In this context, the objective of this research was to investigate the role
of genetic factors of the innate immune system in the infection and evolution of the dengue
pathogenesis. We conducted a study of the case-control which included 127 patients
diagnosed with dengue laboratory (78 with dengue fever and 49 with dengue hemorrhagic
fever) and 135 healthy controls. SNPs in the TNFA (-308), IL-10 (-819) and IFNG (+874)
genes were genotyped by real-time polymerase chain reaction (qPCR) and by ARMS-PCR.
For statistical analysis, the free online software SNPStats and the BioEstat version 5.0
software were used. The genotypic frequencies were tested for the Hardy-Weinberg
equilibrium and this was framed within the equilibrium standards as determined by the same.
There was no statistically significant difference in the allelic frequencies of the SNPs in the
TNFA (-308) and IFNG (+874) genes. However, the C allele of IL-10 (-819) was associated
with protection against the development of dengue hemorrhagic fever when compared to the
control group (OR with 95% CI = 0.56 [0.34 - 0.9]; p = 0.028). Statistically significant
difference was found between the genotypic distributions of the TNFA gene (-308) in the
dominant model (GA + AA vs GG) for protection against dengue fever, when compared to
the dengue fever group (OR with 95% CI = 0.45 [0.20 - 1.00], p = 0.043) with the control
group. The T/T genotype was significantly associated with dengue fever in the codominant
model (OR with 95% CI = 4.21 [1.45-12.25], p = 0.027) and recessive (OR with 95% CI =
3.82 [1.38-10.59], p = 0.0089). Interestingly, the C/T genotype in the overdominant model
(OR with 95% CI = 2.10 [1.01-4.38]; p = 0.047) was associated with progression to dengue
hemorrhagic fever. As for the IFNG gene (+874), a significant association was identified
between the T / A genotype with dengue protection when compared to the control group and
DEN in the codominant model (AA; TA; TT) (OR with 95% CI = 0.45 [ (OR = 95% CI =
0.54 [0.30-0.96], p = 0.033) and overdominant (TA vs AA + TT) (OR with 95% CI) % = 0.46
[0.26-0.82], p = 0.0071). When stratified by clinical classification in dengue fever and dengue
hemorrhagic fever, in the overdominant model there was a significant association for
protection against dengue development (OR with 95% CI = 0.46 [0.24-0.89], p = 0.02) and
dengue hemorrhagic fever (OR with 95% CI = 0.43 [0.19-0.95], p = 0.034). When the SNPs
studied here were analyzed in combination, it was identified that the combination G/T/A (OR
with 95% CI = 2.95 [1.187.41]; p = 0.022) was statistically associated with susceptibility to
dengue fever and combination G/C/T (OR with 95% CI = 0.28 [0.08 0.90], p = 0.035) with
protection against the development of hemorrhagic dengue fever. Our results suggest that
genetic polymorphisms involved with molecules of the immune system may affect
susceptibility or promote protection for clinical phenotypes of dengue and can be considered
as good prognostic markers.
Keywords: Dengue. Genetic polymorphism. Interleukin-10. TNF-alpha. Interferon-gamma.
LISTADE FIGURAS
Figura 1 - Incidência de dengue nas Américas entre 1980 e 2010. ......................................... 21

Figura 2 - Incidência dos casos de dengue no estado de Alagoas entre 1996 a 2014. ............ 23
Figura 3 - Genoma do vírus da dengue.................................................................................... 26
Figura 4 - Patogênese da infecção pelo vírus da dengue de acordo com a fase da doença. .... 31
Figura 5 - Esquematização dos SNPs em genes de citocinas e seus possíveis efeitos. ........... 33
Figura 6 - Localização do gene TNF no complexo HLA de classe III. ................................... 34
Figura 7 - Localização do gene IL-10 no cromossomo 1. ....................................................... 36
Figura 8 - Localização do gene IFNG no cromossomo 12. ..................................................... 38
Figura 9 - Curso do tempo da dengue e a adequação do diagnóstico. ..................................... 39
Figura 10 - Exemplo da determinação e amplificação genotípica por qPCR. .......................... 46
Figura 11 - Exemplo da determinação genotípica por PCR –ARMS. ...................................... 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Características gerais dos pacientes com dengue e controles recrutados. .............. 44
Tabela 2 – Sequências dos primers utilizados para as genotipagens do SNP no gene IFNG
+874T/A................................................................................................................. 47
Tabela 3 - Distribuição genotípica e alélica do SNP-308G/A do gene TNFA em pacientes com
dengue e controles ........................................................................................... 50
Tabela 4 - Associação alélica e dos modelos gênicos do SNP -308G/A do gene TNFA ......... 51
Tabela 5 - Distribuição genotípica e alélica do SNP -819C/T do gene IL-10 em pacientes com
dengue e controles ................................................................................................. 52
Tabela 6 - Associação alélica e dos modelos gênicos do SNP -819C/T do gene IL-10. .......... 53
Tabela 7 - Distribuição genotípica e alélica do SNP +874T/A do gene IFNG em pacientes
com dengue e controles ......................................................................................... 54
Tabela 8 - Associação alélica e dos modelos gênicos do SNP +874T/A do gene IFNG ......... 55
Tabela 9 - Combinações dos SNPs dos genes TNFA -308G/A, IL-10 -819C/T, IFNG
+874T/A................................................................................................................. 56
Tabela 10 - Associação das combinações dos genes TNFA -308G/A, IL-10 -819C/T, IFNG
+874T/A ................................................................................................................... 57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Adenina
ADE antibody dependent enhancement
AL Alagoas
ARMS-PCR Amplification-refractory mutation system
bp Pares de base
C Capsídeo
ºC Celsius
CD Células dendríticas
d. C. Depois de Cristo
DC-SIGN Dendritic Cellspecific Intercellular Adhesion Molecule 3 Grabbing
Nonintegrin
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Desoxirribonucleotídeos Fosfatados
DENV Vírus da Dengue
DENV1 Vírus da Dengue sorotipo 1
DP Desvio padrão
E Glicoproteína do envelope viral
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
EUA Estados Unidos da América
FD Febre da dengue
FHD Febre hemorrágica da dengue
Fc Fixação de complemento
G Guanina
HLA Human leucocytes antigen/ antigen leucocitário humano
IC Intervalo de confiança
IDO Indolamina 2,3 dioxigenase
IFNγ/IFNG Interferon gama
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
IH Inibição de hemaglutinação
IL - 1β Interleucina 1 β
IL - 2 Interleucina 2
Kb Kilobases
Km2 Quilômetro quadrado
kDa Kilodaltons
LABMEG Laboratorio de Biologia Molecular e Expressão Gênica
M Proteína da membrana
MHC Complexo de histocompatibilidade principal
MgCL2 Cloreto de magnésio
Mg Miligramas
mL Mililitros
µL Microlitros
Mm3 Milímetros cúbicos
Nº Número
(NH4)2SO4 Sulfato de amônio
NaCL Cloreto de sódio
NASBA Nucleic acid sequence based amplification
Nm Nanômetro
Nk Natural killer
NS1Ag Antígeno NS1
NS Proteína Viral Não Estrutural
OPAS Organização Panamericana de Saúde
OR Odds ratio
ORF Open Reading Frame
pH Potencial hidrogeniônico
PCR Polymerase Chain Reaction
qPCR Real time Polymerase Chain Reaction
RR Roraima
RER Retículo endoplasmático rugoso
RNA Ácido Ribonucleico
SCD Síndrome do choque da dengue
SESAU Secretaria de Saúde
SINAN Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SNP Single nucleotide polymorphism
T Timina
TCLE Termo de consentimento livre esclarecido
TAE Tris-Acetato-EDTA
TGN TransGolgi
Th1 T helper 1
Th2 T helper 2
TNF Fator de necrose tumoral
TNF-α /TNFA Fator de necrose tumoral alfa
UFAL Universidade Federal de Alagoas
x2 Qui – quadrado
WHO World Health Organization
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 17
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 20
2.1 Aspectos histórico - epidemiológicos da dengue ...................................................... 20
2.1.1 Dengue nas Américas ................................................................................................ 20
2.1.2 Dengue no Brasil ......................................................................................................... 22
2.1.3 Dengue em Alagoas ..................................................................................................... 22
2.2 Transmissão ................................................................................................................. 23
2.3 Vetor ............................................................................................................................. 24
2.4 Vírus da dengue – DENV ............................................................................................ 25
2.5 Ciclo viral ..................................................................................................................... 26
3 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS ........................................................................... 27
3.1 Dengue clássica ou febre da dengue ........................................................................... 27
3.2 Febre hemorrágica da dengue e síndrome de choque da dengue ........................... 27
3.3 Nova classificação ........................................................................................................ 28
3.4 Infecções assintomáticas ............................................................................................. 28
3.5 Manifestações atípicas ................................................................................................. 28
4 IMUNOPATOGÊNESE ............................................................................................. 30
4.1 Polimorfismos em genes envolvidos na regulação do sistema imune e dengue ...... 32
4.1.1 Polimorfismo do gene TNF alfa (TNFA) .................................................................. 34
4.1.2 Polimorfismo do gene interleucina-10 (IL-10) ......................................................... 35
4.1.3 Polimorfismo do gene Interferon gama (IFNG) ...................................................... 37
5 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO VIRAL ............................................................ 38
5.1 Isolamento viral ......................................................................................................... 39
5.2 Amplificação do genoma ou amplificação de ácidos nucleicos ................................ 39
5.3 Diagnósticos sorológicos .............................................................................................. 40
5.4 Biossensores.................................................................................................................. 40
6 TERAPÊUTICA ......................................................................................................... 41
7 PREVENÇÃO ............................................................................................................. 41
8 OBJETIVOS ............................................................................................................... 42
8.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 42
8.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................... 42
9 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 43
9.1 Delineamento do estudo .............................................................................................. 43
9.2 População e local do estudo ........................................................................................ 43
9.3 Critérios de inclusão e exclusão.................................................................................. 44
9.4 Extração de DNA genômico ........................................................................................ 45
9.5 Eletreforese em gel de agarose ................................................................................... 45
9.6 Genotipagem dos genes das citocinas TNFA -308G/A e IL-10 -819C/T ................. 45
9.7 Genotipagem do gene da citocina IFNG +874T/A .................................................... 47
9.8 Análises estatísticas ..................................................................................................... 48
9.9 Aspectos éticos ............................................................................................................. 49
10 RESULTADOS ........................................................................................................... 50
10.1 Frequência genotípica e alélica do SNP -308G/A do gene TNFA ............................ 50
10.2 Frequência genotípica e alélica do SNP -819C/T do gene IL-10 ............................. 52
10.3 Frequência genotípica e alélica do SNP +874T/A do gene IFNG ............................ 54
10.4 Combinações dos genes TNFA, IL-10, IFNG. ........................................................... 56
11 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 58
12 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 62
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 63
APÊNDICE A – ARTIGO SUBMETIDO ................................................................ 74
APÊNDICE B – ARTIGO ORIGINAL 1 ................................................................. 89
APÊNDICE C – ARTIGO ORIGINAL 2 ............................................................... 112
ANEXO A - PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO POR
NaCL
.. ..................................................................................................................................126
ANEXO B - PARECER DE APROVAÇÃO DA PESQUISA PELO COMITÊ DE
ÉTICA E PESQUISA. .............................................................................................. 127
ANEXO C - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO .... 128
17
1 INTRODUÇÃO
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a dengue resulta em

consequências significativas no que envolve o âmbito da saúde, economia e os aspectos
sociais das populações em áreas endêmicas. Estima-se que dois terços da população mundial
se encontram em risco de desenvolver dengue, com 50 milhões de pessoas infectadas
anualmente por um dos quatro sorotipos (DENV-1 a DENV-4), destas 500 mil evoluem para
o quadro com complicações a nível sistêmico (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
Em um estudo cartográfico foi identificado um panorama diferente que estimou que cerca de
390 milhões de casos entre sintomáticos e assintomáticos ocorrem no mundo (BHATT et al.,
2013).
A dengue abrange manifestações clínicas que envolve desde sintomas inaparentes
(assintomático) até as formas graves que pode culminar em óbito. Os pacientes com dengue
apresentam febre, cefaleia, mialgia, artralgia e eritema cutâneo, que pode persistir uma
semana. A forma mais grave da doença é caracterizada pela presença de hemorragias,
hipotensão, trombocitopenia e extravasamento plasmático e manifestações neurológicas
associados com a sintomatologia clássica da doença (HUY et al., 2013). A virulência,
associada à história de infecção por flavivírus, idade, sexo e o genótipo do hospedeiro
parecem ser determinantes da evolução desta patologia (GUZMÁN; KOURÍ, 2002).
Estudos têm demonstrado que a resposta imune do hospedeiro desempenha um papel
crucial na patogênese da doença (COSTA et al., 2013; GUABIRABA; RYFFEL, 2014; LAN;
HIRAYAMA, 2011; SINGLA et al., 2016). As consequências da infecção pelo vírus da
dengue associado ao sistema imune do hospedeiro, o qual exerce um importante papel ao
longo de todo o processo da infecção, tem sido objeto de estudos por sofrer influência da
susceptibilidade para a progressão da doença. Neste contexto diversas pesquisas têm
demonstrado que polimorfismos em determinados genes de citocinas predispõem os pacientes
a complicações com a infecção pela dengue (ALAGARASU et al., 2013, 2015; FEITOSA et
al., 2016a; FERNÁNDEZ-MESTRE et al., 2004; FERNANDO et al., 2015; SAM et al., 2015;
XAVIER-CARVALHO et al., 2013).
A resposta inflamatória contra o vírus da dengue desempenha um papel importante na
patogênese (COSTA et al., 2013). As discrepâncias em relação às manifestações clínicas de
pacientes com febre da dengue e febre hemorrágica da dengue podem ser decorrentes de
respostas inflamatórias diferentes. Estudos demonstram que os níveis de mediadores da
inflamação, como TNF-α, IFN-γ, IL-8 e IL-10 são elevados em casos com sinais de
18
agravamento da doença (BECERRA et al., 2009; MALAVIGE et al., 2013; PANDEY et al.,
2015; PÉREZ et al., 2004; RATHAKRISHNAN et al., 2012).
A produção de citocinas pode ser mediada por polimorfismos que estão associados com a
susceptibilidade a infecção (ABRAHAM; KROEGER, 1999; DE MAAT et al., 2004). As
diferenças observadas na expressão das proteínas ocorrem como resultado de variações
genéticas funcionais em diversas regiões do gene, de modo a promover um desequilíbrio na
produção de citocinas e assim originar uma variabilidade na resposta imune entre indivíduos.
As variações mais comuns observadas no seguimento do genoma humano são os
polimorfismos de nucleotídeo único (do inglês: single nucleotides polymorphism - SNP), há
evidências de que os SNPs estão presentes nos genes de várias moléculas envolvidas no
processo inflamatório, o que afeta a expressão gênica, estrutura e função das proteínas
codificadas pelos genes (OLLIER, 2004). A presença de certos alelos e genótipos podem
contribuir para a proteção, susceptibilidade ou resistência do hospedeiro a várias infecções,
assim como pode influenciar na gravidade das doenças infecciosas e na permanência dos
sintomas de uma infecção.
Polimorfismos genéticos de muitas moléculas da resposta imune inata foram associados
com a febre da dengue hemorrágica. Neste contexto o estudo de Perez (2010) foi crucial para
as investigações sobre polimorfismos genéticos de citocinas e dengue, o qual mencionou que
vários distúrbios de um único gene (TNFA) estavam envolvidos nas alterações provocadas
pela dengue na população cubana demonstrando que o TNFA, a IL-10 e outras citocinas
possuem papel significante na progressão da dengue, o que configura estas como um campo
de investigação importante. Entretanto, diferenças no perfil genético em genes de citocinas
em pacientes com dengue foram identificadas considerando as diferentes etnias nas
populações da Malásia (SAM et al., 2015), Venezuela (FERNÁNDEZ-MESTRE et al., 2004)
e no Sri Lanka (FERNANDO et al., 2015).
No Brasil o cenário de pesquisas genéticas para a dengue mostra uma discrepância em
vista as características relacionadas a miscigenação presente fortemente na população. Três
pesquisas evidenciam essa perspectiva. Um estudo caso-controle realizado na região sudeste
com crianças que desenvolveram febre hemorrágica da dengue não identificou associação do
gene TNFA e IL-10 com a severidade da doença (XAVIER-CARVALHO et al., 2013). Um
coorte realizado na mesma região geográfica identificou que o alelo A do gene TNFA esteve
associado com a não persistência dos sintomas em pacientes convalescentes (DETTOGNI et
al., 2015). Enquanto, que na região norte outro estudo caso-controle conduzido com adultos
identificou uma correlação entre os SNPs dos genes TNFA (-308G/A) e IFNG com a proteção
19
para a infecção (FEITOSA et al., 2016). Ainda não há relatos publicados de pesquisas em
outras regiões do Brasil, o que diante desta particularidade se torna relevante a realização de
estudos de associação genética.
A investigação de SNPs em genes de citocinas envolvidos na resposta imune inata
pode auxiliar na exploração do conhecimento da fisiopatologia da infeção pela dengue e na
criação de métodos preventivos e terapias mais efetivos considerando as particularidades
destes pacientes. Assim, a determinação de biomarcadores genéticos envolvidos na
patogênese da infecção aqui exposta permitirá determinar a susceptibilidade em uma
população de Alagoas, Brasil, para infecção e progressão em casos mais grave. Além disso, os
dados aqui descritos servirão de modelo básico para outros estudos de associação.
Neste contexto, a identificação do perfil genético específico de cada população por ser
diferente em diferentes regiões geográficas permite conhecer os aspectos particulares de cada
grupo étnico. Portanto, considerando a hipótese de que polimorfismos genéticos presentes no
sistema imune inato humano produzem respostas diferenciais à infecção e consequentemente
estão associados com uma maior susceptibilidade ou a progressão para a gravidade da doença,
a presente pesquisa teve como finalidade investigar polimorfismos genéticos das citocinas
TNFA (-308G/A), IL-10 (-819) e IFNG (+874) na população do município de Arapiraca, em
indivíduos com infecção pelo vírus da dengue e em pessoas não infectadas (saudáveis).
20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Aspectos histórico - epidemiológicos da dengue
A palavra “dengue” tem origem hispânico-caribenha, este termo começou a ser

utilizado a partir de 1827 para configurar todas as síndromes febris que acometiam
endemicamente as populações da época (GUBLER, 1997). Dentre as evidências sugerindo a
existência desta doença, a mais antiga é a que foi publicada por uma enciclopédia chinesa no
século III durante a dinastia Chin, datada de 265-420 d.C. (NORMILE, 2013). Entre os anos
de 1779 e 1780 nos continentes Asiático, Africano e Norte Americano foram descritos os
primeiros relatos de epidemias que provavelmente teriam sido causadas pelo vírus da dengue.
Mas, foi Benjamin Rush, no curso de uma epidemia na Filadélfia (EUA) ocorrida em 1780,
quem descreveu minuciosamente a doença, inclusive utilizando o termo “break-bone fever”
(em português "febre quebra ossos") (BRATHWAITE DICK et al., 2012).
A vinda de escravos da África, no século XVIII, propiciou a disseminação do Aedes
aegypti para os demais continentes e as epidemias de dengue tornaram-se mais frequentes.
Após a Segunda Guerra Mundial ficou evidente uma mudança no comportamento da doença.
Diversos fatores implicaram para tal cenário variando desde o crescimento populacional até o
aumento das viagens comerciais entre culminando na expansão geográfica do vetor e do vírus
(GUBLER, 1997). Nas Filipinas (1953/54) e em Bangkok (1958), ocorreram os primeiros
surtos de febre hemorrágica da dengue documentados. A partir de então, casos de febre
hemorrágica da dengue passaram a ser frequentes no sudeste asiático nas décadas posteriores,
expandindo-se para regiões como Índia e China aumentando exponencialmente o número de
epidemias e a circulação dos diferentes sorotipos e consequentemente em alterações no
panorama epidemiológico (MARTINEZ-TORRES, 1990).
2.1.1 Dengue nas Américas
A partir do século XIX, relatos sobre infecções oriundas da dengue foram comuns em
cidades portuárias do Caribe e nas Américas do Norte, Central e do Sul em que a atividade
comercial era prevalente (GUZMAN; KOURI, 2003; HALSTEAD, 2006). Em 1818 um surto
de dengue acometeu a população peruana e registrou mais de cinquenta mil casos
(SCHNEIDER, 2001). Durante 1827 e 1828 uma epidemia de grande curso envolvendo o
Caribe e o Golfo do México foram relatados com início nas Ilhas Virgens e estendendo-se
para Cuba, Jamaica, Colômbia, Venezuela e algumas cidades portuárias do sul dos Estados
21
Unidos e México (BRATHWAITE DICK et al., 2012; EHRENKRANZ et al., 1971).

