3.4 Técnicas de Análise PCR e Técnicas de Hibridização

3.
4 Técnicas de análise: PCR e

técnicas de hibridização
Prof. MSc. Francieli Dominiki Zavislak
Técnica de PCR
• Antes do desenvolvimento da PCR, Reação em
Cadeia da Polimerase, os métodos utilizados para
amplificar e gerar cópias de fragmentos de DNA
eram demorados e trabalhosos.
• A PCR permite realizar várias cópias de um

segmento específico de DNA com rapidez e precisão
em um tempo muito menor.
• A técnica é usada em diversos segmentos, desde
experiências e procedimentos em biologia
molecular e pesquisa à análise forense e diagnóstico
médico.
• A descoberta da estrutura do DNA, em 1953, pela
dupla de pesquisadores Watson e Crick, levou a
uma revolução científica admirável.
• Aparentemente simples agora, essa revolução

biotecnológica, criou um ramo totalmente novo na
ciência – a biologia molecular.
• A Reação em Cadeia da DNA Polimerase, mais
conhecida pela sigla PCR, foi desenvolvida nos anos
de 1980 e também revolucionou diversas áreas da
biologia e da medicina.
• Essa técnica é utilizada para se obter a amplificação
seletiva de determinada região de uma molécula de
DNA, na qual apenas uma única molécula de DNA
pode servir de molde para amplificação, produzindo
milhares de cópias da molécula-alvo.
Como acontece a amplificação
do DNA na técnica de PCR
• O procedimento de PCR envolve três etapas, cada uma
repetida muitas vezes.
1 – Desnaturação
• O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada
é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por
cerca de 30 segundos.
• A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma

fita única.
2 – Anelamento ou hibridização
• Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou
primers (uma fita de DNA específica para o gene
que se quer estudar) complementam a fita oposta
da sequência de DNA a ser amplificada.
•
• Ou seja, um deles é complementar à sequência em
uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é
complementar à sequência na outra fita.
• O molde é determinado pela posição dos

iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a
uma temperatura de 60°C.
3 – Extensão ou polimerização
• Com o molde já identificado, a enzima DNA-
polimerase adiciona as bases complementares,
formando uma nova fita e então tem-se novamente
a duplicação da fita de DNA.
• Esse processo acontece a uma temperatura de

72°C.
• O ciclo inteiro é então reiniciado, os produtos do
primeiro ciclo de replicação são então
desnaturados, hibridizados e novamente replicados
com DNA-polimerase.
• O procedimento é repetido muitas vezes até que o

nível desejado de amplificação seja obtido.
• Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 20 a
30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo
servindo como DNA-molde para o próximo – dando
origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase.
• Como cada etapa da reação ocorre em uma
temperatura específica, a reação pode ser
controlada.
• É utilizado um termociclador para determinar a

temperatura e o tempo de cada etapa, bem como o
número de ciclos de replicação.
• A detecção do produto de amplificação
normalmente é feita em eletroforese em gel de
agarose, que é corado com brometo de etídio,
permitindo a visualização direta do DNA
pesquisado.
• Hoje, existem termocicladores que, além de

amplificar o DNA, permitem a sua detecção –
chamada PCR em tempo real (qPCR).
Hibridização
• A hibridização in situ é uma técnica que permite a
detecção de sequências específicas de DNA, ou de RNA,
em um corte de tecido, ou em células.
• Usa sequências complementares de DNA ou RNA, em

fita única, marcadas, constituindo-se as “sondas,” que
podem ser de DNA ou RNA clonados, ou de
oligonucleotídeos sintéticos.
• As sondas estabelecem ligações de hidrogênio
(pontes entre o átomo de hidrogênio e átomos
fortemente eletronegativos, como o oxigênio, o
flúor e o nitrogênio) com o DNA ou o RNA alvos,
complementares, nos tecidos ou células.
• Podendo ser visualizadas com marcadores
radioativos (32P, 125I, 35S e 3H), ou não radioativos
(peroxidase, biotina, digoxigenina);
• Ou por um fluorocromo (fluoresceína, rodamina,

cianina, etc) caracterizando, o último, a hibridização
in situ fluorescente (FISH).
• A hibridização in situ é útil na detecção de genoma
viral nos tecidos, na separação dos subtipos virais e
na avaliação se a infecção é latente ou produtiva.
• Tem sido empregada para o:
- vírus do papiloma humano (HPV, α-Papillomavirus,
Papillomaviridae);
- vírus Epstein Barr (EBV, Lymphocryptovirus,
Herpesviridae);
- vírus da imunodeficiência humana (HIV, Lentivirus,
Retroviridae);
- adenovírus (Mastadenovirus, Adenoviridae), entre
outros.
• É também usada na identificação e diferenciação de
hifas de várias espécies de fungos nos tecidos, como
os do gênero Aspergillus, dentre as hialo-
hifomicoses, entre outros.
• No estudo das neoplasias permite detectar RNAs
mensageiros (RNAm) de peptídeos hormonais,
cadeias leves de imunoglobulinas, albumina, etc.
• De modo a se ter certeza de serem produtos das

células neoplásicas em si, e não provenientes da
difusão nos fluidos teciduais.
• Também é empregada no estudo de alterações
genéticas em várias neoplasias, assim como em
combinação com outros métodos, a saber:
- imuno-histoquímica;
- a reação em cadeia da polimerase (PCR in situ), com
ouro coloidal para visualização em microscopia
eletrônica, etc.
OBRIGADA!

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4 Técnicas de análise: PCR e

• A PCR permite realizar várias cópias de um

• Aparentemente simples agora, essa revolução

• A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma

• O molde é determinado pela posição dos

• Esse processo acontece a uma temperatura de

• O procedimento é repetido muitas vezes até que o

• É utilizado um termociclador para determinar a

• Hoje, existem termocicladores que, além de

• Usa sequências complementares de DNA ou RNA, em

• Ou por um fluorocromo (fluoresceína, rodamina,

• De modo a se ter certeza de serem produtos das

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