Evidências de surtos no Brasil foram relatadas em 1845 e 1849. Sendo a partir de 1980, surtos
de caráter epidêmico foram notificadas em vários países: no Brasil, Bolívia, Paraguai,
Equador, Peru e Cuba (PORTO, 2014). A Figura 1 representa a evolução da incidência de
dengue na região das Américas entre os anos de 1980 e 2010.
Figura 1 - Incidência de dengue nas Américas entre 1980 e 2010
Fonte: Adaptado de Organização Pan-americana de Saúde, 2011.
A transmissão do vírus da dengue (DENV) nas Américas foi interrompida devido a

campanhas de erradicação do mosquito vetor na região entre 1960 e 1970. Entretanto, fatores
como a descontinuidade nas campanhas de erradicação, urbanização acelerada e a capacidade
de sobrevivência do vetor contribuíram para a reemergência da doença (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2009). Em 1981, o DENV-4 foi introduzido no continente Americano e,
durante esta mesma década, ocorreu em Cuba, a primeira epidemia de Febre Hemorrágica da
Dengue (FHD) e Síndrome do Choque da Dengue (SCD) das Américas, causada pelo DENV-
2. Nesta epidemia foram notificados mais de 300 mil casos com aproximadamente 116 mil
hospitalizações e 158 mortes (KOURI, 1986; GUBLER, 2006). Entre os anos de 1981 e 1996
foram registrados 42 mil casos de febre hemorrágica da dengue e síndrome do choque da
dengue distribuídos em cerca de 30 países. A segunda maior epidemia de FHD e SCD das
Américas foi oriunda da Venezuela com aproximadamente 22 mil casos, onde foram isolados
os sorotipos: DENV-1, DENV-2 e DENV-4 (PAN AMERICAN HEALTH
ORGANIZATION, 1997).
22
2.1.2 Dengue no Brasil
Relatos da dengue no Brasil iniciaram-se em 1946, com registro de surtos nos estados
do Rio de Janeiro, Bahia, Pernambuco e em outras localidades do País (MARZOCHI et al.,
1998; TADEU; FIGUEIREDO, 2003). Entretanto foi em 1981, que houve a notificação do
primeiro caso laboratorialmente confirmado de dengue com os sorotipos 1 e 4 no Estado de
Roraima (RR). Posteriormente em 1986, um surto epidêmico de DENV-1 ocorreu no Estado
do Rio de Janeiro e foi seguido por diversas epidemias em cidades com grandes aglomerados
populacionais das regiões Sudeste e Nordeste do Brasil (HALSTEAD, 1988; SIQUEIRA et
al., 2005).
O número de casos de febre da dengue (FD) atingiu o pico epidêmico em 1987 e 1991,
possivelmente devido a introdução de diferentes sorotipos no cenário epidemiológico
brasileiro (DENV-1 e DENV-2, respectivamente). Os primeiros casos de FHD foram
confirmados em 1990, depois que o sorotipo DENV-2 foi introduzido no Brasil. Durante a
década seguinte, 893 casos confirmados de FHD com 44 óbitos ocorreram, sendo que 75%
destas mortes incidiram no Estado do Rio de Janeiro. Entre 2001-2002, foi detectado um
aumento no número de casos de FHD com taxas de incidência de 2,9/100.000 hab. e
12,9/100.000 hab. em 2001 e 2002 respectivamente (SIQUEIRA et al., 2005).
De acordo com o relatório da Organização Pan-americana de Saúde (OPAS, 2016)
sobre número de casos notificados de dengue e dengue grave nas Américas, no decorrer de
2016, dentre todos os países que compõem o Cone Sul, o Brasil foi o país que mais notificou
casos de dengue nas Américas notificando 1.452,284 de registros suspeitos de dengue, destes
272.419 mil casos foram confirmados laboratorialmente atingindo uma taxa de incidência de
105.09 a cada 100 mil habitantes. O Brasil também se destacou em relação a notificação de
dengue severa em que foram registrados 785 casos e confirmados 581 mortes oriundas da
infecção por dengue.
2.1.3 Dengue em Alagoas
O estado de Alagoas possui 102 municípios e uma extensão territorial de 27.779,343

km2 com um aglomerado populacional de aproximadamente 3.120,494 habitantes. Há a
predominância de duas categorias de clima: o clima do tipo semiárido que é típico do sertão
alagoano (sendo predominante em grande parte do território) e o clima tropical úmido (ocorre
na costa alagoana com índices pluviométricos mais elevados). A temperatura média anual é
em torno de /24°C (IBGE, 2010).
23
Até a 52ª semana epidemiológica (Nº: 52/2014 de 12 de janeiro de 2015), Alagoas

registrou 16.731 casos suspeitos de dengue, 388 casos suspeitos de dengue com sinais de
alarme e dengue grave (um aumento em comparação a 2013 de cerca de 150%) e 06 óbitos
confirmados. Quando analisados a faixa etária e o gênero mais acometido por dengue com
sinais de alarme e dengue grave predominantemente foram acometidos indivíduos da faixa
etária de 20 a 39 anos (42,01%) e o gênero feminino (54,38%).
De acordo com a Secretaria de Estado da Saúde (SESAU, 2014), o vetor da dengue
infesta todos os municípios alagoanos e os quatro sorotipos circulam o território, estes foram
introduzidos em 1986 (DENV-1), 1991 (DENV-2), 2002 (DENV-3) e 2012 (DENV-4). Em
relação à incidência de dengue no estado entre 1996 até 2014 pode-se perceber picos
epidêmicos de 1996 a 2011 observados nos anos de 1998, 2002, 2003, 2007, 2008, 2010,
2012 e 2013 como representado na Figura 2.
Figura 2 - Incidência dos casos de dengue no estado de Alagoas entre 1996 a 2014
Fonte: Adaptado de Secretaria Estadual de Saúde (SESAU) de Alagoas/SINAN.

Nota: Dados de 2014 sujeitos à alteração.
2.2 Transmissão
A transmissão da dengue acontece quando a fêmea do mosquito adquire o vírus ao picar

um indivíduo infectado durante a fase de viremia e após um período de replicação no
mesentério do mosquito (período de incubação extrínseco) que varia entre oito a doze dias.
Posteriormente, o vírus migra para as glândulas salivares, e a partir deste momento é que o
vetor está pronto para transmitir a doença a outros indivíduos, até o final do seu ciclo de vida
(6-8 semanas) (JESSIE et al., 2004).
24
Além destas, outras formas têm sido evidenciadas na literatura. A transmissão vertical
foi identificada em diversos estudos realizados na Tailândia, Brasil, Polinésia, Índia e em
outras regiões (ARYA; AGARWAL, 2014; GUZMAN; KOURI, 2003; MAROUN et al.,
2008; PHONGSAMART et al., 2008; RIBEIRO et al., 2013). A transmissão por meio de
transplante (JOOB; WIWANITKIT, 2014; WEERAKKODY et al., 2014) e por contato com
agulhas ou transfusão sanguínea ocorrem, embora em menor proporção (RAMOS, 2008;
WENDEL; LEVI, 2008).
2.3 Vetor
A primeira comprovação de que a transmissão da dengue foi oriunda de mosquitos é a

documentada por Graham em 1903, posteriormente Bancroft em 1906 concluiu em um
experimento com voluntários que o Aedes aegypti era o vetor da dengue (GUBLER, 2014
apud GRAHAM, 1903; BANCROFT, 1906). O Aedes (Stegomyia) aegypti é a principal
espécie transmissora do vírus da dengue em humanos como também é responsável por ciclos
endêmicos e epidêmicos em centros urbanos de regiões tropicais e subtropicais nos
continentes Asiático, Américas, África e regiões orientais do Mediterrâneo (GUBLER, 1998;
GUBLER, 2002; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009; SIMMONS, 2012). Outras
espécies do subgênero Stegomyia (Aedes albopictus, Aedes polynesiensis e Aedes scutellaris)
também foram mencionados como vetores em regiões rurais (BRAGA; VALLE, 2007 apud
BANCROFT, 1906; RODHAIN, 1997).
O Aedes aegypti é um mosquito que possivelmente possui ascendências na África.
Originalmente foi referido no Egito, o que posteriormente conferiu o seu nome específico
(BRAGA; VALLE, 2007 apud NELSON, 1986; CHRISTOPHERS, 1960). Provavelmente
este vetor foi introduzido no território das Américas através das excursões europeias ao Novo
Mundo (MARZOCHI et al., 1998). Em território brasileiro, a identificação da presença do
Aedes aegypti foi realizada por Lutz (1898) e por Ribas (1899) (FRANCO, 1969).
O habitat do Aedes aegypti está relacionado às condições domiciliares em vista o
modo de vida da população humana nos centros urbanos. Entretanto, há evidências de que o
mosquito também possa se desenvolver em ambientes com elevados níveis de poluição ou
esgoto doméstico, onde há alta concentração de material orgânico (BESERRA et al., 2009),
assim observa-se que esta espécie possui uma elevada capacidade de adaptação as condições
ambientais (CASTRO JR. et al., 2013; JANSEN; BEEBE, 2010).
25
2.4 Vírus da dengue – DENV
O vírus da dengue (DENV) pertence ao gênero flavivírus (família Flaviviridae) que

possui outros dois gêneros Pestivirus e Hepacivirus (GUBLER, 1998).O gênero flavivírus (do
latim flavus ou "amarelo", referindo-se ao vírus da febre amarela) é composto por
aproximadamente 73 vírus transmitidos por artrópodes que infectam roedores, aves, suínos,
primatas não humanos, seres humanos e outros hospedeiros mamíferos. Os membros desta
classe compreendem vários vírus que desenvolvem diversas doenças que acometem a
população humana (DAEP; MUÑOZ-JORDÁN; EUGENIN, 2014).
Há quatro sorotipos relacionados entre si por seus aspectos genéticos e antigênicos:
DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Estes sorotipos possuem cerca de 70% de
sequências homólogas e consequentemente manifestações clínicas semelhantes (GREEN;
ROTHMAN, 2006; LINDENBACH; RICE, 2003). No cenário epidemiológico da dengue, um
quinto sorotipo (DENV-5) foi identificado em um fazendeiro residente da Malásia em 2007
(NORMILE, 2013), este achado possivelmente pode interferir nas intervenções atuais para
minimização da ocorrência da doença (MUSTAFA et al., 2014).
O vírus possui a conformação de uma partícula esférica (40 a 50nm de diâmetro)
envolvido por um envelope lipídico e uma fita simples de RNA positiva, e apresenta um
nucleocapsídeo icosaédrico (aproximadamente 30 nm de diâmetro). Em relação a sua
estrutura, o genoma possui na extremidade 5’ uma região cap e não exibe uma cauda
poliadenilada na extremidade 3’(LINDENBACH, 2007; BOCK; GOODE, 2006). A tradução
do RNA viral é controlada por regiões não codificantes localizadas nas extremidades 5' e 3'
(DAEP; MUÑOZ-JORDÁN; EUGENIN, 2014).
O genoma tem uma extensão de aproximadamente 11 kilobases que codifica uma
poliproteína (com aproximadamente 3.400 aminoácidos) que co-traducionalmente e pós-
traducionalmente é processada por proteases do hospedeiro e do próprio vírus. Estas proteases
clivam a poliproteína que por fim resulta em três proteínas estruturais: capsídeo (C), proteína
da membrana (M) e glicoproteína do envelope viral (E) e sete proteínas não estruturais: NS1,
NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (figura 3) (BOCK; GOODE, 2006; GUZMAN et al.,
2010; MURRELL; WU; BUTLER, 2011). As proteínas estruturais possuem importante papel
na conformação da partícula viral fornecendo uma estrutura estável para comportar o RNA
viral e assim proteger o envelope lipídico, na estruturação dos vírions maduros e no processo
de replicação viral (ACOSTA; KUMAR; BARTENSCHLAGER, 2014; KUHN et al., 2002).
26
Figura 3 - Genoma do vírus da dengue
Fonte: Adaptado de Guzman (2015) e Screaton (2015).
2.5 Ciclo viral
O vírus da dengue possui tropismo por uma gama de células humanas, englobando as
células da linhagem fagocítica mononucleares como as células dendríticas, monócitos,
macrófagos e células de Langherans dentre os quais são os alvos primários. Quanto ou
sobre....a infecção nos linfócitos B e T, células Natural Killer (NK), células endoteliais,
hepatócitos e inclusive células neuronais, os estudos não são conclusivos (CLYDE; KYLE;
HARRIS, 2006; RODENHUIS-ZYBERT; WILSCHUT; SMIT, 2010). Esta variedade de
células possivelmente indica que o vírus se liga a moléculas de superfície celular presentes em
diferentes linhagens ou explora vários receptores para mediar a infecção (RODENHUIS-
ZYBERT; WILSCHUT; SMIT, 2010). Isto reflete a ampla capacidade de disseminação do
vírus em todo o organismo hospedeiro, conduzindo a uma gama de manifestações clínicas
(CRUZ-OLIVEIRA et al., 2015).
A interação entre as proteínas superficiais virais e os elementos que compõe a
membrana plasmática é peça chave para o reconhecimento do vírus pelas células (GROVE;
MARSH, 2011). Identificar qual a possível(eis) molécula(s) estaria envolvida(s) no
reconhecimento de vírus da dengue pelas células alvo ainda não foi definitivamente
identificado (HIDARI; SUZUKI, 2011). Mas, há diversos candidatos a receptores que tem
sido hipotetizados como o heparan-sulfato, receptor de laminina, DC-SIGN, (do inglês
dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin), o receptor de
manose e CD14 (CRUZ-OLIVEIRA et al., 2015).
O processo de replicação viral da dengue se inicia quando o vírus se fixa diretamente a
algum determinado receptor das células hospedeiras (SCREATON et al., 2015). Após a
entrada do vírus no citoplasma o genoma é traduzido, iniciando-se a síntese de um
27
intermediário de cadeia negativa, que serve como um molde para a produção de múltiplas
cópias de RNA viral de carga positiva. Sucessivos ciclos de tradução produzem uma única
poliproteína que é processada pelas proteases do vírus e do hospedeiro. O RNA é sintetizado
novamente e subsequentemente é empacotado pela proteína cápside, formando um
nucleocapsídeo. A moldagem do vírus ocorre na superfície do lúmen do retículo
endoplasmático rugoso derivando em partículas virais imaturas. Dentre os quais são
transportados para o compartimento de Golgi, onde a acidificação induz mudanças
conformacionais do vírus (BÄCK; LUNDKVIST, 2013; CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006;
SCREATON et al., 2015).
3 Características clínicas
As manifestações clínicas da dengue variam de inaparente ou assintomático até as

formas graves e fatais (CARABALI et al., 2015). Após o período de incubação, a doença
começa abruptamente e é seguida por três fases: febril, crítico e recuperação ou convalescença
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
3.1 Dengue clássica ou febre da dengue
A dengue clássica é uma doença febril aguda de início abrupto em que o período de
incubação dura entre 2-7 dias, a temperatura corporal pode alcançar 38ºC. A febre muitas
vezes é acompanhada de rubor facial, eritema cutâneo, dor generalizada pelo corpo, mialgia,
artralgia e dor de cabeça. Alguns pacientes podem ter tosse, fadiga, dor de garganta,
hiperemia conjuntival, além de anorexia, náuseas e vômitos (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1997; TANTAWICHIEN, 2012).
3.2 Febre hemorrágica da dengue e síndrome de choque da dengue
A principal diferença em termos fisiopatológicos que determina a severidade da doença

é o extravasamento plasmático. A Febre hemorrágica da dengue é caracterizada pelas
seguintes manifestações clínicas: febre alta, presença de manifestações hemorrágicas
(presença de prova do laço positiva, petéquias, equimoses ou púrpuras e etc.), e, muitas vezes,
hepatomegalia e problemas circulatórios, trombocitopenia moderada (<100.000/m/mL),
hemoconcentração com aumento do hematócrito em 20% na admissão ou queda do
28
hematócrito em 20% após o tratamento, presença de derrames cavitários e hipoproteinemia

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1997).
A Febre hemorrágica da dengue era classificada pela Organização Mundial da Saúde
(1997), de acordo com sua gravidade, em quatro graus. No primeiro grau, as manifestações
clínicas englobam uma febre acompanhada de sintomas inespecíficos em que a única
manifestação hemorrágica consiste na prova do laço positiva. No segundo grau, além das
manifestações do grau I, ocorrem hemorragias espontâneas leves. Colapso circulatório com
pulso fraco e rápido, estreitamento da pressão arterial ou hipotensão, pele pegajosa e fria, e
inquietação englobam o terceiro grau. O quarto grau é a classificação que define a síndrome
do choque da dengue em que existe o quadro clínico de choque profundo com ausência de
pressão arterial e pressão de pulso imperceptível (DIAS et al., 2010).
3.3 Nova classificação
Os critérios da Organização Mundial da Saúde em 2009 classificam a dengue de

acordo com os seguintes níveis diferenciados considerando a gravidade: dengue sem sinais de
alerta; dengue com sinais de alarme (dor abdominal, vômitos persistentes, acúmulo de líquido,
sangramento de mucosas, letargia, aumento do fígado e aumento do hematócrito com a
diminuição das plaquetas) e dengue grave (dengue com grave perda plasmática, hemorragia
grave ou falência de órgãos) (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
3.4 Infecções assintomáticas
O panorama epidemiológico dos indivíduos assintomáticos está relacionado a diversos

fatores que englobam o ambiente, as características peculiares do indivíduo, o vetor e o
próprio vírus (GUZMÁN; KOURÍ, 2002). A infecção assintomática (inaparente, subclínica ou
oligossomática) é definida como uma infecção pelo vírus da dengue sem apresentação de
manifestações clínicas ou um quadro leve caracterizado por uma febre indiferenciada (ENDY
et al., 2011). Estima-se que três quartos de 390 milhões de infecções pelo vírus da dengue a
cada ano são clinicamente assintomáticos, em vista que o indivíduo infectado passa a possuir
uma significante contribuição no ciclo de transmissão (DUONG et al., 2015). Além disso, a
imunidade pré-existente por infecções assintomáticas pode afetar a captação da vacina, bem
como a interpretação dos ensaios sobre a efetividade das vacinas (GRANGE et al., 2014).
3.5 Manifestações atípicas
29
Os estudos sobre manifestações atípicas ainda são em menor proporção na literatura.

As Manifestações atípicas da dengue são mais comuns do que realmente é relatado. No
processo fisiopatológico, o endotélio é o alvo dos mecanismos imunopatológicos na dengue e
dengue grave, estes mecanismos podem explicar o diversificado envolvimento sistêmico no
organismo (GULATI; MAHESHWARI, 2007). As alterações que acometem o sistema
neurológico desenvolvem a encefalopatia na FHD podendo apresentar-se de diversas formas
incluindo desde a depressão até distúrbios comportamentais. Pós-infecção pode haver
sequelas como amnésia, demência, psicose maníaca, síndrome de Reye 1 e meningoencefalite.
Dentre as manifestações gastrintestinais o paciente pode apresentar hepatite, falência hepática
fulminante, colecistite acalculosa, pancreatite aguda e diarreia febril (GULATI;
MAHESHWARI, 2007).
As manifestações cardíacas da dengue são as mais incomuns, entretanto há relatos de
manifestações irregulares incluindo distúrbios do ritmo cardíaco, como bloqueio
atrioventricular e fibrilação atrial. No que abrange as manifestações renais, pode ocorrer a
insuficiência renal aguda, embora seja rara nos casos de dengue. Nos aspectos respiratórios, a
dengue pode culminar na síndrome do desconforto respiratório agudo e hemorragia pulmonar
com ou sem hemoptise. Outras manifestações ocorrem mesmo que em menor proporção:
complicações linforreticulares e rabdomiólise (GULATI; MAHESHWARI, 2007). A
Síndrome de Guillain–Barré foi associada com a infecção por dengue em diversas populações
incluindo a brasileira (HIRA; KAUR; SHUKLA, 2012; RALAPANAWA; KULARATNE;
JAYALATH, 2015).
Estudos recentes têm evidenciado diversas manifestações atípicas em crianças e
adultos. Em uma pesquisa realizada na Índia, as manifestações atípicas mais comuns foram
hepatite, diarreia febril, insuficiência renal, colecistite acalculosa e anormalidades cardíacas.
Interessantemente nesta população, os níveis séricos de plaquetas não foram correlacionados
com a gravidade no quadro hemorrágico (NIMMAGADDA et al., 2014). Em crianças
indianas, foi identificado que as principais apresentações clínicas incomuns consistiram em
choque prolongado, hemorragia, dor abdominal, melhora clínica deficiente pós
convalescença, consciência prejudicada, letargia, agitação e trombocitopenia grave
(POTHAPREGADA; KAMALAKANNAN; THULASINGAM, 2016).
1
Síndrome de Reye é tipicamente precedida por uma infecção viral com um intervalo intermediário sem doença
de 3-5 dias. A explicação bioquímica para os sintomas é possivelmente uma desregulação generalizada do
metabolismo mitocondrial, resultando eventualmente em falha metabólica do fígado e outros tecidos. Tem sido
relacionada com a utilização do Ácido Acetilsalicílico (AAS).
30
4 Imunopatogênese
Os aspectos que envolvem a patogenia do vírus da dengue têm sido alvo de diversas
discussões e postulações de teorias. Três hipóteses tentam explicar a patogênese da FHD e
SCD: teoria da virulência (ROSEN, 1977); teoria sequencial (KOURI, 1987) e teoria integral
(HALSTEAD, 1980). Em 1977, Rosen defendia que a virulência e consequentemente a
severidade da dengue era condicionada por determinadas cepas do vírus. Considerando que
alterações da virulência do vírus podem ser induzidas por sucessivas passagens pelo sistema
do hospedeiro humano e também no vetor, ocorrendo variações genéticas na cepa (ROSEN,
1977).
A teoria proposta por Kouri (1987) considera que múltiplos fatores condicionam o
desenvolvimento da FHD e SCD. Três grupos de fatores estão nesta teoria: o primeiro grupo
de fatores envolve as particularidades individuais do indivíduo como a idade, o sexo, a raça e
doenças crônicas; o segundo grupo inclui fatores virais como a virulência e o sorotipo
infectante; por fim os fatores epidemiológicos como a presença de alta densidade de
infestação do vetor, e ampla circulação do vírus da dengue, interagindo com condições
ecológicas (BRAVO; GUZMÁN; KOURI, 1987; KOURI; GUZMÁN; BRAVO, 1987).
O fenômeno ADE (em inglês antibody dependent enhancement) ou teoria integral
proposta por Halsteald (1980) é a atual hipótese de explicação para a ocorrência da severidade
da dengue em reinfecções por sorotipos diferentes do DENV. Em que numa infecção
secundária com um sorotipo diferente, a presença de pequena quantidade de anticorpos
neutralizantes heterotípicos pode evitar a doença grave, entretanto, na ausência destes, os
anticorpos formam complexos (receptor Fc e anticorpos não neutralizantes) com os DENV,
que passam a infectar os fagócitos mononucleares com maior eficiência resultando na
infecção de um maior número de células (HALSTEAD, 1980, 1988, 2012).
A fisiopatologia da severidade da dengue é multifatorial consistindo em um balanço
entre o sistema imune do hospedeiro e aspectos genéticos que podem contribuir para a
proteção ou o desfecho patológico da doença. Como ilustrado na Figura 4, os possíveis
mecanismos envolvidos na patogênese da dengue incluem a presença de anticorpos
preexistentes que podem mediar a ADE, a ativação das células do sistema imune inato durante
a infecção, ativação do sistema complemento e das células T e B e enfim a produção de auto-
anticorpos (GUZMAN; HARRIS, 2015). Neste contexto, destaca-se o papel das citocinas, que
são liberados sequencialmente por diferentes tipos celulares como consequência da ativação
31
do sistema imune, desempenhando um papel crucial através da mediação do extravasamento

plasmático.
Figura 4 - Patogênese da infecção pelo vírus da dengue de acordo com a fase da doença
Fonte: Adaptado de Guzman, 2015.

Nota: DENV = vírus da dengue; Abs = anticorpos; ADE = aumento dependente de anticorpos; Ics =
imunocomplexos; DC = células dendríticas; Mo = monócitos/macrófagos; NS1 = proteína NS1; mT =
célula T de memórial; Tn = célula T; Treg = célula T reguladora; mB = célula B de memória; Bn =
célula B; NK = natural killer.
As citocinas consistem em um grupo diversificado de pequenas proteínas que são

secretadas por diversas células com a finalidade de promover a sinalização intercelular e
comunicação. Possuem específicas atividades parácrinas e endócrinas, através de ligação a
receptores, podendo induzir uma variedade de respostas dependendo da citocina e da célula
alvo. Dentre as muitas funções das citocinas estão o controle da proliferação e diferenciação
celular, regulação da angiogênese e atuação significativa nos desfechos do sistema imune e no
processo inflamatório (TISONCIK et al., 2012).
As citocinas também regulam a produção e a atividade de outras citocinas, podendo
elevar ou diminuir a resposta inflamatória (CURFS; MEIS; HOOGKAMP-KORSTANJE,
1997). Elas foram classificadas como: interleucinas (IL), fatores de necrose tumoral (TNF),
quimiocinas (citocinas quimiotáticas), interferons (IFN) e fatores de crescimento
mesenquimal (RAEBURN et al., 2002). De acordo com as ações no sistema imune as
citocinas também foram classificadas em pró-inflamatórias (Th1) ou anti-inflamatórias (Th2).
32
Dentre as pró-inflamatórias tem-se as interleucinas 1, 2, 6, 7 e FNT (fator de necrose tumoral)

e as anti-inflamatórias englobam a interleucinas 4, 10, 13 e FTC-β (fatortransformador de
crescimento β)(CURFS; MEIS; HOOGKAMP-KORSTANJE, 1997).
O panorama clínico da dengue surge após o período de dois a sete dias no momento
pós-incubação em consonância com a viremia. Neste contexto, níveis séricos elevados de
citocinas têm sido correlacionados com o desenvolvimento e agravamento do quadro clínico
como a IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN-γ e TNF (BUTTHEP et al., 2012;
HALSTEAD, 2012; MANGIONE et al., 2014; SRIKIATKHACHORN; GREEN, 2010). Foi
desenvolvida uma teoria intitulada “cytokine storm” (em português: tempestade de citocinas)
a qual enfatiza que a desregulada produção de citocinas devido a ativação maciça de células T
durante o processo infeccioso contribui para a severidade da doença (DONG et al., 2007;
ROTHMAN, 2010). De acordo com a teoria do pecado original antigênico o hospedeiro tem
uma alteração nos níveis de citocinas que o sensibiliza ao agravamento quando há um
aumento considerável de células T de memória que se sobrepõe sobre as células T de alta
afinidade para a infecção (MONGKOLSAPAYA et al., 2003).
Adicionalmente, foi proposto um modelo para a fisiopatologia da dengue em que a
produção de citocinas por monócitos durante a infecção desencadeia uma cascata de eventos
que leva o aumento de citocinas (CHEN; WANG, 2002) e consequentemente provoca o
aumento da permeabilidade vascular (COSTA et al., 2013; TISONCIK et al., 2012). Em vista
a particularidade das citocinas em induzir a liberação e a produção de outras citocinas
formando uma rede complexa com aumento dos seus respectivos níveis e mediadores
(GREEN; ROTHMAN, 2006; ROTHMAN, 2004). Os efeitos no organismo destas citocinas
podem ser sinérgicos, como por exemplo, o TNF-α, a IFN-γ e IL-10 em conjunto induzem o
aumento da permeabilidade vascular (LOPEZ-RAMIREZ et al., 2016). Devido a estas
particularidades na homeostase do organismo humano as citocinas TNF-α, IFN-γ e IL-10
destacam-se na identificação de biomarcadores de severidade da doença em diversas
populações e tem sido campo de diversos estudos.
4.1 Polimorfismos em genes envolvidos na regulação do sistema imune e dengue
Polimorfismo de nucleotídeo simples ou SNP (do inglês Single Nucleotide

Polymorphism) configura-se como uma variação do genoma, que ocorre em um ou poucos
nucleotídeos e que se distingue de outras raras variações por apresentar uma frequência
populacional de pelo menos 1%. O interesse pela pesquisa em relação aos SNPs vem das
33
perspectivas de contribuição para identificação do perfil genético da população quanto a

susceptibilidade a patologias de importância epidemiológica e clínica (BROOKES, 1999).
Os SNPs podem abranger diversas regiões no gene, alguns ocorrem nos éxons (também
denominados estruturais) podendo modificar a sequência de aminoácidos codificadas que
posteriormente serão expressas. Geralmente é responsável por mudanças na estruturada
proteína podendo culminar na perda ou redução da função ou da capacidade de ligação
(NUSSBAUM et al.,2002). SNPs encontrados em regiões gênicas não-codificantes (íntrons)
ou em regiõesr eguladoras/promotoras não ocasionam em alterações na sequência de
aminoácidos, entretanto, podem alterar a expressão gênica (OLLIER, 2004). A figura 5
representa um esquema dos possiveis efeitos dos SNPs em genes de citocinas.
Figura 5 - Esquematização dos SNPs em genes de citocinas e seus possíveis efeitos
Fonte: adaptado de Ollier, 2004
Há evidências de que SNPs que estão presentes nos genes de várias moléculas
envolvidas no processo inflamatório podem interferir na síntese e na modulação da resposta
inflamatória (ABRAHAM; KROEGER, 1999; DE MAAT et al., 2004; MULLER et al., ;
WILSON et al., 1997). Diversos polimorfismos em genes de proteínas envolvidas no sistema
imune têm sido relacionados com a susceptibilidade para a dengue: antígenos leucocitários
humanos (HLA), receptores de anticorpos, mediadores imunes/inflamatórios, moléculas
ligantes, citocinas e outros fatores que exercem efeitos imunomoduladores (LAN;
34
HIRAYAMA, 2011). As evidências genéticas relacionadas ao sistema imune fornecem dados

sobre a patogênese da dengue e perspectivas sobre novas opções de prevenção e tratamento
(LAN; HIRAYAMA, 2011; VANNBERG; CHAPMAN; HILL, 2011). A cascata de citocinas
tem sido citada como a causa de extravasamento plasmático (ROTHMAN, 2010). A produção
destas pode ser mediada por polimorfismos que estão associados com a susceptibilidade à
infecção (FERNÁNDEZ-MESTRE et al., 2004).
4.1.1 Polimorfismo do gene TNF-alfa (TNFA -308G/A)
O fator de necrose tumoral (em inglês: Tumour Necrosis Factor - TNF) (Figura 6) é
uma citocina pró-inflamatória produzida por monócitos/macrófagos e células T e B. O gene
TNF encontra-se na região do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe III
no braço curto do cromossomo 6 (6p21.31) (AGUILLÓN G et al., 2002; JACOB, 1992).
Estas citocinas possuem um papel fundamental na regulação da diferenciação, proliferação e
morte celular, no processo inflamatório e nas respostas do sistema imune adaptativo e inato
(QIDWAI; KHAN, 2011).
Figura 6 - Localização do gene TNF no complexo HLA de classe III
Fonte: Flori, 2005.

Nota: símbolos da cor ( ) representa éxon e ( ) íntron.
A regulação transcricional do gene do TNFA é essencial para evitar os efeitos

deletérios na síntese inadequada ou excessiva de TNF. Variações genéticas localizadas na
região promotora deste gene potencialmente afetam a transcrição e sua expressão, e, por
conseguinte, desempenha um papel em certas doenças associadas com a expressão elevada de
TNF (ABRAHAM; KROEGER, 1999; JACOB, 1992). A variação genética na região
promotora do TNFA na posição -308G/A (rs1800629) é a mais investigada em estudos de
associação, e resulta em duas formas alélicas, em que a presença de guanina (G) define a
variante comum e a presença de adenina (A) define a variante menos comum. Neste contexto,
35
o alelo A foi associado com o aumento transcricional em comparação com o alelo G

(WILSON et al., 1997).
Diversos estudos têm associado polimorfismos na região promotora na posição -308
com a susceptibilidade e agravamento a diversas doenças, como o risco para o
desenvolvimento da hipertensão arterial crônica na população Malasiana (GHODSIAN et al.,
2015), susceptibilidade a diabetes mellitus tipo 2 (SAXENA; SRIVASTAVA; BANERJEE,
2013) e agravamento do quadro clínico da Malária na população Indiana (SINHA et al., 2008)
e com o risco para o desenvolvimento o câncer cervical na população Argentina (BARBISAN
et al., 2012).
Um estudo caso-controle realizado com uma população do sudeste do Brasil
identificou uma associação entre o alelo A do gene TNFA na posição -308 com a proteção à
hanseníase (CARDOSO et al, 2011) essa associação esteve em consonância com outros
estudos realizados no Brasil (SANTOS et al., 2000, 2002). Em um estudo caso-controle
realizado com pacientes com colite ulcerativa na região nordeste, o gene TNFA evidenciou o
alelo A como fator de risco para a susceptibilidade à doença (TAVARES et al., 2016).
Nenhuma associação foi identificada quando investigado este polimorfismo com a
tuberculose em um estudo caso-controle conduzido com pacientes do sudeste brasileiro
(MILANO et al., 2016).
Os estudos têm evidenciado altos níveis séricos de TNF-α em pacientes com febre
hemorrágica da dengue e febre da dengue (LIAO et al., 2015; SOUNDRAVALLY et al.,
2014; VILLAR et al., 2013). O alelo A foi identificado como possível fator de risco genético
para a febre hemorrágica da dengue em estudo realizado com a população cubana (PEREZ et
al., 2010), enquanto que na população do Sri Lanka o genótipo GG foi associado como risco
para o desenvolvimento da febre hemorrágica da dengue (FERNANDO et al., 2015).
Entretanto, na população Mexicana e Venezuelana não foi identificado nenhuma

associação (GARCÍA-TREJO et al., 2011; VEJBAESYA et al., 2009). Na população
brasileira, este polimorfismo não foi associado com a infecção em crianças com febre
hemorrágica da dengue na região sudeste (XAVIER-CARVALHO et al., 2013) e em adultos
com febre da dengue na região norte (FEITOSA et al., 2016).
4.1.2 Polimorfismo do gene interleucina-10 (IL-10 -819C/T)
A Interleucina 10 (IL-10) é uma citocina que possui efeitos pleiotrópicos e regula as

funções imunitárias, promovendo a supressão das respostas imunes. As capacidades autócrina
36
e parácrina da IL-10 através da ligação direta com leucócitos e controle das respostas imunes
são consideradas a principal função desta citocina. A secreção ocorre a partir de células T,
macrófagos e outros leucócitos seguidos por subsequente ligação aos receptores de
macrófagos e células dendríticas (CD) (SHALEV et al., 2011). Esta citocina também atua na
minimização da produção de citocinas relacionadas com Th1 (IL-12 e IFN-γ) e estimula o
aumento dos níveis de citocinas relacionadas com Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) (COPE et al.,
2011).
Além disso, o aumento dos níveis de IL-10 tem sido associado com o aumento da
atividade da morte celular programada (HATACHI et al., 2003; SHALEV et al., 2011).
Adicionalmente, a IL-10 é eficaz na redução dos níveis de outras citocinas pró-inflamatórias:
IL-2, IL-6, IL-1β, IL-12, TNF-α e IFN-γ, em ambas as situações estimuladoras e relacionadas
com a presença ou ausência de antígenos suficientes (SHALEV et al., 2011; TANG-
FELDMAN et al., 2011). Consequentemente, a redução destas citocinas minimiza a
maturação de leucócitos, o recrutamento e o processo inflamatório (FROSSARD;
EIGENMANN, 2008). O gene IL-10 corresponde ao cromossomo 1q31-32 como é
representado pela Figura 7.
Figura 7 - Localização do gene IL-10 no cromossomo 1
Fonte: Aguilon, 2002.
O SNP -819 do gene IL-10 tem sido evidenciado na literatura pelo seu papel na
susceptibilidade à endometriose na população da România (MALUTAN et al., 2016),
síndrome do ovário policístico em mulheres egípcias (TALAAT et al., 2016) e pré-eclâmpsia
37
na população chinesa (LIU et al., 2015). Análises metanalíticas identificaram a associação

deste SNP com o risco de câncer de pulmão (LAN; LAN; FAXIANG, 2015) e o risco para
desenvolvimento de tuberculose especialmente em asiáticos (GAO et al., 2015). Um estudo
realizado no Brasil na região sudeste com enfoque na hanseníase (SANTOS et al., 2002)
identificaram associação do genótipo TT com a susceptibilidade a doença, enquanto que uma
metanálise concluiu que o alelo T está associado com o desfecho clínico da hanseníase
(ALVARADO-ARNEZ et al., 2015). Na região norte, o SNP -819 do gene IL-10 foi
correlacionado com a predisposição à malária e a consecutiva diminuição dos níveis séricos
desta citocina e com a baixa densidade parasitária (PEREIRA et al., 2015).
Altos níveis séricos de IL-10 em pacientes com febre hemorrágica da dengue têm sido
relatados na literatura (MALAVIGE et al., 2012, 2013; PANDEY et al., 2015; PÉREZ et al.,
2004). A maioria dos estudos não evidenciou associação genotípica e alélica do polimorfismo
do gene IL-10 na posição -819 com a dengue (FERNANDO et al., 2015; PEREZ et al., 2010;
SAM et al., 2015; XAVIER-CARVALHO et al., 2013). Entretanto, na população Indiana o
genótipo T/C foi associado com a redução do risco para o desenvolvimento da febre
hemorrágica da dengue (ALAGARASU et al., 2015).
4.1.3 Polimorfismo do gene Interferon gama (IFNG +874A/T)
Os interferons são citocinas que desempenham um papel complexo na resistência do

hospedeiro em consequência a atuação de agentes patogênicos. Células que são infectadas por
vírus secretam o interferon alfa e beta (interferons tipo I) enquanto que o interferon - γ
(interferon do tipo II) é secretado principalmente por células Natural Killer (NK). Dentre as
propriedades do IFN-γ estão incluídos a regulação da resposta imune, estimulação da
atividade fagocitária e de moléculas componentes do complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) classe I e II, interações de leucócito com o endotélio,
proliferação celular e apoptose (BOEHM et al., 1997). O IFN-γ é capaz de regular
positivamente a expressão de receptores Fcg em monócitos e macrófagos, assim, facilita a
replicação viral (PRESTWOOD et al., 2012).
O gene do IFNG, representado na figura 8, está localizado no braço longo do
cromossomo 12 (12q24.1), estende-se por cerca de 5,4kb e contém quatro éxons que
codificam uma proteína de 146 aminoácidos (HAYDEN et al., 1997). O polimorfismo
funcional (rs2430561) do gene IFNG que consiste na substituição da adenina (A) por uma
timina (T) na posição +874 foi correlacionado com o aumento da expressão desta citocina, Os
38
genótipos TT, TA e AA estão associados com a alta, intermediária e baixa produção de IFN-γ,
respectivamente (PRAVICA et al., 2000). Revisões sistemáticas com metanálise identificaram
a associação genotípica e alélica deste gene com a susceptibilidade e proteção com a
tuberculose (CHANG et al., 2010; DE ALBUQUERQUE et al., 2012) e o quadro clínico da
hanseníase (SILVA et al., 2014).
Um estudo conduzido com a população brasileira na região norte sugeriu que a
presença do alelo A do gene IFNG na posição +874 conferiu susceptibilidade a infecção pelo
HIV e consequente diminuição dos linfócitos T CD4+(BONFIM FREITAS et al., 2015). Na
região centro-oeste o genótipo TT foi correlacionado com o desenvolvimento de pré-
eclâmpsia grave e o aumento dos níveis séricos (PINHEIRO et al., 2015). Recentemente, o
genótipo A/T foi associado com a proteção à febre da dengue na população brasileira
(FEITOSA et al., 2016a) e o alelo A foi associado com a não persistência dos sintomas da
dengue na infecção primária e a persistência dos sintomas na infecção secundária.
Figura 8 - Localização do gene IFNG no cromossomo 12
Sítio de ligação NF-kB
IFNG
Éxon 1 2 3 4
5' 3'
rs2069727
rs2069718
rs2069728
rs2193050
MicrosatelliteC
rs2430561
rs1861493
rs2069732
rs2069707
rs2069705
A(11-22)
Fonte: Adaptado de Nie, 2014.

Nota: São apresentados nove polimorfismos de nucleotídeos simples e o microssatélite no íntron 1, um
sítio de ligação (NF-kB), que pode ter consequências funcionais para a transcrição da proteína.
5 Métodos de identificação viral
O diagnóstico da dengue é exclusivamente laboratorial, considerando que as

características clínicas da doença não são específicas e presumíveis de confusão no
diagnóstico com outras doenças exantemáticas. Várias técnicas convencionais laboratoriais
estão disponíveis para o diagnóstico, a confirmação da dengue pode ser feita através de
39
isolamento viral, amplificação do genoma, detecção de antígenos e anticorpos específicos

através de sorologia e biossensores (BHAT et al., 2015). Há duas fases diferentes no
diagnóstico da dengue, sendo a primeira fase febril quando o paciente está em pico virêmico
e, segundo, quando os pacientes começam a formar anticorpos específicos como representado
na Figura 9 (RATHAKRISHNAN; SEKARAN, 2013).
Figura 9 - Curso do tempo da dengue e a adequação do diagnóstico
Fonte: Adaptado de Rathakrishnan (2013).
5.1 Isolamento viral
O isolamento viral é considerado a técnica padrão-ouro para a identificação de infecção

por dengue (PARKASH; SHUEB, 2015). É realizado através da inoculação no soro ou plasma
do paciente com o vírus da dengue, cérebro de camundongo ou em cultura de células de
mamífero ou de mosquito. Entretanto, esta técnica não é geralmente útil no diagnóstico
clínico e para a gestão devido as limitações em relação à disponibilidade e o alto custo
(BHAT et al., 2015).
5.2 Amplificação do genoma ou amplificação de ácidos nucleicos
A detecção do vírus pode ser realizada pela amplificação de ácido nucleico utilizando
qPCR (reação da polimerase em cadeia em tempo real). Esta técnica proporciona várias
40
vantagens, incluindo a capacidade de diferenciar os sorotipos, pode ser um ensaio quantitativo

que quando combinado com a tecnologia em tempo real possui maior sensibilidade (KONG et
al., 2006). No entanto, o teste de qPCR é caro e exige equipamento especializado e pessoal
qualificado, assim, limitando sua utilização em muitos países em desenvolvimento
(CASTRO-JORGE et al., 2010). Outros métodos de PCR têm sido descritos como
metodologia de identificação viral: PCR convencional, Nested PCR, PCR multiplex e
amplificação baseada na sequência de ácidos nucleicos (NASBA) (WRIGHT; PRITT, 2012).
5.3 Diagnósticos sorológicos
Os testes sorológicos são os mais amplamente utilizados para a detecção de infecções

pela dengue em países com recursos limitados além disso são relativamente baratos e fáceis
de manusear. Estes testes incluem a inibição de hemaglutinação (IH), NS1 e ELISA ( em
inglês: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) para detectar anticorpos de imunoglobulina M
(IgM) e imunoglobulina G (IgG) (PARKASH; SHUEB, 2015). Ainda há o teste de fixação de
complemento e o teste de neutralização (DE PAULA; FONSECA, 2004).
O ensaio ELISA específico para IgM e IgG é dependente da resposta imune do
hospedeiro e do tempo necessário para a produção de anticorpos IgM/IgG contra os antígenos
do vírus da dengue. Na maioria dos casos, o primeiro anticorpo IgM detectável aparece
apenas entre o quarto e quinto dia doença, enquanto o anticorpo IgG aparece no sétimo dia. O
teste ELISA IgG identifica infecções secundárias e é utilizado para distinguir a infecção em
primária ou secundária (BHAT et al., 2015).
Os anticorpos IgM são detectáveis em 80% dos casos de dengue no quinto dia da
doença e em 99% até o décimo dia da doença, o que pode, em seguida, permanecer detectável
durante mais de três meses (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009). Este teste somente
identifica a infecção recente (IgM) ou passada (IgG) e não pode identificar o tipo de vírus
infectante. Ainda há a limitação em relação à infecção cruzada, em vista que os flavivirus
compartilham de epítopos antigênicos (BHAT et al., 2015).
5.4 Biossensores
O desenvolvimento de biossensores para o diagnóstico da dengue ainda está em sua

fase inicial e não tem sido comercializada. Os biossensores podem superar as limitações de
ELISA por exemplo, pois a tecnologia do biossensor tem sensibilidade semelhante ou
superior à do ELISA e com possibilidade de portabilidade e compartimentalização. Além
41
disso, a tecnologia é de fácil manejo e o custo é acessível, possibilitando também a

monitorização contínua ao analisar o alvo em matrizes complexas com a utilização de uma
quantidade mínima de amostra (PARKASH; SHUEB, 2015).
6 Terapêutica
Atualmente, nenhum tratamento farmacológico está disponível para a terapia da

dengue. A maioria dos casos sintomáticos pode ser tratada no ambiente domiciliar do paciente
com repouso e terapia de suporte sem a necessidade de hospitalização. O tratamento a nível
hospitalar é realizado em casos mais graves e inclui soroterapia, transfusão de hemoderivados,
terapia de suporte e gerenciamento das complicações (BHAT et al., 2015).
No manejo domiciliar a maioria dos pacientes é tratado com medicamentos
antipiréticos como paracetamol, banho morno, repouso adequado complementado com
hidratação oral. A monitoração diária de perda de peso e da urina, se possível, auxilia na
manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico. A ingestão de antiagregantes plaquetários como a
aspirina, ácido mefenâmico e ibuprofeno deve ser evitada, devido ao risco de complicações da
doença (trombocitopenia). Adicionalmente, pacientes que desenvolvem sinais de alerta
necessitam monitorização constante imediata a nível hospitalar (BHAT et al., 2015).
7 Prevenção
Aumento das taxas de hospitalização por dengue grave, durante os surtos, resulta em
perdas econômicas enormes para os serviços de saúde. Na ausência de terapia antiviral
específica, o controle da transmissão de DENV pelo vetor é o método mais viável para a
diminuição da morbidade associada à dengue (FARES et al., 2015; GHOSH; DAR, 2015).
Entretanto, as estratégias de controle do vetor por si só não têm sido capazes de alcançar
satisfatoriamente a redução na transmissão viral (PEPIN et al., 2013; REGIS et al., 2013).
Neste contexto, a implementação de uma vacina contra a dengue que seja eficaz e de baixo
custo como medida suplementar é uma alta prioridade para a saúde pública (GHOSH; DAR,
2015).
42
8 OBJETIVOS
8.1 GERAL
Identificar o papel de fatores genéticos do sistema imune inato na infecção e

progressão da dengue.
8.2 ESPECÍFICOS
 Avaliar as frequências alélicas e genotípicas dos SNPs nos genes TNFA (-308G/A), IL-10
(-819C/T) e do IFNG (+874T/A) em pacientes com dengue e controles da população
alagoana;
 Investigar a associação dos SNPs nos genes TNFA (-308G/A), IL-10 (-819C/T) e do IFNG
(+874T/A) com a infecção e progressão da dengue em uma população alagoana;
 Identificar a associação da combinação de SNPs nos genes TNFA (-308G/A) IL-10 (-
819C/T) e do IFNG (+874T/A) na infecção e progressão da dengue em uma população
alagoana.
43
9 MATERIAL E MÉTODOS
9.1 Delineamento do estudo
O tipo de estudo observacional o desenvolvimento desta pesquisa foi o de caso-

controle, propõe determinar a possível associação entre a infecção por dengue e os
polimorfismos genéticos dos SNPs TNFA -308G/A, IL-10 -819C/T e IFNG +874T/A. As
análises moleculares foram conduzidas no LABMEG - Laboratório de Biologia Molecular e
Expressão Gênica, vinculados à Universidade Federal de Alagoas - Campus Arapiraca. Este
estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa de Alagoas (FAPEAL) através do
edital Programa Primeiros Projetos (PPP) 02/2011 com o projeto de pesquisa intitulado
“Polimorfismo genético de pacientes com dengue: associação com a infecção e progressão da
doença”.
9.2 População e local do estudo
A pesquisa foi realizada no município de Arapiraca, estado de Alagoas, Brasil, que

consiste no principal município da região metropolitana do Agreste. Os locais de coleta de
amostras de sangue periférico do grupo caso foram realizados em convênio com o Laboratório
Municipal de Arapiraca. A amostragem do presente estudo consistiu em uma seleção de
participantes não probabilística por conveniência.
Os pacientes com suspeita de dengue que procuraram o atendimento nos centros de
saúde do município foram encaminhados ao Laboratório Municipal para confirmação
laboratorial. Após a chegada na instituição, os profissionais de saúde informavam a todos os
pacientes sobre a pesquisa, liam o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), e os
que aceitavam participar, assinaram o TCLE o para fornecimento da amostra biológica. A
amostra final foi composta por 78 indivíduos confirmados laboratorialmente para a infecção
por febre da dengue (FD) pelo teste imunológico ELISA (Panbio® Dengue IgM Capture
ELISA, Brasil).
Pacientes com complicações devido à dengue e que foram hospitalizados na instituição
filantrópica Nossa Senhora do Bom Conselho (Hospital Regional de Arapiraca) durante os
anos de 2010 a 2015 foram incluídos no grupo caso. O recrutamento dos pacientes do grupo
febre hemorrágica da dengue (FHD) teve como base a análise das fichas de notificação
compulsória presentes no Hospital Regional de Arapiraca. Após a identificação, listagem e
44
organização de acordo com as manifestações clínicas registradas dos pacientes hospitalizados

foram iniciadas as coletas de material biológico que ocorreram nas residências durante seis
meses. As manifestações clínicas e laboratoriais dos pacientes foram revisadas e todos os
pacientes com trombocitopenia (<80.000 plaquetas/mm3) e confirmados laboratorialmente
para a infecção foram incluídos para coleta de material biológico.
A lista inicial de pacientes era composta por 130 indivíduos, entretanto alguns não
concordaram em participar da pesquisa, vieram a óbito ou haviam se mudado no momento das
visitas nas residências. Assim, a amostra final deste estudo compreendeu 49 pacientes que
foram classificados como febre da dengue hemorrágica. A classificação dos casos de dengue
nas instituições de saúde foi obtida segundo os critérios definidos pela Organização Mundial
da Saúde (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1997).
O grupo controle foi composto por 135 voluntários saudáveis sem relatos de
hospitalização por dengue e/ou sinais clínicos da dengue ou de outra patologia que se
dispuseram a participar da pesquisa. Todos os indivíduos foram investigados
laboratorialmente para a presença do vírus da dengue através do teste imunológico ELISA
(Panbio ® Dengue IgM Capture ELISA, Brasil) e o teste rápido (Abon-Bioeasy Diagnóstica,
Brasil). Os testes foram realizados pelo Laboratório de Análises Clínicas Dr. Edler Lins. As
características gerais das populações em estudo estão listadas na Tabela 1.
Tabela 1 – Características gerais dos pacientes com dengue e controles recrutados
Grupo Gênero Média de idade (anos) ± DP

Masculino Feminino
DEN 50 77 33.99 ± 16.4
Febre da dengue 30 48 32.77 ± 15.4
Febre hemorrágica da dengue 20 29 35.4 ± 18.1
Controle saudável 72 63 22.4 ± 4.9
Fonte: Autor, 2017.
Nota: DEN= febre da dengue + febre hemorrágica da dengue; DP=desvio padrão.
9.3 Critérios de inclusão e exclusão
Os pacientes com febre dengue incluídos no estudo foram aqueles que procuraram o
serviço de saúde e tiveram confirmação laboratorial para a infecção. Os pacientes incluídos no
grupo febre hemorrágica da dengue foram os que apresentaram trombocitopenia (80.000
plaquetas/mm3) hospitalizados entre os anos de 2010 a 2015 e que consentiram participar
45
desta pesquisa. Os pacientes que não concordaram em participar da pesquisa, com resultado
sorológico negativo para infecção da dengue, gestação ou puerpério foram excluídos da
pesquisa.
9.4 Extração de DNA genômico
A extração do DNA genômico foi realizada de duas formas: para o grupo casos e
controles foi realizada extração a partir de sangue periférico conservado em tudo para coleta
sanguínea contendo EDTA de acordo com as instruções do fabricante do Kit comercial
(FlexiGene® DNA Handbook- Qiagen, Germany e Wizard® Genomic DNA, Brasil). Para o
grupo dos pacientes com progressão da doença, a extração do material genético foi realizada
através do swab de células da mucosa oral pelo método de NaCl, etanol e proteinase K diluída
em 10 mg/mL, resultando em 50 ng/mL de DNA como descrito no anexo A. Esta técnica foi
realizada devido a alguns pacientes se sentiram incomodados pela realização da punção
venosa periférica (ABRÃO et al., 2005b). Após o processo de extração, todas as amostras
foram quantificadas por espectrofotometria através do espectrofotômetro BioPhotometer plus
(Eppendorf® AG, Hamburg, Germany) e a razão das absorbâncias nos comprimentos de onda
260 e 280 nm (nanômetro) que estiveram entre 1,7 e 1,9 apresentaram um DNA mais puro.
Adiante, as amostras foram estocadas a –20 °C.
9.5 Eletreforese em gel de agarose
A integridade quantitativa e qualitativa das amostras de DNA genômico foi verificada

através de eletroforese em gel de agarose a 1% utilizando tampão TAE (Tris mmoles/L,
acetato e EDTA a 1mmol/L com pH 8,0). A migração eletroforética foi realizada a 100V,
60mA por 60 minutos em cuba horizontal com fonte LPS 1000V (Loccus biotecnologia®,
Brasil). Para referência em relação ao tamanho molecular de DNA foi utilizado um marcador
de 100pb (Invitrogen® Corporation, USA). As bandas foram visualizas por luz ultravioleta
após coloração do gel com brometo de etídio (mg/mL) e documentadas através do sistema de
captura de imagem (Loccus Biotecnologia, São Paulo, Brasil).
9.6 Genotipagem dos genes das citocinas TNFA -308G/A e IL-10 -819C/T
A identificação dos SNPs dos genes das citocinas TNFA -308G/A e IL-10 -819C/T foram
determinadas pela técnica de reação de cadeia da polimerase em tempo real (qPCR), através
46
do método de discriminação alélica utilizando o ensaio Taqman (Applied Biosystem®,

Califórnia, USA) como ilustrado na figura 10. As amostras de DNA diluídas foram
amplificadas através de uma reação de qPCR com um volume final de 10 µL, contendo 5 µL
de solução TaqMan Genotyping Master Mix (Applied Biosystems®, Califórnia, USA); 0,125
µL de sonda referente ao SNP alvo e 4,87 µL de cada amostra. As reações foram realizadas
pelo equipamento ABI StepOne plus da Applied Biosystems® sob as seguintes condições:
95ºC por 10 min, seguido de 40 ciclos de 92ºC por 15s e 60ºC por 1min. Em todas as reações
foram utilizados um controle negativo (reação sem a amostra do DNA) e um controle positivo
(amostra de DNA com o polimorfismo previamente identificado). Os resultados das reações
foram fornecidos pelo software do aparelho em forma de relatório com as curvas de
amplificação da discriminação alélica de cada indivíduo.
Figura 10 - Exemplo da determinação e amplificação genotípica por qPCR
Fonte: Autor, 2017.

Nota: Exemplo da genotipagem (a) e da curva de amplificação (b) do gene TNFA -308G/A, mostrando
os genótipos GG (em azul), GA (verde) e AA (vermelho) e as amostras indeterminadas representadas
pelo símbolo x.
47
9.7 Genotipagem do gene da citocina IFNG +874T/A
O SNP do gene IFNG na posição +874T/A foi identificado pelo método ARMS – PCR
(do inglês: Amplification Refratory Mutation System). O volume final de 20µL era composto
por1 µL de primer genérico,1 µL de primer especifico A ou 1µL de primer especifico T (a
depender do mix da reação), 1 µL de controle interno sense (hormônio de crescimento
humano), 1 µL de controle interno antisense, 0.8µL de dNTP (10 mM), 2.4 µL de MgCl2 (25
mM), 3 µL de tampão (NH4)2SO4, 0.5 µL de Taq DNA polimerase (5 U/µL), 7.3µL água livre
e 2 µL de DNA genômico. Os primers utilizados para a genotipagem estão listados na Tabela
2.
Tabela 2 – Sequências dos primers utilizados para as genotipagens do SNP no gene IFNG
+874T/A.
Sequência dos primers

Primer genérico 5’-TCAACAAAGCTGATACTCCA-3’
Alelo específico A 5’-TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3’
Alelo específico T 5’-TTCTTACAACACAAAATCAAATCT-3’
Controle interno (hormônio do
5’-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3’
crescimento) sense
Controle interno (hormônio do
5’-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3’
crescimento) antisense
Fonte: Autor, 2017.
ARMS-PCR foi realizado em um termociclador (Biocycle®, China) com o seguinte

ciclos: 95ºC (3 min), 10 ciclos de 95ºC (15 s), 65ºC (50s) e 72ºC (40 s), seguido por 20 ciclos
de 95ºC (20 s), 55ºC (50 s) e 72ºC (50 s), 72ºC (7 min) e 4ºC (temperatura de finalização). A
amplificação do fragmento foi confirmada em corrida eletroforética utilizando o tampão TAE
(Tris-Acetato-EDTA) em gel de agarose a 3% com um marcador de peso molecular de 100bp
(Invitrogen® Corporation, USA). Posteriormente, os fragmentos foram observados utilizando
equipamento de foto documentação (Loccus biotecnologia®, Brasil) conectado a um
computador com um sistema de captura de imagens como representado pela Figura 11.
48
Figura 11 - Exemplo da determinação genotípica por PCR –ARMS
Fonte: Autor, 2017.
9.8 Análises estatísticas
As frequências gênicas e alélicas foram organizadas manualmente com o auxílio pelo

Microsoft® Office Excel. A análise de Equilíbrio de Hardy-Weinberg da população em estudo
foi realizada através do Teste Qui-quadrado (χ2) utilizando a tabela de contingência de 2x2,
considerando um intervalo de confiança limite de α/5%. As análises das correlações entre as
frequências gênicas e alélicas em relação a susceptibilidade à infecção foi realizada pelo
software on line gratuito SNPstats - https://www.snpstats.net/snpstats/start.htm (SOLÉ et al.,
2006) e pelo software BioEstat versão 5.0, respectivamente.
Foram considerados os fatores intrínsecos que poderiam influenciar o perfil da
população e assim ajustados pelos dados em relação a idade e gênero. O modelo codominante,
dominante, recessivo, sobredominante e log-aditivo foram considerados para avaliar o risco
de susceptibilidade ou progressão a dengue associado a cada SNP. Os critérios Akaike
information criterion (AIC) e Bayesian Information Criterion (BIC) foram utilizados para
determinar o melhor modelo de herança. O odds ratios (OR) e os intervalos de confiança de
95% (IC) foram calculados considerando OR <1 associado com proteção e OR/ 1 associado a
susceptibilidade/risco.
Para ilustração dos resultados das frequências alélicas e genotípicas e respectivas
associações e combinações houve a distribuição dos pacientes com dengue em três grupos:
“DEN” que consiste no agrupamento de todos os indivíduos diagnosticados com dengue sem
distinção em relação a classificação clínica, os pacientes com características de dengue
clássica foram enquadrados no grupo “FD” e os pacientes com complicações da doença foram
49
denominados “FHD”. Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente

significativos.
9.9 Aspectos éticos
O estudo obteve a anuência da secretaria de saúde do município de Arapiraca e do

hospital regional. E posteriormente, o projeto foi provado pelo comitê de ética e pesquisa da
Universidade Federal de Alagoas (UFAL) sob parecer número: 1.073.204 (anexo B) e todos
os participantes assinaram o termo consentimento livre e esclarecido (TCLE) como descrito
no anexo C.
50
10 RESULTADOS
As frequências genotípicas dos três polimorfismos aqui estudados estavam dentro dos
parâmetros do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) na população em estudo.
10.1 Frequência genotípica e alélica do SNP-308G/A do gene TNFA
Na Tabela 3 é evidenciada a distribuição genotípica e alélica do polimorfismo do

respectivo gene no grupo caso e controles saudáveis. A análise das frequências genotípicas e
alélicas mostrou que o genótipo G/G apresentou a maior prevalência em todos os grupos em
investigação: DEN (80,3%), FD (80,8%) e FHD (79,6%) controles (73,3%). O grupo FHD
não apresentou nenhuma frequência em relação ao genótipo A/A. Quanto à distribuição
alélica do polimorfismo-308 do gene TNF-α, o alelo G foi o mais frequente em todos os
grupos.
Tabela 3 - Distribuição genotípica e alélica do SNP-308G/A do gene TNFA em pacientes com

dengue e controles
N (frequência %) EHW
Genótipo Controle DEN FD FHD x2 (p)
G/G 99(73,3) 102(80,3) 63(80,8) 39(79,6) 0,0003 (0,98)
G/A 33(24,4) 24(18,9) 14(17,9) 10(20,4)
TNFA -308G/A A/A 3(2,2) 1(0,8) 1 (1,3) 0 (0)
Alelo
G 231 (85,6) 228 (86,3) 140 (89,7) 88 (89,7)
A 39 (14,4) 36 (13,7) 16 (10,3) 10 (10,3)
Fonte: Autor, 2017.
Na Tabela 4 é evidenciada a associação alélica e dos modelos gênicos do SNP -308G/A

do gene TNF-α entre o grupo caso e suas respectivas categorizações e o grupo controle. A
comparação das frequências do grupo controle com o grupo DEN identificou uma associação
protetora para a susceptibilidade à infecção (OR com IC = 0.51 [0.26-0.99]; p=0.043) no
modelo dominante G/A+A/A vs GG. Panorama semelhante foi encontrado quando comparado
o grupo controle com o grupo FD (OR com IC 95% = 0.45 [0.20 – 1.00]; p = 0.043). Em
relação às frequências alélicas, diferenças estatísticas não foram identificadas.
51
Tabela 4 - Associação alélica e dos modelos gênicos do SNP -308G/A do gene TNFA
TNFA -308G/A Controle versus DEN Controle versus FD Controle versus FHD FD versus FHD
OR com 95% IC P OR com 95% IC p OR com 95% IC p OR com 95% IC p
Associação alélica
G 1,06 (0,65-1,74) 0,88 1,47 (0,79 - 2,74) 0,27 1,48 (0,71 - 3,10) 0,37 1,00 (0,43 – 2,31) 0,84
A
Modelos gênicos
Codominante GG
GA 0,52 (0,26-1,05) 0,12 0,45 (0,20-1,03) 0,13 0,49(0,19-1,27) 0,17 1,21(0,48-3,02) 0,54
AA
Dominante GA+AA vs GG 0,51 (0,26-0,99) 0,043 0,51 (0,26-0,99) 0,043 0,46(0,18-1,18) 0,09 1,12 (0,45-2,77) 0,8
Recessivo GG+GA vs AA 0,36 (0,03-3,92) 0,38 0,58 (0,05-6,32) 0,64 0,00 (0,00-NA) 0,26 0,00 (0,00-NA) 0,31
Sobredominante GG+AA vs GA 0,54 (0,27-1,07) 0,07 0,46(0,20-1,04) 0,054 0,50 (0,19-1,30) 0,14 1,23(0,49-3,07) 0,66
Log aditivo -- 0,53 (0,29-0,98) 0,03 0,50 (0,24-1,04) 0,052 0,45 (0,18-1,13) 0,07 1,03 (0,44-2,41) 0,95
Fonte: autor, 2017.
Nota: OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança; DEN: febre da dengue + febre hemorrágica da dengue; FD: febre da dengue; FHD: febre hemorrágica da dengue.
52
10.2 Frequência genotípica e alélica do SNP -819C/T do gene IL-10
Na Tabela 5 encontra-se a distribuição das frequências alélicas e genotípicas do SNP -

819C<T. Na frequência dos genótipos e alelos do SNP -819C<T do gene IL-10 pôde-se
observar que o genótipo C/C foi o mais frequente no grupo controle (53,3%) e FD (47,4%).
Quando analisado pela classificação clínica, destaca-se que o genótipo C/T foi o mais
predominante no grupo FHD (53,1%). O alelo C foi o mais frequente em todos os grupos do
estudo, entretanto o grupo controle apresentou maior frequência (73,7%).
Tabela 5 - Distribuição genotípica e alélica do SNP -819C/T do gene IL-10 em pacientes com
dengue e controles
Genótipo Controle DEN FD FHD x2 (p)
C/C 72(53,3) 54(42,5) 37 (47,4) 17 (34,7) 0,225 (0,63)
C/T 55(40,7) 54(42,5) 28 (35,9) 26 (53,1)
IL-10 -819C/T T/T 8(5,9) 19(15) 13 (16,7) 6 (12,2)
Alelo
C 199 (73,7) 162 (63,7) 102 (65,4) 60 (61,2 )
T 71 (26,3) 92 (36,3) 54 (34,6) 38 (38,8)
Fonte: Autor, 2017.
Como visualizado na Tabela 6, quando o grupo controle foi comparado com o grupo
DEN, o genótipo T/T foi associado com o risco (OR com IC 95% = 4.07 [1.52-10.85]; p =
0.014) para susceptibilidade a febre da dengue no modelo codominante. Nessa mesma
comparação, outros modelos genéticos foram associados com a susceptibilidade: dominante
(OR com IC 95% = 1.78 [1.02-3.11]; p=0.04) e recessivo (OR com IC 95% =3.41 [1.33-8.72;
p=0.008]. Quando comparado o grupo FD contra FHD, o genótipo C/T foi associado
significativamente com a progressão para FHD no modelo sobredominante (OR com IC 95%
=2.10 [1.01-4.38]; p=0.047). Destaca-se que o alelo C foi associado significativamente com a
proteção para FHD quando comparado com o grupo controle (OR com IC 95% =0.56 [0.34 -
0.91]; p = 0.028).
53
Tabela 6 - Associação alélica e dos modelos gênicos do SNP -819C/T do gene IL-10
IL-10 -819C/T Controle versus DEN Controle versus FD Controle versus FHD FD versus FHD
OR com 95% CI P OR com 95% CI P OR com 95% CI p OR com 95% IC p
C 0,62 (0,43-0,91) 0,018 0,67 (0,43 - 1,03) 0,088 0,56 (0,34 - 0,91) 0,028 0,83 (0,49 - 1,41) 0,59
T
Modelos gênicos
Codominante CC 4,07(1,52-10,85) 0,01 4,21 (1,45-12,25) 0,027 3,37 (0,89-12,82) 0,17 1,05 (0,34-3,2) 0,14
CT
TT
Dominante CT+TT vs C/C 1,78 (1,02-3,11) 0,04 1,62 (0,86-3,08) 0,13 1,83 (0,84-3,97) 0,12 1,78 (0,84-3,77) 0,13
Recessivo CC+CTvs T/T 3,41 (1,33-8,72) 0,008 3,82 (1,38-10,59) 0,008 2,66 (0,75-9,43) 0,14 0,71 (0,25-2,01) 0,51
Sobredominante CC+CT vs T/C 1,13 (0,65-1,97) 0,67 0,95 (0,50-1,83) 0,89 1,32 (0,61-2,83) 0,48 2,10 (1,01-4,38) 0,04
Log aditivo -- 1,79 (1,18-2,73) 0,005 1,75 (1,09-2,82) 0,02 1,75 (0,97-3,18) 0,064 1,21 (0,3-2,02) 0,46
Fonte: autor, 2017.
Nota: OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança; DEN: febre da dengue + febre hemorrágica da dengue; FD: febre da dengue; FHD: febre hemorrágica da dengue.
54
10.3 Frequência genotípica e alélica do SNP +874T/A do gene IFNG
A Tabela 7 mostra a distribuição genotípica e alélica do SNP +874T/A do gene IFNG.

Pode-se identificar que o genótipo A/A foi o mais frequente no grupo controle com 52,2%,
enquanto que o genótipo A/T teve predominância no grupo FD (44,9%). Quanto a distribuição
alélica, o alelo A foi o mais frequente em todos os grupos com maior representação no grupo
controle (62,8%).
Tabela 7 - Distribuição genotípica e alélica do SNP +874T/A do gene IFNG em pacientes

com dengue e controles
Genótipo Controle DEN FD FHD x2(p)
A/A 43(35,2) 54(42,5) 35 (44,9) 19 (38,8) 1,260 (0,26)
A/T 64(52,5) 46(36,2) 28 (35,9) 18 (36,7)
IFNG +874T/A T/T 15(12,3) 27(21,3) 15 (19,2) 12 (24,5)
Alelo
T 58 (37,2) 136 (39,7) 94 (38,5) 42 (42,8)
A 98 (62,8) 206 (60,3) 150 (61,5) 56 (57,2)
Fonte: Autor, 2017.
Como evidenciado na Tabela 8, quando comparado o grupo controle e o grupo DEN o

genótipo A/T foi associado significativamente com proteção para a susceptibilidade à
infecção por dengue (OR com 95% IC = 0.45 [0.24-0.83]; p=0.026). O modelo
sobredominante também foi associado com proteção (OR com 95% IC = 0.46 [0.26-0.82];
p=0.0071). Quando estratificado pela classificação clínica o mesmo genótipo foi associado
com proteção tanto para o grupo FD (OR com 95% IC = 0.46 [0.24-0.89]; p=0.02) quanto
para o grupo FHD (OR com 95% IC = 0.43 [0.19-0.95]; p=0.034).
55
Tabela 8 - Associação alélica e dos modelos gênicos do SNP +874T/A do gene IFNG
IFNG +874T/A Controle versus DEN Controle versus FD Controle versus FHD FD versus FHD
OR com 95% CI p OR com 95% CI p OR com 95% CI p OR com 95% IC p
T 1,11(0,75-1,64) 0,65 0,94 (0,62-1,42) 0,86 1,19 (0,74-1,92) 0,53 1,26 (0,75-2,12) 0,44
A
Modelos gênicos
Codominante AA 0,45 (0,24-0,83) 0,02 0,45(0,22-0,92) 0,066 0,45(0,19-1,07) 0,1 1,15 (0,50-2,61) 0,79
TA
TT
Dominante AA vs TA+TT 0,54 (0,30-0,96) 0,03 0,53(0,27-1,03) 0,061 0,58(0,26-1,29) 0,18 1,23 (0,58-2,60) 0,59
Recessivo TT vs AA+TA 1,39 (0,64-3,05) 0,4 1,39 (0,56-3,44) 0,48 1,81 (0,66-5,00) 0,26 1,31 (0,54-3,23) 0,55
Sobredominante TA vs AA+TT 0,46 (0,26-0,82) 0,007 0,46 (0,24-0,89) 0,02 0,43(0,19-0,95) 0,034 1,02 (0,48-2,15) 0,96
Log aditivo -- 0,80 (0,54-1,20) 0,29 0,79 (0,49-1,27) 0,33 0,91 (0,51-1,60) 0,73 1,18 (0,3-1,92) 0,5
Fonte: autor, 2017.
Nota: OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança; DEN: febre da dengue + febre hemorrágica da dengue; FD: febre da dengue; FHD: febre hemorrágica da dengue. Para o
gene IFNG foram utilizadas 122 pacientes com dengue (DEN) devido a não amplificação de algumas amostras durante a genotipagem.
56
10.4 Combinações dos genes TNFA, IL-10, IFNG.
Os três SNPs avaliados apresentaram combinações como mostrado na tabela 9 e a

combinação GCA foi a mais frequente no grupo controle (0,414%) e no grupo FHD (0,406%).
Tabela 9 - Combinações dos SNPs dos genes TNFA -308G/A, IL-10 -819C/T, IFNG +874T/A
Frequências
TNFA IL10 IFNG Controles DEN FD FHD
G C A 0,414 0,388 0,354 0,406

G C T 0,210 0,197 0,216 0,165
G T A 0,111 0,145 0,202 0,124
G T T 0,124 0,147 0,124 0,201
A C A 0,049 0,050 0,052 0,040
A C T 0,050 0,044 0,031 0
A T A 0,039 0,025 0,019 NA
Fonte: autor, 2017.
Na tabela 10, são evidenciadas as comparações entre as combinações dos três SNPs
TNFA -308G/A, IL-10 -819C/T, IFNG +874T/A. Quando comparado o grupo controle e o
grupo FD, a combinação GTA foi associada significativamente com a susceptibilidade à
infecção por dengue (OR com 95% IC = 2.95 [1.18-7.41]; p=0.022). A combinação GCT foi
associado significativamente com proteção contra o desenvolvimento de FHD (OR com 95%
IC=0.28 [0.08 - 0.90]; p=0.035).
57
Tabela 10 - Associação das combinações dos genes TNFA -308G/A, IL-10 -819C/T, IFNG +874T/A
Combinações Controles vs DEN Controles vs FD Controles vs FHD DF vs FHD

OR* com 95% CI p OR com 95% CI p OR com 95% CI p OR com 95% CI p
TNFA IL10 IFNG
G C A 1,00 - 1,00 - 1,00 - 1,00 -

G C T 0,60 (0,28 - 1,26) 0,18 0,89 (0,38 - 2,10) 0,79 0,28 (0,08 - 0,90) 0,035 0,42 (0,17 - 1,05) 0,066
G T A 1,28 (0,68 - 2,42) 0,45 2,95 (1,18 - 7,41) 0,022 0,79 (0,23 - 2,71) 0,71 0,59 (0,24 - 1,46) 0,25
G T T 2,22 (0,97 - 5,08) 0,06 1,04 (0,48 - 2,23) 0,92 1,14 (0,48 - 2,67) 0,77 1,94 (0,92 - 4,10) 0,086
A C A 0,82 (0,22 - 2,98) 0,76 0,72 (0,15 - 3,38) 0,68 0,48 (0,09 - 2,72) 0,41 1,06 (0,31 - 3,57) 0,93
A C T 1,04 (0,30 - 3,66) 0,95 0,86 (0,17 - 4,40) 0,86 0,08 (0,00 - 4,91) 0,23 0,83 (0,13 - 5,23) 0,84
A T A 0,22 (0,03 - 1,41) 0,11 0,29 (0,04 - 2,00) 0,21 - - - -
Fonte: autor, 2017.
Nota: OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança; DEN: febre da dengue + febre hemorrágica da dengue; FD: febre da dengue; FHD: febre hemorrágica da dengue. Para o
gene IFNG foram utilizadas 122 pacientes com dengue (DEN) devido a não amplificação de algumas amostras durante a genotipagem.
58
11 DISCUSSÃO
Os estudos sobre polimorfismos configuram-se como uma importante ferramenta

prognóstica para a identificação do panorama genético do hospedeiro que torna grupos e
populações mais ou menos susceptíveis a desenvolver alguma patologia. Para a prática clínica,
estudos genéticos possuem dois benefícios fundamentais na prevenção de doenças, consistindo na
detecção de diferentes riscos para o desenvolvimento da doença e promoção de uma maior
compreensão dos mecanismos etiológicos que atuam na patogênese da doença (KELADA et al.,
2003).
Nesse contexto, relatos de associação de polimorfismos em genes de citocinas e patologias
importantes para o cenário epidemiológico mundial têm sido relatado, como a susceptibilidade
para o desenvolvimento da tuberculose em Europeus e Asiáticos (KE et al., 2015), risco elevado
para a susceptibilidade a Leishmaniose visceral em Iranianos (AHMADI et al., 2015),
susceptibilidade a doença pulmonar obstrutiva crônica (GANE; STOCKLEY; SAPEY, 2015) e
doença celíaca (DE ALBUQUERQUE MARANHÃO et al., 2015) na população Italiana e o risco
para infecção por dengue na população Indiana (CHATURVEDI; NAGAR; SHRIVASTAVA,
2006).
Na infecção por dengue, polimorfismos em genes de citocinas podem mediar a produção a
níveis séricos e consecutivamente proporcionar susceptibilidade a progressão da doença
(FERNÁNDEZ-MESTRE et al., 2004). Aqui foi identificado o papel de três polimorfismos
genéticos: TNFA (-308 G/A), IL10 (-819 C/T) e IFNG (+874 T/A), que já foram previamente
listados na literatura pelo papel na susceptibilidade ou proteção da infecção por dengue em
diferentes populações do mundo e em algumas regiões brasileiras.
Este estudo corrobora com outros na literatura quanto ao aspecto do desenvolvimento da
febre da dengue e da febre hemorrágica da dengue seguir padrões demográficos em relação ao
gênero, uma vez que a prevalência entre as mulheres é mais evidente em pesquisas realizadas em
Taiwan (HSU; HSIEH; LU, 2017), China (SANG et al., 2016) e Brasil (SANTOS et al., 2016).
Este cenário poderia ser atribuído ao fato de a mulher permanecer a maior parte do tempo em sua
residência (RIBEIRO et al., 2006). A presença do vetor próximo aos domicílios aumenta assim o
risco de transmissão, em vista a característica hematófaga da fêmea do mosquito que possui
maior atividade pela manhã e no final da tarde (CHADEE, 1988).
O TNF-α é uma importante citocina pro – inflamatória que atua na homeostase do sistema
imune. Possui um significante papel na regulação da proliferação e morte celular bem como na
resposta a infecções e no processo inflamatório. Na fisiopatologia da dengue, a sinergia entre o
TNF-α e o vírus DENV foi associado com a indução da febre, aumento da permeabilidade
vascular e indução do processo apoptótico em células endoteliais culminando no extravasamento
plasmático (ALAGARASU et al., 2015; INYOO; SUTTITHEPTUMRONG;
PATTANAKITSAKUL, 2016). O polimorfismo -308G<A desta citocina tem sido postulada pelo
seu papel na susceptibilidade a diversas doenças infecciosas, autoimunes e neurodegenerativas
(ELAHI et al., 2009; QIDWAI; KHAN, 2011).
Neste estudo, foi identificado que o modelo dominante (GA+AA) do gene TNFA na posição
-308G/A foi associado com a proteção à infecção por dengue em uma amostra populacional de
59
Alagoas, Brasil. Estudos experimentais evidenciaram que o alelo A está relacionado com a alta
expressão do gene e consecutivamente com o aumento da atividade transcricional (ABRAHAM;
KROEGER, 1999; WILSON et al., 1997). Um estudo in vitro identificou que os níveis séricos de
TNF-α em altas e médias concentrações foi associado com a inibição da replicação do vírus da
dengue em células dendríticas humanas culminando na diminuição da infecção viral.
Considerando estas premissas, nossos achados sugerem que a presença do alelo A de alta
expressão do gene TNFA na posição -308G/A consiste em um fator protetor para a
susceptibilidade à infecção. Em um coorte prospectiva realizada com adultos no sudeste do Brasil
foi identificada uma associação entre o alelo A com a não persistência dos sintomas da dengue
durante a convalescença (DETTOGNI et al., 2015).
Em sintonia com nosso resultado, um estudo caso-controle realizado na Malásia, concluiu
que o modelo dominante (GA+AA) do gene TNFA -308G<A foi relacionado com a redução do
risco para o desenvolvimento da febre hemorrágica da dengue (SAM et al., 2015). Já em estudos
realizados com adultos na região norte (FEITOSA et al., 2016a) e crianças na região do sudeste
brasileiro (XAVIER-CARVALHO et al., 2013) em que foi investigado o papel do polimorfismo
em diversas citocinas inclusive do gene TNFA -308G/A, os autores concluíram que este gene não
foi correlacionado com a predisposição ou proteção à infecção pela dengue.
Pesquisas conduzidas na população Tailandesa (VEJBAESYA et al., 2009) e Mexicana
(GARCÍA-TREJO et al., 2011) também não identificaram associação deste polimorfismo com a
infecção. Alguns estudos mostraram a associação do alelo A com a severidade da doença em
crianças Venezuelanas (FERNÁNDEZ-MESTRE et al., 2004) e em pacientes com infecção
secundária que foram confirmados laboratorialmente para o sorotipo 2 (DENV-2) em Cuba
(PEREZ et al., 2010). Na população Tailandesa, o alelo A foi associado com o risco para o
desenvolvimento do quadro hemorrágico (CHUANSUMRIT et al., 2013).
A citocina IL-10 possui efeitos imunomodulatórios sendo uma eficaz molécula anti-
inflamatória (TSAI et al., 2013). A literatura reporta a associação entre os níveis séricos elevados
desta citocina com o quadro clínico da dengue (MALAVIGE et al., 2013;
SRIKIATKHACHORN; GREEN, 2010), por exemplo, um estudo realizado com crianças no
sudeste brasileiro, mostrou uma consistente relação entre o desenvolvimento da trombocitopenia
e os níveis séricos desta citocina (FERREIRA et al., 2015).
Ademais, estudos in vitro demonstraram uma correlação entre os níveis de IL-10 e o
fenômeno ADE (do inglês: antibody dependent enhancement) (CHAREONSIRISUTHIGUL;
KALAYANAROOJ; UBOL, 2007). Os anticorpos relacionados a este fenômeno levam a uma
reação cruzada com sorotipos heterólogos, favorecendo o desenvolvimento da doença e
infectando um abrangente número de células, o que pode levar a forma grave de doença. Tal
perspectiva é reportada por um ensaio in vitro que mostrou uma associação positiva entre os
níveis de IL-10 com polimorfismos na região promotora do gene, sugerindo que os efeitos do
ADE são influenciados pela genética do hospedeiro (BOONNAK et al., 2011).
Os estudos relevantes envolvendo o fenômeno ADE foram reconhecidos como um evento
importante na sintomatologia da dengue de acordo com Organização Mundial de Saúde
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009). É provável que a IL-10 seja regulada a nível
60
transcricional por vários polimorfismos na região promotora deste gene, entre eles o SNP -819
C/T (PEROVIC et al., 2016; TSAI et al., 2013).
Em nosso estudo, o genótipo T/T do SNP-819C/T do gene IL-10 foi significativamente
associado com a susceptibilidade a febre da dengue, enquanto que o genótipo C/T foi relacionado
com a progressão para a febre hemorrágica da dengue diferentemente de outros estudos
publicados sobre o SNP -819C<T realizados com crianças do sudeste brasileiro (XAVIER-
CARVALHO et al., 2013) e com adultos na população Venezuelana (FERNÁNDEZ-MESTRE et
al., 2004), Singalesa (FERNANDO et al., 2015) e Cubana (PEREZ et al., 2010). No entanto, o
genótipo C/T foi previamente associado à proteção contra o desenvolvimento da dengue na
população Indiana (ALAGARASU et al., 2015). O estudo também apresentou associação entre o
alelo C e o desenvolvimento da febre hemorrágica da dengue. Estudos realizados com uma
população infantil do sudeste brasileiro (XAVIER-CARVALHO et al., 2013) e com adultos nas
populações Indiana (ALAGARASU et al., 2015) e Cubana (PEREZ et al., 2010) não
identificaram associação alélica do SNP -819C<T com a infecção pelo vírus da dengue.
O papel do IFN-γ na imunidade contra a dengue não está bem elucidado. Os interferons são
citocinas que desempenham um papel complexo na resistência do hospedeiro devido à ação de
agentes patogênicos. Nossos achados indicam uma associação entre o genótipo A/T do gene
IFNG na posição +874T/A e um efeito protetor contra a susceptibilidade a dengue e febre da
dengue hemorrágica. O alelo A mostrou previamente uma relação com a não persistência dos
sintomas na infecção primária durante 30 dias e com a persistência de sintomas na infecção
secundária (DETTOGNI et al., 2015), em uma coorte prospectiva com adultos do sudeste
brasileiro. No entanto, na população do Norte do Brasil, o genótipo de A/T em comparação foi
associado com a proteção à susceptibilidade a infecção em adultos (FEITOSA et al., 2016).
Outros estudos realizados com adultos nas populações Indiana (ALAGARASU et al., 2015),
Venezuelana (FERNÁNDEZ-MESTRE et al., 2004) e Mexicana (PEREZ et al., 2010) não
encontraram associações entre esse SNP e a infecção por dengue.
O possível papel do IFN-γ no catabolismo do triptofano poderia ser considerado com uma
hipótese para compreender a via de proteção desta citocina na patogênese da dengue. A enzima
indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) tem sido implicada pelo seu desempenho em mecanismos de
defesa antimicrobiana e na regulação imunológica. A IDO catalisa a quinurenina que consiste em
um metabólito tóxico, e é a principal via de degradação para o triptofano em mamíferos. Neste
contexto, o maior estimulador da IDO é o interferon gama (KING; THOMAS, 2007).
Em um estudo que avaliou a atividade do IFN-γ em comparação com os níveis de triptofano
e quinurenina em doadores saudáveis, foi identificado que a presença do alelo T de alta expressão
foi associada com o aumento dos níveis séricos da IDO. Estes dados evidenciam que o
catabolismo do triptofano pode ser regulado pelo gene IFNG e possivelmente estaria relacionado
com patologias associadas a polimorfismos genéticos (RAITALA et al., 2005). Recentemente o
aumento de quinurenina foi associado significativamente com a severidade do quadro clínico em
pacientes com febre hemorrágica da dengue na população de Singapura (CUI et al., 2016b). Em
nosso estudo hipotetizamos que a presença do genótipo de expressão intermediária A/T não
proporciona o aumento da atividade da IDO culminando na diminuição dos níveis séricos de
61
quinurenina e assim consecutivamente pode vir a ter um efeito protetor contra a susceptibilidade
a febre hemorrágica da dengue.
Realizou-se também uma análise de combinação alélica para investigar o efeito entre o
polimorfismo das citocinas. Nossos resultados mostraram associação entre a combinação GTA
TNFA/IL10/IFNG com a susceptibilidade para a infecção por dengue, enquanto que a
combinação GCT -TNFA/IL10/IFNG foi associada com um efeito protetor contra a DHF.
Nossos resultados indicam que polimorfismos genéticos envolvidos na resposta imune do
hospedeiro podem contribuir com a suscetibilidade a infecção, progressão ou proteção a fenótipos
clínicos de dengue e podem ser considerados como bons marcadores prognósticos. Considerando
que o agravamento da doença possa estar relacionado com alterações genéticas no sistema imune
inato, realizar pesquisas de cunho molecular para prognóstico da doença pode incidir no número
de óbitos por dengue, uma vez que a monitorização clínica prévia garante medidas preventivas e
terapêuticas com maior efetividade. Portanto a inserção da biologia molecular se torna uma
ferramenta interessante para as instituições de saúde.
Aqui nós também atentamos para o estímulo de futuros estudos com a inclusão de indivíduos
assintomáticos, um número amostral maior e o perfil sérico de citocinas para poder investigar o
panorama genético-imunológico do hospedeiro a proteção para o desenvolvimento da infecção
pelo vírus da dengue. Uma das estratégias poderia estar atrelada a estudos de investigação da
validade funcional em genes de citocinas para desvendar o papel específico destes com a
susceptibilidade a dengue.
62
12 CONCLUSÃO
A partir dos resultados encontrados neste estudo, nós concluímos que:
 O modelo dominante GA + AA do SNP -308 do gene TNFA foi associado

significativamente à proteção para dengue quando comparado com o grupo controle e
o grupo febre da dengue em uma população de Alagoas;
 O genótipo T/T do SNP -819 do gene IL-10 foi significativamente associado com a
susceptibilidade à infecção da dengue, enquanto o genótipo T/C foi associado com a
progressão para a febre hemorrágica da dengue diferentemente de outros estudos
prévios que não identificaram associação nas populações;
 Neste estudo, foi identificada uma associação entre o alelo C do SNP -819 do gene IL-
10 e proteção ao desenvolvimento para a febre da dengue hemorrágica;
 Nossos resultados também sugerem uma associação significativa entre o genótipo A/T
do polimorfismo do gene IFNG (+874) e um efeito protetor para a susceptibilidade a
dengue e a febre hemorrágica da dengue;
 As análises das combinações gênicas identificaram uma combinação G/T/A
estatisticamente associada com a susceptibilidade a febre da dengue e a combinação
G/C/T com proteção contra o desenvolvimento da febre da dengue hemorrágica.
63
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74
APÊNDICE A – Artigo derivado da dissertação submetido
Association of TNFA (-308G/A), IFNG (+874 A/T) and IL-10 (-819 C/T) polymorphisms
with protection and susceptibility to dengue in Brazilian population
Ana Caroline Melo dos Santosa, Edilson Leite de Mouraa, Jean Moises Ferreiraa, Alexandre
Wendel Araújo de Mouraa, Ailson Darlan Sales Ferreiraa, Rubens Pereira Bezerraa, Diego de
Siqueira Figueiredoa, Karol Fireman de Fariasa, Tiago Gomes de Andradea,b, Elaine Virgínia
Martins de Souza Figueiredoa,1.
a
Molecular Biology and gene expression Laboratory, Federal University of Alagoas, Campus
Arapiraca, Av Manoel Severino Barbosa, Bom Sucesso, 57309-005. - Arapiraca - AL - Brazil.
b
Federal University of Alagoas (UFAL) – Faculty of Medicine (FAMED), Campus AC Simões,
Tabuleiro dos Martins, Maceió, Alagoas, Brazil.
First author: Ana Caroline Melo dos Santos,
Institute of Biological Sciences and Health, Federal University of Alagoas, CEP 57072-970,
Maceió, Alagoas, Brazil.
Phone: +55-82- 99603.3197
E-mail: [email protected]
Corresponding author: Elaine Virgínia Martins de Souza Figueiredo
Laboratory of Molecular Biology and Gene Expression, Federal University of Alagoas, CEP:
57309-005, Arapiraca, Brazil.
Phone: +55-82-99931.0827
E-mail: [email protected]
75
Association of TNFA (-308G/A), IFNG (+874 A/T) and IL-10 (-819 C/T)
polymorphisms with protection and susceptibility to dengue in Brazilian
population
Abstract
Objective: In the study, gene polymorphisms and their association with susceptibility to dengue
will be evaluated. Subjects and methods: A retrospective case-control study was development
with 262 subjects, comprising 78 Dengue fever (DF) patients, 49 Dengue hemorrhagic Fever
(DHF) patients and 135 healthy controls. Genotypic and allelic profile were identified using
polymerase chain reaction (PCR) based in real time and amplification-refractory mutation system
(ARMS). Results: We observed a protective association of IL-10 (-819 C/T) C allele (p = 0.018,
OR = 0.62, CI = 0.43 - 0.91) against DHF, while the C/T (p = 0.047, OR = 2.10, CI = 1.01 - 4.38)
and T/T (p = 0.008, OR = 3.41, CI = 1.33 - 8.72) genotypes were association with DHF and DF,
respectively. The dominant model TNFA -308GA+AA (p = 0.043, OR = 0.45, CI = 0.20 - 1.00)
genotypes were found to protective effect against dengue infection. A protective association
among the IFNG (+874 A/T) A/T genotype against DF (p = 0.02, OR = 0.46, CI = 0.24 - 0.89)
and DHF (p = 0.034, OR = 0.43, CI = 0.19 - 0.95) was observed. When the studied SNPs were
analyzed in combination, the combination GTA (p = 0.022, OR = 2.95, CI = 1.18 - 7.41) was
statistically associated with susceptibility to DF and the combination GCT (p = 0.035, OR= 0.28,
CI= 0.08 - 0.90) with protection against the development of DHF. Conclusions: In this research
was identified the association of the IFNG (+874 A/T), TNFA (-308G/A), IL-10 (-819 C/T)
genotypes as a factor for protection, susceptibility and severity to dengue.
Keywords: Immune system; IFNG; TNFA; IL-10; dengue; polymorphism.
1. Introduction
Dengue is a public health problem and its incidence has a wide geographical spread [1,2]. It is
endemic in more than 100 countries and the World Health Organization (WHO) [3] estimated a
50–100 million dengue infections reported worldwide each year. However, a cartographic study
estimated that there is approximately 390 million dengue cases per year around the world
including symptomatic and asymptomatic[4]. According to the Pan American Health
Organization[5] in 2015, Brazil was the country that reported most cases of dengue in the
Americas with 1,649.008 of suspected dengue records and an incidence rate of 820.27 cases.
Dengue infection presents diverse a wide spectrum of clinical presentation, from

asymptomatic and mild dengue fever (DF), to the most serious forms: dengue hemorrhagic fever
(DHF) and dengue shock syndrome (DSS). DHF is characterized by increased vascular
permeability, followed by vascular leakage, which promote the appearance of hemorrhagic
manifestations and thrombocytopenia while DSS includes hypotension and hypovolemic
shock[6]. Clinical manifestations of dengue to severe clinical conditions which may lead to
death[7]
76
The mosquito Aedes Aegypti is the main vector that transmits the viruses that cause dengue in
tropical and subtropical regions and there are five serotypes distinct: DENV 1-4 [8].
Environmental factors, the serotype/genotype of dengue virus, the immune response and genetic
background of host have significant influence on the development of clinical manifestations of
dengue and, therefore, in disease severity[9]. Additionally, single nucleotide polymorphisms
(SNPs) in cytokine genes have significantly contributed to the comprehension of the
physiopathology and the role of host genetic in dengue infection[10].
There are various factors associated with the development of dengue and the host immune
response has been highlighted as an genetic biomarker for the disease [11] with the production of
several cytokines. Therefore, polymorphisms in genes coding can influence the production and
function of these proteins and consequently the protection, susceptibility or disease progression
[12].
TNF-α is a pro-inflammatory cytokine involved in several physiological processes, immune

conditions and tumor growth. TNF-α has been associated with DHF and DSS influencing the
activity in endothelial cells, induction of inflammatory mediators, recruitment of inflammatory
cells, survival of inflammatory cells, induction of tissue-destructive enzymes, apoptosis, among
others[13]. The SNP -380G/A (rs1800629) has been reported to directly affect TNF-α expression
in autoimmune and infectious diseases[14].
IL-10 presents a pleiotropic role with immune regulation and inflammatory in infectious
diseases. In DENV pathogenesis, IL-10 has immunomodulatory activity with consequences in
persistent infection viral enable an inflammatory that promotes aggravation of infection [15].
There are few studies investigating the role of polymorphisms of IL10 gene (SNP -819C/T-
rs1800871) in the pathogenesis of dengue.
Interferons are a family of pleiotropic cytokines produced by T helper cells and natural killer
cells during the initial phase of infection. Interferon-gamma (IFN-γ) is noteworthy due to its
essential role in the regulation of the inflammatory response[16], in which it enhances the
transcription of genes involved in antiviral response and antitumor activity[17]. The increase of
IFNG expression was identified as a consequence of a functional polymorphism A/T
(rs2430561), located at the +874 position in the first intron[18].
The investigation of SNPs in pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ, as well
as the anti-inflammatory cytokine of IL-10, has been associated with the variation of cytokine
levels in the immune response. In this study, we investigated if SNPs from IL-10, TNFA and
IFNG gene regions (-819C/T, -308G/A and +874A/T, respectively) influence the susceptibility to
infection or dengue progression in a sample of Brazilian patients.
2. Materials and methods
2.1. Study design and samples
Dengue patients attended in the city of Arapiraca by Unified Health System (Brazilian
National Public Health System), Northeast Brazil, during the years 2010 and 2015 were recruited
for this research. The patients were classified by medical records and clinical laboratory results
77
obtained at hospital or health center. The classification of dengue cases were in accordance with
the criteria of WHO guidelines [6]. DF was characterized by the presence of high fever
accompanied by the following symptoms: myalgia, severe headache, retro-orbital, abdominal
pain, arthralgia or rash. The DHF has the same clinical condition, however with hemorrhagic
manifestations. We recruited hospitals patients who presented medical records of hemorrhagic
manifestations and thrombocytopenia less than 80.000/mm3. Case population was positive for
ELISA anti-dengue IgM realized in the Municipal Laboratory of Arapiraca (Dengue IgM Capture
Elisa, PanBio, Brazil).
Control population was a group of healthy volunteer’s blood donor. They all reported no
history, signs and symptoms of dengue infection and, consequently without hospitalization. The
laboratories tests in this group was performed using immunochromatographic rapid test
(Bioeasy/Abon,Brazil) and enzyme linked immunosorbent assay (Dengue IgM Capture Elisa,
PanBio, Brazil). This retrospective case-control study was reviewed and approved by the
Research Ethics Committee of Federal University Alagoas and consent from all study
participants was obtained (Protocol: 1.073.204).
2.2. DNA extraction and genotyping

Genomic DNA was extracted from peripheral blood in anticoagulant solution EDTA
(Ethylenediamine tetraacetic acid), and it was performed in accordance to the manufacturer
instructions (Qiagen FlexiGene® DNA Handbook, Qiagen, Germany). For patients with dengue
laboratory confirmed before, samples were obtained from swab oral mucosa cells for NaCl
solution extraction method [19]. DNA was quantified in a BioPhotometer plus (Eppendorf® AG,
Hamburg, Germany), and visualized in a 1% agarose gel electrophoresis stained with ethidium
bromide. The DNA samples were stored at -20 °C.
Polymorphisms in the TNFA gene (-308G/A - rs1800629) and IL-10 gene (-819 C/T -
rs1800871) were genotyped by Real-time PCR, performed by allelic discrimination method using
TaqMan assays (Applied Biosystem®, California, USA). Amplification of the target DNA was
performed in Step One Plus equipment (Applied Biosystem®, California, USA) with the
following conditions: 95 °C for 10 min, followed by 40 cycles of 92 °C for 15 sec and 60 °C for
1 min. Data were analyzed by StepOne Plus software (Applied Biosystems ®, California, USA).
The polymorphism of IFNG (+874A/T - rs2430561) gene was identified by Amplification
Refractory Mutation System - Polymerase Chain Reaction (ARMS-PCR). The primer sequences
were as follows [20]: IFNG primer A allele, 5’-TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3’;
IFNG primer T allele, 5’-TTCTTACAACACAAAATCAAATCT-3’; GH (growth hormone)
Internal Control 1, 5’-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3’; GH (growth hormone) Internal
Control 2, 5’-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3’; and IFNG generic primer, 5’-
TCAACAAAGCTGATACTCCA-3’. Amplification of the target DNA was performed in a
thermocycler (Esco technologies®, USA) under the following conditions: heating at 95 °C for 3
min, 10 cycles of denaturation at 95 °C for 15 s, annealing at 65 °C for 50 s, elongation at 72 °C
for 40 s, followed by 20 cycles of denaturation at 95 °C for 20 s, annealing at 55 °C for 50 s,
elongation at 72 °C for 50 s, final elongation at 72 °C for 7 min, and final hold at 4 °C for 5 min.
78
ARMS-PCR amplicons were then submitted to a 2% agarose gel electrophoresis stained with
ethidium bromide (Amresco Inc., USA), and visualized under ultraviolet light.
2.3. Statistical analysis
The data were presented as mean and standard deviation. Hardy-Weinberg equilibrium
(HWE) was tested using goodness-of-fit chi-square test to compare the observed and expected
genotype frequencies among cases and controls. Statistical analyses were performed using
BioEstat version 5.0 for allelic frequencies and associations. For association analysis, a logistic
regression model was carried out by using SNPstats software, the intrinsic factors that could
influence the profile of the population and thus adjusted by the data in relation to age and gender.
Codominant model, dominant model, recessive model, over dominant model and log-additive
model were considered to evaluate the risk of dengue associated with each SNP. Akaike
information criterion (AIC) and Bayesian Information Criterion (BIC) was used to determine the
best model of inheritance. Odds ratios (OR) and 95% confidence intervals (CI) were calculated
considering OR<1 associated with protection and OR>1 associated with susceptibility/risk.
Values p<0.05 were considered statistically significant. The power of sample size was calculated
by G*power software version 3.0 using as test family: Chi-squared test; Statistical test:
Goodness-of-fit tests-contingency tables and Type of power analysis: Post hoc [21].
3. Results
The genotypic distribution was in accordance to the Hardy–Weinberg equilibrium. Seventy-

eight patients with DF (age 32.77 ± 15.4), 49 (35.4 ± 18.1) patients with DHF and 135 (age 22.4
± 4.9) control subjects were recruited for this study. Tables 1 and 2 show the genotypic and
allelic frequencies of TNFA (-308G/A), IL-10 (-819 C/T) and IFNG (+874 A/T) SNPs in dengue
clinical forms and healthy controls.
Genotypic frequencies between group dengue (DEN=DF+DHF) and controls were compared,
and was observed an association of protection with TNFA (-308G/A) polymorphism gene
G/A+A/A in model dominant (p = 0.043, OR = 0.51, CI = 0.26 - 0.99). Comparing DF group and
healthy controls for TNFA (-308G/A) polymorphism in a dominant model (GG vs G/A+A/A),
G/A+A/A genotypes were positively associated with protection for dengue fever (p = 0.043, OR
= 0.45, CI = 0.20 - 1.00) (Table 1). Genotypic (table 1) and allelic (table 2) frequencies were not
significantly different between DF and DHF.
To analyze the association of IL-10 (-819 C/T) polymorphism with disease susceptibility, the
genotype frequency was compared between DEN and controls. In a codominant model (p =
0.014, OR = 4.07, CI = 1.52 - 10.85), dominant model (p = 0.04, OR = 1.78, CI = 1.02 - 3.11)
and recessive model (p = 0.008, OR = 3.41, CI = 1.33 - 8.72) the T/T genotype was significantly
associated with DEN. The genotypic distribution of IL-10 (-819 C/T) were compared between DF
group and healthy controls and a high frequency of genotype C/C was observed in group control.
The T/T genotype of IL-10 (-819 C/T) was significantly associated with DF but not with the
severe form DHF (Table 1) in a co-dominant model (p = 0.014, OR = 4.07, CI = 1.52 - 10.85)
and (p = 0.0089, OR = 3.82, CI = 1.38 - 10.59). When compared between DF group with DHF,
the C/T genotype was significantly associated with the progression for DHF in an over dominant
79
model (p = 0.047, OR = 2.10, CI = 1.01 - 4.38) (table 1). Interestingly, the C allele were
significantly associated with protection for DHF when compared to healthy controls (p = 0.028,
OR = 0.56, CI = 0.34 - 0.91) (Table 3).
We also evaluated the association of IFNG (+874 A/T) polymorphisms with DEN group and
healthy controls, in a codominant model (p = 0.026, OR = 0.45, CI = 0.24 -0.83), dominant
model (p = 0.033, OR = 0.54, CI = 0.30 - 0.96) and over dominant model (p = 0.0071, OR = 0.46,
CI = 0.26 - 0.82) the T/A genotype was significantly associated with protection a disease. The
T/A genotype of IFNG (+874 A/T) polymorphism was statistically associated with protection
when compared DF group with healthy controls for dengue infection (p = 0.02, OR = 0.46, CI =
0.24 - 0.89) and when compared DHF group with healthy controls (p = 0.034, OR = 0.43, CI =
0.19 - 0.95) in an over dominant model (Table 1). There were no observed differences in allelic
and genotypic frequencies between DF and DHF (Tables 1 and 2).
Table 3 shows the haplotype distribution of the analyzed polymorphisms. TNFA/IL-10/ IFNG
GTA was associated with the susceptibility for dengue infection (p = 0.022, OR = 2.95, CI = 1.18
- 7.41) and TNFA/IL-10/IFNG GCT (p = 0.035, OR = 0.28, CI = 0.08 - 0.90) was significantly
associated with protection for DHF. The post hoc power analyses in this paper were 68% (TNFA
-308G/A), 99% (IL-10 -819 C/T) and 99% (IFNG +874 A/T).
4. Discussion
We investigated the potential association of the TNFA (-308G/A), IFNG (+874 A/T) and IL-
10 (-819 C/T) polymorphism with the development of dengue in a Brazilian sample. Individual
genetic variations may affect the host response to infectious, in this context several studies have
investigated the role of cytokine gene polymorphisms in susceptibility to diseases included
dengue [22]. In infection dengue, the polymorphisms genetics could mediate the production of
cytokines and hence susceptibility or progression to infection. Here, our findings suggested a role
of genetic polymorphisms of the TNFA (-308G/A), IL-10 (-819) and IFNG (+874 A/T) on dengue
infection in a sample from the Brazilian population.
The significant role of TNF-α in DENV immunopathogenesis has been reported [23]. In this
study we identified that the dominant model GA+AA was linked with protection to dengue,
additionality to our results, in a case control study on Malaysia, the G/A+A/A TNFA (-308G/A)
genotype was associated with reduced risk for DHF[24]. The presence of A allele polymorphism
has been related to a higher TNFA gene expression level [25]. Therefore, our findings suggest a
possible correlation between the presence of high-expressing TNFA -308A allele and protection
against DF. The TNF-α cytokine in high and medium concentrations may inhibit the DENV
replication in human dendritic cells [23] and this inhibition may decrease the dengue infection.
Interestingly, the Brazilian studies that investigated the role of several cytokines
polymorphisms concluded that TNFA (-308G/A) were not related with predisposition to dengue
[26,27]. Studies conducted in population Thai [28] and Mexican[29] did not identify association
of the polymorphism of this cytokine with dengue. Some studies have shown the association of
the A allele of TNFA (-308G/A) polymorphism with severity of dengue in Cuban population with
80
secondary infection with DENV-2[30]. In a study conducted with Thai children, the same allele
was associated with the risk of bleeding[31]. Another study performed in Brazil identified a
significant association of TNFA allele A with no persistence of the symptoms of dengue in
convalescence[32]. In Sri Lanka, the G/G genotype was identified as a risk factor for the
development of dengue hemorrhagic fever[10]. In our study, the G/G genotype had a high
frequency in the case group compared with the control group but there was no significantly
statistical difference.
IL-10 is antinflammatory cytokine has been considered as key in the control of host
immune response by regulate the production of several pro inflammatory cytokines [33]. Likely
the IL-10 is regulated at transcriptional level by several polymorphisms in the promotor region in
this gene, among them the polymorphism -819 [15,33]. In our study, the T/T genotype of the
SNP IL-10 (-819 C/T) was significantly associated with susceptibility to dengue fever infection,
whereas the C/T genotype was linked with the progression for DHF differently from other studies
performed which did not identify association in the populations Brazilian [26], Singhalese [10]
and Cuban [30]. Nevertheless, the heterozygous genotype was previously associated with
protection for DF in India [34]. In this study, we found an association between C allele and
protection against the development for the DHF. Other studies, including one performed in a
sample from the Brazilian population, did not find any allelic association [24,26,34].
Interferons are cytokines that play a complex role in host resistance because of the action of
pathogens, the IFN-γ is able to upregulate the expression of Fcγ receptors on monocytes and
macrophages, thus, may facilitate viral replication [35]. The presence of +874 A/T polymorphism
in INF-γ gene has been shown to influence gene transcriptional level. Genotypes TT, T/A and
AA were associated with high, intermediate and low production of IFNG, respectively, wherein
the T allele was associated high levels [36]. Our findings suggest a possible association between
heterozygosity for IFNG (+874 A/T) polymorphism and a protector effect against DF and DHF.
The A allele previously showed a possible association with the non-persistence of symptoms
during thirty days, in primary dengue and persistence of symptoms in secondary dengue[32], in a
Brazilian patients cohort. Yet in population Brazilian, the genotype heterozygosity in comparison
of group control and dengue was linked with protection [27]. However, earlier studies did not
find associations between this SNP and dengue severity [30,34]. The T allele have been
associated with increased indoleamine-pyrole 2,3-dioxygenase (IDO) activity[37], the growth this
enzyme activity promotes a high conversion of tryptophan to kynurenine, a molecule involved in
DHF, for present increased significantly in patients with DHF [38]. The intermediate expression
A/T genotype may non-increased IDO activity, accordingly causing a low level of kynurenine
that may act in effect protector against DHF.
We also performed a haplotype analysis to investigate the combinatory effect among the
cytokines polymorphism. Our findings showed an association between TNFA/IL-10/IFNG GTA
haplotype and the susceptibility for dengue infection. While the TNFA/IL-10/IFNG GCT
haplotype was associated with a protector effect against DHF. The diversity genetic between
81
populations and miscegenation of population Brazilian may explain the different results presented
in this study.
We identified associations between polymorphisms in TNFA (-308G/A), IFNG (+874 A/T)

and IL-10 (-819) genes with dengue infection and clinical category for the disease. This outcome
provides evidence that genetic polymorphisms in immune system affect susceptibility or protect
to clinical phenotypes of dengue and may be considered as good prognostic markers. Yet is
important that further studies investigated asymptomatic individuals and linked with factors
clinical and laboratorial, genetics, immunological are needed. In addition, gene expression of
cytokines in patients with dengue associated with polymorphisms may be an opportunity to
observe the synchronized biological relevance and interaction of genes in susceptibility,
progression or protection a disease.
Acknowledgements
We thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) by

supported scholarship the ACMS. This work was financed by Fundação de Amparo à Pesquisa de
Alagoas (FAPEAL), nº protocol: 20110906-011-0025-0080. The authors acknowledge the help
rendered by Laboratory Municipal de Arapiraca - AL in sample collection and performing IgM
ELISA. The authors thank Laboratory de Analysis Clinics Dr. Edler Lins (LACEL) by
performing IgM ELISA in control group.
Disclosure statement
None of the authors has any potential financial conflict of interest related to this manuscript.
Funding
This work was supported by the Fundação de Amparo à Pesquisa de Alagoas (FAPEAL) -
Programa Primeiros Projetos (PPP/2011) .
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Table 1 - Percent genotype distributions of TNFA, IL10 and IFNG in healthy controls and dengue patient groups.
N (Frequencies) Control vs DEN Control vs DF Control vs DHF DF vs DHF
SNP Genotype Control DEN DF DHF Model Genotype OR* with 95% CI p OR with 95% CI p OR with 95% CI p OR with 95% CI p
GG
TNFA G/G 99(73.3) 102(80.3) 63(80.8) 39(79.6) Codominant GA 0.52 (0.26-1.05) 0.12 0.45 (0.20-1.03) 0.13 0.49(0.19-1.27) 0.17 1.21(0.48-3.02) 0.54
AA
GA+AA vs 0.51 (0.26-0.99) 0.04 0.51 (0.26-0.99) 0.043 0.46(0.18-1.18) 0.092 1.12 (0.45-2.77) 0.8
-308 G/A 33(24.4) 24(18.9) 14(17.9) 10(20.4) Dominant
GG
GG+GA vs 0.36 (0.03-3.92) 0.38 0.58 (0.05-6.32) 0.64 0.00 (0.00-NA) 0.26 0.00 (0.00-NA) 0.31
A/A 3(2.2) 1(0.8) 1 (1.3) 0 (0) Recessive
AA
GG+AA vs 0.54 (0.27-1.07) 0.072 0.46(0.20-1.04) 0.054 0.50 (0.19-1.30) 0.14 1.23(0.49-3.07) 0.66
Overdominant
GA
Log additive -- 0.53 (0.29-0.98) 0.03 0.50 (0.24-1.04) 0.052 0.45 (0.18-1.13) 0.073 1.03 (0.44-2.41) 0.95
CC
IL10 C/C 72(53.3) 54(42.5) 37 (47.4) 17 (34.7) Codominant CT 4.07(1.52-10.85) 0.01 4.21 (1.45-12.25) 0.027 3.37 (0.89-12.82) 0.17 1.05 (0.34-3.2) 0.14
TT
C/C vs 1.78 (1.02-3.11) 0.04 1.62 (0.86-3.08) 0.13 1.83 (0.84-3.97) 0.12 1.78 (0.84-3.77) 0.13
-819 C/T 55(40.7) 54(42.5) 28 (35.9) 26 (53.1) Dominant
CT+TT
T/T vs CC 3.41 (1.33-8.72) 0.008 3.82 (1.38-10.59) 0.0089 2.66 (0.75-9.43) 0.14 0.71 (0.25-2.01) 0.51
T/T 8(5.9) 19(15) 13 (16.7) 6 (12.2) Recessive +CT
T/C vs 1.13 (0.65-1.97) 0.67 0.95 (0.50-1.83) 0.89 1.32 (0.61-2.83) 0.48 2.10 (1.01-4.38) 0.047
Overdominant
CC+CT
Log additive -- 1.79 (1.18-2.73) 0.0058 1.75 (1.09-2.82) 0.02 1.75 (0.97-3.18) 0.064 1.21 (0.3-2.02) 0.46
AA
IFNG A/A 43(35.2) 54(42.5) 35 (44.9) 19 (38.8) Codominant TA 0.45 (0.24-0.83) 0.02 0.45(0.22-0.92) 0.066 0.45(0.19-1.07) 0.1 1.15 (0.50-2.61) 0.79
TT
AA vs 0.54 (0.30-0.96) 0.03 0.53(0.27-1.03) 0.061 0.58(0.26-1.29) 0.18 1.23 (0.58-2.60) 0.59
+874 A/T 64(52.5) 46(36.2) 28 (35.9) 18 (36.7) Dominant
TA+TT
TT vs 1.39 (0.64-3.05) 0.4 1.39 (0.56-3.44) 0.48 1.81 (0.66-5.00) 0.26 1.31 (0.54-3.23) 0.55
T/T 15(12.3) 27(21.3) 15 (19.2) 12 (24.5) Recessive
AA+TA
TA vs 0.46 (0.26-0.82) 0.007 0.46 (0.24-0.89) 0.02 0.43(0.19-0.95) 0.034 1.02 (0.48-2.15) 0.96
Overdominant
AA+TT
Log additive -- 0.80 (0.54-1.20) 0.29 0.79 (0.49-1.27) 0.33 0.91 (0.51-1.60) 0.73 1.18 (0.3-1.92) 0.5
For IFNG it was used 122 controls due to used of PCR-ARMS did not getting amplification of some samples. *OR (Odds ratio) with CI (confidence interval) 95% adjusted for sex and age. SNP: single nucleotides
polymorphism; DEN (group DEN= DF+DHF); DF: dengue fever; DHF: dengue hemorrhagic fever.
Table 2 - Percent allelic distributions of TNFA, IL10 and IFNG in healthy controls and dengue patient groups.
SNP Allele N(Frequencies) Control vs DEN Control vs DF Control vs DHF DF vs DHF

p
Control DEN DF DHF OR* with 95% CI p OR with 95% CI p OR with 95% CI p OR with 95% CI
TNFA G 231 (85.6) 228 (86.3) 140 (89.7) 88 (89.7) 1.06 (0.65-1.74) 0.88 1.47 (0.79 - 2.74) 0.27 1.48 (0.71 - 3.10) 0.37 1.00 (0.43 – 2.31) 0.84
-308 A 39 (14.4) 36 (13.7) 16 (10.3) 10 (10.3)
IL10 C 199 (73.7) 162 (63.7) 102 (65.4) 60 (61.2 ) 0.62 (0.43-0.91) 0.018 0.67 (0.43 - 1.03) 0.088 0.56 (0.34 - 0.91) 0.028 0.83 (0.49 - 1.41) 0.59
-819 T 71 (26.3) 92 (36.3) 54 (34.6) 38 (38.8)
IFNG T 58 (37.2) 136 (39.7) 94 (38.5) 42 (42.8) 1.11(0.75-1.64) 0.65 0.94 (0.62-1.42) 0.86 1.19 (0.74-1.92) 0.53 1.26 (0.75-2.12) 0.44
+874 A 98 (62.8) 206 (60.3) 150 (61.5) 56 (57.2)
*OR (Odds ratio) with CI (confidence interval) 95% adjusted for sex and age. SNP: single nucleotides polymorphism; DEN (group DEN= DF+DHF); DF: dengue fever; DHF: dengue hemorrhagic
fever.
Table 3 - Combinations distributions of TNFA, IL10 and IFNG in healthy controls and dengue patient groups.
Combinations Frequencies Controls vs DEN Controls vs DF Controls vs DHF DF vs DHF

TNFA IL10 IFNG Control DEN DF DHF OR* with 95% CI p OR with 95% CI p OR with 95% CI p OR with 95% CI p
G C A 0.4148 0.3886 0.3543 0.4061 1.00 - 1.00 - 1.00 - 1.00 -

G C T 0.2109 0.1975 0.2165 0.1653 0.60 (0.28 - 1.26) 0.18 0.89 (0.38 - 2.10) 0.79 0.28 (0.08 - 0.90) 0.035 0.42 (0.17 - 1.05) 0.066
G T A 0.111 0.1455 0.2024 0.1245 1.28 (0.68 - 2.42) 0.45 2.95 (1.18 - 7.41) 0.022 0.79 (0.23 - 2.71) 0.71 0.59 (0.24 - 1.46) 0.25
G T T 0.124 0.1479 0.1243 0.2019 2.22 (0.97 - 5.08) 0.06 1.04 (0.48 - 2.23) 0.92 1.14 (0.48 - 2.67) 0.77 1.94 (0.92 - 4.10) 0.086
A C A 0.0494 0.0505 0.0521 0.0408 0.82 (0.22 - 2.98) 0.76 0.72 (0.15 - 3.38) 0.68 0.48 (0.09 - 2.72) 0.41 1.06 (0.31 - 3.57) 0.93
A C T 0.0504 0.0442 0.031 0 1.04 (0.30 - 3.66) 0.95 0.86 (0.17 - 4.40) 0.86 0.08 (0.00 - 4.91) 0.23 0.83 (0.13 - 5.23) 0.84
A T A 0.0396 0.0259 0.0195 NA 0.22 (0.03 - 1.41) 0.11 0.29 (0.04 - 2.00) 0.21 - - - -
For combinations it was used 122 controls due to used of PCR-ARMS did not getting amplification of some samples. *OR (Odds ratio) with CI (confidence interval) 95% adjusted
for sex and age. SNP: single nucleotides polymorphism; DEN (group DEN= DF+DHF); DF: dengue fever; DHF: dengue hemorrhagic fever.
APÊNDICE B – Artigo original 1
 Artigo publicado no periódico “Immunological investigations” com fator de impacto: 1,82
e qualis CAPES na classificação medicina II: B1.
IMMUNOLOGICALINVESTIGATIONS
http://dx.doi.org/10.1080/08820139.2016.1248560
Meta-analysis of the Relationship between TNF-α (−308G/A) and IL-10

(−819C/T) Gene Polymorphisms and Susceptibility to Dengue
Ana Caroline Melo dos Santosa,b, Edilson Leite de Mourab, Jean Moisés Ferreirab,
Barbara Rayssa Correia dos Santosb, Verônica de Medeiros Alvesc,
Karol Fireman de Fariasb and Elaine Virgínia Martins de Souza Figueiredoa,b
aInstitute
of Biological and Health Sciences, Federal University of Alagoas, Maceio, Brazil; bLaboratory of Molecular Biology
and Gene Expression, Federal University of Alagoas, Maceio, Brazil; cNursing Department, Federal University of Alagoas,
Maceio, Brazil
ABSTRACT KEYWORDS
Objective: This study determined whether tumor necrosis factor alpha (TNF- Dengue; interleukin-10; TNF-
α) and Interleukin-10 (IL-10) polymorphisms are associated with susceptibility alpha; meta-analysis;
to dengue. polymorphism
Methods: a systematic review with meta-analysis was conducted of the
associations between the TNF-α (−308G/A) and IL-10 (−819C/T)
polymorphisms and dengue.
Results: A total of eight case-controls studies involving 384 individuals with
symptomatic dengue, 571 individuals with dengue hemorrhagic fever, and
995 healthy controls were considered in the meta-analysis. There was no
significant association between TNF-α (−308G/A) and IL-10 (−819C/T)
polymorphism and dengue in overall population. However, stratifying meta-
analysis by groups, the meta-analysis revealed association between the TNF-
α −308 G/G (OR: 1.62, CI: 1.02–2.57, p = 0.04) genotype and allele G (OR:
1.62, CI: 1.04–2.55, p = 0.03) that confers susceptibility to symptomatic
dengue, while the TNF-α−308 G/A genotype (OR: 0.69, CI = 0.39–0.99, p =
0.04) and allele A (OR: 0.64, CI: 0.41–1.00, p = 0.05) confers protection to
symptomatic dengue. No difference was observed for the TNF-α (−308) and
IL-10 (−819C/T) polymorphisms in the comparisons of hemorrhagic dengue
versus control and hemorrhagic dengue versus symptomatic dengue.
Conclusion: This meta-analysis showed that TNF-α (−308) polymorphism is
associated with dengue symptomatic susceptibility.
Introduction
Dengue is the most common arboviral diseases in humans; it is mainly transmitted through
the bite of mosquitoes of the genus Aedes (Aedes Aegypti and Aedes Albopictus) in regions
tropical and subtropical. Dengue virus (DENV), member of the genus Flavivirus in the family
Flaviviridae, has four infectious serotypes: DENV 1–4, and there are reports of a fifth
serotype (DENV 5) that was located in the forests of South East Asia (Mustafa et al., 2015;
Guabiraba and Ryffel, 2014; Pozzetto et al., 2015). It is estimated that over 50 million people
are infected with DENV each year worldwide and about 2.5 million people live in endemic
countries (WHO, 2009) and a cartographic search estimated that about 390 million dengue
cases per year around of the world (Bhatt et al., 2013).
Figure 1. The flow chart of literature screening.
The disease can cause infections asymptomatic in most of cases. Symptomatic cases may
develop a milder form or progress to a more severe form, when patients may develop
increased vascular permeability. The progression to severe forms for DENV infection is
multifactorial, involving immunological/genetic factors of the host, genotype/serotype of the
virus, and environmental. Evidences epidemiological indicate that host immunity has
important role in the predisposing to severity of dengue and in the induction of clinical
characteristics (Gurugama et al., 2010; Herrero et al., 2013; Grange et al., 2015; Simmons et
al., 2015). Immune response is involved in the pathogenesis of infectious diseases and the
pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines are associated with the disease severity
(Acioli-Santos et al., 2008; Ennis; et al., 2009; Doeschl-Wilson et al., 2011; Costa et al., 2013;
Fang et al., 2012; Rothman, 2011; Rathakrishnan et al., 2012; Vejbaesya et al., 2009). The
tumor necrosis factor (TNF-α) and interleukin-10 (IL-10) have been associated with
progression of severe dengue, which are proinflammatory cytokines and anti-inflammatory,
respectively.
Hence, single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes that are potentially involved in
the immune response may help on the comprehension of pathophysiology of infectious
diseases, as dengue. SNPs are small genetic variations that may influence in the genic
expression (Nardin, 2009; Lan, 2011). To better explain the association between these
reported polymorphisms and dengue, we conducted a review systematic with meta-analysis
about previously published studies. In the present study, we assess relationship of the
polymorphism TNF-α (−308G/A) and IL-10 (−819C/T) with the dengue infection and
progression of the illness.
Material and methods
Search strategy
The study consisted in a systematic review and meta-analysis of according with the
guidelines PRISMA statement (Moher et al., 2009). The databases PubMed, Web of Science,
Scopus, and Portal of Periodic of Capes were searched with unbounded period. The keys
words were used as follows: dengue, polymorphism genetic, TNF-α, IL-10, and cytokines.
Studies duplicated were excluded this review. The titles and abstract of the articles were
assessed for two authors (ACMS and BRCS) to determine inclusion independently and
selected about the association between polymorphisms of interest and dengue (Figure 1).
The discrepancies were resolved by consensus.
The approach PICOS (Pregunta, 2007) was used for definition of descriptors for assess
eligibility. In which participants were patients (P) with dengue and fever hemorrhagic
dengue; the intervention (I): TNF-α(−308G/A) and IL-10 (−819C/T) polymorphism
identification; compared to control groups (C): absence of dengue in the control group;
outcome (O): presence or absence of the TNF-α(−308G/A) and IL-10 (−819C/T)
polymorphism in the group of patients with dengue; Study design (S): genetic association
study.
Studies included in the systematic review were (1) articles that investigated polymorphisms
of TNF-αand IL-10 associated with dengue, (2) original data, and (3) studies in English
language. Exclusion criteria were (1) duplicated articles; (2) case, review, or articles only with
an abstract; (3) articles with other genetics polymorphisms and invitro experiments. Thefull
text wasread by all authors, because choosing of the studies could not be decided based on
title and abstract. The studies selected were established by the descriptors for eligibility to
this review. Disagreement on studies inclusions was resolved by consensus. All studies were
in accordance with the ethical aspects of research.
Two authors (BRCS and JMF) independently assessed the quality of the searches based on
the Newcastle–Ottawa Scale. Analysis was based on three broad dimensions: selection,
comparability, and exposure in studies case-control. The score varies from 0 up to 9, as
described follow: high-quality study: more than 7; medium-quality study: between 4 and 6;
poor-quality study: less than4. Inconsistencies between the investigators were elucidated by
debates to reevaluate the methodological quality.
The data extraction were composed for information about authors, gene, country of study,
type of study, size sample, mean age of cases and controls, genotype and allelic distribution,
Hardy–Weinberg equilibrium (HWE), and association.
Statistical analysis
The metafor package (http://cran.r-project.org/web/packages/metaphor/index. html)

(Nicodemus, 2008) in R (version 3.2.4; http://www.r-project.org/) and RevMan (version 5.3;
http://tech.cochrane.org/revman) software were utilized for statistical analysis. Sensitivity
analysis was also performed to evaluate the impact of each individual study on the pooled
OR. Allele and genotypes frequencies of the TNF-α(−308G/A) and IL-10 (−819C/T)
polymorphism in studies were determined using the direct counting method. For each study
was estimated point of risks, OR, and 95% confidence interval (CI). PooledOR with 95% CI
was used to measure the association between the TNF-α(−308G/A) and IL-10 (−819C/T)
polymorphisms in the susceptibility and progression dengue. Pooled ORs were tested by Z
test (p < 0.05 was considered significant). The test χ2 was used to evaluate HWE considering
p value / 0.05. Heterogeneity was examined by Q2 (Higgins et al., 2003) and I2 statistic
(Higgins and Thompson, 2002). The fixed effect and random model were used. When the
genetic factor has a similar outcome in susceptibility to disease in the studies included in a
meta-analysis is used the fixed effect model, however, when there is a variation due to
sampling errors is used the model of random effects (DerSimonian and Laird, 1986). When
the groups investigated are uniform, the two models are analogous. However, when there is
the presence of significant heterogeneity is used the random model. (DerSimonian and Laird,
1986). For investigating potential risk of bias in the studies was conducted by Egger’s funnel
plot and Egger’s regression test, p < 0.05 was considered statistically significant (Egger et al.,
1997).
Results
Study inclusion and characteristics
The databases show 58 possible relevant articles. Articles in duplicate were excluded; thus,
34 potentially articles were included (Figure 1). In this review, after carefully reading the
abstracts and titles, eight papers (Fernandez-Mestre et al., 2004; Perez et al., 2010; García-
Trejo et al., 2011; Xavier-Carvalho et al., 2013; Alagarasu et al., 2013; Alagarasu et al., 2015;
Sam et al., 2015; Fernando et al., 2015) were relevant to the key words and search strategy
in the electronic databases. The period of publication was 2004–2015 in populations from
different countries, thus distributed: two from India, one from Malaysia, one in Brazil, one
from Mexico, one of Cuba, one of Sri Lanka, and one in Venezuela. The meta-analysis was
performed with 384 individuals with symptomatic dengue individuals, 578 hemorrhagic
dengue individuals, and 988 healthy controls (Fernandez-Mestre et al., 2004; Perez et al.,
2010; García-Trejo et al., 2011; Alagarasu et al., 2013; Xavier-Carvalho et al., 2013; Alagarasu
et al., 2015; Fernando et al., 2015). Because the number of frequency genotype/allelic of the
TNF-α(−308G/A) and/or IL-10 (−819C/T) gene was not in accordance with the sample size
referred by authors (Perez et al., 2010; García-Trejo et al., 2011; Sam et al., 2015), we revised
it according to the percentage genotype described in the table of each study.
The classification of individuals was defined by criteria of the World Health Organization
(World Health Organization, 1997). The methods for detecting polymorphisms included PCR-
SSP (polymerase chain reaction-sequence specific of primers), RFLP for restriction enzyme
(Restriction Fragment Length Polymorphism), qPCR (real-time PCR), and Amplification-
refractory mutation system (ARMS-PCR). Information about authors, gene, country of study,
type of study, size sample, mean age cases and controls, genotype and allelic distribution,
HWE, and association were shown in Table 1.
The comparisons were conducted considering the genotypes and allelic frequencies and
stratified into the following groups: DEN (symptomatic dengue + hemorrhagic dengue)
versus control (seven studies by TNF-αand five studies by IL-10), symptomatic dengue versus
control (with four studies by TNF-αand two studies by IL-10), hemorrhagic dengue versus
control (with seven studies by TNF-αand two studies by IL-10), and hemorrhagic dengue
versus symptomatic dengue (with five studies by TNF-αand three studies by IL-10).
Quantitative data synthesis
In Table 2, the group DEN (symptomatic dengue + hemorrhagic dengue) versus control group
showed seven studies to TNF-α(−308G/A) with a total of 1887 participants (889 cases and
995 controls) and there was no significant association under genetic model dominant (Figure
2). When compared the group symptomatic dengue versus control, the analysis of TNF-
α(−308G/ A) showed four studies (García-Trejo et al., 2011; Alagarasu et al., 2013; Sam et al.,
2015; Alagarasu et al., 2015), with 314 symptomatic dengue cases and 436 controls. In Table
3, the meta-analysis of the TNF-α(−308G/A) polymorphism showed an association between
the genotype GG (OR: 1.62, CI: 1.02–2.57, p = 0.04) and the allele G (OR: 1.62, CI: 1.04–2.55,
p =0.03) in the development of infection dengue. Furthermore, the genotype GA (OR: 0.69,
CI = 0.39–0.99, p = 0.04) and the allele A (OR: 0.64, CI: 0.41–1.00, p = 0.05) were associated
with protection to symptomatic dengue (Figure 3). For comparison between hemorrhagic
dengue versus group control were used 7 studies (Perez et al., 2010; García-Trejo et al.,
2011; Alagarasu et al., 2013; Xavier-Carvalho et al., 2013; Sam et al., 2015; Alagarasu et al.,
2015; Fernando et al., 2015) with 546 hemorrhagic patients and 995 controls. No association
was found among the genotype GG (OR = 0.70, CI = 0.42–1.15, p = 0.15), genotype GA (OR =
1.49, CI = 0.45–1.07, p = 0.76), AA (OR = 0.15, CI = 0.01–3.60, p = 0.24), allele G (OR = 1.08,
CI: 0.65–1.80, p = 0.25), and allele A (OR = 0.92, CI = 0.56–1.54, p = 0.76).
In Table 2 which showed the group DEN (symptomatic dengue + hemorrhagic dengue) versus
control group with 5 studies for IL-10 with 646 dengue cases and 703 controls (Perez et al.,
2010; Xavier-Carvalho et al., 2013; Sam et al., 2015; Alagarasu et al., 2015; Fernando et al.,
2015), meta-analysis identified that any association was found between genotypes and
alleles (Figure 4). The analysis of IL-10 (−819C/T) between symptomatic dengue and group
control showed 2 studies (Sam et al., 2015; Alagarasu et al., 2015) with 172 patients dengue
and 227 controls and no association among the genotypes as also the alleles. The
hemorrhagic dengue versus group control was used 5 studies (Perez et al., 2010; Xavier-
Carvalho et al., 2013; Sam et al., 2015; Alagarasu et al., 2015; Fernando et al., 2015) with 631
hemorrhagic patients and 703 controls without association for the genotypes and alleles
(Table 3).
In Table 3, we have a comparison between hemorrhagic dengue versus symptomatic

dengue; 5 studies (Fernandez-Mestre et al., 2004; García-Trejo et al., 2011; Alagarasu et al.,
2013; Sam et al., 2015; Alagarasu et al., 2015) were analyzed, with 384 dengue patients and
339 hemorrhagic for TNF-α(−308G/A) and 3 studies (Fernandez-Mestre et al., 2004;
Alagarasu et al., 2015; Sam et al., 2015) with 213 dengue patients and 263 hemorrhagic for
IL-10 (−819C/T). No difference was observed for the polymorphisms of TNF-α – 308 and IL-10
(−819C/T).
Figure 3. Forest plot of TNF-α (−308G/A) polymorphisms in the group symptomatic dengue versus control.
Publication bias and heterogeneity
The DEN group versus control group for analyses of the TNF-α(–308G/A) obtained
heterogeneity in the codominat model for genotype GG (p = 0.01), GA (p = 0.02), allele G (p =
0.005), allele A (p = 0.005) and dominant model (<0.0001). In the analysis of IL-10 (– 819C/T)
for the DEN group versus control group for the genotype TC (p = 0.00001) and dominant
model (0.0001) there was large heterogeneity (Table 2). The TNF-α(–308G/A) showed
significant heterogeneity in the codominant model for genotype GG (p = 0.004), GA (p =
0.007), allele G (p = 0.004), A (p = 0.004) and in the dominant model (0.005) when compared
hemorrhagic dengue versus control group (Table 3). The genotype GG, GA, G allele, A allele
and IL-10 (– 819C / T), TT genotype and the dominant model showed heterogeneity in the
groups of hemorrhagic dengue and symptomatic dengue for TNF-α. The genotype GG (p =
0.03), GA (p = 0.04), allele G (p = 0.02), allele A (p = 0.02) and for IL-10 (–819C/T) the
genotype TT (p = 0.04) and the dominant model (0.002) demonstrated heterogeneity in the
groups of hemorrhagic dengue and symptomatic dengue for TNF-α(–308G/A) (Table 3). The
symptomatic dengue versus control for IL10 (–819C / T) obtained heterogeneity for
dominant model (0.002).These variations might be due to clinical or genetic heterogeneity.
Egger’s funnel plot was used to identify potential risks bias. In comparison of the group DEN
(hemorrhagic + symptomatic dengue) versus controls was indicated publication bias for
genotype CT (z = 2.96, p = 0.003) (Figure 5) and any to TNF-α(−308G/A) (Figure 6). The results
indicated no significant evidence for publication bias in comparison symptomatic dengue
versus group control to TNF-α(−308G/A) (Figure 7). In comparison of the group hemorrhagic
dengue versus controls, no significant evidence for publication bias was meet, except CT (z =
2.55, p = 0.01). In relation to the category hemorrhagic dengue and symptomatic dengue
was identified significant evidence for publication bias in the allele G (z = 4.25, p = <.0001)
for TNF-α(−308G/A) and for IL-10 (−819C/T) the genotype CT (z = −1.98, p = 0.04).
Comparing the forest plot of the TNF-α(−308G/A) gene from dengue and hemorrhagic
dengue versus control observed that these latter studies showed less variability in genotypes
and alleles. In addition, the hemorrhagic versus control was higher heterogeneity than
others were. This suggests that in DHF, genotypes and alleles of the TNF-α(−308G/A) gene
have distinct characteristics of classical dengue and control. The same was identified with
the IL-10 (−819C/T) polymorphism gene.
Discussion
Polymorphisms of cytokines has been highlight by role in the pathogenesis of several

diseases as brucellosis in Iranian (Kazemi et al., 2016), chronic immune thrombocytopenic
purpura in Egyptians (El Ghannam et al., 2015), metabolic syndrome in asthmatics on China
(Yang et al., 2015), tuberculosis susceptibility in Europeans and Asians (Ke et al., 2015), risk
of visceral leishmaniosis in Iran (Ahmadi et al., 2015), chronic obstructive pulmonary disease
(Gane et al., 2015), susceptibility to celiac disease in Italian (Maranhão et al., 2015), and
infection disease as dengue (Chaturvedi et al., 2006). The study of SNPs is proving a powerful
tool in disease association studies.
TNF-αis a pro-inflammatory cytokine immunomodulatory significant. It has an important role

in regulation of cell proliferation and death as well as inflammation and immune response
involving various infectious diseases, autoimmune diseases, neurodegenerative diseases
among others (Elahi et al., 2009; Qidwai and Khan, 2011). In the pathogenesis of dengue, the
TNF-αinduces the fever, enhances vascular permeability, and induces apoptosis in
endothelial cells (Alagarasu et al., 2015). The TNF-α(−308G/A) polymorphism has been
associated with the dengue, and presence of allele A has been related with high expressing
of gene; due to the presence, this allele increases the transcriptional activity (Wilson et al.,
1997).
We performed a meta-analysis with aim to investigate the association between the
polymorphisms (TNF-α−308 and IL-10 −819) and the infection and progression of dengue.
The results showed that TNF-α −308G allele and −308GG genotype were associated with
symptoms of dengue fever in relation the control. While TNF-α −308A allele and −308GA
genotype were correlated with protect against dengue fever. These findings suggest that the
presence of TNF-α−308A allele was associated with protect effect. This association did not
show bias and it demonstrated significant statistical heterogeneity.
However, the −308A allele in the Cuban (Perez et al., 2010) and Thailand (Chuansumrit et al.,
2013) population has reported the association with the severity of the dengue (dengue
hemorrhagic fever) (Dettogni et al., 2015). Although the TNF-α-308A allele was not
statistically significant, the frequency of this allele was elevated in children with dengue
hemorrhagic fever of India (Alagarasu et al., 2013). Thailand’s children showed association
between polymorphism −308A and significant bleeding manifestations (Chuansumrit et al.,
2013).
Figure 5. Funnel plot with 95% confidence limit on the IL-10 (−819) polymorphism of overall population.
Study realized in human dendritic cells reported that TNF-αcytokine in high and medium
concentration in blood inhibits the DENV replication; this may suggest that the TNF-α−308A
allele high expressing might be involved in the protection of the symptomatic dengue as
visualized in the review (Shi et al., 2006).
In a study in the Brazilian population, TNF-α −308GG genotype was associated with
persistence of neurological, psychological, and behavioral symptoms (Dettogni et al., 2015).
Adults and children of Malaysia with GG genotype were associated with the development of
dengue hemorrhagic fever compared to controls. In this same population, the G/A genotype
was associated positively to protect against the evolution of dengue hemorrhagic fever and
dengue shock syndrome (Sam et al., 2015); this genotype also showed a protective effect in
the review to symptomatic dengue. Other study in Malaysia the TNF-α −308GA+AA displayed
a protection role against dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome (Sam et al.,
2015).
Figure 6. Funnel plot with 95% confidence limit on the TNF-α (−308G/A) polymorphism of overall population.
IL-10 is a cytokine with immunomodulatory effects and a powerful anti-inflammatory

molecule (Tsai et al., 2013). Some studies have associated IL-10 cytokine levels with clinical
status of dengue (Srikiatkhachorn and Green, 2010; Malavige et al., 2013). Recently, a study
of children in Rio de Janeiro showed strong relationship between thrombocytopenia and
high levels IL-10 serum of patients (Ferreira et al., 2015). In vitro studies demonstrates a
correlation between IL-10 levels and ADE (antibody-dependent enhancement) phenomenon
(Chareonsirisuthigul et al., 2007).
The antibodies related to this phenomenon lead a cross reaction with heterologous
serotypes infectious, favoring the development of dengue, infecting a large number of cells,
which may leads severe disease forms. The IL-10 levels in ADE in vitro assay showed an
positive association with polymorphisms in promoter region gene, suggesting that ADE
effects are influenced by genetics of the host (Boonnak et al., 2011). The relevant studies
involving ADE phenomenon has been recognized as an important event by World Health
Organization (World Health, Organization, 2009). However, there are no reports in literature
correlating in vivo ADE phenomenon and IL-10 serum levels (Tsai et al., 2013), and similarly,
no correlation was established between allelic forms IL-10 promoter polymorphisms gene
and disease progression, what is different to the TNF-αpromoters polymorphisms gene. Only
the genotype C/T of IL-10 (−819C/T) has been associated with protection against the severity
of dengue fever in the Indian population (Alagarasu et al., 2015).
Figure 7. Funnel plot with 95% confidence limit on the TNF-α (−308G/A) polymorphism in the group symptomatic
dengue versus control.
Allelics forms of IL-10 (−819 C → T) genotypes have not been associated with disease
severity. However, a study conducted with Cuban population, organizing polymorphisms
promoter in haplotypes, showed significant relation between polymorphisms and DHF, when
positions −1082/−819/−592 of IL-10 gene were coupled in ACC and ATA haplotypes (Perez et
al., 2010). In the other hand, non-presence of GCC haplotype was reported as protective
effects against DHF/DSS in Malaysian population (Sam et al., 2015).
Others studies obtained associative results with the dengue disease when combined
different polymorphism in combinations, joining IL-10 (−819C/T) polymorphisms with
polymorphisms of other genes that expressing pro-inflammatory molecules, obtaining
configurations statistically significant, as on study conducted in Indian population (Alagarasu
et al., 2015), heterozygous genotypes of IL-8 rs4973 and IL-10 rs1800871(−819) are
associated with reduced risk of DHF.
Researches realized with pro- and anti-inflammatory cytokines, when find significant results,
contribute to the hypothesis that dengue is a disease modulated by a complex response to
infection, that is guided by these molecules. In this perspective, the description of SNPs in
the human genome can be a powerful tool in studies of diseases such in as dengue
associations (Vejbaesya et al., 2009).
This meta-analysis did not identify association of IL-10 (−819C/T) polymorphism with
dengue. Few studies have analyzed the role of IL-10 polymorphism in dengue pathogenesis;
so, there has been the need for further population studies that can identify the genetic
profile of individuals with dengue. The association of IL-10 polymorphism with infection
progression was strongly correlated in studies that used the haplotype –1082/–819/–592 in
the IL-10 gene promoter. In conclusion, this metaanalysis propose that the TNF-α −308 G/G
genotype and allele G confer susceptibility to symptomatic dengue, while the TNF-α −308
G/A genotype and allele A confer protection. However, due to the number of studies of the
studies included in the metaanalysis, the results should be deduced with attention. Sources
similar genotyping analysis in several ethnic populations is necessary to validate the
association between SNPs with susceptibility or progression in relation of dengue. Future
studies should involve large sample sizes, homogeneous populations of dengue patients,
investigating the genetic profile of patients with dengue compared to the viral serotype,
clinical, and laboratory features. This is necessary to understand complete way of the
paradigm of host genetics.
Declaration of interest
The authors declare that there are no conflicts of interest.
Funding
This study was supported by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES) and Fundação de Amparo à Pesquisa de Alagoas (FAPEAL), nº protocol:
20110906-0110025-0080. The authors acknowledge to Laboratory Municipal de Arapiraca –
AL and Laboratory de Analysis Clinics Dr. Edler Lins (LACEL).
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J Clin Exp Pathol 8:13739.
APÊNDICE C – Artigo original 2
• Artigo submetido ao periódico “Revista de enfermagem UFPE On Line” com fator de
impacto: 0,963 e qualis CAPES na classificação medicina II: B5.
APÊNDICE D – Artigo original 3
Artigo construído em parceria com o programa de pós-graduação em biotecnologia –
RENORBIO – UFPE
APÊNDICE E – Patente em parceria
Patente desenvolvida em parceria com o programa de pós-graduação em biotecnologia –
RENORBIO – UFPE.
ANEXO A - Protocolo de extração de DNA genômico por NaCl
1. Aos tubos contendo swab adicionar 600µl (para tubos de 2ml) ou 400µl(para tubos de
1,5ml) de TES (Tris HCL 10mM pH 7,6; EDTA 1mM; SDS 0,6%) e 7 µl(para 600 µl)
ou10 µl (para 400 µl) de proteinase K (10mg/ml);
2. Incubar por 2h a 42ºC;
3. Após a incubação retirar o swab (este passo exige o máximo de cuidado para a retirada da
escova que deve ser realizada com uma pinça pequena e exclusiva para o procedimento);
4. Adicionar 84µl (para 600 µl)ou 116 µl (para 400 µl) de NaCl e agitar manualmente com
vigor;
5. Centrifugar por 1 minuto a 15.000×g;
6. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e adicionar 2 vezes (800 µl) o volume de
etanol absoluto;
7. Agitar e centrifugar os tubos por 1 minuto a 15.000×g;
8. Descartar o etanol absoluto e adicionar 1ml (1000 µl) de etanol a 70%;
9. Inverter os tubos diversas vezes para lavar o pellet;
10. Centrifugar os tubos por 1 minuto a 15.000×g e desprezar o sobrenadante;
11. Deixar os tubos abertos por 30min invertidos em papel limpo, para evaporação do etanol
residual;
12. Dissolver o DNA em 60µl de TE 10:0,1 (Tris HCL 10mM pH 7,6; EDTA 1mM)
OBS: Passar no vortex;
13. A concentração de DNA obtida é em torno de 80ng/µl.
ANEXO B - Parecer de aprovação da pesquisa pelo Comitê de ética e pesquisa.
ANEXO C - Termo de consentimento livre e esclarecido
‘’O respeito devido à dignidade humana exige que toda pesquisa se processe com
consentimento livre e esclarecido dos participantes, indivíduos ou grupos que, por si
e/ou por seus representantes legais, manifestem a sua anuência à participação na
pesquisa. Entende-se por Processo de Consentimento Livre e Esclarecido todas as
etapas a serem necessariamente observadas para que o convidado a participar de uma
pesquisa possa se manifestar, de forma autônoma, consciente, livre e esclarecida’’.
Resolução Nº 466 de 12 de dezembro de 2012.
Eu, _________________________________________________ tendo sido convidado (a) a

participar como voluntário (a) do estudo:POLIMORFISMO GENÉTICO DOS PACIENTES
COM DENGUE NO ESTADO DE ALAGOAS E SUA RELAÇÃO COM A INFECÇÃO E
PROGRESSÃO DA DENGUE, recebi da Sr. Professora Adjunta Elaine Martins de Souza Figueiredo
do Departamento de Enfermagem da Universidade Federal de Alagoas – Campus Arapiraca,
responsável por sua execução e da discente de mestrado Ana Caroline Melo dos Santos, as seguintes
informações que me fizeram entender sem dificuldades e sem dúvidas os seguintes aspectos:
 Que o estudo se destina a investigar padrões genéticos na população geral relacionados a

infecção e evolução da doença dengue;
 A importância deste estudo é entender estes aspectos correlacionados a doença da dengue e
gerar conhecimento para poder determinar a predisposição das pessoas em relação com a
dengue;
 Esse estudo começara em 2015 e terminará em 2016;
 O estudo será feito da seguinte maneira: Se você estiver com suspeita de dengue e for pedido a
realização de exame sorológico pelo seu médico e você autorizar participar do estudo, será
solicitada a coleta de sangue em um dos braços por punção venosa (retirada de sangue pela
veia do braço com agulha) realizada com material descartável por profissional treinado. Será
retirado no máximo 10 ml de sangue. Este volume de sangue é cerca de trinta vezes menor do
que o volume de sangue normalmente doado quando um indivíduo doa sangue para bancos de
sangue. Caso a punção realizada não obtiver sucesso, uma amostra de saliva será necessária
através da coleta por uma escova (swab). Estas amostras serão submetidas à análise de
laboratório para estudos genéticos. Solicitamos também a sua autorização para utilizar dados
do seu prontuário como idade, sexo, idade que iniciou a doença, tempo de doença e os
resultados dos últimos exames de rotina pedidos pelo seu médico;
 Que eu participarei das seguintes etapas: doação de material biológico (sangue ou saliva) e
dessa forma encerra-se a minha participação neste estudo;
 Que os outros meios conhecidos para se obter o mesmo resultado são os seguintes: não
existem outros meios para se obter os mesmos resultados;
 Que os incômodos que poderei sentir com a minha participação são os seguintes: o
desconforto da coleta de sangue é dor leve e passageira;
 Os riscos à minha saúde física e mental são mínimos. No momento da coleta de sangue poderá
haver alguma dor decorrente da punção da veia. Complicações de coleta de sangue rotineira
são raras e geralmente de pequeno porte. O acesso ao meu prontuário pode conter
informações pessoais e confidenciais, entretanto os pesquisadores envolvidos afirmam que os
resultados da pesquisa não terão os entrevistados divulgados. Estou ciente de que será
mantido o sigilo e a privacidade do meu nome na pesquisa;
 Que eu não terei nenhuma despesa na participação da pesquisa;
 Que os benefícios que deverei esperar com a minha participação, mesmo que não diretamente
são: a avaliação da predisposição da população estudada para a infecção e evolução da
dengue;
 Que, sempre que eu desejar será fornecido esclarecimentos sobre cada uma das etapas do
estudo;
 Que eu poderei, a qualquer momento, recusar a continuar participando do estudo e também a
que eu poderei retirar este meu consentimento, sem que isso me traga nenhuma penalidade ou
prejuízo;
 Que a qualquer momento eu poderei recusar e continuar participando do estudo e, também,
que eu poderei retirar este meu consentimento, sem que isso me traga qualquer penalidade ou
prejuízo;
 Que as informações conseguidas através da minha participação no estudo não permitirão a
identificação da minha pessoa, exceto pelos responsáveis, e que a divulgação das
mencionadas informações só será feita entre os profissionais estudiosos do assunto;
 Que eu receberei uma cópia deste termo devidamente assinado por mim e pelos responsáveis
pela pesquisa;
 Que não haverá ressarcimento de despesas, caso eu apresente algum custo na realização desta
pesquisa e de que eu não serei indenizado por qualquer dano que venha a sofrer com a
participação na pesquisa.
 Que serei indenizado para alguma situação adversa decorrentes da minha participação no
projeto de pesquisa;
Finalmente, tendo eu compreendido perfeitamente tudo o que me foi informado sobre a minha
participação no mencionado estudo estando consciente dos meus direitos, das minhas
responsabilidades, dos riscos e dos benefícios que a minha participação implica, concordo em
dele participar e para isso eu DOU O MEU CONSENTIMENTO SEM QUE PARA ISSO EU
TENHA SIDO FORÇADO OU OBRIGADO.
Endereço do Comitê de Ética:

Instituição: Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Alagoas
Endereço: Prédio da Reitoria, sala do C.O.C, Campus A. C. Simões
Bairro: Cidade Universitária Cidade: Maceió
Fone: 32141041
_____________________________________ Elaine Virginia de Martins de Souza Figueiredo

Assinatura ou impressão datiloscópica do (a) voluntário
ou responsável legal
Ana Caroline Melo dos Santos

Assinatura do(s) responsável (is) pela pesquisa.

Associação de Polimorfismos em Genes de Citocinas Com A Proteção e Susceptibilidade À Infecção e Progressão Da Dengue

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

ANA CAROLINE MELO DOS SANTOS

ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS EM GENES DE CITOCINAS COM A

ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS EM GENES DE CITOCINAS COM A

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Orientador (a): Prof.ª. Drª. Elaine Virgínia

Co-orientador: Prof. Dr. Tiago Gomes de

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, PPGCS, pela oportunidade e

Ao secretário da Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Jhonatan Guedes, pela

Agradecimento especial, ao Laboratório de Análises Clínicas Dr. Edler Lins na pessoa de

Aos funcionários da UFAL que contribuíram indireta ou diretamente para a consolidação

A Fundação de Amparo à Pesquisa de Alagoas (FAPEAL) pelo financiamento do projeto que

Meu Muito obrigado!!!

Você que habita ao amparo do Altíssimo, e vive à sombra do Onipotente,

Dengue é a arbovirose de maior prevalência no mundo. Diversos fatores foram associados

Figura 1 - Incidência de dengue nas Américas entre 1980 e 2010. ......................................... 21

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a dengue resulta em

2.1 Aspectos histórico - epidemiológicos da dengue

A palavra “dengue” tem origem hispânico-caribenha, este termo começou a ser

2.1.1 Dengue nas Américas

Unidos e México (BRATHWAITE DICK et al., 2012; EHRENKRANZ et al., 1971).

Figura 1 - Incidência de dengue nas Américas entre 1980 e 2010

Fonte: Adaptado de Organização Pan-americana de Saúde, 2011.

A transmissão do vírus da dengue (DENV) nas Américas foi interrompida devido a

2.1.2 Dengue no Brasil

2.1.3 Dengue em Alagoas

O estado de Alagoas possui 102 municípios e uma extensão territorial de 27.779,343

Até a 52ª semana epidemiológica (Nº: 52/2014 de 12 de janeiro de 2015), Alagoas

Fonte: Adaptado de Secretaria Estadual de Saúde (SESAU) de Alagoas/SINAN.

A transmissão da dengue acontece quando a fêmea do mosquito adquire o vírus ao picar

A primeira comprovação de que a transmissão da dengue foi oriunda de mosquitos é a

2.4 Vírus da dengue – DENV

O vírus da dengue (DENV) pertence ao gênero flavivírus (família Flaviviridae) que

Figura 3 - Genoma do vírus da dengue

Fonte: Adaptado de Guzman (2015) e Screaton (2015).

2.5 Ciclo viral

As manifestações clínicas da dengue variam de inaparente ou assintomático até as

3.1 Dengue clássica ou febre da dengue

3.2 Febre hemorrágica da dengue e síndrome de choque da dengue

A principal diferença em termos fisiopatológicos que determina a severidade da doença

hematócrito em 20% após o tratamento, presença de derrames cavitários e hipoproteinemia

3.3 Nova classificação

Os critérios da Organização Mundial da Saúde em 2009 classificam a dengue de

3.4 Infecções assintomáticas

O panorama epidemiológico dos indivíduos assintomáticos está relacionado a diversos

Os estudos sobre manifestações atípicas ainda são em menor proporção na literatura.

do sistema imune, desempenhando um papel crucial através da mediação do extravasamento

Fonte: Adaptado de Guzman, 2015.

As citocinas consistem em um grupo diversificado de pequenas proteínas que são

Dentre as pró-inflamatórias tem-se as interleucinas 1, 2, 6, 7 e FNT (fator de necrose tumoral)

4.1 Polimorfismos em genes envolvidos na regulação do sistema imune e dengue

Polimorfismo de nucleotídeo simples ou SNP (do inglês Single Nucleotide

perspectivas de contribuição para identificação do perfil genético da população quanto a

Figura 5 - Esquematização dos SNPs em genes de citocinas e seus possíveis efeitos

Fonte: adaptado de Ollier, 2004

HIRAYAMA, 2011). As evidências genéticas relacionadas ao sistema imune fornecem dados

4.1.1 Polimorfismo do gene TNF-alfa (TNFA -308G/A)